Аллостерические ферменты

Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях

5. Аллостерические ферменты. 5. Аллостерические ферменты.

Функциональные димеры, механизм их Функциональные димеры, механизм их функционированияфункционирования

Аллостерические ферментыАллостерические ферменты

Аллостерическиеэффекторы

ОтрицательныеАллостерические Аллостерические

ингибиторыингибиторы

Снижают активность фермента

ПоложительныеАллостерические Аллостерические

активаторыактиваторы

Повышают активность фермента

ГомотропнаяГомотропная регуляция – аллостерическая регуляция, когда субстрат

может выступать в качестве эффектора (эффектор и субстрат - одно и то же вещество).

Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)

Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза)Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза)

АКТ-аза – фермент биосинтеза пиримидинов, обеспечивает образование карбамоиласпартата – одного из промежуточных продуктов синтеза СТР.

6 каталитических субъединиц(34 кДа, 2 тримера)

Карбамоил-фосфат

L-аспартат карбамоиласпартат

6 регуляторных субъединиц(16 кДа, 3 димера)

Бактериальная АКТ-аза E. coli

Работа регуляторных субъединиц АКТ-азыРабота регуляторных субъединиц АКТ-азы

Протекание реакции во времени приводит к появлению СTP – конечного продукта цепи. По мере накопления СTP и его связывания с ферментом сродство к субстратам снижается и фермент включается в работу только при гораздо больших концентрациях субстрата. АТР конкурирует с СTP и может устранять его ингибирующее действие. Регуляция является обратимой и при изменении в клетке концентрации АТР или СTP скорость работы фермента изменяется. Таким образом АКТ-аза обеспечивает постоянное присутствие в клетке нужных количеств СТР.

Регуляторные субъединицыРегуляторные субъединицы

СTPСTPАллостерическийАллостерический

ингибиторингибитор

АТРАТРАллостерический Аллостерический

активаторактиватор

NH CH

SH

C

O

O + ClHg COOH-HCl Hg COOH

CH

S

р-ClHg-бензоатДве –SH группы остатков Cysна каждую регуляторную

субъединицу

Разделение каталитических и регуляторных субъединиц аспартат

карбамоил-трансферазы (АКТ-азы) на анионообменнике в градиенте

соли KCl. Первый пик (1) – каталитические субъединицы, второй

пик (2) – регуляторные субъединицы.

Номер фракцииНомер фракции

S-образная кривая зависимости скорости S-образная кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстратареакции от концентрации субстрата

Арчибальд ХиллАрчибальд Хилл1886-19771886-1977

Английский физиологАнглийский физиологНобелевская премия по физиологии и медицине

1922 г.

График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в виде S-образной кривой на примере АКТ-азы: без эффектора, с АТР, с СTP. Субстрат – аспартат.

Впервые S-образные функции для насыщения были получены в 1909 году (А. Хилл)

Кооперативное связываниеКооперативное связывание

Аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и к изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента.

Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая кооперативность связывания лиганда ферментомкооперативность связывания лиганда ферментом

hh0,5

h

[L][L]

[L]Y

h0

h0,5

h0

max ][S[S]

][SVv

Y – степень насыщения, [L] – равновесная концентрация лиганда и [L]0,5 – равновесная концентрация лиганда, при которой Y=0,5 от максимального насыщения.

Vmax – максимальная скорость при S0→∞, [S]0,5 – концентрация субстрата при половине максимальной скорости, которая входит в уравнение вместо константы Михаэлиса KМ.

Графическое определение Графическое определение коэффициента Хиллакоэффициента Хилла

lg(v/( Vmax-v)) = h lg[S0] – h lg[S]0,5

• Для изостерических ферментов, у которых кооперативного взаимодействия между активными центрами нет, то есть сродство фермента к субстрату не зависит от уже присоединенных молекул субстрата, h=1h=1.

• Положительная кооперативность (hh>1>1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы субстрата к активному центру фермента увеличивает сродство к субстрату остальных активных центров.S-образные кривые зависимости скорости реакции от концентрации субстрата характерны для положительной кооперативности. Связывание кислорода с гемоглобином, имеющим 4 центра связи, характеризуется параметром Хилла h=2,9.

• Отрицательная кооперативность (hh<1<1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы лиганда к активному центру фермента уменьшает сродство к лиганду остальных активных центров.

Конформационные состояния и возможные переходы между Конформационные состояния и возможные переходы между ними при аллостерических взаимодействиях протомеров ними при аллостерических взаимодействиях протомеров

тетрамерного белкатетрамерного белка

Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния, верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния, для которых переход из одного в другое индуцируется лигандомдля которых переход из одного в другое индуцируется лигандом

АКТ-аза:АКТ-аза: субстрат и эффекторы влияют на равновесие между Т- и R-формами и тем самым на сигмоидность кривой. С возрастанием концентрации аспартата равновесие смещается к R-форме. АТР стабилизирует R-состояние путем связывания с регуляторной субъединицей. Напротив, присоединение СTP содействует переходу в Т-состояние.

Белковый олигомер может находиться в одном из двух состояний:

Т-состоянии (от англ. tense – напряженное) и R-состоянии (от англ. relaxed – расслабленное).

Функциональные димерыФункциональные димеры

Примеры структур функциональных димеровПримеры структур функциональных димеров

α2 α4 α2β2α2 α4 α2β2

Ассоциация мономеров позволяет уменьшить объем гидрофобной поверхности белка, и это более экономично провести через ассоциацию мономеров, чем путем увеличения молекулярного веса белка в пересчете на активный центр.

Это позволяет организовать в олигомер субъединицы различной химической природы, на которых в случае регуляторных ферментов можно расположить аллостерически активные центры и регуляторные участки, и тем самым разделить их в пространстве.

Жак Люсьен МоноЖак Люсьен Моно1910, Париж – 1976, Канн1910, Париж – 1976, Каннфранцузский биохимикфранцузский биохимик

и микробиологи микробиологНобелевская премия по физиологии и медицине

1965 г.

Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской кинетике и проявляет свойство отрицательной кинетике и проявляет свойство отрицательной кооперативности при связывании субстратовкооперативности при связывании субстратов

Возможные причины ухудшения связывания второго Возможные причины ухудшения связывания второго субстрата для фермента, состоящего из двух субстрата для фермента, состоящего из двух субъединиц:субъединиц:

1.1. Активные центры, расположенные на субъединицах, Активные центры, расположенные на субъединицах, изначально неравноценны.изначально неравноценны.

2.2. Центры изначально равноценны, но их Центры изначально равноценны, но их неэквивалентность возникает в результате неэквивалентность возникает в результате гетерологической укладки субъединиц.гетерологической укладки субъединиц.

3.3. Один из центров экранирован, сродство фермента ко Один из центров экранирован, сродство фермента ко второму субстрату снижается по стерическим второму субстрату снижается по стерическим причинам. причинам.

4.4. Изменение структуры второго центра, приводящее к Изменение структуры второго центра, приводящее к уменьшению сродства фермента к субстрату в уменьшению сродства фермента к субстрату в результате конформационных взаимодействий результате конформационных взаимодействий субъединиц.субъединиц.

Механизм реакционной способности половины Механизм реакционной способности половины активных центров (активных центров (halfhalf--ofof--thethe--sites reactivitysites reactivity))

Отрицательная кооперативность для ферментов, подчиняющихся Михаэлисовской кинетике, может проявляться не только при связывании субстратов, но и в процессе формирования продуктов реакции.

При механизме реакционной способности половины активных центров

только один активный центр функционирует в единицу времени

и продукт формируется на 1 центре фермента.

Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза EE..colicoli

•Димер с молекулярным весом 94 кДа. •Гидролаза, дефосфорилирующая многие типы молекул, например, нуклеотидов, белков и алкалоидов. •Проявляет наибольшую активность в щелочной среде. •На каждой субъединице имеет три центра связывания двухвалентных металлов Zn2+, а также Mg2+, Co2+, Cd2+ и др., из которых два являются прочно связывающими.

E + ROPO32- E~O-PO3

2- + ROH E + HPO42-


Фосфорилирование гидроксильной группы остатка серина происходит как при действии субстрата, так и продукта реакции. Нековалентное связывание ортофосфата с Zn2+ идет по двум сайтам фосфатазы. Соответствующие константы диссоциации отличаются на порядок, что обусловлено выраженной отрицательной кооперативностью связыванияотрицательной кооперативностью связывания.

Имеет ли место отрицательная кооперативность при отрицательная кооперативность при

образовании ковалентных производныхобразовании ковалентных производных???


Отрицательная кооперативность была обнаружена в кислых рН, когда ковалентные производные устойчивы. При фосфорилировании второго центра концентрацию [32Р]-ортофосфата повышали:– при рН 4,2 в 20-40 раз, – при рН 5 на три порядка.

Фосфорилирование активных центров Фосфорилирование активных центров ZnZn2+2+ препаратов фосфатазыпрепаратов фосфатазы

При щелочном рН, которое оптимально для катализа,обнаруживается фосфорилирование фермента строго по одному центру.


*Е и **Е указывают на внутри и межсубъединичные взаимодействия соответственно. *E-S – нековалентное присоединение субстрата, Е-Р или * Е-Р – ковалентное фосфорилирование. Межсубъединичные взаимодействия необходимы как для фосфорилирования (*Е), так и для дефосфорилирования (**Е).

Внутрисубъединичная кооперативность обуславливает фосфорилирование,

а межсубъединичная – дефосфорилирование.


Реакция может быть представлена в виде следующей схемы (графа):

Для этой схемы:

S

K1

V

M

max

42

1

1-4

3

33-2

M kk

kkkk

)k(kkK

V =V =

042

42max E

kk

kkV

• В случае функционального димера на 1 моль фермента может приходиться 2 или 1,5 моль субстрата. Когда вторая молекула субстрата связывается с ферментом с меньшим сродством, можно наблюдать связывание менее двух молей субстрата на моль фермента. То есть функциональными являются оба активных центра, но функциональная активность второго во время функционирования первого подавляется.

• При связывании двух субстратов, как правило, Kd(2) (10-7 М) >> Kd(1) (10-9 М): для первого субстрата Kd(1)=[E][S]/[ES], для второго субстрата Kd(2)=[E][ЕS]/[ES2].

Функциональная димерность фермента нужна в основном Функциональная димерность фермента нужна в основном для повышения числа оборотов ферментативной реакции, для повышения числа оборотов ферментативной реакции, то есть для повышения каталитической активности то есть для повышения каталитической активности фермента.фермента.

Documents

Аллостерические ферменты