““Методы лабораторного Методы лабораторного исследования гемостаза”исследования гемостаза”

1. Скрининговые исследования

2. Исследование сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза

Лабораторные методы, используемые Лабораторные методы, используемые в исследовании гемостаза:в исследовании гемостаза:

• Клоттинговые: (ВСК, ПВ, АПТВ, ТВ …)• Хромогенные: (активность ATIII, PC, Pl)• Иммунологические:(количество отдельных факторов)• ПЦР: (ДНК-диагностика наследственных гемофилий и

тромбофилий: аномалия Лейдена, гомоцистеинемия, дефицит AT)

• Проточная цитофлуориметрия: (определение рецепторов тромбоцитов)

• Нефелометрия: (исследование функции тромбоцитов по методу Born)

Клоттинговые методы:- основаны на определении времени образования, а также растворения сгустка в стандартных условиях;

- определяется активность отдельных звеньев

системы свертывания и фибринолиза.

Хромогенные методы:

- это хромогенное (оптическое) определение хромогенных (окрашенных) веществ (нитроанилина) связанных с субстратами (белками) специфических реакций;

- так определяется активность отдельных компонентов свертывающей, антитромбиновой или фибринолитической системы.

Пример: Стрептокиназа + плазминоген** = плазмин + свободный нитроанилин**(желтая окраска)

Скрининговые тесты гемостаза:

1) Определение резистентности микрососудов:- манжеточная проба;

-баночная проба;-проба щипка

2) Определение времени кровотечения:- по Дьюка;

- по Айви;- по Шитиковой

3) Определение времени свертывания крови:- по Ли и Уайту

Манжеточная пробаВыполнение: Создают венозный стаз путем дозированного сжатия плеча манжеткой тонометра (90 мм на 5 минут) и подсчитывают количество петехий в в верхней ладонной поверхности предплечья и локтевого сгиба.Клиническое значение:Положительная проба возможна при врожденной ломкости капиляров, тромбоцитопении, значительной тромбоцитопатии, гиповитаминозе С, болезни Виллебранда, приеме непрямых антикоагулянтов, гормональном сдвиге у женщин, ДВС-синдроме.

Время кровотечения - тест общего состояния сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза

Выполнение: Определяют длительность кровотечения из микрососудов кожи после дозированного (3 мм) прокола ее ланцетом.

Клиническое значение:Удлинение времени кровотечения возможна при значительной тромбоцитопении, тяжелых формах тромбоцитопатии (тробастения Гланцмана), болезни Виллебранда, приеме непрямых антикоагулянтов, гормональном сдвиге у женщин, ДВС-синдроме.

Оценка работы Оценка работы первичного гемостазапервичного гемостаза

Оценка работы Оценка работы первичного гемостазапервичного гемостаза

Platelet Function аnalyzer-100

Прибор для количественной оценки гемостатической функции тромбоцитов

Определение количества Определение количества тромбоцитовтромбоцитов: (170-350х10/л): (170-350х10/л)

1) В мазке по Фонио: не может быть рекомендован из-за малой точности.

2) Подсчет в камере Горяева после гемолиза эритроцитов оксалатом аммония.

3) С помощью автоматического счетчика в венозной крови, стабилизированной ЭДТА.

Исследование функции Исследование функции тромбоцитовтромбоцитов

Выполняется из венозной крови, стабилизированной цитратом натрия в соотношении 1/9; в течении 1 часа после забора крови.

Богатая тромбоцитами плазма - отбирают после центрифугирования крови при 1000 оборотов /6 минут

Бедная тромбоцитами плазма - отбирают после центрифугирования крови при 3000 оборотов/ 15 минут

Исследование функции Исследование функции тромбоцитов:тромбоцитов:

РЕТРАКЦИЯ В ПЛАЗМЕ (богатой тромбоцитами)

Пробирка полистироловая мерная:2,5 мл забуференного физ.раствора0,2 мл тромбина 0,2 мл Ca Cl2 (0,277%)Добавить 0,2 плазмы, богатой тромбоцитамиПеремешать, вылить в пластиковый шприц на 5,0 млинкубировать 60 минут при 370СВынуть сгустокЗамерить объемРасчет: Vост/ Vобщ . 100%

Исследование агрегации Исследование агрегации тромбоцитовтромбоцитов

• ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Борна - основан на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы после активации индукторами.

• Индукторы агрегации - естественные или искуственные активаторы:

• АДФ;• Адреналин;• Коллаген;• Ристоцетин и др.

Агрегометр Агрегометр HELENA PACKS-4HELENA PACKS-4 • СПИСОК МЕТОДИК:• Агрегация с АДФ• Агрегация с эпинефрином• Агрегация с коллагеном• Агрегация с ристоцетином• Агрегация с арахидонатом• Активность фактора фон

Виллебранда (по ристоцетин-кофакторной активности)

• Хромогенное определение:• Антитромбина III• Плазминогена• Протеина С• Гепарина• Активности фактора VIII

AP 2110 Анализатор агрегации тромбоцитов предназначен для исследования in vitro агрегационных свойств тромбоцитов турбидиметрическим методом.

Анализатор агрегации тромбоцитов АMS 600

Агрегометры

Агрегометр LA230 ( " БИОЛА" Россия) Двухканальный анализатор агрегации тромбоцитов

Прибор позволяет проводить в каждом канале исследования агрегации тромбоцитов методом светопропускания и определения среднего радиуса тромбоцитарных агрегатов.

Агрегометр тромбоцитарный "CHRONOLOG CORP." (США)

Агрегометр 430 (одноканальный) Агрегометр 440VS(двухканальный) Агрегометр 470VS(четырехканальный) Оптический анализатор агрегации тромбоцитов служит для исследования агрегационных свойств тромбоцитов в плазме.

АгрегометрыАгрегометры

Оптическая агрегометрия используется для исследования процессов агрегации на плазме обогащенной тромбоцитами (PRP), а также для измерения агглютинации латексных частиц и для исследования изменения формы взвешенных частиц. Оптические агрегометры «Хроно-лог» с успехом используются во всем мире уже многие годы, начиная с 1967 г и являются «золотым» стандартом в оптической агрегометрии.

Двойной инфра-красный луч и чувствительный фотодетекторный модуль используется для определения разницы в световом прохождении между плазмой обогащенной и обедненной тромбоцитами.

Цельная кровь, разведенная кровь, плазма обогащенная тромбоцитами, отмытые тромбоциты, отмытые лейкоциты – все эти образцы могут быть измерены с помощью импедансной технологии. Корпорация «Хроно-лог» обладает патентом на применение этого метода.

Широкий спектр люминисцентных реакций (выброс АДФ, уровень ионизированного кальция, генерация супероксидов и др.) может быть измерен при помощи ультра-чувствительной фотоумножительной трубки, которая испльзуется в люми-агрегометрах корпорации “Хроно-лог”. Люминисценция используется для детекции всех дефектов накопления и секреции. Этот метод также достаточно чувствительный для детекции гепарин-индуцированной тромбопении.

ТромбоэластографТромбоэластограф

Гематокоагулограф ГКГМ4-02 тромбоэластограф

ПРИМЕРЫ ГРАФИКОВ

ОСНОВНЫЕ ИЗМЕРЯЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫCT (время коагуляции) - общая активность коагуляционной системы

CFT (время образования сгустка) и a-угол (начальная скорость оборазования сгустка) – оценка функции тромбоцитов, действия фактора XIII, полимеризации фибрина, активности гепарина

MA (или MCF) – качество сгустка, оценка его механических свойств

LOT (время наступления фибринолиза) – оценка фибринолитической активности l-угол – скорость фибринолиза

роТЭГ "Анализатор гемостаза роТЭГ " это современный 4-х

канальный компьютерный тромбоэластограф.

ИДЦ 2008-2011г.г.ИДЦ 2008-2011г.г.

Автоматический коагулометрSTA-R Evolution Roche Diagnostics, Франция

Гемостаз в ИДЦГемостаз в ИДЦ

Структура исследований отдела лабораторной диагностики по лабораториям

41%40%

6%

5%

8%

Биохимическая лаборатория

Гематологическая лаборатория

Молекулярно-биологическая лаборатория

Лаборатория общеклинических исследований

Иммунологическая лаборатория

Гематология

Гемостаз

Спектр анализов лаборатории гематологии ИДЦ с учетом Спектр анализов лаборатории гематологии ИДЦ с учетом гомеостатических методовгомеостатических методов

• Полный гематологический анализ• Миелограмма• Протромбиновое время и фибриноген• Коагулограмма стандартная • Ретикулоциты• Цитограмма (мазок из носа или глаза)• LE-клетки• Осмотическая резистентность эритроцитов• Ретракция плазменного сгустка• Агрегация тромбоцитов с АДФ• Агрегация тромбоцитов с ристоцетином• Агрегация тромбоцитов с арахидоновой

кислотой • Агрегация тромбоцитов с коллагеном• Агрегация тромбоцитов с адреналином• Определение фактора Виллебранда• Активность фактора свертывания крови XII• Активность фактора свертывания крови • VIIIАктивность фактора свертывания крови

IXАктивность фактора свертывания крови XI• Активность комплекса протеина С (скрининг)• Активность антитромбина III• Активность протеина С

• Активность плазминогена• Активность альфа-2-антиплазмина• АПТВ с люпус-чувствительным кефалином• Время кровотечения• Коррекционно-ингибиторная проба по АПТВ

Коррекционно-ингибиторная проба по ПТИ• Определение групповой принадлежности по

АВО• Определение резус-антигенов• Фибринолиз• Активность фактора свертывания крови II• Активность фактора свертывания крови V• Активность фактора свертывания крови VII• Активность фактора свертывания крови X• Активность фибриназы (фактор XIII)• Коагулограмма (тромбогенный риск)

Протромбиновое время (с МНО) • Фибриноген • Активированное время рекальциф

Активированное парциальное тро • Тромбиновое время• Растворимые фибрин-мономерные• Содержание Д-димера

- Диагностика тромбофилий- Диагностика гемофилий- Мониторинг противо-гемофилийной

терапии для пациентов с наличием ингибитора фактора VIII

- Мониторинг антикоагулянтной терапии, направленной на ингибирование тромбина и фактора Xa (гепарин)

TGA-анализ – универсальный метод оценки TGA-анализ – универсальный метод оценки тромбогенного потенциала гемостазатромбогенного потенциала гемостаза

• CEVERON-ALPHA для 4 методов анализа:• - коагулометрия

АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген, Протеин С, ВА, дефицит факторов свертывания, мутация Лейдена и другие.

• - фотометрияС1-ингибитор, FVIII, Протеин С, АТ-III и другие.

• - турбидиметрияД-димер, ВА, С-реактивный белок и другие.

• - флуориметриякинетика образования эндогенного тромбина (для модификации Ceveron TGA)

• Автомат CEVERON-ALPHA TGA позволяет проводить уникальный флуориметрический TGA-анализ

• 360/430 нм• Длины волн фотометрического блока:

405, 570, 630 и 740 нм• Скорость проведения анализов на CEVERON-

ALPHA до 70 образцов/час (ПВ) (Стационар на 300-400 больных)

Спасибо за внимание!Спасибо за внимание!