11

第二节第二节 分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 分子杂交分子杂交 ,, 标记的探针标记的探针 DNADNA 变性后与变性后变性后与变性后

的靶的靶 DNA/RNADNA/RNA 通过碱基互补配对结合，形通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程成杂种分子的过程

。。 分子杂交包括分子杂交包括：： DNA-DNADNA-DNA 杂交，杂交， DNA-RNADNA-RNA

杂交及蛋白杂交等。杂交及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复

杂的靶杂的靶 DNADNA 中同源的中同源的 DNADNA 片段。片段。

22

双链双链 probeprobe 或或 DNADNA 解链，主要取决于：解链，主要取决于：

11 ．．链的长度链的长度：链越长，需要的 能量多才能：链越长，需要的 能量多才能解链；解链；

22 ．．碱基成分碱基成分：： GCGC 含量高，较难变性；含量高，较难变性； 33 ．．化学环境化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰：单价阳离子稳定双链，甲酰

胺，尿素破坏双链胺，尿素破坏双链

33

一、杂交探针的获得一、杂交探针的获得

是指一段目的基因或是指一段目的基因或 DNA/RNADNA/RNA 片段特异杂片段特异杂交的核苷酸序列。交的核苷酸序列。

ProbeProbe 可以是整个基因，或是基因的一部分，可以是整个基因，或是基因的一部分，是是 DNADNA ，也可以是，也可以是 RNARNA 。。

44

（一）制备特异性探针所需要的基（一）制备特异性探针所需要的基本条件本条件

1.1. 被检基因结构清楚；被检基因结构清楚； 2.2. 有明确的基因产物有明确的基因产物 ;; 3.3. 已知某一基因产物对表型的反应或缺少某已知某一基因产物对表型的反应或缺少某

一基因对表型的反应。一基因对表型的反应。 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探具备以上条件之一就可以制备特异性基因探

针。针。

55

（二）特异探针的来源（二）特异探针的来源 11 、基因组、基因组

探针：探针： 从已建立的从已建立的

基因组文库基因组文库中筛选和分中筛选和分离所需的目离所需的目的基因。的基因。

克隆 克隆 扩增 扩增 大量的大量的 DNADNA 探针探针

66

DNADNA克隆克隆

77

22 、、 cDNA cDNA probe :probe : 从从

已构建的已构建的 cDcDNANA 文库中文库中筛查和分离筛查和分离目的基因探目的基因探

针。针。

88

33 、寡核苷酸探针、寡核苷酸探针

克隆（ clone ） : 是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。

根据已知基因序列，人工合成一段互补的 DNA 片段。一般长约 15 ～ 50 个 bp 。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。

99

二、探针的标记二、探针的标记 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 常用于标记探针的标识物：常用于标记探针的标识物： 同位素同位素：： 3232PP ,, 35 35SS ,, 3 3H-dNTPH-dNTP 等；等； 非同位素非同位素：地高辛：地高辛 -dNTP -dNTP ，生物素，生物素 -dNT-dNT

PP 。。 常用的标记方法常用的标记方法：：

1010

11 、缺口平移法 （、缺口平移法 （ Nick TranslatioNick Translationn ））

原理及过程：原理及过程： 反应体系中反应体系中 DNADNA 酶酶 II 随机在探针随机在探针 DNADNA 上打开缺上打开缺

口，然后利用口，然后利用 DNADNA 聚合酶聚合酶 I 5’ → 3’I 5’ → 3’ 外切酶活外切酶活性，在缺口处按性，在缺口处按 5’→ 3’5’→ 3’ 方向切除单核苷酸；方向切除单核苷酸；同时同时 DNADNA 聚合酶聚合酶 II 有有 5’ → 3’5’ → 3’ 的聚合酶活性，的聚合酶活性，在缺口处在缺口处 3’3’ 端加入底物中的单核苷酸，弥补缺端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。单核苷酸，并被随机掺入。 DNADNA 聚合酶聚合酶 II 的两种的两种作用交替进行，探针即被标记。 作用交替进行，探针即被标记。

1111

Nick TranslationNick Translation

OH p

OH+ P

P

DNA

dNTP ， DNA 酶 I ，DNA 聚合酶 I

32P-dNTP

Bio-dNTP

1212

22 、随机引物法（、随机引物法（ 66核苷酸引物标记核苷酸引物标记法）法）

原理及过程：原理及过程：利用利用 E.coli E.coli DNADNA 聚合酶聚合酶 II 的的 KlKlenowenow 亚单位亚单位，合成含有标记核苷酸的，合成含有标记核苷酸的 DNADNA链。链。 KlenowKlenow具有具有 5’→ 3’5’→ 3’ 聚合酶活性。聚合酶活性。

被标记的被标记的 DNADNA （探针）变性成单链，引物与（探针）变性成单链，引物与模板结合。在模板结合。在 KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物3’3’ 端为起点，沿模板端为起点，沿模板 3’ → 5’3’ → 5’ 方向合成方向合成DNADNA 新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的 dNTP,dNTP,随机掺入新合成的随机掺入新合成的 DNADNA 链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。

1313

随机引物标记探针随机引物标记探针

5`3`

5` 5` 3`

DNA

32p-dNTP,Bio-Dntp

6bp primer

Klenow,dNTP

变性 - 复姓

1414

一、一、 DNADNA 杂交常用的方法杂交常用的方法 （一）（一） .Southern blot.Southern blot 19751975年，英国科学家年，英国科学家 SouthernSouthern首创，是指首创，是指 DNA-DNADNA-DNA 杂交，是经典杂交，是经典

的基因分析方法。的基因分析方法。

11 、原理和步骤、原理和步骤 : : 提取提取 T T 、、 Cell DNACell DNA 限制酶消化 限制酶消化 DNADNA 片段片段 电泳分离电泳分离 变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜 变性、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析

1515

Southern BlotSouthern Blot

1616

22 、应 用、应 用 ::

(1)(1) 基因组结构分析：基因组结构分析： 如缺失、插入、倒位等的检测如缺失、插入、倒位等的检测 (2)RFLP(2)RFLP连锁分析连锁分析

1717

((二二 ).).斑点杂交斑点杂交(dot and slot hybridization)(dot and slot hybridization)

鉴定核酸序列的简便方法。鉴定核酸序列的简便方法。11 、原理及步骤、原理及步骤：：提取提取 TT 、、 Cell DNACell DNA ↓ ↓ 点样品至膜、干燥、固定点样品至膜、干燥、固定 ↓ ↓ 探针、探针、 DNADNA 变性、杂交变性、杂交 ↓ ↓ 洗膜、放射自显影洗膜、放射自显影 ↓ ↓ 结果分析 结果分析   

1818

DNADNA 样品样品

  22 、应用：、应用：11 ）混合样品）混合样品 DNADNA 鉴鉴定定22 ）基因缺失检测）基因缺失检测33 ）基因表达分析）基因表达分析

点样

Probe-32P

检测

A

B

1 2 3 4

1919

（（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASOASO ））

该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成以合成 ASOASO探针。探针通常为探针。探针通常为 20bp20bp左右，标记后用于左右，标记后用于杂交检测。杂交检测。

检测点突变时一般需合成两种探针：检测点突变时一般需合成两种探针： 设计：正常探针 设计：正常探针 5’-AGT-3’ 5’-AGT-3’ 与正常基因序列杂交 与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交；稳定而不与突变基因杂交； 突变探针 突变探针 5’-AAT-3’ 5’-AAT-3’ 与突变基因序列杂交 与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交；稳定而不与正常基因杂交； PCRPCR 技术可结合技术可结合 ASOASO，即，即 PCR-ASOPCR-ASO技术，以技术，以 ASOASO探探

针检测扩增后的产物——突变基因检测。针检测扩增后的产物——突变基因检测。

2020

例例 :PKU:PKU 产前诊断产前诊断

正常探针

突变探针

1 2

Ⅰ

Ⅱ1 2

Ⅱ2进行产前基因诊断

结果分析Ⅱ 2为正常个体

2121

四、四、 Northern blotNorthern blot 是指是指 DNA-RNADNA-RNA 分子杂交，应用特异性基 分子杂交，应用特异性基 因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。11 、原理及步骤：、原理及步骤：提取 提取 TT 、、 Cell Cell 总 总 RNARNA ↓ ↓ 提纯分离提纯分离 mRNAmRNA ↓ ↓ 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离 RNARNA ↓ ↓ 转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜 ↓ ↓ 杂交检测杂交检测

2222

Norther BlotNorther Blot

2323

22 、应 用：、应 用：

（（ 11 ）） .. 检测检测 mRNAmRNA 长度分子量大小（依电长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；泳迁移率估计）；

（（ 22 ）） .mRNA.mRNA 的含量，即基因表达高低。的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析） （密度扫描仪，定量分析）

2424

五、五、 Western blotWestern blot

是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。。 原理及步骤原理及步骤：： T or cellT or cell ↓ ↓ 提取蛋白提取蛋白

聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白 （（ SDS-PAGE SDS-PAGE ））↓↓ 转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜 ↓ ↓ 加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质

2525

West Blot West Blot