第五章 分子生物学研究方法

分子生物学研究之所以从 20 世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。

DNA 分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成

基因操作

基因的定点突变PCR 扩增等

核心技术

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。

外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程 .

基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。

本章将在回顾重组 DNA 技术史上主要事件的基础上，讨论 DNA 操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等三个环节。

三大成就 ：

1. 40 年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA 而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；

BacterialStrain

Injection

Results

Living S cells

Living R cells

Heat killed S cells

Heat killed S cells mixed with living R cells

Living S cells in blood sample from dead mouse

capsule

1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae

1952年Hershey和Chase 证实噬菌体 DNA 侵染细菌实验

2. 50 年代揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制 , 解决了基因的自我复制和世代交替问题；

X-ray source

Crystallized DNA

Rosalind Franklin

Maurice Wilkins

Photographicfilm

1953- Franklin & Wilkins

Description of the 3-D structure of DNA

Francis Crick & James Watson

Conservative Model

Semiconservative Model

Frank Stahl

Matt Meselson

Parent cell

First replication

Second replication

1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway

3. 50 年代末至 60 年代，相继提出了 " 中心法则 " 和操纵子学说 , 成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

Jacob and Monod

但是，如果没有分离和富集单一 DNA 分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。

两大技术保证：1.DNA 的体外切割和连接

1962年 Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967Gellert 发现了 DNA 连接酶 DNA ligase covalently links two DNA strands

Restrictionenzyme

Restrictionenzyme

Ligase

Ligase

3’ 5’

3’5’

Herbert Boyer,Stanley Cohen1972 年获得第一个重组 DNA分子

Herbert Boyer

重组 DNA 实验中常见的主要工具酶酶 类 功 能

限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开 DNA

DNA 连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个 DNA片段连接成一个DNA 分子

DNA聚合酶 I （大肠杆菌） 按 5'到 3' 方向加入新的核苷酸，补平DNA 双链中的缺口

反转录酶 按照 RNA 分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链

多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的 5'-OH 末端（进行末端标记实验或用来进行 DNA 的连接

末端转移酶 在双链核酸的 3' 末端加上多聚单核苷酸

DNA 外切酶 III 从DNA链的 3' 末端逐个切除单核苷酸

λ噬菌体 DNA 外切酶 从DNA链的 5' 末端逐个切除单核苷酸

碱性磷酸酯酶 切除位于 DNA链 5'或 3' 末端的磷酸基团

到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何 DNA 分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。

1972 - Paul Berg,

Produced first recombinant DNA using EcoRI

EcoRI recognition sites

λ phage DNA

EcoRI cuts DNA into fragments

Sticky endSV40 DNA

The two fragments stick together by base pairing

DNA ligaseRecombinant

DNA

仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶进行 DNA 的切割和重组远不能满足基因研究的需要。

DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的 DNA ，必须将它们连接到具备自主复制能力的 DNA 分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。

这就是基因克隆，或分子克隆 。

分子克隆的载体 ---- 具备自主复制能力的DNA 分子（ vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。

1970年Mandel和 Higa 发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收 λ 噬菌体 DNA。

1972 年， Cohen 等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒 DNA。

1973 - Boyer, Cohen & Chang

Transform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie Chan

Herbert Boyer

Kanamycin resistance gene

Plasmid pSC101

Tetracycline resistance gene

E. coli transformed with recombinant plasmid

Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline

Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies

表明：

（ 1）像 pSC101 这样的质粒 DNA 分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源DNA导入寄主细胞；

（ 2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；

（ 3）质粒 DNA- 大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组DNA 或基因工程研究中发挥重要作用。

2.DNA 的核苷酸序列分析技术 DNA 核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的 DNA 技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆 DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。

General process of gene engineering

1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的 DNA片段。

2. 将带有目的基因的外源 DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组 DNA 分子。

3. 将重组 DNA 分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。

4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA 分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。

5.2.4基因扩增 聚合酶链式反应，即 PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定

基因或 DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

DNA DNA 聚合酶聚合酶 具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成

需要具有 3’ -OH 的引物 具有 5’ 到 3’ 方向聚合的能力 通常具有 3’到 5’ 外切酶活性

PCR 技术的原理并不复杂：

一． DNA 体外扩增技术

1.  PCR反应体系 1) 基本原理 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 --退火 --延伸三个基本反应步骤构成：

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)

Target Sequence

Target Sequence

PCR 原理示意图

①模板 DNA 的变性：模板 DNA经加热至 93℃左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

PCR Cycle - Step 2 –

Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

Target Sequence

Target Sequence

Primer 1Primer 25’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

②模板 DNA 与引物的退火 ( 复性 ) ：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

PCR Cycle - Step 3 -

At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are

incorporatedTarget Sequence

Target Sequence

Primer 1

Primer 2

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

Taq DNA

Polymerase

③引物的延伸：DNA 模板 --引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。

End of the 1st PCR Cycle –

Results in two copies of target sequence

Target Sequence

Target Sequence

每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～ 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

Target Amplification

No. of No. Amplicon Cycles

Copies of Target

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1,048,576

30 1,073,741,824

1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

PCR 仪

5.2.5 核苷酸序列分析

1968年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略

Sanger 在它的基础之上发展了快数测定 DNA 的末端终止法

K Mullis完善了 PCR 扩增 DNA 方法

5.2.5.1.5.2.5.1.    SangerSanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 (dideoxy-termination sequencing)

原理：双脱氧（ 2' ， 3'） - 核苷酸可以象 2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的 DNA链中，但因 3’ 端不具 OH 基， DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个 DNA 分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的 DNA片段测定出核苷酸序列。

不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来

5' - AACTGCTG- - 3'与引物退火

5' - AACTGCTG- - 3' 5'

dNTPddATPdNTPddCTP

dNTPddGTPdNTP

ddTTP

5' - AACTGCTG- 3' AC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' C- 5'

5' - AACTGCTG- 3' GAC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' TGACGAC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' CGAC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' CGAC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' GACGAC- 5'

5' - AACTGCTG- 3' TTGACGAC- 5'

2+5

1+4

3+6

7+8

dd

dd

dddd

dd dd

dd

dd

AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’3’

添加 DNA polymerase所有 4 dNTPs其中一种标记的 ddNTP

ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

在四个不同的反应管中各只包含一种 ddNTP.

AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’3’

T

TCGAT

TCGATT

TCGATTT

TC

TCGATTTC

TCGATTTCC

TCG

TCGA

T reaction

C reaction

G reaction

A reaction

每一管中的复制的序列都停留在 ddNTPs 处

5’

反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 .

这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基 .

电泳结构通过显色指示 .

T C G A3’

CCTTTAGCT

5’

过程：制备 ss-DNA→ 与引物退火→分为 4 个反应系统→每个系统中加入 dNTP（其中 dATP 常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→ DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。 `

该法亦适合 mRNA 的序列分析。 GC 富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入

dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸 -7- 脱氧鸟苷可解决GC 富集区的测序。

*5- GCATCGAT

R1 R2

R3

R4

*5' - GCATC *5' - P

*5' - GCATCG, *5' - GCATC, *5' - GC, *5- P

*5' - GCATCGA *5' - GCAT*5' - GCA, *5' - G

*5' - GCAT, *5' - G

3'T

TC

C

A

A

G

5'

R1 R4R2 R3

2. DNA 定序的一般程序 酶法测序 (Sanger) 化学测序法 (Maxam-Gilbert) 待测 DNA片段 待测 DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’- 末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 ↓ 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的 ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 ↓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自显影 ↓ 阅读序列和计算机录入 ↓ 核苷酸序列的分析与比较

二 . DNA 序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，

放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2. 自动测序仪 Conney 等人于 1987 年设计了不同荧光染料标记引物，然后

做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物 +T反应系统（引物 +DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物 +G反应系统（引物 +DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物 +A反应系统（引物 +DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物 +C反应系统（引物 +DNA+dNTP+ddCTP）

优点： i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录 , 四个反应产物点在一条道上 , 相互间会发生干

扰 , 导致读序时分辨率下降。

+光扩增量

计算机

( )激光仪 氩离子

窗口

DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自动化。

5.2.5.3.5.2.5.3. 杂交测序

自从 70 年代末期 DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（ sequencing by hybridization， SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶 DNA 分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。

DNA 杂交测序实质上包括两个主要的步骤首先是将待测定的靶 DNA 分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶 DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶 DNA 的核苷酸序列。

如果将一种核苷酸顺序为 5'-AGCCTAGCTGAA-3' 的 12-mer 的靶DNA ，与一组完全随机的 8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65 536 种的 8-mer探针群体中，仅有 5 种会与靶 DNA形成完全互补的双链体分子。根据这 5 种发生了完全杂交作用的 8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段 12-mer 的靶 DNA 分子的核苷酸顺序。 当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶 DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。

上图是两条长度均为 17-mer 的靶 DNA片段 I和 II 的杂交测序结果，两者仅在第 8位碱基有不同，分别为 C和 T 。靶 DNA片段 I可与 1~8共 8段彼此相互重叠的 8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第 9段 8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段 8-mer寡核苷酸之间各自具有 7 个碱基的重叠情况，可以构建出互补的 DNA 序列。靶 DNA片段 II 的杂交结果表明，横跨其第 8位碱基 T 的 6段 8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第 1和第 8两段 8-mer寡聚体形成的具有末端 G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第 9段 8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段 I 相比，它在第 8位发生了由 C碱基到 T碱基的变化。

1 ATACGTTA

2 GTTAGATC

3 ACGTTAGA

4 CGTTAGAT

5 GTTAGATC

DNA 样品 TATGCAATCTAG

与基因芯片上 65,000 种可能的

八聚体进行杂交从而形成特定

的结合图形

计算机分析杂交图象

并由探针的重叠情况

推导样品的核酸序列1 ATACGTTA

3 TACGTTAG

4 ACGTTAGA

2 CGTTAGAT

5 GTTAGATC

3 TACGTTAG

4 ACGTTAGA

2 CGTTAGAT

互补序列为：ATACGTTAGATC

样品序列为：TATGCAATCTAG

（基因芯片测序 )

基因芯片测序流程

5.2.6.1. 凝胶阻滞试验

凝胶阻滞试验（ gel retardation assay），又叫作 DNA迁移率变动试验（ DNA mobility shift assay），是用于体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时 DNA 分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个 DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。

5.2.6 DNA与蛋白质相互作用研究

凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的 DNA由于与一种细胞蛋白质 B 结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带

AA CCBB

放射自显影放射自显影

** **

** **

凝胶电泳凝胶电泳

放射性标记的放射性标记的 DNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物

蛋白质与蛋白质与 DNADNA 结合结合

** ** ** **** **

BB DNA-DNA- 蛋白质结合蛋白质结合物电泳迁移缓慢物电泳迁移缓慢

滞后带表明滞后带表明 DNADNA 与蛋与蛋白质结合白质结合

5.2.6.2.  DNaseI足迹试验

在 DNaseI足迹试验（ DNA foot-printing assay）过程中，首先将待检测的双链 DNA 分子用 32P 作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA 分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的 DNaseI（它可沿着靶 DNA 作随机单链切割）消化 DNA 分子，并控制酶的用量使之达到平均每条 DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。如果蛋白质提取物中不存在与 DNA 结合的特异蛋白质，经 DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1 个、 2 个、3 个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的 DNA片段梯度群体。 如果有一种蛋白质已经结合到 DNA 分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的 DNA免受 DNaseI 的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。

3232pp

1 5 101 5 10

**

1 4 8 11 4 8 100

**

加入蛋白质加入蛋白质 XX

加入加入 DNaseIDNaseI凝胶电泳放凝胶电泳放

射自显影射自显影

11

55

1010

A BA B

足迹足迹

((a)a)

((c)c)

((b)b)

DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验

5.3 基因克隆的主要载体系统

1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。

2.  至少应有一个克隆位点，以供外源 DNA 插入。

3.  至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组 DNA 分子是否进入宿主细胞

4.安全性

pBR322

BamHI

Sal I

Hi ndI I I

Pst I

ScaI Ampr

ori

( 4. 36 kb)

大肠杆菌载体pBR322 结构图

载体特点

基因工程载体是一类可供外源DNA 插入并携带重组 DNA 分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA 分子。

5.3.1 质粒 DNA及其分离纯化

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNA 组成的复制子，也有线性质粒 的报道。

质粒 DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

应用质粒作为基因克隆的载体分子，最重要的前提是要获得大量纯化的质粒 DNA 分子。

E ． coli 的质粒种类 1) colE1 因子（大肠杆菌素因子）—多数不能

进行接合转移DNA ，属高拷贝松弛型。 2) R 因子（抗药性因子） 可接合转移DNA ，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F 因子（性因子）

关键步骤：寄主细胞的裂解作用是分离质粒 DNA 实验操作。

通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒 DNA 的回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，那么绝大部分的染色体 DNA 分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒 DNA。

质粒载体 DNA 的分离

关键：如何使质粒 DNA 与宿主染色体 DNA 分开

原理：质粒 DNA比染色体 DNA 小得多，在 DNA抽提过程中，染色体 DNA断裂成小片段 (线状 ) ，质粒 DNA仍保持超螺旋构型

变性法： 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法

上述方法亦可用于 ss 环状病毒 DNA RF 型的分离 , 质粒 DNA 的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）

5.3.1.1. 氯化铯密度梯度离心法 实验表明，在细胞裂解及 DNA 分离的过程中，大分子量的细菌染色体 DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒 DNA 则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒 DNA 的纯化是十分有用的。

上清液 加入固体 CsCl与 EtBr溶液 室温下超速离心 (45,000rpm） 16小时 穿孔取出DNA（ 320nm ） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余 CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀 DNA

离心、洗涤、干燥

5.3.1.2. 碱变性法 通过氯化铯 -EtBr 密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量

的质粒 DNA ，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。

实验观察发现，在 pH值介于 12.0~12.5 的条件下加热 DNA溶液，使染色体 DNA 变为单链，而质粒 DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。

随机断裂产生的线性染色体 DNA 分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及 RNA 一道被离心沉淀下来。

用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒 DNA。

5.3.2 重要的大肠杆菌质粒载体5.3.2.1.  pSC101 质粒载体

pSC101 是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有 1～ 2 个拷贝。其分子大小为9.09kb ，编码有一个四环素抗性基因（ tetr）。。 pSC101 质粒不仅具有可插入外源 DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取 pSC101 DNA ，其产量就要比其它质粒载体低得多。

5.3.2.2. ColE1 质粒载体 ColE1 质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常

生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体 DNA 的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒 DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1 质粒拷贝数增加到 1000~3000 个之多，质粒 DNA 大约可占细胞总 DNA 的 50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源 DNA片段的产量也就得到相应的提高。

5.3.2.3.  pBR322 质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号、又具有低分子量、高拷贝、以及外源DNA 插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。

pBR322 质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于 pSF2124 质粒转座子 Tn3 的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）；第二部分来源于 pSC101 质粒的四环素抗性基因（ tertr）；第三部分则来源于 ColE1 的派生质粒 pMB1的 DNA 复制起点（ ori）。

12

3

第一个优点：具有较小的分子量，其长度为 4,363bp 。由于分子量小，不仅易于纯化，而且即使携带上一段 6-8kb 的外源 DNA片段，操作起来仍较为便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒 DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积 1000~3000 个拷贝，为重组体 DNA 的制备提供了极大的方便。

pBR322 质粒载体的优点

5.3.2.4.  pUC 质粒载体pUC 系列质粒载体包括如下四个部分：(i) 来自 pBR322 质粒的复制起点（ ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ ampr），但它的核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶的单识别位点；(iii) 大肠杆菌 β- 半乳糖酶基因（ lacZ）的启动子及其编码 α-肽链的 DNA 序列，此结构特称为lacZ‘ 基因；(iv)位于 lacZ' 基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位点（MCS）区段，它并不破坏该基因的功能。

E co S ac K p n S m a B am X b a S a l P st S p h H inR I I I I H I I I I I d III

p U C 1 8

p U C 1 9

H in S ph P st S a l X b a B am S m a K p n S ac E cod III I I I I H I I I I R I

Ap

Or i

LacZ

( 2. 68kb)

r

第一，更小的分子量和更高的拷贝数。在 pBR322 基础上构建pUC 质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子缩小了许多，如 pUC8为 2 750bp， pUC18为 2 686bp 。同时，由于 rop 基因缺失，使 pUC8 质粒的拷贝数比带有pMB1或 ColE1 复制起点的质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达 500~700 个拷贝。 第二，可用组织化学方法检测重组体。 pUC8 质粒结构中具有来自大肠杆菌 lac 操纵子的 lacZ' 基因，所编码的 α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用 X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。 第三，具有多克隆位点 MCS 区段，可以把具两种不同粘性末端（如 EcoRI和 BamHI）的外源 DNA片段直接克隆到 pUC8 质粒载体上。

pUC 质粒载体优点：

5.3.2.5.  pGEM-3Z 质粒 pGEM-3Z 是一种与 pUC 系

列十分类似的小分子质粒载体，总长度为 2,743bp ，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个 lacZ' 基因。

pGEM-3Z 具有两个来自噬菌体的启动子，即 T7启动子和 SP6启动子，它们为 RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于 lacZ' 基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应试管中加入纯化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的 mRNA 。质粒载体pGEM-4Z和 pGEM-3Z 在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和 T7 这两个启动子的位置互换、取向相反而已。

5.3.2.6. 穿梭质粒载体

所谓穿梭质粒载体（ shuttle plasmid vector），是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

早期发展的大肠杆菌 -枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大多是由这两种细菌的质粒载体融合构建的。例如， pHV14 是由 pBR322和 pC194融合而成， pEB10 是由 pBR322和 pUB110融合而成的。

大肠杆菌 -酿酒酵母穿梭质粒载体，含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记。它使研究工作者可以自如地在这两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种寄主细胞中研究目的基因的表达活性及其它调节功能。例如，可将酵母的某种基因亚克隆到穿梭质粒载体上，置于大肠杆菌中进行定点突变处理后，再把突变体基因返回到酵母细胞，以便在天然寄主中观察研究此种突变的功能效应。

Y R p 1 2 (6 .9 k b )o ri

Tc r

E

E

P

B

大肠杆菌 -酿酒酵母穿梭载体

5.3.3  λ噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作Bacteriophage ，来源于希腊文“ phagos” ，如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的 DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。

我们将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。而溶源生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体 DNA 上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫作温和噬菌体。

以噬菌体 DNA 分子作载体，克隆含有目的基因的外源 DNA片段，如果没有导致重要的噬菌体基因失活，那么当这种重组的噬菌体 DNA 分子感染了寄主细胞之后，插入的外源 DNA片段便会随着噬菌体 DNA 分子一道增殖。用放射性同位素 32P标记的特异性探针作噬菌斑放射自显影杂交，可以十分敏感地检测出含有这种重组体 DNA 分子的噬菌斑（即阳性斑点）。获得了阳性噬菌斑之后，我们就可按照类似于制备质粒 DNA 的方法，分离到大量的重组体噬菌体 DNA ，实现克隆基因的扩增。

噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。

λ噬菌体整个基因组可分为三个部分①左臂：从 A 到 J长约 20kb ，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约 20kb ，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约 10kb ，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA 复制起始均在这区域内。 左右臂包含 λDNA 复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。

在 λ 噬菌体线性双链 DNA 分子的两端，各有一条由 12 个核苷酸组成的彼此完全互补的 5‘ 单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的 λ 噬菌体的线性 DNA 分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链 DNA 分子。随后在 DNA 连接酶的作用下，将相邻的 5’-P 和 3‘-OH 基团封闭起来，并进一步超盘绕。这种粘性末端结合形成的双链区段称为 cos位点（ cohesive-end site ，粘性末端位点 .

5.3.3.1. 插入型载体

外源的 DNA 克隆到插入型 λ 载体分子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，插入型 λ 载体又可以进一步被分为免疫功能失活和大肠杆菌 β- 半乳糖苷酶失活两种亚型。

(1) 免疫功能失活插入型载体。这类载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种限制性核酸内切酶的单切割位点。当外源 DNA片段插入到这种位点上时，就会破坏载体所具有的合成功能性阻遏物的能力，阻碍其进入溶源周期。因此，凡带有外源 DNA 插入的 λ 重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源 DNA 插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。

(2) β- 半乳糖甙酶失活插入型载体。许多种载体的基因组中含有大肠杆菌的 lacZ 区段，编码 β- 半乳糖苷酶基因 lacZ 。由这种载体感染大肠杆菌的 lac- 指示菌，涂布在补加有 IPTG和 X-gal 的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源 DNA 插入到 lacz 区段上，阻断了 β- 半乳糖苷酶基因 lacZ 的编码序列，那么由这种重组体感染的 lac- 指示菌，由于不能合成 β- 半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。

5.3.3.2. 替换型载体

替换型载体又叫作取代型载体（ substitution vector）是一类在 λ 噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入 DNA 分子所取代的 DNA片段的克隆载体。在构建此类载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源 DNA 插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源 DNA片段的能力。

“cosmid”一词是由英文“ cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有 λDNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。在柯斯质粒载体 pHC79 中，除cos位点之外，其两侧还具有与噬菌体包装有关的 λDNA短序列。质粒DNA部分则是一个完整的复制子，包括一个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和 tetr 。很明显， pHC79柯斯质粒兼具了 λ噬菌体载体和pBR322 质粒载体两方面的优点，其克隆能力为 31~45kb ，而且能够被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。

5.3.4 柯斯质粒载体

用限制性内切酶处理质粒和噬菌体，再将cos位点拼接到质粒上

再酶切位点将重组质粒线形化，再插入相应的基因组 DNA

通过含有氨苄青霉素的选择性培养平板筛选

存活的细胞可能含有相应的重组质粒

第一，具有 λ 噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源 DNA ，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对λ 噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA 分子，能按照 λ 噬菌体 DNA 同样的方式环化。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒 DNA 一样在寄主细胞内进行复制，并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。第三，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和 cos位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有 5~7kb左右。因此，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成 λ 噬菌体颗粒的最大外源 DNA片段，即柯斯质粒载体的克隆极限可达 45kb左右。

柯斯质粒载体的特点：

pBluescript 是专用的商品名称，系指由 Stratagene公司发展的一类从 pUC 载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（ +/-），如今则更多地叫作 pBluescript KS（ +/-）或pBluescript SK（ +/-）。 SK 表示多克隆位点区的一种取向，即 lacZ 基因是按照SacI→KpnI 的方向转录；（ +/ -）表示单链噬菌体 f1 复制起点的两种相反的取向。 f1（ +）起点表示当 pBluescript 噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到 lacZ 基因的有意义链 DNA ；而 f1（ -）起点则表示当 pBluesript 噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到 lacZ 基因的无意义链DNA。

5.3.5  pBluescript噬菌粒载体

(i)     在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对 T3和 T7 噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)    同时具有一个单链噬菌体M13或 f1 的复制起点和一个来自ColE1 质粒的复制起点，保证pBluescript 噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链 DNA；(iii)  编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)  含有一个 lacZ 基因，可以按照 X-gal-IPTG 组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。

5.4 基因的分离与鉴定克隆： 多细胞的高等生物个体水平上 : 表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体，所以说，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（ monozygotic twins）便是属于同一克隆。

在细胞水平上 : 指由同一个祖细胞（ progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。

基本步骤： (1) 用于基因克隆的 DNA材料的选择以及 DNA 分子的片段化；

(2) 外源 DNA片段与载体分子的体外连接反应；(3) 将人工重组的 DNA 分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；(4) 重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。

克隆基因的分离1 、 应用核酸探针分离克隆目的基因

2 、应用 mRNA差别显示技术分离克隆目的基因

3、应用 cDNA差示分析法克隆基因

4、应用酵母双杂交体系克隆基因

5 、基因的图位克隆法

6、DNA微列阵技术进行基因克隆

基因克隆的第一步是要从实验材料中制备包括“目的基因”在内的 DNA片段群体，而且这个 DNA片段群体必须包容整个基因组的全部序列， DNA片段的大小要适合于基因操作的要求。最简单的办法是利用限制性核酸内切酶消化供体基因组 DNA ，并直接将消化产物与载体分子相连接。这个被称为鸟枪法（ shot-gun approach）的方法最明显的缺点，是所形成的重组体分子带有大小不同的插入片段。由于高等真核生物的基因组庞大，按一般载体承受外源DNA 插入能力（大约为 1000~3000bp）计算，能产生几十万个大小不同的DNA片段，形成由几十万个大小不同的重组体分子组成的克隆群体。要想从如此巨大的群体中，选出带有目的基因的克隆，显然是十分费事的。为了克服上述困难，有人建议采用局部双酶消化法，保证 DNA产物大小在 10-30kb左右，通过蔗糖梯度离心或制备凝胶电泳技术，得到分子量约为 20kb 的随机群体并将其克隆到合适的载体上。

 5.4.1 DNA片段的产生与分离

5.4.2 重组体 DNA分子的构建5.4.2.1.  外源 DNA片段定向插入载体分子 若用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的 DNA

分子，将产生具有两种不同粘性末端的 DNA片段。因此，如果载体分子和待克隆的 DNA 分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么，载体分子和外源 DNA片段将按一种取向退火形成重组 DNA 分子，从而保证外源 DNA片段定向插入载体分子。事实上，载体分子和外源 DNA 插入片段（或称供体 DNA），并不一定总能产生出互补的粘性末端，所以，有时采用平末端连接法或采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。

5.4.2.2.  最佳连接反应 为了使连接反应物中的外源 DNA片段都能插入载体分子形成重组 DNA ，必须设法阻止经限制性内切酶切割后的线性载体分子的自身再环化作用，以提高 DNA片段的插入效率。目前常用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生的线性载体分子，除去该 DNA 的 5'-P 末端，而留下一个 5'-OH 基团。经碱性磷酸酯酶处理过的线性载体分子，除非插入了外源 DNA片段，否则就不再能够重新环化成有功能的载体分子。

在连接反应中，正确地调整载体 DNA 和外源 DNA 之间的比例，是能否获得高产量重组转化子的一个重要因素。应用 λ 噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体 DNA/供体 DNA 的连接反应体系有利于重组分子的形成。以柯斯质粒载体为例，因为只有当给体 DNA片段的两个末端都同柯斯质粒载体结合之后，才能被有效地包装。若使用质粒分子作为克隆的载体，其重组体分子由一个载体分子和一个给体 DNA片段连接环化而成，所以，当载体 DNA 与供体 DNA 的比值为 1时，有利于这类重组体分子的形成。

5.4.2.3.   重组体分子导入受体细胞的途径

转化（或转染转导、

显微注射电穿孔

原核细胞和酵母等低等真核细胞

高等动物的真核细胞

核生物基因组 DNA十分庞大，而且含有大量的重复序列。因此无论是采用电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。这个问题可以通过由mRNA产生的 cDNA 进行克隆而得以部分解决，因为尽管高等生物一般具有 3-5万种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有 15%左右的基因得以表达，产生出约5 000-10 000 种不同的 mRNA 分子。 cDNA 克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总 poly（ A）mRNA 转变成双链 cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的 cDNA 基因文库。

5.4.3 5.4.3 cDNAcDNA 基因克隆基因克隆

 5.4.3.1. 高质量mRNA 的制备

可应用 Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚 (A)mRNA 。将用生物素标记的寡聚 (dT)引物与细胞总 RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚 (dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的 mRNA。

Isolation of mRNARNA 提取

分离 mRNA

5.4.3.2. 反转录生成 cDNA

可同时在反转录系统中加入寡聚（ dT）及随机引物 R6 ，以保证得到全长 cDNA ，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP ，保证所获得双链 cDNA 的方向性。因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有 5'-methyl C 的外源 DNA ，所以实验中常选用mcrA- mcrB- 菌株。

选用 cDNA 克隆这一实验方案时必须考虑到目的基因 mRNA 在特定的生物体组织中的含量问题。在组织和培养的细胞中，各种mRNA 的含量是极不相同的，有些mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些mRNA 的含量很低，每个细胞只有几个拷贝。根据mRNA 分子含量的多寡，即我们所说的丰富程度（简称丰度），可以将 mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度三种不同的类型（表 5-3）。

Oligo dT 或随机引物合成 cDNA 第一链

合成 cDNA 第二链

补平 cDNA链末端

从表中看出低丰度mRNA ，每个细胞仅有 14 个拷贝左右，其总量约占总mRNA 的 30% ，其中约有 11,000 个左右的不同种类的mRNA 。因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA 序列的 cDNA 基因文库，必须的最低克隆数（理论值）应是 11,000/0.30=~37 000 。但由于在实验中存在着取样上的差异，有些序列容易被克隆，有些序列却不容易被克隆，为了保证基因文库中能够包含所有的序列，就必须增加克隆的数目。为了使上述低丰度mRNA的 cDNA 克隆达到 99% 的期望率，大约需要筛选 170,000 个克隆。

丰 度 等 级相应丰度等级的mRNA群体占总mRNA 的百分数（%）

在相应丰度等级中所含的不同种类 mRNA 序列的数量（个）

每个细胞所含的相应丰度mRNA 序列的拷贝数（个）

高丰度 22 30 3,500

中丰度 49 1,090 230

低丰度 29 10,670 14

5.4.4 克隆基因的分离5.4.4.1. 应用核酸探针分离克隆目的基因 把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可

以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。

应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。此法的最大优点是应用广泛，而且相当有效，适用于大规模筛选。只要有现成可用的核酸探针，我们就有可能从任何生物体的任何组织中分离目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源 DNA 序列，而不以这种序列能否在大肠杆菌细胞中表达为前提。

5.4.4.2.  应用 mRNA差别显示技术分离克隆目的基因

根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（ house-keeping gene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（ developmental regulated gene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（ differential expression）。

1992 年，美国波士顿 Dena-Farber癌症研究所的两位科学家 P. Liang和 A. D. Pardee 发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（ mRNA differential display）技术，简称 DDRT-PCR ，可以从一对不同基因型的细胞群体所产生的约 15,000种mRNA 中有效地鉴定并分离出差别表达的基因。

DDRT-PCR 的主要操作步骤如下： （ 1 ）从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA ，并以 3' 锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA； （ 2 ）用 5' 随机引物和某个 3' 端锚定引物对扩增第一链 (掺入 32P-dNTP)；

（ 3）用 DNA 变性测序胶分离扩增产物， X光片曝光后检测差别条带；（ 4）回收特异性差别条带；（ 5）用同一引物对扩增已回收的 DNA条带；（ 6）用Northern， Southern 及测序法分析所得的条带；（ 7）以该 DNA片段做探针，筛选全长 cDNA 或核基因。

5.4.4.3. 应用 cDNA差示分析法克隆基因

RDA 法充分发挥了 PCR 以指数形式扩增双链 DNA 模板的特性，通过降低 cDNA群体复杂性和更换 cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（ Tester）和供试探针（ Driver）在接受差示分析前均经一个 4碱基切割酶处理，形成平均长度 256bp 的代表群（ representation），保证绝大部分遗传信息能被扩增。 每次 T减 D 反应后仅设置 72℃ 复性与延伸， 94℃ 复性这两个参数共 20个 PCR循环， PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。

5.4.4.4. 应用酵母双杂交体系克隆基因

酵母双杂交体系也叫 interaction trap（相互作用陷井），是 90 年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质相互作用的基因。研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4的 N端 1-147aa是DNA 结合域（ BD），其 C端 768-881aa 是转录激活域（ AD）。一般情况下， AD 能与 GAL4效应基因启动子上游的特定 DNA 区段（ UAS）相结合， AD 则推动了转录起始。

AD

AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain

Promoter

RNA polymerse

A

B

C

若用基因工程的方法，将 GAL4 AD和 BD 分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活。但是，如果把某个已知的靶蛋白基因克隆到 GAL4 DNA 结合结构域基因片段的下游，同时把可能表达与靶蛋白相互作用因子的细胞群体中的全部 cDNA 克隆到 GAL4 转录激活结构域基因片段的上游，就有可能通过特定细胞群体中靶蛋白及其合作伙伴的相互关系把 GAL4 蛋白的 AD与 BD 结构域连成一个功能性转录因子，诱导报告基因表达。

主要实验过程如下：（ 1）选择缺失 GAL4编码基因的酵母寄主菌株— SFY526或 HF7c；（ 2）构建带有 GAL1 UAS-启动子 -lac Z（ His3）的转化载体；（ 3）把已知的靶蛋白质编码基因克隆到 pGBT9 的多克隆位点上，把所有 cDNA都克隆到 pGAD424 载体上，构成cDNA 表达文库。（ 4）从大肠杆菌中分别提取重组质粒 DNA ，转化感受态酿酒酵母菌株。（ 5）将共转化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和 His 的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。

5.4.4.5. 基因的图位克隆法

基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一种好方法，从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的 RFLP或 RAPD 分子标记。其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的 RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在 RFLP 作图中，连锁距离是根据重组率来计算的， 1cm（厘摩）相当于 1% 的重组率。

5.4.4.6. 用 DNA微列阵技术进行基因克隆

近年来，已有越来越多的实验室采用 DNA微列阵技术进行基因克隆。最简单的例子是用机械手把极微量（ nanoliters）的已经除去中等或高度重复序列的 DNA样品点到玻片或其它载体上，照射紫外光使之永久固定，用不同细胞周期发育阶段的 cDNA 作探针系统性地研究细胞中任何时期特异表达的基因。若把某一生物体内全部已知基因分别点到 DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA 与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性。基因芯片还可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的 cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活。

cDNA clones(probes)

PCR product amplificationpurification

printing

microarray Hybridise target to microarray

mRNA target)

excitation

laser 1laser 2

emission

scanning

analysis

overlay images and normalise

0.1nl/spot