实验十四杂交瘤技术

生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室

大连理工大学环境与生命学院

实验十四杂交瘤技术

指导教师：唐颖


大连理工大学环境与生命学院1. 实验目的

• 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。法。

• 能运用杂交瘤技术来制备自己所需要的单能运用杂交瘤技术来制备自己所需要的单克隆抗体。克隆抗体。



2. 实验原理



• 动物免疫动物免疫

• 细胞融合细胞融合

• 杂交瘤细胞杂交瘤细胞的筛选和克隆的筛选和克隆

杂交瘤技术产生的 3个技术关键



接受抗原刺激后，能接受抗原刺激后，能分泌分泌针对该抗原的针对该抗原的特异性抗体特异性抗体，，在在

体液免疫中具有重要功能。体液免疫中具有重要功能。

BB 淋巴细胞本身是一种淋巴细胞本身是一种终末分化细胞终末分化细胞，，通常不再进行细通常不再进行细

胞分裂，存活一段时间后便会死亡——胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞。短命细胞。

（（ 11 ）） BB 淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：（（ 11 ）） BB 淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：

BB 淋巴细胞淋巴细胞 (B lymphocytes)(B lymphocytes) ：：

2.1 动物免疫



骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myeloma cells):(myeloma cells):

恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可

永远分裂和存活——永远分裂和存活——长命细胞长命细胞。。

经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株

————没有抗体分泌物。没有抗体分泌物。



目的：目的：在细胞融合后获在细胞融合后获得尽可能多的分得尽可能多的分泌针对于该目标泌针对于该目标抗原的特异性抗抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞 ..

特定目标抗原特定目标抗原

动物动物免疫免疫

脾脏中脾脏中 BB 淋巴细胞淋巴细胞

BB 淋巴细胞大量增殖淋巴细胞大量增殖

刺激刺激

能分泌针对于该抗原能分泌针对于该抗原的的特异性抗体特异性抗体

2.1 动物免疫

（（ 22 ）动物免疫）动物免疫（（ 22 ）动物免疫）动物免疫



☺常规免疫法常规免疫法

☺脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法

☺短程免疫法短程免疫法

☺体外免疫法体外免疫法

常用免疫方法：常用免疫方法：

““ 稳妥；优势克隆”稳妥；优势克隆”

皮下注射皮下注射腹腔注射腹腔注射静脉注射静脉注射

免疫途径：免疫途径：

““ 省时；省抗原”省时；省抗原”

““ 省时”省时”

““ 操作繁琐”操作繁琐”



脾细胞脾细胞(B(B 淋巴细胞淋巴细胞 ))

骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞

杂交瘤细胞杂交瘤细胞

长命长命不分泌抗体不分泌抗体

分泌抗体分泌抗体短命短命

分泌抗体分泌抗体长命长命

KöhlerKöhler 和和 Milstein, 1975Milstein, 1975

2.2 细胞融合



细胞融合方法• 病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合

• PEGPEG 介导的细胞融合介导的细胞融合

• 电激融合电激融合

脾细胞脾细胞(B(B 淋巴细胞淋巴细胞 ))

骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞

杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞 // 脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 // 骨髓瘤细骨髓瘤细

胞胞

骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞

筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活

2.3 杂交瘤细胞的筛选和克隆

HATHAT 培养基筛选培养基筛选 BB 淋巴细胞淋巴细胞：： HGPRTHGPRT++ ，， TKTK++

骨髓瘤细胞： HGPRT- ， TK-

存活存活

死亡死亡

（（ 11 ）杂交瘤的筛选）杂交瘤的筛选（（ 11 ）杂交瘤的筛选）杂交瘤的筛选



DNADNADNADNA内源性途径内源性途径 (( 主要途径主要途径 ))

谷氨酰胺谷氨酰胺 oror

单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸

二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶

AA

HHHH

TTTT

外源性途径外源性途径 (( 旁路途径旁路途径 ))

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( ( HGPRT HGPRT ))

胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 ( ( TK TK ))

外源性途径外源性途径 (( 旁路途径旁路途径 ))


大连理工大学环境与生命学院（（ 22 ）抗体的检）抗体的检

测测（（ 22 ）抗体的检）抗体的检

测测要求：要求：简便、快速、敏感简便、快速、敏感 ;; 在短时间内能检测大量样品在短时间内能检测大量样品

常用方法：常用方法：常用方法：常用方法：

酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 ( ELISA)( ELISA)

间接免疫荧光法间接免疫荧光法 (IFA)(IFA)

放射免疫法放射免疫法 (RIA)(RIA)

双相扩散法双相扩散法


大连理工大学环境与生命学院酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 (ELISA)(ELISA)酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 (ELISA)(ELISA)

抗原抗原

第第 11 抗体抗体

酶酶

第第 22 抗体抗体

待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液

底物

有色产物有色产物酶标仪检测

技术原理：技术原理：


大连理工大学环境与生命学院（（ 33 ）克隆）克隆

化化（（ 33 ）克隆）克隆

化化常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：

有限稀释法有限稀释法

软琼脂平板法软琼脂平板法

显微操作法显微操作法

8080 个细胞个细胞 /96/96 孔孔饲养细胞饲养细胞

ELISAELISA 法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。单克隆抗体。



由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇原决定簇————单克隆抗体单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)(monoclonal antibody, MAb)

单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)单克隆抗体 (monoclonal antibody, MAb)

单克隆抗体优点：单克隆抗体优点： • 高度纯一高度纯一• 高度专一高度专一

应用：应用：疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗 (( 生物导弹生物导弹 ))生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离


大连理工大学环境与生命学院（（ 44 ）大规模培养）大规模培养——批量生产单克隆抗体——批量生产单克隆抗体（（ 44 ）大规模培养）大规模培养——批量生产单克隆抗体——批量生产单克隆抗体

常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：

动物接种法动物接种法

转瓶培养法转瓶培养法

细胞培养罐法细胞培养罐法


大连理工大学环境与生命学院3. 实验材料、用品

• 实验材料实验材料88 ～～ 1212 周龄周龄 BALB/cBALB/c 纯系小鼠纯系小鼠 1010 只；只； SP2/0-AG14SP2/0-AG14 骨髓瘤细胞；灭骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒（用作抗原）。：活人轮状病毒（用作抗原）。：

• 实验用品实验用品仪器与用具：仪器与用具：超净工作台、普通离心机、倒置显微镜、酶联免疫检测超净工作台、普通离心机、倒置显微镜、酶联免疫检测

仪、仪、 CO2CO2 恒温培养箱、恒温水浴、烤箱、高压灭菌锅。血细胞计数板、恒温培养箱、恒温水浴、烤箱、高压灭菌锅。血细胞计数板、25ml25ml 和和 50ml50ml 培养瓶、培养瓶、 9696 孔和孔和 2424 孔培养板各、孔培养板各、 4040 孔酶标板、孔酶标板、 50ml50ml

塑料离心管、塑料离心管、 10ml10ml 玻璃离心管、玻璃离心管、 lmllml 、、 5ml5ml 和和 10ml10ml 吸管、吸管、 6cm6cm 培培养皿、养皿、 100ml100ml 和和 50ml50ml 培养液瓶各、培养液瓶各、 1ml1ml 、、 5ml5ml 和和 10ml10ml 注射器各、注射器各、小滴管、玻璃套管、手术剪刀、手术镊、小滴管、玻璃套管、手术剪刀、手术镊、 66 号针头、号针头、 LL 型型 66 号针头、号针头、500ml500ml 和和 1000ml1000ml 烧杯、酒精灯、不锈钢网烧杯、酒精灯、不锈钢网 (5×5cm 200(5×5cm 200 目目 )) 、解剖、解剖盘、培养液抽滤灭菌装置。盘、培养液抽滤灭菌装置。



试剂：试剂：

RPMI 1640RPMI 1640 培养基、小牛血清培养基、小牛血清 (FCS)(FCS) 、、 GKNGKN

液、液、 5050 ％％ PEGPEG 液、液、 HTHT 培养液、培养液、 HATHAT 培养液、培养液、0.50.5 ％胎酚蓝、％胎酚蓝、 1mol/L NaOH1mol/L NaOH 、、 1mol/L HCl1mol/L HCl 、、包被液、底物反应液、辣根过氧化物酶—羊包被液、底物反应液、辣根过氧化物酶—羊 (( 或或兔兔 )) 抗鼠抗鼠 IgGIgG 、青霉素、链霉素。、青霉素、链霉素。



4. 实验步骤


大连理工大学环境与生命学院4.1 动物免疫

实验使用人轮状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物。实验使用人轮状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物。• （（ 11 ）纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。）纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。• （（ 22 ）按每克体重注射）按每克体重注射 0.05g0.05g 戊巴比妥钠的量进行小鼠腹腔注射，戊巴比妥钠的量进行小鼠腹腔注射，对对 22 只只 1010 周龄的周龄的 BALB/cBALB/c 小鼠进行麻醉，小鼠进行麻醉， 5min5min 后小鼠即进入昏后小鼠即进入昏迷状态。迷状态。

• （（ 33 ）无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用）无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用 1ml1ml 注射器将含有注射器将含有 30µ30µ

gg 的的 0.1ml0.1ml 人轮状病毒（抗原）液分别注射到两只小鼠脾脏内。人轮状病毒（抗原）液分别注射到两只小鼠脾脏内。• （（ 44 ）将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。）将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。• （（ 55 ）免疫三天后取脾细胞进行融合。）免疫三天后取脾细胞进行融合。



(1) (1) 脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第最后一次免疫后第 33天制备天制备

(2) (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备于对数生长期制备

4.2 细胞悬液的制备与融合

(2) (2) 饲养细胞悬液的制备饲养细胞悬液的制备



①①脾细胞悬液的制备脾细胞悬液的制备取已免疫取已免疫 BALB/cBALB/c 小鼠，于免疫后第三天用眼球放血法处死小鼠，于免疫后第三天用眼球放血法处死

（收集流出血液制备阳性血清），用（收集流出血液制备阳性血清），用 70%70% 酒精浸泡消毒酒精浸泡消毒 5min5min 后，无后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用 37 GKN℃37 GKN℃ 液清洗液清洗22 ～～ 33 次。向脾内注射次。向脾内注射 0.2ml GKN0.2ml GKN 液后（使脾脏膨胀以利于细胞散液后（使脾脏膨胀以利于细胞散开），放人培养皿中，加入开），放人培养皿中，加入 5ml GKN5ml GKN 液，用液，用 LL 型型 66 号针头将脾细胞号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个将此细胞悬液过滤到一个 50ml50ml 塑料离心管中，再加入塑料离心管中，再加入 10ml GKN10ml GKN 液，液，混匀后，混匀后， 1000 r/min1000 r/min 离心离心 5min5min ，弃上清，用，弃上清，用 10ml GKN10ml GKN 液重新悬液重新悬浮细胞，取浮细胞，取 0.1ml0.1ml 均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液放均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液放 3737

℃℃ 备用。备用。



②②SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14 细胞悬液的制备细胞悬液的制备

将将 SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14 细胞用细胞用 RPMl 1640RPMl 1640 完全培养液作增殖培养，每完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代三天，使细胞在融合时达到对数生长期。取天传代一次，连续传代三天，使细胞在融合时达到对数生长期。取33 ～～ 55 瓶瓶 (50ml(50ml 的培养瓶的培养瓶 )SP2/0-Ag14)SP2/0-Ag14 细胞，倾去原来的培养上细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入清液，每瓶加入 37 GKN℃37 GKN℃ 液液 4ml4ml ，将细胞悬浮起来，收集各瓶，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放人一个中细胞液放人一个 50ml50ml 塑料离心管中，塑料离心管中， 1000r/min1000r/min 离心离心 5min5min ，，弃去上清液，用弃去上清液，用 10ml 37 GKN℃10ml 37 GKN℃ 液将细胞悬浮均匀，取液将细胞悬浮均匀，取 0.1ml0.1ml 作作活细胞计数，其余悬液放活细胞计数，其余悬液放 37℃37℃ 备用。备用。


大连理工大学环境与生命学院③③腹腔巨噬细胞悬液的制备腹腔巨噬细胞悬液的制备

杂交瘤细胞开始生长时，需要有饲养细胞，一般用腹腔巨噬细杂交瘤细胞开始生长时，需要有饲养细胞，一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。取胞作为饲养细胞。取 1212 周龄周龄 BALB/cBALB/c 小鼠，拉颈处死，浸入小鼠，拉颈处死，浸入 70%70%

酒精中消毒酒精中消毒 5min5min 。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入向腹腔中注入 10ml RPMI 164010ml RPMI 1640 完全培养液，按摩腹部完全培养液，按摩腹部 11 ～～ 2min2min

后，用注射器抽出腹腔液（一般可抽出后，用注射器抽出腹腔液（一般可抽出 8—9ml8—9ml ），放人一个），放人一个 50m50m

ll 塑料离心管中，置塑料离心管中，置 37℃37℃ 备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种胞可接种 33 ～～ 55 块块 2424 孔或孔或 9696 孔培养板。可根据需接种的培养板孔培养板。可根据需接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。数来确定所使用饲养细胞的量。


大连理工大学环境与生命学院4.3 细胞融合及 HAT筛选

融合后细胞混合液融合后细胞混合液

HATHAT 培养基培养基2 weeks later2 weeks later

HTHT 培养基培养基

正常培养基正常培养基1 week later1 week later


大连理工大学环境与生命学院• ①①将已计数脾细胞和将已计数脾细胞和 SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞按骨髓瘤细胞按 6:16:1 的数量的数量比例混合于一个比例混合于一个 50ml50ml塑料离心管中，塑料离心管中， 1000 r/min1000 r/min 离心离心 10m10minin 。。

• ②②弃上清液，轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散，放弃上清液，轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散，放 40℃40℃预热预热 11～～ 2min2min 。。

• ③③向已预热的离心管中边摇边在向已预热的离心管中边摇边在 45s45s内匀速加入内匀速加入 1ml 50%P1ml 50%PEGEG溶液。溶液。

• ④④立即在立即在 90s90s内边摇边向管内加速加入内边摇边向管内加速加入 15ml 37℃ GKN15ml 37℃ GKN液，液，放室温静置放室温静置 10min10min 。。

• ⑤⑤1000r/min1000r/min 离心离心 10min10min ，弃上清。，弃上清。



• ⑥⑥向离心管中加入向离心管中加入 37℃37℃腹腔巨噬细胞悬液和腹腔巨噬细胞悬液和 40ml 37℃40ml 37℃的的 HATHAT培养液，悬浮均匀。培养液，悬浮均匀。

• ⑦⑦将细胞悬液分别接种于二块将细胞悬液分别接种于二块 2424孔板（孔板（ 0.5ml/0.5ml/ 孔）和二孔）和二块块 9696 孔板（孔板（ 0.2ml/0.2ml/ 孔）中，放孔）中，放 37℃ 5%CO2 37℃ 5%CO2 培养箱中培培养箱中培养。养。

• ⑧⑧每天观察细胞的生长情况。每天观察细胞的生长情况。• ⑨⑨于融合后第于融合后第 55 天，用天，用 HATHAT培养液半量换液；于第培养液半量换液；于第 1010天天

用用 HTHT培养液半量换液；于第培养液半量换液；于第 1414 天用天用 HTHT培养液全量换液。培养液全量换液。• ⑩⑩当杂交瘤细胞长满孔底面积的当杂交瘤细胞长满孔底面积的 1/2—2/31/2—2/3 时，即可取培时，即可取培

养上清液进行抗体检测。养上清液进行抗体检测。



4.4 抗体的检测• a a 将纯人轮状病毒用包被液稀释，使该病毒浓度为将纯人轮状病毒用包被液稀释，使该病毒浓度为 10µg/100µl10µg/100µl 。。• b b 将此浓度抗原液按每孔将此浓度抗原液按每孔 100µl100µl 的量分别加入的量分别加入 4040 孔酶标板孔中，孔酶标板孔中，轻轻震荡使液体覆盖孔底。轻轻震荡使液体覆盖孔底。

• c c 把酶标板放在把酶标板放在 4℃4℃ 冰箱过夜（或冰箱过夜（或 37℃37℃ 孵育孵育 11 ～～ 2h2h ）。）。• d d 取出包被好的酶标板，倾去其中液体，用取出包被好的酶标板，倾去其中液体，用 PBSS-T20PBSS-T20 缓冲液洗缓冲液洗涤酶标板孔，每次洗涤酶标板孔，每次洗 3min3min ，共洗，共洗 33 次。次。

• e e 每孔加入含每孔加入含 1%1% 小牛血清白蛋白小牛血清白蛋白 (BSA)(BSA) 的的 PBSS-T20PBSS-T20 缓冲液缓冲液至孔满，室温下封闭至孔满，室温下封闭 30min30min 。。

• f f 甩去封闭液，用甩去封闭液，用 PBSS-T20PBSS-T20 缓冲液洗缓冲液洗 33 次，每次次，每次 3min3min 。。



• g g 每孔加入待测杂交瘤培养上清液每孔加入待测杂交瘤培养上清液 100µl100µl 。留出。留出 44 孔加入孔加入 100µl100µl阳性血清作为阳性对阳性血清作为阳性对照，照， 44 孔加入孔加入 HTHT 培养液培养液 100µl100µl 作为阴性对照，作为阴性对照， 44 孔加入孔加入 PBSS-T20PBSS-T20 缓冲液缓冲液 100µl100µl 作作为空白对照。为空白对照。

• h h 在在 37℃37℃恒温恒湿水浴中放置恒温恒湿水浴中放置 6060 ～～ 90min90min 。。• i i 甩去待测上清液及对照液，用甩去待测上清液及对照液，用 PBSS-T20PBSS-T20 液洗液洗 55 次，每次次，每次 3min3min 。。• j j 每孔加入每孔加入 100µl100µl按按 1:5001:500倍稀释的标有辣根过氧化物酶的羊（或兔）抗鼠倍稀释的标有辣根过氧化物酶的羊（或兔）抗鼠 IgGIgG ，， 3737

℃℃孵育孵育 60min60min 。。• k k 甩去酶标二抗液，用甩去酶标二抗液，用 PBSS-T20PBSS-T20 液洗液洗 55 次，每次次，每次 3min3min 。。• l l 每孔加入每孔加入 100µl100µl邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应 30min30min 。。• m m 每孔加入每孔加入 11 滴滴 2mol/L H2SO42mol/L H2SO4 终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测。呈现棕终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测。呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验。验。

动物免疫动物免疫

细胞融合细胞融合混合细胞的混合细胞的 HATHAT 筛选筛选 ) )

分泌分泌 XX抗体抗体BB淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞

XX抗原抗原BB淋巴细胞淋巴细胞瘤的突变株瘤的突变株

培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡无限生长细胞无限生长细胞

分泌分泌XX抗体抗体

只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来

BALB/cBALB/c 培养上清中培养上清中 XX抗体的检测抗体的检测克隆化培养克隆化培养

单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中 XX抗体的检测抗体的检测

杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体

规模化培养规模化培养获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体

杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解



5. 实验结果



• （（ 11）免疫效果的观察）免疫效果的观察

在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果，用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的则说明有免疫效果，用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所获。及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所获。


大连理工大学环境与生命学院• （（ 22）融合结果的观察）融合结果的观察细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞，有细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞，有未融合的脾细胞和未融合的脾细胞和 SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中，骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中，有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。

在融合后第在融合后第 33～～ 55 天，便可看到天，便可看到 SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，经换液可清除部分逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，经换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于融合后第脾细胞较小，于融合后第 1414 天左右大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以天左右大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。减少对活细胞的毒害作用。

在融合后第在融合后第 55 天左右便有杂交瘤细胞开始分裂，从而出现一些较小的细胞克隆，天左右便有杂交瘤细胞开始分裂，从而出现一些较小的细胞克隆，一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。



• （（ 33 ）克隆化结果的观察）克隆化结果的观察

在克隆化后第在克隆化后第 55 天左右即可看到小的细天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。胞克隆。



6.思考题• 细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微镜下形态如何镜下形态如何 ??

• 为什么要进杂交瘤细胞的克隆化培养为什么要进杂交瘤细胞的克隆化培养 ??• 单细胞克隆有何形态特征单细胞克隆有何形态特征 ?? 如何判定一个如何判定一个细胞团是不是单克隆细胞细胞团是不是单克隆细胞 ??

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实验十四 杂交瘤技术

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