1

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

«Ο ρόλος της πρωτεΐνης TRAF5 στη µεταγωγή σήµατος από την ογκογονική πρωτεΐνη LMP1 του ιού

Epstein Barr»

Μερόπη Καρακιουλάκη

Επιβλέπων: Γεώργιος Μόσιαλος

Καθηγητής Μοριακής Βιολογίας-Βιοχηµείας-Βιοτεχνολογίας

Θεσσαλονίκη, Ιούλιος 2016

2

ΑRISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY

DEPARTMENT OF GENETICS, DEVELOPMENTAL AND MOLECULAR BIOLOGY

DIPLOMA THESIS

“The role of TRAF5 protein in signal transduction by the Epstein Barr virus oncoprotein LMP1”

Meropi Karakioulaki

Supervisor: Professor George Mosialos

Thessaloniki, July 2016

3

Περιεχόµενα 1. Περίληψη.......................................................................................................5

2. Abstract.........................................................................................................6

3. Εισαγωγή.......................................................................................................7

3.1. Οι γ-ερπητοϊοί............................................................................................7

3.2. Ο ιός Epstein Barr.....................................................................................83.3. Λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (Lymphoblastoid Cell Lines- LCLs)12

3.4. H πρωτεΐνη LMP1: δοµή και µεταγωγή σήµατος...................................13

3.5. Το µονοπάτι του NF-κB και η αυξορρύθµισή του από την LMP1...........18

3.6. H οικογένεια των πρωτεϊνών TRAF........................................................21

3.7. Η πρωτεΐνη TRAF5 και η σχέση της µε την LMP1.................................23

3.8. Σκοπός της παρούσας εργασίας...............................................................24

4. Υλικά και Μέθοδοι......................................................................................244.1. Δηµιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών από σειρές ΗΕΚ293FT που εκφράζουν την LMP1..........................................................................................25

4.1.1. Πλασµιδιακός φορέας έκφρασης.........................................................254.1.2. Μετασχηµατισµός βακτηρίων, καλλιέργειες και αποµόνωση πλασµιδιακού DNA.............................................................................................25

4.1.2.1. Μετασχηµατισµός βακτηρίων..........................................................25

4.1.2.2. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA σε µεγάλη κλίµακα.......................26

4.1.2.3. Ποσοτικοποίηση του πλασµιδιακού DNA........................................27

4.1.3. Καλλιέργεια κυτταρικών σειρών HEK293FT......................................27

4.1.4. Επιµόλυνση µε τους πλασµιδιακούς φορείς.........................................29

4.1.5. Ανίχνευση κλώνων που εκφράζουν την LMP1 µε στύπωµα Western..30

4.1.5.1. Προετοιµασία δειγµάτων.................................................................30

4.1.5.2. Παρασκευή πηκτής πολυακρυλαµιδίου...........................................31

4.1.5.3. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση.............................................................32

4.1.5.4. Ηλεκτροµεταφορά............................................................................33

4.1.5.5. Blocking............................................................................................33

4.1.5.6. Ανοσοανίχνευση................................................................................33

4.2. Kρυοσυντήρηση δειγµάτων.....................................................................35

4.3. Καταστολή της έκφρασης της TRAF5 µε siRNA....................................36

4.3.1. RNA interference και siRNAs..............................................................36

4

4.3.2. Επιµόλυνση κλώνων µε siRNA............................................................37

4.4. Μέτρηση βιωσιµότητας µετά την καταστολή της έκφρασης της TRAF538

4.4.1. ΜΤΤ.....................................................................................................394.5. Επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 και επιβεβαίωση της έκφρασης της LMP1 από τον κλώνο 67 NS 15 µε στύπωµα Western...........394.6. Επιβεβαίωση της καταστολή της έκφρασης της TRAF5 µε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (RT-PCR)..................................41

4.6.1. Αποµόνωση RNA και σύνθεση cDNA..................................................44

4.6.2. RT-PCR...............................................................................................46

5. Αποτελέσµατα..............................................................................................48

5.1.1. Ανίχνευση κλώνων που εκφράζουν την LMP1 µε στύπωµα Western..48

5.1.2. Πρότυπες καµπύλες oπτικής απορρόφησης της µεθόδου ΜΤΤ...........48

5.1.3. Μέτρηση βιωσιµότητας µε τη µέθοδο ΜΤΤ........................................505.1.4. Επιβεβαίωση της έκφρασης της LMP1 από τον κλώνο 67 και επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 µε στύπωµα Western 52

5.1.5. Επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 µε RT-PCR53

6. Συζήτηση.....................................................................................................54

7. Ευχαριστίες.................................................................................................57

8. Παράρτηµα..................................................................................................58

9. Βιβλιογραφία...............................................................................................60

5

1. Περίληψη Ο ιός Epstein-Barr (EBV) είναι ένας διαδεδοµένος ανθρώπινος γ-ερπητοϊός που έχει

την ικανότητα να µολύνει επιθηλιακά κύτταρα και Β-λεµφοκύτταρα, ακολουθώντας

είτε µια λυτική, είτε µία λυσιγονική πορεία µόλυνσης. Η λυτική µόλυνση, όταν

συµβαίνει µετά την παιδική ηλικία, σχετίζεται µε την εµφάνιση του κλινικού

συνδρόµου λοιµώδους µονοπυρήνωσης. Η λυσιγονική µόλυνση σχετίζεται µε την

ανάπτυξη διαφόρων τύπων επιθηλιακών και λεµφικών νεοπλασιών.

Η πρωτεΐνη LMP1 είναι η κύρια ογκογόνος πρωτεΐνη του EBV και είναι απαραίτητη

για τον µετασχηµατισµό και την αθανατοποίηση των Β-λεµφοκυττάρων από τον ιό. Η

LMP1 αλληλεπιδρώντας µέσω του καρβοξυτελικού της άκρου µε διάφορους

κυτταροπλασµατικούς παραγόντες, έχει την ικανότητα να µιµείται ένα συνεχώς

ενεργό CD40 υποδοχέα και, έτσι, να επάγει τον µετασχηµατισµό και τον ανεξέλεγκτο

πολλαπλασιαµό των Β-λεµφοκυττάρων, κυρίως ενεργοποιώντας τα µονοπάτια των

µεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας NF-κΒ.

Ανάµεσα στους κυτταροπλασµατικούς παράγοντες που έχουν εµπλακεί στη

σηµατοδότηση από την LMP1 ανήκει και η οικογένεια των πρωτεϊνών TRAF. Η

λιγότερο µελετηµένη από αυτές, η πρωτεϊνη TRAF5, φαίνεται να είναι απαραίτητη

για τη βιωσιµότητα των Β-λεµφοκυττάρων που έχουν µολυνθεί από τον EBV. Στην

παρούσα εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος της TRAF5 στη βιωσιµότητα επιθηλιακών

κυττάρων που εκφράζουν και εξαρτώνται από την LMP1. Τα αποτελέσµατα έδειξαν

πως η καταστολή της έκφρασης της TRAF5 µειώνει σηµαντικά τη βιωσιµότητα

αυτών των επιθηλιακών κυττάρων, κάτι που καθιστά την TRAF5 έναν πιθανό στόχο

για την ανάπτυξη µεθόδων αντιµετώπισης επιθηλιακών νεοπλασιών που σχετίζονται

µε τον EBV.

6

2. Abstract The Epstein-Barr virus (EBV) is a widespread human γ- herpes virus, which is

capable of infecting epithelial cells as well as B-lymphocytes following either a lytic

or a latent type of infection. The lytic infection during adolescence is associated with

the clinical syndrome called infectious mononucleosis. The latent infection is

associated with the development of various epithelial and lymphoid malignancies.

The LMP1 protein is the major oncogenic protein of EBV and it is necessary for the

transformation and immortalization of B-lymphocytes by the virus. Via its carboxyl

terminal end the LMP1 protein interacts with various cytoplasmic factors and has the

ability to mimic a constantly activated CD40 receptor and thus induce the

transformation and uncontrolled proliferation of B-lymphocytes, mainly by activating

the NF-κΒ transcription factor family.

Among the cytoplasmic factors that are implicated in the LMP1 signal transduction

are the TRAF protein family members. The least investigated among them is TRAF5,

which seems to be essential for the viability of B-lymphocytes that have been infected

by the EBV. In the present study we investigated the role of TRAF5 in the viability of

epithelial cells that express LMP1 and depend on LMP1 for their survival. The results

suggested that the repression of TRAF5 expression reduces the viability of these

epithelial cells. This indicates that TRAF5 might be a potential target for the

development of new therapeutic approaches against EBV-associated epithelial

malignancies.

7

3. Εισαγωγή

3.1. Οι γ-ερπητοϊοί Οι γ-ερπητοϊοί είναι µια οικογένεια ερπητοϊών που διακρίνονται για τον τροπισµό

τους προς τα λεµφοκύτταρα. Ένα χαρακτηριστικό των γ-ερπητοϊών είναι η ικανότητά

τους να επάγουν υπερπλασίες των λεµφοκυττάρων και να προκαλούν διάφορες

µορφές καρκίνων. To DNA τους είναι δίκλωνο και γραµµικό 1.

Κατά τη λυτική µόλυνση των γ-ερπητοϊών, ιϊκοί trans ενεργοποιητές ενεργοποιούν τη

µεταγραφή του ιϊκού γονιδιώµατος που έχει εισέλθει στον πυρήνα. Έτσι,

διαφορετικές κλάσεις ιϊκών γονιδίων (άµεσα-πρώιµα, πρώιµα, όψιµα) µεταγράφονται

οδηγώντας στην παραγωγή µολυσµατικών παραγόντων. Οι µολυσµατικοί αυτοί

παράγοντες δηµιουργούνται όταν το γονιδίωµα των γ-ερπητοϊών πακετάρεται σαν

ένα γραµµικό µόριο σε ένα πρωτεϊνικό καψίδιο, το οποίο περιβάλλεται από έναν

λιπιδιακό φάκελο και εξέρχεται από το κύτταρο1.

Η λυτική µόλυνση παρουσιάζει πολλές οµοιότητες µεταξύ των διαφορετικών γ-

ερπητοϊών και τα γονίδια που εµπλέκονται στην παραγωγή του ιϊκού καψιδίου είναι

πολύ συντηρηµένα µεταξύ των διαφόρων υποοικογενειών. Οι γ-ερπητοϊοί διαφέρουν

µεταξύ τους δραµατικά στο λυσιγονικό κύκλο ζωής τους. Μάλιστα ο λυσιγονικός

κύκλος των γ-ερπητοϊών EBV (Epstein Barr Virus) και KSHV (Kaposi’s Sarcoma-

associated Herpesvirus) µπορεί να εγκαθιδρυθεί in vitro, κάτι που καθιστά τους ιούς

αυτούς σηµαντικά πειραµατικά εργαλεία 1.

Κατά τον λυσιγονικό κύκλο, ο ιός µολύνει το κύτταρο και το καψίδιό του

µεταφέρεται στον πυρήνα, όπου απελευθερώνεται το γραµµικό ακόµα γονιδίωµά του.

Εκεί, το γραµµικό γονιδίωµα κυκλοποιείται και πολλαπλασιάζεται σαν επίσωµα

χρησιµοποιώντας τις µοριακές µηχανές του κυττάρου, ενώ αντίθετα κατά τον λυτικό

κύκλο, το γονιδίωµα του ιού παραµένει γραµµικό. Η αντιγραφή του ιϊκού DNA κατά

τη λανθάνουσα µόλυνση πραγµατοποιείται από τις κυτταρικές πολυµεράσες,

παράλληλα µε την αντιγραφή των κυτταρικών χρωµοσωµάτων, ενώ κατά τη λυτική

µόλυνση το γονιδίωµα του ιού αντιγράφεται από την ιϊκή πολυµεράση1.

8

3.2. Ο ιός Epstein Barr

O ιός Epstein Barr (EBV- Epstein Barr Virus) ήταν ο πρώτος ανθρώπινος ογκογόνος

ιός που ανακαλύφθηκε. H ανακάλυψή του έγινε το 1964 από τους Anthony Epstein,

Yvonne Barr και Burt Achong, όταν διέκριναν µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο ιϊκά

σωµατίδια σε µια κυτταρική σειρά που είχε προέλθει από βιοψία λεµφώµατος

Burkitt2. Ο EBV είναι ένας γ-ερπητοϊός που έχει την ικανότητα να αθανατοποιεί Β-

λεµφοκύτταρα σε καλλιέργειες 3. Οι µακροχρόνια πολλαπλασιαζόµενες (ή αλλιώς

αθανατοποιηµένες) κυτταρικές σειρές που προκύπτουν ονοµάζονται

λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs- lymphoblastoid cell lines). Αυτές οι

σειρές περιέχουν επισώµατα του EBV και εκφράζουν έναν περιορισµένο αριθµό

γονιδίων του 1. Αν και οι ερπητοϊοί είναι ευρέως διαδεδοµένοι στη φύση, ο άνθρωπος

αποτελεί το µοναδικό ξενιστή για τον EBV 4.

Το ιοσωµάτιο του EBV αποτελείται από ένα δίκλωνο γραµµικό µόριο DNA µέσα σε

ένα εικοσάεδρο καψίδιο (capsid) που περιβάλλεται ένα λιπιδιακό φάκελο (envelope).

Το δίκλωνο DNA τυλίγεται γύρω από µία κεντρική πυρηνική πρωτεΐνη

(nucleoprotein). Ο λιπιδιακός φάκελος αποτελείται από διάφορες γλυκοπρωτεϊνες, οι

οποίες παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στην είσοδο του ιού στο κύτταρο. Μεταξύ του

καψιδίου και του λιπιδιακού φακέλου βρίσκεται µια πρωτεϊνική εφυµενίδα

(tegument). Τα κύτταρα ξενιστές απελευθερώνουν το ιοσωµάτιο του ιού µόνο κατά

τη λυτική µόλυνση1,5–8 [Εικόνα 1].

Εικόνα 1: Η δοµή του EBV.

[πηγή:http://web.stanford.edu/group/virus/herpes/2000/herpes2000.html ]

Οι δύο κύριοι στόχοι του EBV είναι τα Β-λεµφοκύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα.

Η µόλυνση µε τον EBV συνήθως πραγµατοποιείται νωρίς στην παιδική ηλικία, όντας

9

κυρίως ασυµπτωµατική. Μολύνσεις κατά την εφηβεία οδηγούν περίπου τις µισές

φορές σε λοιµώδη µονοπυρήνωση 9.

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα του ιού που τον καθιστά επιτυχηµένο µολυσµατικό

παράγοντα για τον άνθρωπο είναι η ικανότητά του να ξεφεύγει από τους µηχανισµούς

ανοσίας του ξενιστή. Αυτό συµβαίνει διότι πολλές πρωτεΐνες του EBV συµµετέχουν

σε σηµατοδοτικά µονοπάτια που αποτρέπουν τον εντοπισµό των µορίων του ιού από

το ανοσοποιητικό σύστηµα 10.

Ο ιός µεταδίδεται µέσω του σιέλου και µέχρι την ενηλικίωση το 90% του πληθυσµού

έχει µολυνθεί µε EBV 1. Ο EBV είναι δυνατό να πολλαπλασιαστεί είτε µέσω της

λυτικής, είτε µέσω της λυσιγονικής οδού. Η λυτική οδός είναι απαραίτητη για την

οριζόντια µεταφορά του ιού µεταξύ ξενιστών, ή µεταξύ των κυττάρων 8,11. Ειδικά σε

περιπτώσεις ανοσοκαταστολής (όπως για παράδειγµα σε ασθενείς που πάσχουν από

AIDS) υπάρχει µεγάλη ποσότητα ελεύθερων ιοσωµατίων στο αίµα, κάτι που

υποδεικνύει µεγάλη λυτική δραστηριότητα 11. Ωστόσο, υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο

ιός βασίζεται κυρίως στη λυσιγονική του οδό, ίσως διότι αυτή του προσφέρει την

ικανότητα να ξεφεύγει από τους µηχανισµούς άµυνας του ξενιστή 10.

Κατά την πρωτογενή µόλυνση, ο ιός µολύνει επιθηλιακά κυρίως κύτταρα (όπως τα

επιθηλιακά κύτταρα του ρινοφάρυγγα), πολλαπλασιάζεται µέσω της λυτικής οδού και

εκκρίνεται ξανά στη σίελο, µε σκοπό να επεκταθεί. Κατά τη λυτική µόλυνση, το

γονιδίωµα του ιού µεταφέρεται στον πυρήνα και αντιγράφεται, κάτι που οδηγεί στην

παραγωγή νέων ιοσωµατίων, τα οποία εξέρχονται από το κύτταρο και µολύνουν

κάποιο άλλο. Το γεγονός αυτό ενεργοποιεί µια ανοσολογική απόκριση στον

οργανισµό-ξενιστή που οδηγεί στην εµφάνιση του κλινικού συνδρόµου της

λοιµώδους µονοπυρήνωσης.

Αφού δηµιουργηθούν πολλά αντίγραφά του ιού µέσα στο σίελο του ξενιστή,

καθίσταται δυνατή η µόλυνση των Β-λεµφοκυττάρων στα λεµφικά όργανα του

ρινοφάρυγγα. Εκεί, η γλυκοπρωτεϊνη gp350/220 (glycoprotein 350/220) του

λιπιδιακού φακέλου του ιού αναγνωρίζεται από τον επιφανειακό υποδοχέα CD21

(Cluster of differentiation 21) των Β-λεµφοκυττάρων 12, γεγονός που οδηγεί σε

ενεργοποίηση της κινάσης τυροσίνης Lck (Lymphocyte-specific protein tyrosine

10

kinase) και άµεση µεταφορά ιόντων ασβεστίου 13. Έπειτα στην επιφάνεια των Β-

λεµφοκυττάρων εκφράζεται η CD23 (Cluster of differentiation 23) και από αυτά

παράγεται η ιντερλευκίνη 6. Τέλος, απελευθερώνεται το γενετικό υλικό από το

καψίδιου του ιού και αυτό εισέρχεται στον πυρήνα των κυττάρων 14–16.

Όταν ο ιός εισέλθει στα Β-λεµφοκύτταρα συνήθως ενεργοποιείται ο λυσιγονικός του

κύκλος, κατά τον οποίο δεν παράγονται ιοσωµάτια. Ο κύκλος αυτός αποσκοπεί στο

να διατηρηθεί το ιϊκό φορτίο µέσα στον ξενιστή και τα µολυσµένα κύτταρα περιέχουν

αρκετά αντίγραφα του επισώµατος του EBV 6. Έτσι, όταν πολλαπλασιάζονται τα

µολυσµένα κύτταρα, πολλαπλασιάζεται και ο ιός µαζί µε αυτά.

Η λυσιγονική µόλυνση είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη υπερπλασιών, καθώς ο EBV

µολύνει κατά κύριο λόγο τα Β- λεµφοκύτταρα και εκφράζει µια σειρά γονιδίων,

γνωστά ως λυσιγονικά γονίδια (latent genes). Τα γονίδια αυτά συµβάλλουν στον

ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των Β- λεµφοκυττάρων 6,17. Η έκφρασή τους ποικίλει

ανάλογα µε τον τύπο της λυσιγονικής µόλυνσης και σχετίζεται µε τον τύπο καρκίνου

που προκαλεί ο ιός 18. Ωστόσο, έχει δειχθεί πως ακόµα και η λυτική µόλυνση µπορεί

να ενεργοποιήσει τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των µολυσµένων µε EBV Β-

λεµφοκυττάρων, διότι οδηγεί στην έκκριση ορισµένων παρακρινικών παραγόντων 11,19.

Το γονιδίωµα του EBV αποτελείται από ένα γραµµικό δίκλωνο DNA µεγέθους

περίπου 172 χιλιάδων ζευγών βάσεων, το οποίο κωδικοποιεί περισσότερα από 90

γονίδια 5. Το µεγάλο αυτό γονιδίωµα είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα όλων των

ερπητοϊών. Τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF- Open Reading Frames) γενικά

χωρίζονται σε ξεχωριστά λυτικά και λυσιγονικά τµήµατα. Στα άκρα του

γονιδιώµατός του, ο EBV διαθέτει τερµατικές άµεσες επαναλήψεις (TRs- terminal

direct repeats) µήκους 0.5 χιλίαδων βάσεων, ενώ κατά µήκος του DNA του

συναντώνται ενδιάµεσες επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες (IRs- internal repeat

sequences), οι οποίες χωρίζουν το γονιδίωµά του σε µικρές και µεγάλες περιοχές1

[Εικόνα 2]. Ο αριθµός των προαναφερθέντων επαναλήψεων µπορεί να αλλάζει κατά

τον λυτικό πολλαπλασιασµό του ιού, ωστόσο κατά τη λυσιγονική µόλυνση ο αριθµός

των επαναλήψεων παραµένει σταθερός στα κύτταρα- απογόνους 5,20. To γεγονός αυτό

µας επιτρέπει να συµπεράνουµε εάν τα µολυσµένα κύτταρα έχουν προέλθει από ένα ή

11

περισσότερα προγονικά κύτταρα. Τα περισσότερα γονίδια του EBV κωδικοποιούν

πρωτεΐνες, ωστόσο υπάρχουν ορισµένα λυσιγονικά γονίδια που παραµένουν

αµετάφραστα (EBERs: EBV encoded RNAs) και ορισµένα γονίδια που κωδικοποιούν

micro-RNAs7.

Εικόνα 2: Το γονιδίωµα του EBV. (a) Γενική οργάνωση του γραµµικού DNA του ιού. U1 είναι η

µικρή και U2 είναι η µεγάλη περιοχή του γονιδιώµατος. Αυτές διακόπτονται από 4 εσωτερικές

επαναλαµβανόµενες περιοχές (IR1-4). Οι TR είναι οι τελικές επαναλήψεις. Το σηµείο έναρξης

της αντιγραφής (Ori-P) του ενδοκυτταρικού κυκλικού επισώµατος (λυσιγονικός κύκλος)

συµβολίζεται µε ένα γκρι κύκλο, ενώ τα σηµεία έναρξης της αντιγραφής του λυτικού κύκλου

(Ori-lyt) συµβολίζονται µε µαύρους κύκλους.1

Oι περισσότερες µολύνσεις µε τον EBV είναι κυρίως ασυµπτωµατικές 21. Ωστόσο, ο

ιός έχει συσχετιστεί µε διαφόρων τύπων καρκίνους, όπως το λέµφωµα Burkitt, το

λέµφωµα Hodgkin, το ρινοφαρυγγικό και το γαστρικό καρκίνωµα 6,9. Πολυάριθµες

µελέτες προσπαθούν να κατανοήσουν πώς ακριβώς οι ιϊκές πρωτεΐνες µπορεί να

σχετίζονται µε τέτοιου είδους νεοπλασίες. Έχει δειχθεί για παράδειγµα, πως η

πρωτεΐνη LMP1 (EBV- encoded latent membrane protein 1) είναι απαραίτητη για την

µετασχηµατισµό των Β-λεµφοκυττάρων από τον ιό και τη µετατροπή τους σε

αθανατοποιηµένες λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs) 6,22. Παρόλο όµως

που το 90% του πληθυσµού έχει µολυνθεί µε τον EBV, τα ποσοστά των ανθρώπων

που εµφανίζουν αυτού του τύπου τις νεοπλασίες δεν είναι υψηλά (oι νεοπλασίες

εµφανίζονται κυρίως σε ανοσοκατεσταλµένα άτοµα, όπως σε άτοµα που πάσχουν

από AIDS, σε άτοµα που πάσχουν από άλλες µολύνσεις (όπως η ελονοσία) και

υποσιτισµό, ή σε ανοσοκατεσταλµένα άτοµα µετά από µεταµόσχευση 21). Αυτό

οφείλεται στη στρατηγική επιβίωσης του ιού. Χωρίς τον ξενιστή του, ο ιός δεν µπορεί

να επιβιώσει, οπότε η φυσική επιλογή τον αναγκάζει να µην προκαλεί µεγάλες

βλάβες στα άτοµα που µολύνει. Στους περισσότερους ξενιστές, µάλιστα, η µόλυνση

είναι ασυµπτωµατική, διότι ο ιός εκφράζει ελάχιστες πρωτεΐνες του, αποσκοπώντας

στο να αποφύγει τον εντοπισµό του από το ανοσοποιητικό σύστηµα 21.

12

Παρόλο που η µόλυνση µε τον EBV προκαλεί σχετικά ήπια συµπτώµατα,

προσπάθειες ανάπτυξης αντιϊκών φαρµάκων και θεραπειών έχουν αποτύχει. Είναι

γενικά δύσκολο να περιοριστεί η µετάδοση του ιού, καθώς χρόνιες µολύνσεις

επιτρέπουν σε φορείς, που δεν εµφανίζουν τα συµπτώµατα της µόλυνσης, να

µεταδίδουν τον ιό ακόµα και πολλά χρόνια µετά την αρχική µόλυνση9.

Λόγω της καρκινογενούς φύσης του EBV και της µειωµένης ικανότητας ανάπτυξης

αντιϊκών φαρµάκων για την καταπολέµησή του, κρίνεται απαραίτητη η περεταίρω

κατανόηση των µηχανισµών µε τους οποίους ο ιός πολλαπλασιάζεται και

µετασχηµατίζει τα κύτταρα του ξενιστή.

3.3. Λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (Lymphoblastoid Cell Lines-

LCLs)

Οι λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs) είναι αθανατοποιηµένες κυτταρικές

σειρές B- λεµφοκυττάρων που έχουν µολυνθεί µε τον ιό EBV in vitro. Κάθε LCL

διαθέτει πολλαπλά αντίγραφα των επισωµάτων του EBV [Εικόνα 3] και µπορεί να

εκφράζει 9 ιϊκές πρωτεΐνες, οι οποίες περιλαµβάνουν 6 πυρηνικά αντιγόνα (EBV

nuclear antigen- EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C, LP) και τρεις λυσιγονικές µεµβρανικές

πρωτεΐνες (LMP 1, 2A, 2B). Επιπλέον, οι LCLs εκφράζουν 2 µη κωδικές

αλληλουχίες RNA (EBER 1, 2), των οποίων η λειτουργία δεν είναι πλήρως

κατανοητή, αλλά πιθανότατα εκφράζονται σε όλες της µορφές λυσιγονικής µόλυνσης

και έχουν χρησιµεύσει ως εξαιρετικοί δείκτες ανίχνευσης του ΕΒV σε όγκους. Τέλος,

οι LCLs εκφράζουν 2 µετάγραφα της περιοχής BamHIA του ιϊκού γονιδιώµατος, που

ονοµάζονται BARFs (BamHIA reading frames) και δεν είναι σίγουρο εάν

κωδικοποιούν πρωτεϊνες 1.

13

Εικόνα 3: Το δίκλωνο επίσωµα του EBV, πάνω στο οποίο φαίνεται η θέση των λυσιγονικών

γονιδίων του ιού. Η θέση έναρξης αντιγραφής (OriP) συµβολίζεται µε πορτοκαλί χρώµα. Τα

σηµεία µεταγραφής των EBER συµβολίζονται µε µπλε βέλη. Τα εσωτερικά πράσινα βέλη

συµβολίζουν την κατεύθυνση της µεταγραφής των γονιδίων EBNA (1, 2, 3A, 3B, 3C, LP) και

LMP (1, 2A, 2B). Το εξωτερικό πράσινο βέλος συµβολίζει την κατεύθυνση της µεταγραφής των

γονιδίων EBNA που ρυθµίζονται από έναν από τους προαγωγείς Cp ή Wp και το κόκκινο βέλος

την κατεύθυνση της µεταγραφής των γονιδίων EBNA που ρυθµίζονται από τον προαγωγέα Qp.

Στην εικόνα φαίνεται επίσης και η περιοχή BamHI, από την οποία προέρχονται ορισµένα

µετάγραφα (ΒΑRF 0, 1) 6.

3.4. H πρωτεΐνη LMP1: δοµή και µεταγωγή σήµατος

H LMP1 (EBV- encoded latent membrane protein 1), µια µεµβρανική πρωτεϊνη που

αποτελείται από 386 αµινοξέα και έχει µοριακό βάρος 62 kD, είναι η κύρια

µετασχηµατιστική πρωτεΐνη του EBV που συµπεριφέρεται σαν ένα κλασσικό

ογκογονίδιο και είναι απαραίτητη για το µετασχηµατισµό τον B-λεµφοκυττάρων από

τον EBV in vitro 1,5. Η καρκινογόνος δράση της LMP1 περιγράφηκε αρχικά από τους

Wang, Liebowitz και Kieff, οι οποίοι παρατήρησαν πως Rat-1 κυτταρικές σειρές που

εκφράζουν την LMP1 εµφανίζουν αυξηµένο ρυθµό ανάπτυξης, καθώς και υψηλή

ανθεκτικότητα σε αναστολείς ανάπτυξης 22. Επιπλέον, οι ερευνητές έδειξαν πως η

ένεση σε ποντίκια των κυτταρικών σειρών Rat-1 που εκφράζουν την LMP1 οδήγησε

στη δηµιουργία όγκων 22 [Φωτογραφία 1].

14

Φωτογραφία 1: Ένεση των RAT-1 κυτταρικών σειρών που εκφράζουν την LMP1 σε ποντίκι.

Παρατηρείται ο σχηµατισµός όγκων στα σηµεία της ένεσης. Αυτό αποδεικνύει ότι η LMP1 είναι

ένας σηµαντικός παράγοντας που συµµετέχει στο σχηµατισµό όγκων από τον EBV 22.

Σε µια άλλη µελέτη οι Kaye et al. παρατήρησαν πως µολυσµένα Β- λεµφοκύτταρα µε

ένα µεταλλαγµένο στη θέση του γονιδίου της LMP1 επίσωµα του EBV δεν

µετασχηµατίστηκαν, ούτε παρουσίασαν υψηλούς ρυθµούς ανάπτυξης. Ο

µετασχηµατισµός και ο συνεχής πολλαπλασιαµός των Β- λεµφοκυττάρων επανήλθε

µετά την εισαγωγή του άγριου τύπου γονιδίου της LMP1, µέσω µόλυνσης µε το

στέλεχος EBV P3HR-1 23.

Σε καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων, η LMP1 φαίνεται να αναστέλλει τη

φυσιολογική πορεία της διαφοροποίησης, µια ιδιότητα που ίσως εξηγεί τον

αδιαφοροποίητο φαινότυπο που παρατηρείται σε πολλά ρινοφαρυγγικά

καρκινώµατα24. Όταν µάλιστα εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε ινοβλάστες ποντικών

και ανθρώπινες λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές είναι ιδιαίτερα τοξική 25.

Η LMP1 αλληλεπιδρά µε µια πληθώρα πρωτεϊνών του κυττάρου-ξενιστή, οι οποίες

συµµετέχουν στους καταρράκτες µεταγωγής σήµατος. Η ογκογόνος δράση της

µπορεί να αποδοθεί σε ορισµένες λειτουργίες της:

1) Επάγει τη σύνθεση του DNA στα Β-λεµφοκύτταρα, κάτι που παρατηρείται

και όταν αυτά ενεργοποιηθούν από κάποιο αντιγόνο 26.

15

2) Επάγει την παραγωγή µορίων της κυτταρικής επιφάνειας, όπως τα ICAM1

(Intercellular Adhesion Molecule 1), CD40 (Cluster of Differentiation 40),

CD44 (Cluster of Differentiation 44), µερικά από τα οποία συµµετέχουν στο

µετασχηµατισµό των κυττάρων 27,28.

3) Καταστέλλει τον κυτταρικό θάνατο οδηγώντας στην αυξορρύθµιση

(upregulation) διαφόρων αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως οι Bcl-2 (B-cell

lymphoma 2), η Mcl-1(Induced myeloid leukemia cell differentiation protein),

η A20 (tumor necrosis factor a-induced protein) και οι cIAPs (Cellular

inhibitors of apoptosis proteins) 29–32.

4) Συµβάλλει στην παραγωγή κυτοκινών, όπως οι ιντερλευκίνες 6 και 8 33,34 και

οδηγεί στην αυξορρύθµιση των MMPs (Matrix metalloproteinases), κάτι που

υποδεικνύει ότι η LMP1 επηρεάζει την αγγειογένεση και τη µετάσταση σε

όγκους που σχετίζονται µε τον EBV 35.

5) Επάγει τον µετασχηµατισµό κυτταρικών σειρών που προέρχονται από

ινοβλάστες ποντικού36, ενώ µπορεί, επίσης, να επάγει την ανάπτυξη

πρωτογενών εµβρυϊκών ινοβλαστών, παρεµβαίνοντας στον µηχανισµό που

ελέγχει την κυτταρική γήρανση 37.

6) Μπορεί να επιφέρει γονιδιακή αστάθεια, αποτρέποντας µηχανισµούς

επιδιόρθωσης του DNA, ή ακόµα και να επάγει την απόπτωση κάτω από

συνθήκες stress (µέσω των NF-κΒ και JNK µονοπατιών) 38.

Όλα τα παραπάνω έχουν ως αποτέλεσµα τα κύτταρα που εκφράζουν την LMP1 να

µετασχηµατίζονται και να µπορούν να επιβιώνουν.

Η σηµατοδότηση που επάγει η LMP1 µιµείται τη σηµατοδότηση που ξεκινά µετά από

την ενεργοποίηση των µελών της οικογένειας TNFRs (Tumor Νecrosis Factor

Receptors) 39,40. Πιο ειδικά, η σηµατοδότηση της LMP1 µιµείται τα σήµατα αύξησης

που επάγονται µετά τη σύνδεση του υποδοχέα CD40 (Cluster of differentiation 40)

στον προσδέτη του, CD40L (CD40 ligand) 1. Ο CD40, ένα µέλος των TNFR,

βρίσκεται στην επιφάνεια των Β-λεµφοκυττάρων. Φυσιολογικά, όταν ένα

ενεργοποιηµένο T- βοηθητικό λεµφοκύτταρο αναγνωρίσει το αντιγόνο που του

παρουσιάζεται από κάποιο Β-λεµφοκύτταρο, o CD40L του Τ- βοηθητικού

λεµφοκυττάρου συνδέεται στον CD40 υποδοχέα του Β-λεµφοκυττάρου. Έπειτα, τα

µόρια του CD40 ολιγοµερίζονται και ενεργοποιούνται. Αυτό οδηγεί:

a) στον πολλαπλασιασµό των Β-λεµφοκυττάρων,

16

b) στη διαφοροποίησή τους σε πλασµατοκύτταρα ή κύτταρα µνήµης

c) και στην αύξηση της χηµικής συγγένειας των αντισωµάτων προς των

αντιγονικό παράγοντα 41.

Η LMP1 λοιπόν, µιµούµενη ένα συνεχώς ενεργοποιηµένο CD40 παρέχει στα

µολυσµένα B-λεµφοκύτταρα ένα συνεχές και ψευδές σήµα Τ-λεµφοκυττάρων.

Εµπλέκεται, έτσι, σε πολλά σύνθετα µονοπάτια σηµατοδότησης µέσα στα κύτταρα

ξενιστές και συµβάλλει στον πολλαπλασιασµό τους και στην αναστολή της

απόπτωσης6,42.

Δοµικά η LMP1 µπορεί να χωριστεί σε 3 επικράτειες [Εικόνα 4]:

1) Μια βραχεία αµινοτελική κυτταροπλασµατική ουρά, 24 αµινοξέων, η οποία

βοηθά στην πρόσδεση και στον προσανατολισµό της πρωτεϊνης στη

µεµβράνη28. Η ουρά αυτή είναι απαραίτητη αφενός για την ουβικουιτίνωση

της LMP1 και την αποικοδόµησή της στο πρωτεάσωµα 43, αφετέρου για την

αλληλεπίδραση µεταξύ των διαφορετικών µορίων LMP1 23.

2) 6 υδρόφοβες διαµεµβρανικές επικράτειες, συνολικού µήκους 161 αµινοξέων,

οι οποίες αφού συσσωρευτούν και ολιγοµεριστούν, συµβάλλουν στην έναρξη

της σηµατοδότησης από την πρωτεϊνη 28,39.

3) Μια µακριά καρβοξυτελική κυτταροπλασµατική ουρά, 200 αµινοξέων, η

οποία είναι υπεύθυνη για τη µεταγωγή σήµατος. Στην καρβοξυτελική ουρά

εντοπίζονται τρεις διακριτές λειτουργικές επικράτειες (CTAR-C-terminal

activation regions), η CTAR1 (αµινοξέα 194-232) η CTAR2 (αµινοξέα 351-

386), και η CTAR3 (αµινοξέα 232-351), οι οποίες αποτελούν σηµεία

σύνδεσης και ενεργοποίησης πολλών κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών 44,45.

Οι CTARs λειτουργικά µοιάζουν µε το κυτταροπλασµατικό άκρο των υποδοχέων

CD40 και TNFRI, ως προς την ικανότητα δέσµευσης των πρωτεϊνών της οικογένειας

TRAF (TNF receptor associated factors), και της πρωτεϊνης TRADD (TNF receptor 1

associated death domain protein) 46–48. Έχουν δηλαδή την ικανότητα να ενεργοποιούν

διάφορους καταρράκτες µεταγωγής σήµατος, µε τελικό αποτέλεσµα να

ενεργοποιείται ο µεταγραφικός πράγοντας NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-

enhancer of activated B cells) 44. Έτσι, η LMP1 προκαλεί πολλές φαινοτυπικές

17

αλλαγές στα κύτταρα, λόγω της επαγωγής διαφόρων αντιαποπτωτικών γονιδίων και

γονιδίων κυτοκινών.

Συγκεκριµένα, η CTAR1 είναι απαραίτητη για τον µετασχηµατισµό και την

αθανατοποίηση των B- λεµφοκυττάρων από τον EBV. Σε αυτήν προσδένονται

απευθείας οι TRAF1,2,3,5 και ενεργοποιούνται έτσι τα µονοπάτια σηµατοδότησης

του NF-κB και της p38 MAPK (p38 mitogen activated protein kinases)28 [Εικόνα 4].

H CTAR2 είναι απαραίτητη για τη µακροχρόνια ανάπτυξη των αθανατοποιηµένων Β

λεµφοκυττάρων. Στρατολογώντας την RIP (Receptor-interacting protein kinase), την

TRADD (TNFR associated death domain) και έπειτα την TRAF2, ενεργοποιεί τα

σηµατοδοτικά µονοπάτια του NF-κB, του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 (Activator

protein 1) που ενεργοποιείται από τις κινάσες JNK (c-Jun N-terminal kinases) και του

µεταγραφικού παράγοντα ATF2 (Activating transcription factor 2) που

ενεργοποιείται από την p38 ΜΑPK 28,49 [Εικόνα 4].

Βλέπουµε δηλαδή πως η σύνδεση των TRAF στην κυτταροπλάσµατική ουρά της

LMP1 (είτε άµεσα στην επικράτεια CTAR1, είτε έµµεσα µέσω της πρωτεϊνης

TRADD στην επικράτεια CTAR2), παρέχει µία πλατφόρµα για τη στρατολόγηση και

την ενεργοποίηση πολλών σηµατοδοτικών µορίων 50 και, έτσι, η LMP1 µπορεί να

στρατολογεί MAP κινάσες και να οδηγεί στην ενεργοποίηση:

1. του NF-κB (κανονικό και εναλλακτικό µονοπάτι), µέσω της ΝΙΚ,

2. των ΕRK (Extracellular signal- regulated kinases),

3. του µεταγραφικού συµπλόκου AP-1 µέσω της JNK,

4. του ATF-2 (Αctivator of transcription factor 2) µέσω της p38 MAPK,

5. των µεταγραφικών παραγόντων STAT (Signal Transducer and activator of

transcription) µέσω της JAK (Janus kinase) 34,45,51–53 [Εικόνα 4].

Τόσο η CTAR1 όσο και η CTAR2 συµµετέχουν στην ενεργοποίηση του JAK/STAT

µονοπατιού 28 [Εικόνα 4].

H περιοχή CTAR 3 (αµινοξέα 232-351) βρίσκεται µεταξύ των CTAR1 και CTAR2.

Πιθανώς να εµπλέκεται και αυτή στο JAK/STAT µονοπάτι, καθώς στην περιοχή αυτή

συνδέεται η JAK3 (Janus kinase 3) και επάγεται έτσι η σύνδεση της STAT1 (Signal

Transducer and activator of transcription 1) 28,45 [Εικόνα 4]. Ωστόσο, ορισµένες

18

µελέτες δείχνουν πως η περιοχή αυτή δεν επηρεάζει τον µετασχηµατισµό των B-

λεµφοκυττάρων28,43,53,54.

Οι διαµεµβρανικές περιοχές της LMP1 είναι υπεύθυνες για την ενεργοποίηση των

µικρών GTPασών Cdc42 (Cell division control protein 42 homolog), οι οποίες

οδηγούν σε αλλαγές στον κυτταροσκελετό 28,56 [Εικόνα 4].

H LMP1 µπορεί ακόµα να ενεργοποιήσει το µονοπάτι της κινάσης Akt (protein

kinase B) που ενεργοποιείται από την PI3-K (phosphatidylinositol 3-kinase),

επηρεάζοντας τη βιωσιµότητα των κυττάρων, τον πολυµερισµό της ακτίνης και την

κινητικότητα του κυττάρου 57.

Εικόνα 4: Σχηµατική απεικόνιση των µονοπατιών σηµατοδότησης στα οποία συµµετέχει η

LMP128.

3.5. Το µονοπάτι του NF-κB και η αυξορρύθµισή του από την LMP1

Οι οικογένεια των µεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ (Nuclear Factor K-chain in B-

cells) αποτελείται από 5 µέλη:

1) RelA (p65)

2) RelB

3) NF-κB1 (p50/p105)

4) NF-κB2 (p52/p100)

5) c-Rel

19

Τα µέλη αυτά σχηµατίζουν οµο- ή ετεροδιµερή και ελέγχουν, έτσι, την έκφραση

πολλών γονιδίων (κυτοκινών, χηµειοκινών, παραγόντων ανάπτυξης, µορίων

προσκόλλησης, κ.α.), τα οποία σχετίζονται µε τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, τη

διαφοροποίηση, την απόπτωση, την ογκογένεση και τη φλεγµονή.

Χαρακτηριστικό γνώρισµα της οικογένειας είναι η ύπαρξη µιας συντηρηµένης

επικράτειας στο αµινοτελικό άκρο των πρωτεϊνών- µελών, µε µέγεθος 300

αµινοξέων. Η επικράτεια αυτή ονοµάζεται RHD (Rel homology domain) και είναι

υπεύθυνη για το διµερισµό των πρωτεϊνών- µελών, την πρόσδεση των διµερών στο

DNA και τη σύνδεση των πρωτεϊνών- µελών µε τον αναστολέα ΙκΒ (Inhibitor of

NFκΒ).

Οι ενεργοποιητές της οικογένειας ΝF-κΒ µπορεί να είναι οι TNFs (Tumor necrosis

factors), οι TLR (Toll-like receptors), BCR (B-cell receptor), TCR (T-cell receptor),

διάφορες κυτοκίνες (όπως η ιντερλευκίνη 1), βακτηριακά προϊόντα (όπως οι

λιποπολυσακχαρίτες) και σήµατα του stress (όπως το υπεροξείδιο, τα µέταλλα, οι

ακτίνες UV, το θερµικό σοκ) 28,58.

Πολλοί ιοί, όπως και ο EBV, αξιοποιούν το µονοπάτι του NF-κΒ για να

εξασφαλίσουν την επιβίωση και τον µετασχηµατισµό των κυττάρων που µολύνουν 59.

Ένας από τους βασικότερους τρόπους µέσω του οποίου η LMP1 οδηγεί σε

υπερπλασίες των Β-λεµφοκυττάρων είναι µέσω της αυξορρύθµισης (upregulation)

του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. Η αναστολή του NF-κΒ σε ορισµένες

λεµφοβλαστοειδείς σειρές οδηγεί σε µείωση της αυξηµένης κυτταρικής ανάπτυξης

και διαίρεσης 60. Ο ενεργοποιηµένος NF-κΒ φαίνεται να είναι απαραίτητος για την

εγκαθίδρυση της ραγδαίας ανάπτυξης και του πολλαπλασιασµού των κυττάρων των

νεοπλασιών 61, καθώς είναι υπεύθυνος για µια πληθώρα λειτουργιών, που κυρίως

περιλαµβάνουν τη φλεγµονή, την επαγωγή της ανάπτυξης και την ανοσολογική

απόκριση σε ερεθίσµατα, όπως οι κυτοκίνες, οι ελέυθερες ρίζες και η ιϊκή µόλυνση 62. H LMP1, λοιπόν, οδηγεί σε νεοπλασίες προκαλώντας µια συνεχή έκφραση του

NF-κΒ και µεγεθύνοντας, έτσι, το φυσιολογικό του ρόλο στην επαγωγή της

κυτταρικής αύξησης.

20

Η εµπλοκή της LMP1 στο µονοπάτι σηµατοδότησης του NF-κΒ ξεκινά µε την

αλληλεπίδραση των TRAF πρωτεϊνών µε την CTAR1 περιοχή της LMP1. Πολλές

LMP1 πρωτεΐνες µπορεί να συναθροίζονται µαζί στη µεµβράνη, έτσι ώστε να

εκβάλλουν τις κυτταροπλασµατικές τους επικράτειες σε µία συγκεκριµένη περιοχή

για να αλληλεπιδρούν πιο αποτελεσµατικά µε τις TRAF 63. Μεταλλάξεις στην

CTAR1 περιοχή αναστέλλουν τη σύνδεση των TRAF στην LMP1 και µειώνουν την

ικανότητά της να επάγει τον πολλαπλασιασµό των λεµφοκυττάρων 64.

Συγκεκριµένα, οι αλληλεπιδράσεις της CTAR1 µε τις πρωτεϊνες TRAF2 και TRAF5

φαίνεται να είναι αναγκαίες για την ικανότητα της CTAR1 να επάγει τα σήµατα που

θα οδηγήσουν στην ενεργοποίηση του NF-κΒ, µιας και µεταλλάξεις στο µοτίβο

πρόσδεσης των TRAF πάνω στη CTAR1 ή υπερέκφραση επικρατών αρνητικών

TRAF2 ή TRAF5 αλληλοµόρφων (over-expression of dominant negative TRAF2 or

TRAF5 molecules), αναστέλλουν την ενεργοποίηση του NF-κΒ από την

CTAR146,47,65.

Υπάρχουν πολλοί προτεινόµενοι µηχανισµοί µε τους οποίους οι ενεργοποιηµένες από

την LMP1 TRAFs οδηγούν τελικά στην ενεργοποίηση του NF-κΒ. Ο πιο αποδεκτός

σήµερα µηχανισµός φαίνεται στην Εικόνα 5. Σύµφωνα µε αυτόν, η LMP1 επάγει το

κανονικό µονοπάτι του NFκB ενεργοποιώντας την TRAF2 ή την TRAF5, οι οποίες

στρατολογούν την ΝΙΚ (NF-κΒ inducing kinase). Η ΝΙΚ φωσφορυλιώνει την ΙΚΚ

(Iκ-Β regulatory kinase ), η οποία φωσφορυλιώνει την IκBα. Η IκBα φυσιολογικά

αναστέλει τον NF-κΒ όντας συνδεδεµένη µε την ενεργό ετεροδιµερική µορφή του

(p50/p65) στο κυτταρόπλασµα, εµποδίζοντάς τον, έτσι, να εισέλθει στον πυρήνα.

Αφού όµως φωσφορυλιωθεί από την ΙΚΚα, η IκBα ουβικουιτινώνεται, οδηγείται στο

πρωτεάσωµα και αποικοδοµείται, κάτι που επιτρέπει στο ετεροδιµερές p50/p65 να

εισέλθει στον πυρήνα, να συνδεθεί σε ειδικές αλληλουχίες στους υποκινητές των

γονιδίων στόχων του και να ρυθµίσει τη µεταγραφή των γονιδίων αυτών. Το

σηµατοδοτικό αυτό µονοπάτι παρουσιάζει πολλές οµοιότητες µε το µονοπάτι που

ενεργοποιείται από την CD40 28.

Ένα ακόµα αποδεκτό µονοπάτι (εναλλακτικό µονοπάτι του NFκΒ) περιλαµβάνει την

επεξεργασία (φωσφορυλίωση και µερική αποικοδόµηση) του πρόδροµου παράγοντα

21

p100 στην ενεργό µορφή p52, µέσω των IKKα/ΝΙΚ. Αυτό συµβαίνει ανεξάρτητα από

τη ρύθµιση του κανονικού NF-κΒ µονοπατιού 49,66,67 [Εικόνα 5].

Εικόνα 5: Η αλληλεπίδραση της LMP1 µε τα µονοπάτια σηµατοδότησης του ξενιστή. Οι

περισσότεροι καταρράκτες σηµατοδότησης καταλήγουν στην ενεργοποίηση των µεταγραφικών

παραγόντων της οικογένειας NF-κΒ. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ από τον EBV είναι ένας από

τους κύριους µηχανισµούς που επάγουν την καρκινογένεση που οφείλεται στην µόλυνση µε τον ιό 6.

3.6. H οικογένεια των πρωτεϊνών TRAF

Οι πρωτεϊνες TRAF είναι µια οικογένεια 6 κυτταροπλασµατικών κυρίως πρωτεϊνών

(ΤΡΑF 1, 2, 3, 4, 5, 6) στα θηλαστικά που αναγνωρίστηκαν αρχικά ως µόρια-

προσαρµοστές που στρατολογούνται στον TNFR1, µετά από τη σύνδεση του TNF-a

και επάγουν την ενεργοποίηση του NF-κΒ και των ΜΑΡΚ 68. Αργότερα αποδείχθηκε

πως οι TRAF παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή σήµατος από τον CD40, αλλά

και από άλλα µέλη της οικογένειας των TNFR 69. Οι πρωτεϊνες αυτές έχουν την

ικανότητα να ρυθµίζουν αρνητικά τα µονοπάτια που οδηγούν στην απόπτωση του

κυττάρου, καθώς και να ενεργοποιούν µια πληθώρα µεταγραφικών παραγόντων που

σχετίζονται µε την έκφραση διαφόρων γονιδίων 70.

Χαρακτηριστικό γνώρισµα της οικογένειας αυτής είναι µια συντηρηµένη TRAF

επικράτεια στο καρβοξυτελικό άκρο. Η περιοχή αυτή υποδιαιρείται στην

22

καρβοξυτελική περιοχή TRAF-C, η οποία παρουσιάζει υψηλή οµολογία αµινοξέων

σε όλα τα µέλη της οικογένειας και τους προσφέρει τη δυνατότητα οµο- και

ετεροδιµερισµού. Επιπλέον, η περιοχή αυτή παρουσιάζει υψηλή οµολογία αµινοξέων

τόσο µε τις κυτταροπλασµατικές επικράτειες ορισµένων TNFR και διαφόρων άλλων

διαµεµβρανικών υποδοχέων (όπως η LMP1), όσο και µε άλλες πρωτεϊνες που

συµµετέχουν καθοδικά στα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Έτσι οι ΤRΑF έχουν την

ικανότητα να αλληλεπιδρούν µε τις πρωτεϊνες αυτές στις περιοχές οµολογίας τους.

Μάλιστα, υπάρχουν µικρές διαφορές στην επικράτεια TRAF µεταξύ των πρωτεϊνών

της οικογένειας, οι οποίες καθορίζουν την εξειδίκευση της κάθε TRAF πρωτεϊνης για

σύνδεση σε συγκεκριµένους υποδοχείς 71–73. Oρισµένοι TNFR, βέβαια, όπως ο

TNFR1, για να µπορέσουν να συνδεθούν µε τις TRAF, απαιτούν επιπλέον πρωτεΐνες

προσαρµοστές, όπως η πρωτεΐνη TRADD 68.

Οι πρωτεΐνες TRAF παίζουν ένα σηµαντικότατο ρόλο στη στρατολόγηση διαφόρων

πρωτεϊνών καθοδικά των υποδοχέων πάνω στους οποίους συνδέονται. Λαµβάνοντας

µέρος στα σύµπλοκα που σχηµατίζονται ως αποτέλεσµα της ενεργοποίησης των

διαµεµβρανικών υποδοχέων, ενεργοποιούν µονοπάτια που καταλήγουν στη

φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες µε τη σειρά τους

ενεργοποιούν τους µεταγραφικούς παράγοντες Rel και AP-1 45. Επιπρόσθετα οι

TRAF αλληλεπιδρούν µε οµάδες πρωτεϊνών που ρυθµίζουν αποπτωτικά µονοπάτια,

όπως οι TRADD, c-IAPs και RIP 52,57.

Επιπρόσθετα, οι TRAF παίζουν έναν κεντρικό ρόλο στον µετασχηµατισµό των Β-

λεµφοκυττάρων από τον EBV, µιας και σε όλες τις επιδράσεις της LMP1 στο

µετασχηµατισµό των Β-λεµφοκυττάρων µεσολαβούν οι TRAFs 74. Συγκεκριµένα, οι

αλληλεπιδράσεις της LMP1 µε τις TRAF οδηγούν στην ενεργοποίηση του NF-κΒ,

κάτι το οποίο οδηγεί στην αύξηση της µεταγραφής διαφόρων κυτοκινών που επάγουν

τη φλεγµονή και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων 75. Οι αλληλεπιδράσεις της

LMP1 µε τις TRAF και η ενεργοποίηση του NF-κΒ είναι ουσιώδεις για την επιβίωση

των LCLs, µιας και η αναστολή του NF-κΒ επάγει την απόπτωση των LCL, χωρίς να

υπάρχει κάποιο πρόσθετο προ-αποπτωτικό σήµα 59,76. Η ενεργοποίηση, µάλιστα, των

TRAF από την LMP1 προστατεύει τις LCLs από την απόπτωση 44.

23

3.7. Η πρωτεΐνη TRAF5 και η σχέση της µε την LMP1

Η πρωτεΐνη TRAF5 ανήκει στην οικογένεια των TRAF πρωτεϊνών και είναι η

λιγότερο µελετηµένη πρωτεΐνη της οικογένειας αυτής. Αν και η συσχέτισή της µε την

καρβοξυτελική επικράτεια της LMP1 έγινε πριν 18 χρόνια 47, ο λειτουργικός ρόλος

της TRAF5 στη µεταγωγή σήµατος από την LMP1 δεν µελετήθηκε επαρκώς, µιας και

οι περισσότεροι ερευνητές του κλάδου εστίαζαν σε πιο καλά µελετηµένες TRAFs,

όπως οι TRAF2 και TRAF6. Ένας λόγος που δεν µελετήθηκε εκτενώς ό ρόλος της

TRAF5 στη µεταγωγή σήµατος από την LMP1 ήταν το γεγονός ότι η πρωτεΐνη αυτή

δεν παίζει σπουδαίο ρόλο στη µεταγωγή σήµατος από τον CD40, τον υποδοχέα που

µιµείται η LMP1 77,78.

Ωστόσο, αν και η LMP1 µιµείται έναν συνεχώς ενεργό CD40, έχει δειχθεί πως

χρησιµοποιεί τις διάφορες TRAF µε διαφορετικό τρόπο από ότι αυτός. Για

παράδειγµα, στην περίπτωση του CD40, οι TRAF1 και 2 συνεργάζονται για να

µεταβιβάσουν ορισµένα σήµατα, ενώ η TRAF3 αναστέλλει τη µεταγωγή σήµατος

από την TRAF2. Αντίθετα, στην περίπτωση της LMP1, οι TRAF1 και 2 δεν είναι

απαραίτητες για τη µεταγωγή σήµατος, αλλά απουσία της TRAF3, η µεταγωγή

σήµατος αναστέλλεται79–81. Για την µελέτη της αλληλεπίδρασης της TRAF5 µε τον

CD40 χρησιµοποίθηκαν ποντίκια στα οποία δεν εκφράζεται η TRAF5 (null mice). Τα

ποντίκια αυτά γεννιούνται υγιή και παρόλο που η ενεργοποίηση των λεµφοκυττάρων

από τον CD40 σε αυτά είναι σηµαντικά µειωµένη, τα κύτταρά τους παρουσιάζουν

φυσιολογική ενεργοποίηση του NF-κΒ και της JNK από τον υποδοχέα CD4078.

Έτσι λοιπόν, παρόλο που η TRAF5 δεν παίζει πολύ σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή

σήµατος από τον υποδοχέα CD40, η πρωτεϊνη αυτή είναι ουσιώδης για τη µεταγωγή

σήµατος από την LMP1 στα Β-λεµφοκύτταρα in vivo και in vitro. Συγκεκριµένα,

παρουσία της LMP1, αλλά χωρίς την TRAF5 in vivo, δεν παρατηρείται αύξηση στο

µέγεθος των δευτερογενών λεµφικών οργάνων (π.χ. σπλήνας), αλλά ούτε αυξηµένη

ιντερλευκίνη 6 στον ορό 77. Αυτό αποδεικνύει πως η TRAF5 είναι πολύ σηµαντική

για την in vivo λειτουργία της LMP1.

Χωρίς την TRAF5 in vitro, η LMP1 δεν µπορεί να ενεργοποιήσει το µονοπάτι των

κινασών JNK και Akt, ενώ η απουσία της TRAF5 δεν έχει καµία επίδραση στην

ενεργοποίηση του κανονικού µονοπατιού του NF-κΒ 77. Επίσης, ούτε το εναλλακτικό

24

µονοπάτι του NF-κΒ δεν επηρεάζεται από την απουσία της TRAF5, καθώς τα

επίπεδα της p52 παραµένουν σταθερά 77. Η αποικοδόµηση τoυ αναστολέα IκΒα δεν

επηρεάζεται όταν η TRAF5 απουσιάζει, αλλά η φωσφορυλίωσή του είναι λιγότερο

αποτελεσµατική 77.

Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν η TRAF5 επιδρά άµεσα στη µεταγωγή σήµατος από

την LMP1, ή αν ασκεί µια έµµεση επίδραση, είτε επιδρώντας σε άλλους παράγοντες

καθοδικά της LMP1, είτε απλώς συµµετέχοντας στη σταθεροποίηση άλλων

πρωτεϊνών TRAF. Με άλλα λόγια, ο ακριβής τρόπος µε τον οποίο η TRAF5

εµπλέκεται στη µεταγωγή σήµατος της LMP1 παραµένει άγνωστος.

Σε πειράµατα ανάλυσης της εµπλοκής της TRAF5 στη βιωσιµότητα Β-

λεµφοκυττάρων µολυσµένων µε EBV, λεµφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές αγρίου

τύπου (LCL- WT) και κύτταρα της σειράς BJAB (κυτταρική σειρά B λεµφοκυττάρων

από λέµφωµα Burkitt, αρνητική στον ΕBV) επιµολύνθηκαν µε ειδικά shRNA που

στοχεύουν και καταστέλλουν την έκφραση του mRNA της TRAF5 (RNA

interference). Αυτά τα shRNA επηρέασαν αρνητικά τη βιωσιµότητα των κυττάρων

LCL-WT, αλλά όχι εκείνη τη σειράς BJAB. Λόγω της αλληλεπίδρασης της TRAF5

µε την LMP1, είναι πιθανό η έκφραση της TRAF5 να είναι απαραίτητη για την

βιωσιµότητα των κυττάρων όταν εκφράζεται η LMP1 83.

3.8. Σκοπός της παρούσας εργασίας Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να διαπιστωθεί εάν η παραπάνω υπόθεση

ισχύει σε επιθηλιακά κύτταρα που εξαρτώνται από την LMP1 για την επιβίωσή τους,

ελέγχοντας το κατά πόσο η καταστολή της έκφρασης της TRAF5 είναι ασύµβατη µε

τη βιωσιµότητα τους.

4. Υλικά και Μέθοδοι Αρχικά δηµιουργήθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές από σειρές HEK293FT που

εκφράζουν µόνιµα την LMP1 και αντίστοιχες σειρές ελέγχου που δεν εκφράζουν

LMP1. Στη συνέχεια, στις σειρές αυτές πραγµατοποιήθηκε καταστολή της έκφρασης

25

της πρωτεϊνης TRAF5 και µελετήθηκε η επίδραση της καταστολής αυτής στη

βιωσιµότητα των κυττάρων.

4.1. Δηµιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών από σειρές ΗΕΚ293FT που

εκφράζουν την LMP1

4.1.1. Πλασµιδιακός φορέας έκφρασης

Για τη δηµιουργία των σειρών αυτών χρησιµοποιήθηκαν τρεις φορείς έκφρασης:

1) Ο φορέας pcDNA3-LMP1, που εκφράζει το γονίδιο της πρωτεϊνης LMP1.

2) O φορέας pE-selectin-Zeo, που φέρει το γονίδιο ανθεκτικότητας στο

αντιβιοτικό Zεοσίνη. Το γονίδιο αυτό ρυθµίζεται από τον υποκινητή του

γονιδίου E-selectin, o οποίος περιέχει τρεις ρυθµιστικές περιοχές του

µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ 83. Η ρύθµιση του γονιδίου της Ζεοσίνης

από το συγκεκριµένο υποκινητή εξασφαλίζει την παραµονή του φορέα που

φέρει το γονίδιο της LMP1 στο κύτταρο, όταν τα κύτταρα διατηρούνται σε

θρεπτικό µέσο που περιέχει Ζεοσίνη. Αυτό συµβαίνει διότι η έκφραση της

πρωτεΐνης LMP1 ενεργοποιεί το µονοπάτι του µεταγραφικού παράγοντα NF-

κB και συνεπώς οδηγεί στην ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου

ανθεκτικότητας και άρα στην επιβίωση των κυττάρων στο µέσο που περιέχει

το αντιβιοτικό. Ακόµη, µε τον τρόπο αυτό γίνεται δυνατή η επιλογή των

κυττάρων (κλώνων) που εκφράζουν την LMP1, µιας και αυτά που δεν την

εκφράζουν δεν επιβιώνουν τελικά στο θρεπτικό µέσο.

3) O φορέας pcDNA3-empty, που δεν εκφράζει κανένα γονίδιο και

χρησιµοποιείται για να εξισορροπείται η συνολική ποσότητα του

πλασµιδιακού DNA κατά την επιµόλυνση.

4.1.2. Μετασχηµατισµός βακτηρίων, καλλιέργειες και αποµόνωση

πλασµιδιακού DNA

4.1.2.1. Μετασχηµατισµός βακτηρίων

Για τον πολλαπλασιασµό του πλασµιδιακού DNA χρησιµοποιήθηκαν τα βακτηριακά

στελέχη Escherichia coli DH10b, τα οποία έπειτα από χηµική κατεργασία έχουν

αποκτήσει υψηλή ικανότητα πρόσληψης πλασµιδίων. Τα βακτήρια είχαν

κρυοσυντηρηθεί σε διάλυµα γλυκερόλης και αφέθηκαν να ξεπαγώνουν από τους -

26

80oC στον πάγο. Στη συνέχεια, 100µl βακτηρίων αναµίχθηκαν µε 20ng πλασµιδίου.

To µίγµα επωάστηκε στον πάγο για 30 λεπτά και ακολούθησε θερµικό πλήγµα στους

42οC για 90 δευτερόλεπτα. Αµέσως µετά το µίγµα αφέθηκε στον πάγο για 5 λεπτά.

Έπειτα, έγινε προσθήκη στο µίγµα 1ml θρεπτικού µέσου LB (Luria Broth), το οποίο

βρισκόταν σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά από µια ήπια ανάµιξη του µίγµατος,

100µl από αυτό επιστρώθηκαν σε τριβλίο petri. Το τριβλίο petri περιείχε στερεό

θρεπτικό µέσο LB- άγαρ µε το κατάλληλο αντιβιοτικό, που για τα πλασµίδια που

χρησιµοποιήθηκαν ήταν η αµπικιλίνη, µε συγκέντρωση 100µg/ml LB-άγαρ. Τα

µετασχηµατισµένα βακτήρια σχηµάτισαν στο στερεό µέσο αποικίες επαρκώς

ανεπτυγµένες έπειτα από επώαση στους 37οC για 16 µε 19 ώρες. Όλα τα υλικά ήταν

αποστειρωµένα και η διαδικασία πραγµατοποιήθηκε κάτω από ασηπτικές συνθήκες.

4.1.2.2. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA σε µεγάλη κλίµακα

Αρχικά ενοφθαλµίστηκε µια αποικία σε 2ml θρεπτικού µέσου LB µε 100µg/ml

αµπικιλίνη. Ακολούθησε επώαση στους 37οC για 4-6 ώρες, υπό απαλή ανάδευση και

η καλλιέργεια προστέθηκε σε φιάλη µε 250ml LB µε την ίδια συγκέντρωση

αντιβιοτικού. Έπειτα από επώαση 16 ωρών στους 37οC υπό απαλή ανάδευση, το LB

µέσα στη φιάλη θόλωσε, γεγονός που υπέδειξε την ανάπτυξη των βακτηρίων.

Στη συνέχεια, ξεκίνησε η αποµόνωση µε το NucleoBond® Xtra Midi Plasmid DNA

Purification kit της Macherey-Nagel. Το περιεχόµενο της φιάλης µεταφέρθηκε σε

σωλήνες φυγοκέντρου και φυγοκεντρήθηκε στις 5000 στροφές ανά λεπτό, για 20

λεπτά, στους 4οC. Το ίζηµα επαναιωρήθηκε µέχρι να µην υπάρξουν καθόλου

συσσωµατώµατα σε 8ml διαλύµατος RES, το οποίο περιείχε 100µg/ml RNAση Α.

Ακολούθησε προσθήκη 8ml διαλύµατος LYS, το οποίο άνοιξε πόρους στα

βακτηριακά κύτταρα, τόσο µεγάλους, ώστε να επιτρέψουν την έξοδο µόνο του

πλασµιδιακού, και όχι του γενωµικού DNA του βακτηρίου. Έπειτα από ήπια

ανάδευση µε αναποδογύρισµα των σωλήνων, το µίγµα επωάστηκε για 5 λεπτά.

Ακολούθησε εξουδετέρωση µε 8ml διαλύµατος NEU και ήπια ανάδευση. Τα

προϊόντα λύσης µεταφέρθηκαν σε στήλη midi-prep που έχει προηγουµένως

εξισορροπηθεί µε 12ml διαλύµατος EQU και ακολούθησε προσθήκη επιπλέον 5ml

διαλύµατος EQU. Η στήλη είχε ένα αφαιρούµενο φίλτρο για την κατακράτηση

µεγάλων συµπλεγµάτων από κυτταρικά συστατικά και ένα ενσωµατωµένο φίλτρο για

27

τη δέσµευση του DNA. Αφού το µίγµα φιλτραρίστηκε, απορρίφθηκε το αφαιρούµενο

φίλτρο και το ενσωµατωµένο καθαρίστηκε από τυχόν προσµίξεις µε 8ml διαλύµατος

WASH. Αφού ξεπλύθηκε το φίλτρο τοποθετήθηκαν κάτω από τις στήλες σωλήνες,

όπου συλλέχθηκε το DNA, µετά από προσθήκη 5ml διαλύµατος ELU. Σε κάθε

σωλήνα προστέθηκαν 3,5ml ισοπροπανόλης και έπειτα από ισχυρή ανάδευση µε

στροβιλισµό το µίγµα αφέθηκε να επωαστεί για 2-3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου.

Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές ανά λεπτό, για 30 λεπτά,

στους 4οC. Το υπερκείµενο αφαιρέθηκε και το ίζηµα ξεπλύθηκε µε 2ml 70%

αιθανόλη. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 15 λεπτά, στις 6000 στροφές ανά λεπτό,

στους 4οC και το υπερκείµενο αφαιρέθηκε. Αφού στέγνωσε εντελώς το ίζηµα,

επαναδιαλύθηκε σε 300µl ΤΕ µε pH=8 και αποθηκεύτηκε στους -20οC.

4.1.2.3. Ποσοτικοποίηση του πλασµιδιακού DNA

Η ποσότητα του DNA υπολογίστηκε µε τη βοήθεια φωτοµέτρου. 5µl του DNA

αραιώθηκαν σε 1ml ddH2O και η οπτική απορρόφηση του δείγµατος προσδιορίστηκε

στα 260 και 280nm. Σύµφωνα µε το νόµο των Beer-Lambert για την απορρόφηση

ενός δείγµατος ισχύει: A = ε*l*c όπου Α η απορρόφηση, ε η σταθερά µοριακής

απορροφητικότητας φωτός σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος, l το πάχος της

κυψελίδας και c η συγκέντρωση της ουσίας. Για το δίκλωνο DNA η σταθερά ε στα

260nm είναι 0,02(µg/ml)-1cm-1 ενώ το πάχος της κυψελίδας 1cm. Έτσι, η

συγκέντρωση του DNA που φωτοµετρήθηκε ήταν πενηνταπλάσια της απορρόφησης

(σε µg/ml). Αυτή η απορρόφηση αντιστοιχεί στα 5/1000 της πραγµατικής, καθώς

τόση ήταν η αραίωση του DNA. Εποµένως, η συγκέντρωση του αρχικού δείγµατος

ήταν 50*1000/5*Α ή 10000*Α σε µg/ml ή 10*Α σε µg/µl. Ο λόγος της απορρόφησης

στα 260nm προς τα 280nm δείχνει την καθαρότητα του DNA. Λόγος µικρότερος από

1,8 υποδηλώνει επιµόλυνση µε πρωτεΐνες και µεγαλύτερος από 2 υποδηλώνει

παρουσία RNA.

4.1.3. Καλλιέργεια κυτταρικών σειρών HEK293FT

Για τη µελέτη του ρόλου της TRAF5 στο σηµατοδοτικό µονοπάτι της LMP1

χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα της σειράς HEK 293FT (Human Embryonal Kidney

Cells). Προέρχονται από την κυτταρική σειρά 293, η οποία δηµιουργήθηκε από

28

ανθρώπινα πρωτογενή εµβρυονικά κύτταρα νεφρού µετασχηµατισµένα µε DNA

ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 5. Η σειρά 293F είναι µια παράγωγη της σειράς 293 που

αναπτύσσεται µε αυξηµένο ρυθµό και έπειτα από µετασχηµατισµό κυττάρων αυτής

της σειράς µε το πλασµίδιο pCMVSPORT6Tag.neo προκύπτουν τα 293FT κύτταρα

που χαρακτηρίζονται από ιδιοστατική έκφραση υψηλών επιπέδων του µεγάλου

αντιγόνου Τ του ιού SV40. Τα κύτταρα αυτά εµφανίζουν ταχείς ρυθµούς ανάπτυξης,

υψηλά ποσοστά επιτυχίας επιµόλυνσης και ξεκολλούν εύκολα από τον πάτο του

τριβλίου καλλιέργειας. Επιλέχθηκαν για τους ακόλουθους λόγους:

a) Eίναι επιθηλιακά κύτταρα και κατά συνέπεια αντιπροσωπεύουν έναν από τους

δύο κυτταρικούς τύπους που είναι φυσιολογικοί στόχοι της πρωτεΐνης LMP1

και του EBV.

b) Έχουν χαµηλά επίπεδα ενεργότητας των µονοπατιών σηµατοδότησης που

ενεργοποιούνται από την LMP182.

Για την ανάπτυξη των κυττάρων χρησιµοποιήθηκε θρεπτικό µέσο DMEM (Sigma-

Alorich, Dublecco’s Modified Eagle’s Medium, D6429, REF: 41966029, Life

Technologies), εµπλουτισµένο µε 10% θερµικά απενεργοποιηµένο βόειο εµβρυϊκό

ορό (Gibco, Fetal Bovine Serum, REF: 10270-106, Life Technologies), 100 U/ml

πενικιλίνη και 100µg/ml στρεπτοµυκίνη (Gibco, pen/strep, REF: 15140-122, Life

Technologies) και 2mM L-γλουταµίνη (Gibco, GlutaMax-I 100X, REF: 35050-038,

Life Technologies). Για την καλλιέργεια των νέων σταθερών σειρών που εκφράζουν

την LMP1 χρησιµοποιήθηκε το προαναφερόµενο θρεπτικό µέσο µε την προσθήκη

του αντιβιοτικού Ζεοσίνη (200µg/ml, Invivogen, REF: ant-zn-1). Τα κύτταρα

αναπτύσσονται σε κλίβανο, στους 37oC, παρουσία 5% CO2.

Όταν η κάλυψη του τριβλίου έφτασε περίπου στο 80%, τα κύτταρα αραιώθηκαν.

Αρχικά αφαιρέθηκε το θρεπτικό, και προστέθηκε 1ml τρυψίνης (Gibco, 0.05%

Trypsin- EDTA 1X, REF: 25300-054, Life Technologies), στην οποία τα κύτταρα

αφέθηκαν για 2 λεπτά. Έπειτα, µε την προσθήκη 9ml θρεπτικού, η τρυψίνη

αδρανοποιήθηκε από τους αναστολείς πρωτεασών του ορού και τα αποκολληµένα

κύτταρα συλλέχθηκαν σε αποστειρωµένο σωλήνα 15ml. 10µl από το εναιώρηµα των

κυττάρων αναµίχθηκαν µε 10µl χρωστικής trypan blue και υπολογίστηκε, έπειτα από

παρατήρηση στο µικροσκόπιο µε τη βοήθεια αιµοκυτταρόµετρου Neubauer, η

συγκέντρωσή τους στο εναιώρηµα. Στη συνέχεια, κατάλληλος αριθµός κυττάρων

29

στρώθηκαν στις οπές τριβλίου για πειράµατα επιµόλυνσης. Για τα πειράµατα που

πραγµατοποιήθηκαν, στρώθηκαν σε κάθε οπή ενός τριβλίου 6 οπών 400.000 κύτταρα

σε 2ml θρεπτικού.

4.1.4. Επιµόλυνση µε τους πλασµιδιακούς φορείς

Εφαρµόστηκε µέθοδος επιµόλυνσης των κυττάρων µε τη χρήση φωσφορικού

ασβεστίου. Το µίγµα που προστέθηκε σε κάθε οπή του τριβλίου αποτελούνταν από:

1. 70µl ddH2O

2. την επιθυµητή ποσότητα DNA, που σε όλες τις οπές ήταν 2µg. Να σηµειωθεί

ότι η αναλογία των δύο πλασµιδίων που χρησιµοποιήθηκαν για τη επιµόλυνση

(pcDNA3-LMP1: pE-selectin-zeo) ήταν 1:10, δηλάδή τοποθετήθηκαν 1µg pE-

selectin-zeo και 0,1µg pcDNA3-LMP1. Για να συµπληρωθεί η τελική

ποσότητα των 2µg προστέθηκαν επίσης 0,9µg πλασµιδίου pcDNA3-empty.

Να σηµειωθεί επίσης πως στη µία οπή του τριβλίου η επιµόλυνση έγινε µόνο

µε 1µg του πλασµιδίου pE-selectin-zeo και 1µg του πλασµιδίου pcDNA3-

empty, προκειµένου να παραχθούν σειρές ελέγχου που δεν εκφράζουν LMP1,

αλλά εκφράζουν ανθεκτικότητα στη Ζεοσίνη.

3. 100µl διαλύµατος BES 2X µε pH=7

4. 10µl 2,5M CaCl2

Το µίγµα επωάστηκε για 10 λεπτά µετά την προσθήκη του CaCl2, έτσι ώστε να

µπορέσουν να σχηµατιστούν τα σύµπλoκα του φωσφορικού ασβεστίου µε το DNA.

Στη συνέχεια, το µίγµα προστέθηκε σταγόνα-σταγόνα σπειροειδώς σε κάθε οπή και

το τριβλίο αναδεύτηκε απαλά. Στην επώαση που ακολούθησε ορισµένα από τα

σύµπλοκα φωσφορικού ασβεστίου µε το DNA εισήχθησαν στα κύτταρα. Μετά από 4

ώρες πραγµατοποιήθηκε διπλή πλύση των κυττάρων µε PBS (Phosphate buffered

saline) 1X και στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε αλλαγή θρεπτικού. Μετά από 48

ώρες πραγµατοποιήθηκε η επιλογή των κυττάρων που έχουν επιµολυνθεί µε τα

πλασµίδια pcDNA3-LMP1 και pE-selectin-Zeo µε προσθήκη θρεπτικού µε 200µg/ml

Ζεοσίνης. Τα κύτταρα αφέθηκαν σε αυτό το µέσο επιλογής για 5 µέρες. Έπειτα 1000

επιµολυσµένα κύτταρα από τις µαζικές αυτές καλλιέργειες (mass cultures) που έχουν

υποστεί προεπιλογή, µεταφέρθηκαν σε τριβλία διαµέτρου 10cm, όπου και

αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό µέσο που περιέχει 200µg/ml Ζεοσίνης. Επειδή τα κύτταρα

30

ήταν πολύ αραιά µεταξύ τους (clonal density), το καθένα από αυτά αναπτύχθηκε

αποµακρυσµένο από το άλλο. Έτσι, στο σηµείο όπου προσκόλλησε, το κάθε

επιµολυσµένο κύτταρο που κατάφερε να επιβιώσει έδωσε µία αποικία. Οι αποικίες

αφέθηκαν να αναπτυχθούν για διάστηµα περίπου 2-4 εβδοµάδων (αναπτύσσονταν

ετεροσυγχρονισµένα), ενώ πραγµατοποιούνταν αλλαγή θρεπτικού µε 200µg/ml

Ζεοσίνης µία φορά τη βδοµάδα. Μόλις οι αποικίες απέκτησαν ένα εύλογο µέγεθος

εφαρµόστηκαν τοπικά επάνω τους 5µl αραιωµένης τρυψίνης 1:4 σε PBS 1Χ και έτσι

τα κύτταρα της κάθε αποικίας ξεκόλλησαν από το τριβλίο και µεταφέρθηκαν σε οπή

από τριβλίο 48 οπών. Στην οπή αυτή προστέθηκαν 600µl θρεπτικό µε 200µg/ml

Ζεοσίνης. Αφού οι αποικία πολλαπλασιάστηκε και κατέλαβε ολόκληρη την οπή,

εφαρµόστηκαν σε αυτή 50µl τρυψίνης και στη συνέχεια 500µl θρεπτικού µε

200µg/ml Ζεοσίνης. Έπειτα 300µl από τα κύτταρα µεταφέρθηκαν σε οπή τριβλίου 6

οπών, όπου προστέθηκαν 2ml θρεπτικού µε 200µg/ml Ζεοσίνης. Εκεί τα κύτταρα

αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν. Τα υπόλοιπα 250µl συλλέχθηκαν σε

αποστειρωµένο πλαστικό σωλήνα 1.5ml, µε σκοπό να ελεγχθεί αν εκφράζουν την

LMP1 µε στύπωµα Western.

4.1.5. Ανίχνευση κλώνων που εκφράζουν την LMP1 µε στύπωµα

Western

Το στύπωµα Western είναι µια ευρέως χρησιµοποιούµενη τεχνική για την ανίχνευση

των επιπέδων συγκεκριµένων πρωτεϊνών σε κυτταρικά εκχυλίσµατα. Περιλαµβάνει

ηλεκτροφόρηση πηκτής, κατά την οποία οι αποδιατεταγµένες πρωτεϊνες από τα

κυτταρικά εκχυλίσµατα διαχωρίζονται µε βάση το µοριακό τους βάρος. Στη συνέχεια

οι πρωτεϊνες µεταφέρονται σε µια µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και εντοπίζονται µε τη

χρήση κατάλληλων αντισωµάτων 84,85.

4.1.5.1. Προετοιµασία δειγµάτων

Το δείγµα που βρισκόταν σε πλαστικό σωλήνα 1.5ml φυγοκεντρήθηκε στις 6000

στροφές το λεπτό, για 5 λεπτά. Στη συνέχεια αποµακρύνθηκε το υπερκείµενο και µε

σκοπό να ξεπλυθεί το ίζηµα, προστέθηκαν 300µl PBS 1X. Έπειτα το δείγµα

φυγοκεντρήθηκε ξανά στις 6000 στροφές το λεπτό για 5 λεπτά. Η διαδιακασία αυτή

επαναλήφθηκε 3 φορές και την τελευταία φορά προστέθηκαν 20µl SDS-loadying dye

31

1X. Ακολούθησε βράσιµο στους 100 οC για 5-10 λεπτά κατά το οποίο οι πρωτεϊνες

αποδιατάχθηκαν. Το SDS (Sodium dodecyl sulfate) είναι ένα απορρυπαντικό που

συµβάλει στην αποδιάταξη των δευτεροταγών και µη-σουλφιδικών τεταρτοταγών

δοµών των πρωτεϊνών και επιπλέον προσδίδει σε όλες τις πρωτεϊνες αρνητικό φορτίο,

κατ΄αναλογία µε τη µάζα τους. Έτσι, η σύνδεση του SDS στα αποδιατεταγµένα

πολυπεπτίδια προσδίδει σε όλες τις πρωτεϊνες µια ίση κατανοµή φορτίου ανά µονάδα

µάζας και επιτρέπει το διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος 86,87.

4.1.5.2. Παρασκευή πηκτής πολυακρυλαµιδίου

Αρχικά παρασκευάστηκε πηκτή πολυακρυλαµιδίου για την ηλεκτροφόρηση των

κυτταρικών εκχυλισµάτων µε σκοπό το διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε βάση το

µοριακό τους βάρος. Η πηκτή αποτελούνταν από δύο µέρη, την πηκτή επιστοίβαξης

(stacking gel) και την πηκτή διαχωρισµού (separating gel). Οι πρωτεΐνες κινήθηκαν

µέσω της πηκτής επιστοίβαξης οµοιόµορφα και φτάνοντας στην πηκτή διαχωρισµού

ξεκίνησαν να διαχωρίζονται µε βάση το µοριακό τους βάρος.

Η πηκτή διαχωρισµού που χρησιµοποιήθηκε για κάθε πείραµα είχε περιεκτικότητα

πολυακρυλαµιδίου 8,5%. Η περιεκτικότητα αυτή επιλέχθηκε µε βάση το µοριακό

βάρος της πρωτεϊνης που θα ανιχνευθεί. Για µικρότερου µοριακού βάρους πρωτεϊνες,

επιλέγεται πυκνότερη πηκτή, έτσι ώστε να γίνει πιο καλά ο διαχωρισµός τους. Η

σύσταση των µιγµάτων για 2 πηκτές πάχους 1mm φαίνεται στον πίνακα 1:

Πηκτή διαχωρισµού 8,5% Πηκτή επιστοίβαξης

Διάλυµα ακρυλαµιδίου 30% 2,82 ml 0,4125 mlΡυθµιστικό διάλυµα

διαχωρισµού 4X2,5 ml -

Ρυθµιστικό διάλυµα

επιστοίβαξης 4X- 0,625 ml

ddH2O 4,68 ml 1,4625 ml10% APS 55 µl 17,5 µlTEMED 10 µl 5 µlΠίνακας 1: Σύσταση πηκτών διαχωρισµού και επιστοίβαξης.

32

Η πηκτή πολυακρυλαµιδίου σχηµατίζεται όταν το ακρυλαµίδιο και το δις-

ακρυλαµίδιο (Ν,Ν’-methylene-bis-acrylamide) πολυµεριστούν. Αυτή η αντίδραση

πυροδοτείται από τα διαλύµατα APS (Ammonium Persulfate) και ΤΕMED

(Tetramethylethylenediamine). Το TEMED επιταχύνει την ταχύτητα σχηµατισµού

ελεύθερων ριζών από το APS και αυτές µε τη σειρά τους µετατρέπουν τα µονοµερή

του ακρυλαµιδίου σε ελεύθερες ρίζες, οι οποίες αντιδρούν µε τα απενεργοποιηµένα

µονοµερή του ακρυλαµιδίου και έτσι αρχίσει ο πολυµερισµός τους. Τα

επιµηκυνόµενα πολυµερή ακρυλαµιδίου διασταυρώνονται τυχαία µε το δις-

ακρυλαµίδιο, γεγονός που οδηγεί στο σχηµατισµό πηκτής, η οποία διαθέτει

συγκεκριµένους πόρους, ανάλογα µε τις συνθήκες του πολυµερισµού και τη

συγκέντρωση των µονοµερών 88.

Πριν σχηµατιστεί η πηκτή, στο επάνω µέρος της (πηκτή επιστοίβαξης)

τοποθετήθηκαν ειδικά χτενάκια, τα οποία βοήθησαν στο σχηµατισµό βοθρίων

ορισµένου µεγέθους, µέσα στα οποία φορτώθηκε συγκεκριµένη ποσότητα από το

δείγµα.

4.1.5.3. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση

Η πηκτή στερεώθηκε σε συσκευή ηλεκτροφόρησης σε κάθετη διάταξη σε δοχείο

ηλεκτροφόρησης που περιείχε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (Running

Buffer) 1Χ. Στα βοθρία της πηκτής φορτώθηκαν 20µl από κάθε δείγµα κλώνων,

καθώς και 4µl από το µάρτυρα Prestained Protein Marker Broad Range (New

England Biotechnlogies) αραιωµένα σε 16µl 1Χ SDS-loadying dye. Σε τυχόν άδεια

βοθρία φορτώθηκαν 20µl 1Χ SDS-loadying dye, έτσι ώστε το κάθε βοθρίο να

περιέχει την ίδια ποσότητα διαλύµατος και η ηλεκτροφόρηση να πραγµατοποιηθεί

κατά ευθυγραµµισµένο τρόπο. Στη συνέχεια, η κάθε πηκτή ηλεκτροφορήθηκε στα

25mA. Τα δείγµατα αφού πέρασαν την πηκτή επιστοίβαξης στοιχήθηκαν στην

κορυφή της πηκτής διαχωρισµού και ξεκίνησε ο διαχωρισµός τους, µέχρι η χρωστική

(loadying dye) κάθε δείγµατος να φτάσει στη βάση της πηκτής διαχωρισµού.

33

4.1.5.4. Ηλεκτροµεταφορά

Μετά το τέλος της ηλετροφόρησης, ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών

από την πηκτή σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Protran 0,45µm NC, REF:

10600002, GE Healthcare Life Sciences). Συναρµολογήθηκε για το σκοπό αυτό ένα

«sandwich», ως εξής: Με κατεύθυνση από την πλευρά που αντιστοιχεί στην κάθοδο

προς αυτή που αντιστοιχεί στην άνοδο τοποθετήθηκαν διαδοχικά ένα σφουγγάρι,

χαρτί φίλτρου, η πηκτή πολυακρυλαµιδίου, η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, χαρτί

φίλτρου και ένα σφουγγάρι. Το χαρτί φίλτρου, τα σφουγγάρια και η µεµβράνη

µουσκεύθηκαν αρχικά σε ψυχρό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς. Το «sadnwich» µπήκε

σε δοχείο ηλεκτροφόρησης που συµπληρώθηκε µε διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς 1X

και µε µια παγοκύστη, ώστε να διατηρηθεί χαµηλή η θερµοκρασία και να παραµείνει

συµπαγής η πηκτή. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση για 1 ώρα στα 350mA.

4.1.5.5. Blocking

Στη συνέχεια το «sandwich» αποσυναρµολογήθηκε και η µεµβράνη χρωµατίστηκε µε

διάλυµα Ponceau S, ώστε να διαπιστωθεί αν το τρέξιµο και η ηλεκτροµεταφορά

πραγµατοποιήθηκαν οµαλά. Η µεµβράνη ξεπλύθηκε µε 1Χ PBST (Phosphate

Buffered Saline Tween-20) ώσπου να αποχρωµατιστεί και έπειτα επωάστηκε για 1

ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου µε ρυθµιστικό διάλυµα δέσµευσης των µη ειδικών

θέσεων (Blocking Buffer). Το Blocking Buffer αποτελείται από 5% σκόνη άπαχου

γάλακτος διαλυµένου σε 1Χ PBST. Είναι πλούσιο σε πρωτεϊνες, οι οποίες συνδέονται

στις θέσεις της µεµβράνης που δεν έχουν καλυφθεί κατά την ηλεκτροµεταφορά, έτσι

ώστε πάνω σε αυτές να µην δεσµευτούν µη ειδικά τα αντισώµατα κατά τα επόµενα

βήµατα. Ακολούθησε πλύση µε 1Χ PBST, για 5 λεπτά, υπό απαλή ανάδευση.

4.1.5.6. Ανοσοανίχνευση

Για την ανίχνευση των επιθυµητών πρωτεϊνών του δείγµατος χρησιµοποιήθηκαν

αντισώµατα που δεσµεύονται ειδικά επάνω τους (ανοσοανίχνευση).

Αρχικά πραγµατοποιήθηκε εντοπισµός της α-τουµπουλίνης (α-tubulin) του κάθε

δείγµατος, η οποία έχει µοριακό βάρος 52 kDa. Ο εντοπισµός αυτός ήταν

απαραίτητος, διότι η α-τουµπουλίνη είναι µια πρωτεϊνη των µικροσωληνίσκων των

κυττάρων που εκφράζεται σταθερά σε κάθε δείγµα, µιας και είναι απαραίτητη για τη

διατήρηση της βασικής κυτταρικής λειτουργίας (Ηousekeeping gene). Έτσι,

34

λειτούργησε ως δείκτης για τη σύγκριση της ολικής ποσότητας πρωτεϊνης που

φορτώθηκε στην πηκτή από κάθε δείγµα. Κατ’ αρχάς προστέθηκε το πρωτογενές

αντίσωµα κατά της α-τουµπουλίνης, προερχόµενο από κουνέλι (Cell Signaling a-

Tubulin Antibody #2144), σε συγκέντρωση 1:2000 σε 1X PBST. Έπειτα από επώαση

για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου ακολούθησαν τρεις πλύσεις 5 λεπτών µε 1Χ

PBST υπό απαλή ανάδευση και προστέθηκε το αντιιδιοτυπικό αντίσωµα goat anti-

rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, sc-2004), σε συγκέντρωση 1:5000, για 1

ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις 5 λεπτών µε 1X PBST και

στη συνέχεια προστέθηκε το υπόστρωµα της υπεροξειδάσης ραδικιού, η οποία ήταν

συζευγµένη µε το αντιιδιοτυπικό αντίσωµα. Πρόκειται για ένα µίγµα που αποτελείται

από 1:40 Detection Reagent B: Detection Reagent A (Pierce ECL Plus Solution A/B,

REF:1896327A/B ThermoFisher Scientific). Η µεµβράνη επωάστηκε µε το µίγµα

αντιδραστηρίων για 3 λεπτά και ακολούθησε σάρωση στο σύστηµα Typhoon FLA

7000.

Για την ανίχνευση της LMP1, η οποία έχει φαινοµενικό µοριακό βάρος 62 kDa, η

µεµβράνη ξεπλύθηκε µε 1X PBST και την επόµενη µέρα επωάστηκε για 1 ώρα σε

θερµοκρασία δωµατίου µε το πρωτογενές αντίσωµα S12, προερχόµενο από ποντίκι

(In House, αποτελεί το υπερκείµενο υγρό καλλιέργειας Β-λεµφοκυττάρων του

στελέχους S12 που παράγουν αντισώµατα κατά της LMP1), σε συγκέντρωση 1:4000

σε 1X PBST. Έπειτα ακολούθησαν τρεις πλύσεις 5 λεπτών µε 1Χ PBST υπό απαλή

ανάδευση και προστέθηκε το αντιιδιοτυπικό αντίσωµα goat anti-mouse IgG-HRP

(Santa Cruz Biotechnology, sc-2005), σε συγκέντρωση 1:5000, για 1 ώρα σε

θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις 5 λεπτών µε 1X PBST και στη

συνέχεια προστέθηκε το διάλυµα ECL Plus και ακολούθησε σάρωση στο σύστηµα

Typhoon FLA 7000.

Από τους κλώνους που εξετάστηκαν µε στύπωµα Western επιλέχθηκαν οι κλώνοι 3

και 9. Ο κλώνος 3 εκφράζει σταθερά την πρωτεΐνη LMP1, ενώ στον κλώνο 9 δεν

εντοπίστηκε η παρουσία της πρωτεΐνης LMP1. Ο κλώνος 9, ωστόσο, εκφράζει το

γονίδιο της ανθεκτικότητας, µε αποτέλεσµα να µπορεί να επιβιώσει σε θρεπτικό µέσο

εµπλουτισµένο µε Ζεοσίνη και για αυτό το λόγο χρησιµοποιήθηκε ως αρνητικός

κλώνος ελέγχου.

35

4.2. Kρυοσυντήρηση δειγµάτων

Αφού οι κλώνοι 3 και 9 κάλυψαν όλη την επιφάνεια της οπής στο τριβλίο 6 οπών, ο

καθένας µεταφέρθηκε σε τριβλίο διαµέτρου 10cm και καλλιεργήθηκε εκεί παρουσία

Ζεοσίνης (200µg/ml). Αφού καλύψουν όλη την επιφάνεια και αυτού του τριβλίου,

φυλάχθηκαν σε θρεπτικό µέσο κρυοσυντήρησης που αποτελείται από 90% βόειο

εµβρυϊκό ορό (Gibco, Fetal Bovine Serum, REF: 10270-106, Life Technologies,) και

10% DMSO (Dimethyl sulfoxide) σε θερµοκρασία -80 οC.

Δυστυχώς, λόγω δυσλειτουργίας της υπερκατάψυξης των -80 οC οι κλώνοι 3 και 9

που επιλέχθηκαν καταστράφηκαν, διότι µε σηµαντική αύξηση της θερµοκρασίας τα

κύτταρα παρέµειναν διαλυµένα στο µέσο κρυοσυντήρησης και θανατώθηκαν, λόγω

της τοξικότητας του DMSO.

Για το λόγο αυτό, τα πειράµατα συνεχίστηκαν µε δύο παλιότερους κλώνους που

δηµιουργήθηκαν στο εργαστήριο, τον κλώνο 67 ΝS 15 (εκφράζει σταθερά την

LMP1) και τον κλώνο 8 NS 3 (δεν εκφράζει την LMP1, αλλά διατηρεί την

ανθεκτικότητά του στη Ζεοσίνη), οι οποίοι επιπλέον εκφράζουν µόνιµα ένα µη ειδικό

(NS- Non Silencing) παρεµβαλλόµενο RNA, µετά από επιµόλυνση και ενσωµάτωση

του λεντι-ιϊκού φορέα έκφρασης shRNA pGIPZ (Dharmacon) στο γονιδίωµά τους 82

[Φωτογραφία 2].

36

Φωτογραφία 2: Φωτογραφίες οπτικής µικροσκοπίας των κλώνων 8 NS 3 (A1 10Χ, B1 20Χ) και

67 NS 15 (A2 10Χ, B2 20Χ). Στις φωτογραφίες είναι εµφανής η διαφορά στο σχήµα και τον τρόπο

ανάπτυξης των δύο κλώνων, γεγονός που οφείλεται στην έκφραση της πρωτεΐνης LMP1 στον

κλώνο 67 ΝS 15 και στην απουσία της LMP1 από τον κλώνο 8 NS 3.

4.3. Καταστολή της έκφρασης της TRAF5 µε siRNA

4.3.1. RNA interference και siRNAs

Για την καταστολή της έκφρασης της TRAF5 αξιοποιήθηκε ο µηχανισµός

παρεµβολής RNA (RNAi- RNA interference), ένας µηχανισµός ρύθµισης της

γονιδιακής έκφρασης, κατά τον οποίο µόρια RNA καταστέλλουν την έκφραση

ορισµένων γονιδίων, στοχεύοντας τα mRNA των γονιδίων αυτών, µε τα οποία είναι

συµπληρωµατικά. Ο µηχανισµός αυτός παρέχει στα κύτταρα άµυνα κατά των ξένων

νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που εισβάλλουν σε αυτά (οι οποίες µπορεί να

προέρχονται είτε από ιούς, είτε από τρανσποζόνια), καθώς επίσης παίζει πολύ

σηµαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη. Ορισµένα γονίδια κωδικοποιούν µικρά

πρόδροµα µόρια RNA (pri-miRNA), τα οποία υφίστανται επεξεργασία στον πυρήνα

από την πρωτεϊνη Drosha και αποκτούν δοµή φουρκέτας (pre-miRNA). Στη συνέχεια

εξέρχονται στο κυτταρόπλασµα, και η νουκλεάση Dicer κόβει τη φουρκέτα µε

37

αποτέλεσµα να παράγει µικρά διπλόκλωνα RNA, µεγέθους 21-22 νουκλεοτιδίων µε

3’ προεξέχοντα άκρα, µήκους 2 βάσεων. Τα µόρια αυτά ονοµάζονται siRNAs (small

interfering RNAs). Ο ένας κλώνος αυτών των siRNA είναι συµπληρωµατικός µε ένα

µέρος της αλληλουχίας κάποιου συγκεκριµένου mRNA. Ο κλώνος αυτός

ενσωµατώνεται στο σύµπλοκο RISC (RNA-induced silencing complex) και το

κατευθύνει κατά του συµπληρωµατικού του mRNA, το οποίο τελικά αποικοδοµείται

από το σύµπλοκο RISC 89–91.

Ο όρος siRNA χρησιµοποιείται και για να περιγράψει µικρά συνθετικά µόρια RNA

που µιµούνται τα προϊόντα της Dicer και τα οποία εισάγονται στα κύτταρα µε

επιµόλυνση, µε σκοπό να καταστείλουν την έκφραση ορισµένων επιθυµητών

γονιδίων. Στα πειράµατα καταστoλής της έκφρασης της TRAF5 χρησιµιοµποιήθηκαν

2 ειδών siRNAs:

1. siRNA που στοχεύει το mRNA του γονιδίου της λουσιφεράσης (luciferase) της

πυγολαµπίδας Photinus pyralis (Custom made από την Eurofins Genomics,

Πίνακας 2), το οποίο δεν υπάρχει στους κλώνους που επιµολύνθηκαν. Έτσι, το

siRNA αυτό χρησιµοποιείται σαν αρνητικός µάρτυρας.

2. siRNA που στοχεύει το mRNA του γονιδίου της TRAF5 (Hs TRAF 5 5,

FlexiTube siRNA, Cat No: SI00302022, Qiagen).

Όνοµα siRNA Αλληλουχία

siRNA luciferase 5’- CGUACGCGGAAUACUUCGA(dTdT)(19) -3’

Πίνακας 2: Η αλληλουχία του siRNA κατά του mRNA του γονιδίου της λουσιφεράσης (Custom

made από την Eurofins Genomics).

4.3.2. Επιµόλυνση κλώνων µε siRNA

Αρχικά τα κύτταρα µεταφέρθηκαν σε τριβλίο 12 οπών. Από κάθε κλώνο σε 2 οπές

τοποθετήθηκαν 300.000 κύτταρα και 0.5ml θρεπτικό στην καθέ µία. Την επόµενη

µέρα, πραγµατοποιήθηκε η επιµόλυνση των κυττάρων.

Για να επιτευχθεί η επιµόλυνση χρησιµοποιήθηκε το αντιδραστήριο lipofectamine

RNAiMAX Reagent (Invitrogen, REF: 13778-150). To αντιδραστήριο αυτό περιέχει

λιπιδιακές υποµονάδες, οι οποίες σε ένα υδάτινο περιβάλλον σχηµατίζουν

38

λιποσώµατα. Τα λιποσώµατα που είναι θετικά φορτισµένα παγιδεύουν το αρνητικά

φορτισµένο siRNA και συντίκονται µε την αρνητικά φορτισµένη κυτταρική

µεµβράνη. Επιτρέπουν έτσι στο siRNA να ξεπεράσει την ηλεκτροστατική απώθηση

της κυτταρικής µεµβράνης και να εισέλθει στο κύτταρο 92.

Σε διαφορετικούς αποστειρωµένους πλαστικούς σωλήνες 1,5ml τοποθετήθηκαν:

1. 23.5µl Opti-MEM Reduced Serum Medium (Opti-Minimal Essential Medium I

1X, GlutaMAX-I Supplement, REF: 51985-026, Life Technologies) και 1.5µl

lipofectamine RNAiMAX Reagent

2. 24.5µl OPTI-MEM και 0.5µl από το siRNA

Μετά από 5 λεπτά, το περιεχόµενο του σωλήνα µε το siRNA µεταφέρθηκε στον

σωλήνα µε το αντιδαστήριο lipofectamine RNAiMAX Reagent. Μετά από 10 λεπτά

επώασης, τα 50µl του µίγµατος ρίχθηκαν σπειροειδώς στις οπές µε τα κύτταρα και το

τριβλίο αναδεύτηκε ήπια.

Την επόµενη µέρα στις οπές του τριβλίου 12 οπών τοποθετήθηκαν 100µl τρυψίνης

και 1ml θρεπτικού. Στη συνέχεια, µε τη βοήθεια του αιµοκυτταρόµετρου Neubauer,

υπολογίστηκε ο συνολικός αριθµός των κυττάρων στην κάθε οπή και από κάθε

κλώνο µεταφέρθηκαν 5000 κύτταρα σε 100µl θρεπτικού µε 200µg/ml Ζεοσίνης σε 5

οπές τριβλίου 96 οπών.

Όσα από τα κύτταρα των κλώνων περίσσεψαν, µεταφέρθηκαν σε τριβλίο 12 οπών, σε

τελικό όγκο 1ml, όπου αναπτύχθηκαν για 3 µέρες παρουσία 200µg/ml Ζεοσίνης.

Μετά την πάροδο των 3 µερών, από το κάθε οπή χρησιµοποιήθηκαν 500µl για τη

διεξαγωγή στυπώµατος Western και 500µl για τη διεξαγωγή Real-time PCR (βλέπε

ενότητες 4.5 και 4.6.1), έτσι ώστε να επαληθευτεί ότι η καταστολή της έκφρασης της

TRAF5 ήταν επιτυχής.

4.4. Μέτρηση βιωσιµότητας µετά την καταστολή της έκφρασης της TRAF5

Μετά από 3 µέρες ανάπτυξης στο τριβλίο των 96 οπών υπό καταστολή της έκφρασης

της TRAF5, πραγµατοποιήθηκε µέτρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων µε τη

39

χρήση του άλατος MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide).

4.4.1. ΜΤΤ

Το άλας ΜΤΤ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

µεταβολίζεται από τα µιτοχόνδρια των ζωντανών κυττάρων απελευθερώνοντας στο

διάλυµα µια µωβ ουσία που ονοµάζεται φορµαζάνη 93. Με τη χρήση φωτοµέτρου

ELISA, προσδιορίζεται η ποσότητα φορµαζάνης που απελευθερώνεται σε κάθε

περίπτωση, η οποία αντιστοιχεί στη βιωσιµότητα των κυττάρων. Η σχέση της

απορρόφησης µε την πραγµατική ποσότητα φορµαζάνης που απελευθερώνεται είναι

εκθετική. Μετά από µία ορισµένη ποσότητα φορµαζάνης, η καµπύλη φτάνει σε ένα

πλατό και η απορρόφηση δεν αντικατοπτρίζει µε ακρίβεια την ποσότητα φορµαζάνης.

Γι’ αυτό το λόγο, οι µετρήσεις πρέπει να πραγµατοποιούνται στη γραµµική περιοχή

της καµπύλης, η οποία προσδιορίζεται για κάθε κλώνο µε τη δηµιουργία πρότυπης

καµπύλης.

Στο τριβλίο 96 οπών τοποθετήθηκαν σε κάθε οπή 10µl διαλύµατος MTT (5mg/ml,

Sigma Aldrich, REF: M2128). Ύστερα από τέσσερις ώρες επώασης, το θρεπτικό από

κάθε οπή αφαιρέθηκε και οι κρύσταλλοι της φορµαζάνης που βρίσκονται στον πάτο

των οπών διαλύθηκαν µε τη χρήση 100µl όξινης ισοπροπανόλης (ισοπροπανόλη, 10%

TritonX και µία σταγόνα πυκνού υδροχλωρίου) σε κάθε οπή. Το τριβλίο επωάστηκε

για µία ώρα σε σκοτεινό σηµείο και ακολούθησε η φωτοµέτρησή του σε

φασµατοφωτόµετρο ΕLISA (Bio-TekEL 311), στα 570nm.

To πείραµα επαναλήφθηκε 4 φορές, έτσι ώστε τα τελικά αποτελέσµατα να είναι

στατιστικά σηµαντικά.

4.5. Επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 και

επιβεβαίωση της έκφρασης της LMP1 από τον κλώνο 67 NS 15 µε

στύπωµα Western

Μετά τη διµόλυνση των κλώνων µε τα siRNAs, από το τριβλίο των 12 οπών (βλέπε

ενότητα 4.3.2) συλλέχθηκαν 500µl εναιωρήµατος κυττάρων, φυγοκεντρήθηκαν στις

6.000 στροφές το λεπτό για 5 λεπτά, το ίζηµα ξεπλύθηκε 3 φορές σε PBS 1X και

40

τέλος διαλύθηκε σε 100µl SDS-loading dye 1X, κατά τον τρόπο που περιγράφεται

στην ενότητα 4.1.5.1.

Με σκοπό την επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5, στα βοθρία

της πηκτής φορτώθηκαν 20µl από τα δείγµατα των κλώνων και 4µl από το µάρτυρα

PINK Prestained Protein Marker (Nippon Genetics, Cat. No: MWPO2) αραιωµένα σε

16µl 1Χ SDS-loadying dye.

Κατά την ανοσοανίχνευση, η µεµβράνη κόπηκε σε 2 τµήµατα. Αρχικά, στο κάτω

τµήµα της µεµβράνης πραγµατοποιήθηκε εντοπισµός της β-ακτίνης (b-actin) του

κάθε δείγµατος, η οποία έχει µοριακό βάρος 42 kDa. Ο εντοπισµός αυτός ήταν

απαραίτητος, διότι η β-ακτίνη είναι µια πρωτεϊνη του κυτταρικού σκελετού που

εκφράζεται σταθερά σε κάθε δείγµα, µιας και είναι απαραίτητη για την κυτταρική

κινητικότητα και την κυτταρική δοµή (Ηousekeeping gene). Έτσι, λειτούργησε ως

δείκτης για τη σύγκριση της ολικής ποσότητας πρωτεϊνης που φορτώθηκε στην πηκτή

από κάθε δείγµα. Κατ’ αρχάς προστέθηκε το πρωτογενές αντίσωµα κατά της β-

ακτίνης, προερχόµενο από ποντίκι (β-Actin Antibody C4, Santa Cruz Biotechnology,

sc-47778), σε συγκέντρωση 1:5000 σε 1X PBST. Έπειτα από επώαση για 1 ώρα σε

θερµοκρασία δωµατίου ακολούθησαν τρεις πλύσεις 5 λεπτών µε 1Χ PBST υπό απαλή

ανάδευση και προστέθηκε το αντιιδιοτυπικό αντίσωµα goat anti-Μouse IgG-HRP

(Santa Cruz Biotechnology, sc-2005), σε συγκέντρωση 1:5000, για 1 ώρα σε

θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις 5 λεπτών µε 1X PBST και στη

συνέχεια προστέθηκε το διάλυµα ECL Plus και πραγµατοποιήθηκε σάρωση στο

σύστηµα Typhoon FLA 7000.

Για την ανίχνευση της TRAF5, η οποία έχει µοριακό βάρος 55 kDa το επάνω τµήµα

της µεµβράνης επωάστηκε για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου µε το πρωτογενές

αντίσωµα TRAF5 H-257 Rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Cat No:

sc-7220), προερχόµενο από κουνέλι, σε συγκέντρωση 1:200 σε 1X PBST. Έπειτα

ακολούθησαν τρεις πλύσεις 5 λεπτών µε 1Χ PBST υπό απαλή ανάδευση και

προστέθηκε το αντιιδιοτυπικό αντίσωµα goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz

Biotechnology, sc-2004), σε συγκέντρωση 1:1000, για 1 ώρα σε θερµοκρασία

δωµατίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις 5 λεπτών µε 1X PBST και στη συνέχεια

προστέθηκε το διάλυµα ECL Plus και ακολούθησε σάρωση στο σύστηµα Typhoon

41

FLA 7000. Η παντελής απουσία ή η µειωµένη ένταση της ζώνης στην περιοχή όπου

έτρεξαν τα δείγµα που επιµολύνθηκαν µε το siRNA κατά του mRNA της TRAF5

υποδηλώνει την επιτυχή καταστολή της έκφρασης της πρωτεϊνης αυτής.

Το επάνω τµήµα της µεµβράνης ξεπλύθηκε σε PBST 1X και την επόµενη µέρα

πραγµατοποιήθηκε σε αυτό η ανοσοανίχνευση της πρωτεϊνης LMP1, όπως ακριβώς

περιγράφεται στην ενότητα 4.1.5.6. Η παρουσία ζώνης στην περιοχή όπου έτρεξαν τα

δείγµατα που προέρχονται από τον κλώνο 67 NS 15 υποδηλώνει τη σταθερή έκφραση

της LMP1 από αυτόν τον κλώνο.

4.6. Επιβεβαίωση της καταστολή της έκφρασης της TRAF5 µε αλυσιδωτή

αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (RT-PCR)

Ένας ακόµη τρόπος για να επιβεβαιωθεί η καταστολή της έκφρασης της TRAF5 είναι

η χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου, RT-PCR

(Real Time- Polymerase Chain Reaction), η οποία επιτρέπει τον προσδιορισµό των

επιπέδων έκφρασης των γονιδίων. Η RT- PCR δίνει την δυνατότητα

παρακολούθησης της σύνθεσης νέων προϊόντων πολλαπλασιασµού (amplicon

molecules) της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης σε κάθε κύκλο, κάτι που την

καθιστά ένα πολύ χρήσιµο πειραµατικό εργαλείο.

H παρακολούθηση της διαδικασίας της ενίσχυσης του DNA σε πραγµατικό χρόνο

πραγµατοποιείται µέσω της ανίχνευσης των προιόντων της PCR µε διάφορες

φθορίζουσες ουσίες94,95. Μια τέτοια ουσία είναι το SYBR Green Ι, το οποία

συνδέεται στο δίκλωνο DNA στην περιοχή της µικρής αύλακας. Η σύνδεση αυτή

αλλάζει την διαµόρφωση της ουσίας, µε αποτέλεσµα να διεγείρεται από ένα λέιζερ

που υπάρχει στην συσκευή. Για να επανέλθει στα αρχικά επίπεδα ενέργειας, εκπέµπει

ακτινοβολία µε µέγιστο στα 520nm και ο φθορισµός αυτός καταγράφεται από τη

συσκευή 96. Όταν η εκποµπή ακτινοβολίας από το SYBR Green Ι παρακολουθείται σε

πραγµατικό χρόνο παρατηρείται µια αύξηση του φθορισµού κατά το στάδιο του

πολυµερισµού (διπλόκλωνο DNA) και µια µείωση του φθορισµού στο στάδιο της

αποδιάταξης (µονόκλωνο DNA). Έτσι, η µέτρηση του φθορισµού πρέπει να

πραγµατοποιείται πάντα στο τέλος του βήµατος επιµήκυνσης κάθε κύκλου PCR.

42

Η ένταση του φθορισµού αυξάνεται σταδιακά σε συνάρτηση µε την αύξηση των

αντιγράφων που παράγονται σε κάθε κύκλο της αντίδρασης (αύξηση ποσότητας

διπλόκλωνου DNA, Διάγραµµα 1). Το σηµείο Threshold είναι το σηµείο στο οποίο το

φθορίζον σήµα των προϊόντων της RT-PCR ξεχωρίζει έντονα από το φόντο και

αντιστοιχεί στη µέση της εκθετικής φάσης της καµπύλης ενίσχυσης των ανιγράφων

DNA (Διάγραµµα 1). Ο κύκλος κατά τη διάρκεια του οποίου το σήµα του δείγµατος

φτάσει στο σηµείο Threshold ονοµάζεται Threshold cycle (Ct). Όσο µεγαλύτερη είναι

η ποσότητα του αρχικού DNA στο κάθε δείγµα, τόσο νωρίτερα θα φτάσει το σήµα

του φθορισµού στην τιµή Threshold, και άρα τοσο µικρότερη θα είναι η τιµή Ct.

Διάγραµµα 1: Καµπύλη ενίσχυσης RT-PCR (amplification curve). Διακρίνεται από την αρχική

φάση (1. Initation phase), κατά την οποία το σήµα φθορισµού δεν ξεχωρίζει από το φόντο, την

εκθετική φάση (2. Exponential phase), κατά την οποία πραγµατοποιείται µια εκθετική αύξηση

στο σήµα του φθορισµού και µία φάση πλατό (3. Plateau), κατά την οποία τα αντιδραστήρια της

αντίδρασης έχουν εξαντληθεί και δεν παρατηρείται πλέον καµία αύξηση στο σήµα του

φθορισµού. Στη µέση της εκθετικής φάσης η ένταση του φθορισµού φτάνει στο σηµείο

Threshold (ξεχωρίζει έντονα από το φόντο) και ο κύκλος στον οποίο παρατηρείται αυτό

ονοµάζεται Threshold Cycle- Ct [πηγή: http://www.highveld.com/pcr/real-time-pcr-

quantification-analysis.html ].

H χρήση του SYBR Green Ι µπορεί να γίνει µε οποιοδήποτε ζεύγος εκκινητών, για

οποιοδήποτε στόχο, κάτι που την καθιστά πολύ οικονοµική97. Ωστόσο το SYBR

Green Ι έχει και ορισµένα µειονεκτήµατα, όπως το γεγονός ότι η ειδικότητά του

εξαρτάται αποκλειστικά από τους εκκινητές (σε σχέση µε άλλες φθορίζουσες ουσίες

που αναγνωρίζουν συγκεκριµένες αλληλουχίες του DNA) 98. Eπίσης το SYBR Green

Ι µπορεί να συνδεθεί σε οποιοδήποτε τµήµα διπλόκλωνου DNA, και άρα και σε

διµερή εκκινητών που µπορεί να σχηµατιστούν µετά από υβριδισµό των εκκινητών

43

στο µίγµα (εσφαλµένος διµερισµός εκκινητών- primer dimer artifacts). Για το λόγο

αυτό, το SYBR Green Ι µπορεί να παρέχει λανθασµένο σήµα φθορισµού.

Για να ανιχνευθεί το κατά πόσο έχουν σχηµατιστεί διµερή εκκινητών και άρα το κατά

πόσο λανθασµένο σήµα φθορισµού ανιχνεύεται, πραγµατοποιείται η καµπύλη

αποδιάταξης (melting curve), µε την οποία µπορούν να αξιολογηθούν τα προϊόντα

της αντίδρασης. Για το σχηµατισµό της καµπύλης αποδιάταξης, η θερµοκρασία

αυξάνεται (κάτι που οδηγεί στη µετάβαση του DNA από διπλόκλωνο σε µονόκλωνο)

και η συσκευή παρακολουθεί την αλλαγή που συντελείται στην ένταση του

φθορισµού99 [Διάγραµµα 2]. Η καµπύλη αποδιάταξης βασίζεται στη θερµοκρασία

αποδιάταξης (melting temperature –Tm) των προϊόντων της αντίδρασης. H Tm είναι

η θερµοκρασία στην οποία αποδιατάσεται κάθε τµήµα DNA και η οποία εξαρτάται

από το µέγεθος του τµήµατος αυτού.

Διάγραµµα 2: Παράδειγµα καµπύλης αποδιάταξης (πράσινη γραµµή) σε διάγραµµα µέτρησης

του φθορισµού (Fluorescence) σε συνάρτηση µε τη θερµοκρασία (Temperature). Με την αύξηση

της θερµοκρασίας παρατηρείται µια µετάβαση από υψηλά επίπεδα φθορισµού (pre-melt phase,

διπλόκλωνο DNA) σε χαµηλότερα επίπεδα φθορισµού (post-melt phase, µονόκλωνο DNA). Τα

επίπεδα φθορισµού µειώνονται καθώς το SYBR Green I απελευθερώνεται από το διπλόκλωνο

DNA, διότι αυτό µε την αύξηση της θερµοκρασίας αποδιατάσσεται σε µονόκλωνο. To µέσο

σηµείο της καµπύλης αποδιάταξης, στο οποίο η ταχύτητα µείωσης του φθορισµού είναι η

µέγιστη, αντιστοιχεί στη θερµοκρασία αποδιάταξης (Tm) [πηγή: http://www.gene-

quantification.de/hrm-protocol-cls.pdf].

Τα προϊόντα της αντίδρασης θα πρέπει να έχουν ίδια θερµοκρασία αποδιάταξης.

Διαφορετικές θερµοκρασίες αποδιάταξης στην καµπύλη αποδιάταξης µαρτυρούν την

ύπαρξη διµερών εκκινητών [Διάγραµµα 3].

44

Διάγραµµα 3: Παράδειγµα καµπύλης αποδιάταξης, όπου φαίνεται η µέτρηση του φθορισµού

(Fluorescence) σε συνάρτηση µε τη θερµοκρασία (Temperature). Εµφανίζονται τρεις

διαφορετικές κορυφές, Α, Β, Γ. Η υψηλότερη κορυφή (Γ) αντιστοιχεί στη θερµοκρασία

αποδιάταξης του επιθυµητού προϊόντος (Tm). Οι κορυφές Α και Β αντιστοιχούν σε διαφορετικές

θερµοκρασίες αποδιάταξης από αυτή της κορυφής Γ και οφείλονται σε διµερή εκκινητών [πηγή:

http://realtimepcr.dk/tm/ ].

4.6.1. Αποµόνωση RNA και σύνθεση cDNA

Για να γίνει η ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου της TRAF5 µε

την χρήση της RT-PCR, προηγείται η αποµόνωση του RNA των κυττάρων και η

χρήση του στη σύνθεση cDNA (complementary DNA).

Μετά τη διµόλυνση των κλώνων µε τα siRNAs, από το τριβλίο των 12 οπών (βλέπε

ενότητα 4.3.2) συλλέχθηκαν 500µl εναιωρήµατος κυττάρων, φυγοκεντρήθηκαν στις

5.500 στροφές το λεπτό για 5 λεπτά και το ίζηµα διαλύθηκε σε 250µl αντιδραστηρίου

TRI (TRI Reagent, Molecular Research Center, REF: TR118). Το αντιδραστήριο

αυτό περιέχει φαινόλη και ισοθειοκυανική γουανιδίνη, µε αποτέλεσµα να αναστέλλει

άµεσα τη δράση των RNασών. To µίγµα αναδεύτηκε καλά και αφέθηκε σε

θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 50µl (1/5 αρχικού

όγκου TRI) χλωροφορµίου, το οποίο έπεσε διαφανές στον πάτο του σωλήνα. Ύστερα

από ισχυρή ανάδευση µε στροβιλισµό το µίγµα έγινε γαλακτώδες και το

χλωροφόρµιο ανέβηκε στην επιφάνεια. Το µίγµα αφέθηκε για 10 λεπτά σε

θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 στροφές το

λεπτό, στους 4οC για 10 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, το RNA βρισκόταν στην

υδάτινη διαφανή φάση στην επιφάνεια, οι πρωτεϊνες στην οργανική φάση στον πάτο

και το DNA µεταξύ των δύο φάσεων. Η υδάτινη φάση µε το RNA µεταφέρθηκε σε

νέο αποστειρωµένο σωλήνα 1.5 ml και προστέθηκε ισοπροπανόλη όγκου ίσου µε την

45

υδάτινη φάση. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση µε στροβιλισµό και το µίγµα

φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 στροφές το λεπτό, στους 4οC για 10 λεπτά. Μετά από

αυτή τη φυγοκέντρηση το RNA κάθισε ως ίζηµα στον πάτο. Αφαιρέθηκε η

υπερκείµενη ισοπροπανόλη και το ίζηµα ξεπλύθηκε µε 300µl 70% αιθανόλης σε νερό

επεξεργασµένο µε DEPC (Diethylpyrocarbonate, 1ml DEPC ανά λίτρο νερού,

επώαση στους 37οC και αποστείρωση την επόµενη µέρα µε σκοπό την

απενεργοποίηση του DEPC), το οποίο απενεργοποίησε της RNάσες του νερού. Στη

συνέχεια το µίγµα του RNA και της ισορποπανόλης φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά

στις 13000 στροφές το λεπτό, το υπερκείµενο αφαιρέθηκε και αφού στέγνωσε

εντελώς το ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε 20µl νερού επεξεργασµένου µε DEPC. Από

αυτό 10µl χρησιµοποιήθηκαν για τη σύνθεση του cDNA και το υπόλοιπο

αποθηκεύτηκε στους -20οC.

Για την σύνθεση του cDNA στα 10µl από το RNA που αποµονώθηκε προστέθηκαν

2,2µl νερού επεξεργασµένο µε DEPC και 1µl oligo(dT) primer 0,5µg/µl (Custom

Made) και το µίγµα επωάστηκε για 5 λεπτά στους 70οC, µε σκοπό οι oligo(dT)

primers να υβριδιστούν στην poly(A) ουρά του mRNA, από όπου θα ξεκινήσει και η

σύνθεση του cDNA. Στη συνέχεια προστέθηκαν 0,8µl από το ένζυµο Revert Aid

Reverse Τranscriptase (ThermoFisher Scientific, REF: EP0441). Το ένζυµο αυτό

διαθέτει δράση αντίστροφης µεταγραφάσης που συνθέτει DNA µε µήτρα RNA και τη

δράση RNάσης Η, η οποία αποικοδοµεί το RNA που συναντά σε υβρίδια RNA-

DNA102. Τέλος, στο µίγµα προστέθηκαν 4µl ρυθµιστικού διαλύµατος µε MgCl2

(ThermoFisher Scientific, 5Χ Reaction Buffer for Reverse Transcriptase: 250mM

Tris-HCl, ph=8.3/ 250mM KCl, 20mM MgCl2/ 50mM DTT) και 2µl µίγµατος dNTPs

10mM το οποίο περιέχει 5µl dATP (GeneON, Cat No: 110-011A), 5µl dGTP

(GeneON, Cat No: 110-011G), 5µl dTTP (GeneON, Cat No: 110-011T), 5µl dCTP

(GeneON, Cat No: 110-011C) και 30µl νερού επεξεργασµένο µε DEPC. To µίγµα

επωάστηκε για 1 ώρα στους 42οC και πραγµατοποιήθηκε η αντίδραση της

αντίστροφης µεταγραφής. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκε στους 70οC για 10 λεπτά, µε

σκοπό να καταστραφεί η αντίστροφη µεταγραφάση. Για τη διεξαγωγή των

αντιδράσεων της RT-PCR 5µl από το cDNA που παράχθηκε, τοποθετήθηκαν σε νέο

αποστειρωµένο σωλήνα 1,5ml σε 45µl δισαπεσταγµένου αποστειρωµένου νερού

(αραίωση 1:10).

46

4.6.2. RT-PCR

Οι εκκινητές που επιλέχθηκαν για τη διεξαγωγή της RT-PCR αφορούσαν τόσο την

ενίσχυση του γονιδίου της πρωτεϊνης TRAF5, όσο και την ενίσχυση του γονιδίου της

πρωτεϊνης GAPDH (Custom Made, Πίνακας 3). Η GAPDΗ (Glyceraldehyde 3-

phosphate dehydrogenase) παίζει ένα σηµαντικότατο ρόλο στο µεταβολισµό του

κυττάρου, καθώς καταλύει το έκτο βήµα της γλυκόλυσης και συµβάλει έτσι στην

παραγωγή ενέργειας και µορίων του άνθρακα. Είναι δηλαδή απαραίτητη για τη

διατήρηση της βασικής κυτταρικής λειτουργίας (Housekeeping gene) και εκφράζεται

σταθερά σε όλα τα κύτταρα. Έτσι, χρησιµοποιήθηκε ως θετικός µάρτυρας για να

ελεχθεί το κατά πόσο οι αντιδράσεις της PCR πραγµατοποιήθηκαν µε επιτυχία, αλλά

και ως δείκτης για τη σύγκριση της ολικής ποσότητας cDNA που ενισχύθηκε.

Όνοµα εκκινητή Αλληλουχία

GAPDH forward 5'- AGCCACATCGCTCAGACAC -3'

GAPDH reverse 5'- GCCCAATACGACCAAATCC -3'

TRAF5 forward 5'- TTCAAGCAGTTTGCACAGTTG -3'

TRAF5 reverse 5'- AATGTGACTGGCAAAAACCTG -3'

Πίνακας 3: Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στις αντιδράσεις της RT-PCR

(Custom Made).

Οι αντιδράσεις της Real-Time PCR πραγµατοποιήθηκαν στο µηχάνηµα StepOne

Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific, Cat. No: 4376357). Αρχικά

προετοιµάστηκε το master mix για κάθε ζεύγος εκκινητών. Αυτό περιλαµβάνει το το

µίγµα SYBR FAST qPCR Kit (Kapa Biosystems, REF: KK4604), το οποίο περιέχει

όλα τα συστατικά της αντίδρασης, µε εξαίρεση τους εκκινητές και το cDNA. Στο

µίγµα αυτό προστέθηκε το ζεύγος των δύο εκκινητών µε συγκέντρωση 1 pmol/µl και

φιλτραρισµένο νερό. Σε κάθε θέση της αντίδρασης προστέθηκαν 8µl από το master

mix, έτσι ώστε κάθε θέση να περιέχει 1µl από το ζεύγος εκκινητών, 5µl από το SYBR

FAST qPCR Kit και 2µl φιλτραρισµένου νερού. Τέλος, σε κάθε θέση της αντίδρασης

προστέθηκαν 2 µl δείγµατος cDNA. Κάθε αντίδραση πραγµατοποιήθηκε τρεις φορές,

σε τρεις διαφορετικές θέσεις (triplicates), έτσι ώστε να µειωθεί το σχετικό σφάλµα

από πιθανά λάθη στο πιπετάρισµα.

47

Η µεθοδολογία της εφαρµογής της αντίδραση της RT-PCR θα πρέπει να

περιλαµβάνει πάντα και αρνητικούς µάρτυρες µαζί µε τα προς ανάλυση δείγµατα,

έτσι ώστε να είναι δυνατή η εξέταση του ενδεχοµένου επιµόλυνσης του διαλύµατος

της αντίδρασης µε ξένο DNA. Οι αρνητικοί αυτοί µάρτυρες αφορούν την εφαρµογή

κανονικής αντίδρασης µε χρήση όλων των υλικών της PCR πλήν του DNA. Συνήθως

χρησιµοποιείται νερό αντί του αντίστοιχου όγκου DNA. Έτσι, για κάθε ζεύγος

εκκινητών προετοιµάζεται και ένα “τυφλό” δείγµα, στο οποίο δεν τοποθετείται

καθόλου cDNA.

Στη συνέχεια τα δείγµατα τοποθετήθηκαν στο µηχάνηµα και πραγµατοποιήθηκε η

έναρξη των αντιδράσεων. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 40 κύκλοι ενίσχυσης.

Αρχικά. το δείγµα θερµάνθηκε στους 95oC για 20sec, και έπειτα για 40 κύκλους

στους 95oC για 3sec και στους 60oC για 30sec. Για το σχηµατισµό της καµπύλης

αποδιάταξης, αρχικά το δείγµα θερµάνθηκε στους 95oC για 15 sec, έπειτα στους 60oC

για 1 min και τέλος στους 95oC για 15 sec.

Η ανάλυση των αποτελεσµάτων πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο ΔΔCt. Τα

αποτελέσµατα της αντίδρασης αποτυπώθηκαν σε µορφή τιµών Ct. Αρχικά

υπολογίστηκε ο µέσος όρος των τριών τιµών Ct κάθε δείγµατος (triplicates). Η τιµή

ΔCt προέκυψε από την αφαίρεση του µέσου όρου των τιµών Ct του γονιδίου

αναφοράς (GAPDH) από το µέσο όρο των τιµών Ct του γονιδίου ενδιαφέροντος

(TRAF5). Η τιµή ΔΔCt προέκυψε από την αφαίρεση της τιµής ΔCt του δείγµατος

ελέγχου (το δείγµα που έχει µολυνθεί µε το siRNA που στοχεύει το γονίδιο της

λουσιφεράσης) από αυτή του δείγµατος που αναλύεται (δηλαδή το δείγµα που έχει

µολυνθεί µε το siRNA που στοχεύει το γονίδιο της TRAF5). Τα επίπεδα έκφρασης

(fold expression) του κάθε δείγµατος υπολογίστηκαν µε βάση την εξίσωση fold

expression= 2-ΔΔCt. Όταν η τιµή του fold expression είναι µεταξύ 0 και 1, τα επίπεδα

έκφρασης του γονιδίου ενδιαφέροντος στο δείγµα που αναλύεται είναι χαµηλότερα

από τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ενδιαφέροντος στο δείγµα ελέγχου. Όταν η

τιµή του fold expression είναι µεγαλύτερη από 1, τότε τα επίπεδα έκφρασης του

γονιδίου ενδιαφέροντος στο δείγµα που αναλύεται είναι υψηλότερα από τα επίπεδα

έκφρασης του γονιδίου ενδιαφέροντος στο δείγµα ελέγχου 103. Αφαιρώντας στη

συνέχεια την τιµή του fοld expression από τη µονάδα, υπολογίστηκε το ποσοστό

καταστολής του mRNA της TRAF5 στο κάθε δείγµα.

48

5. Αποτελέσµατα

5.1.1. Ανίχνευση κλώνων που εκφράζουν την LMP1 µε στύπωµα

Western

Κατά τη δηµιουργία κλώνων που εκφράζουν σταθερά την LMP1 από κυτταρικές

σειρές 293FT πραγµατοποιήθηκε στύπωµα Western, έτσι ώστε να ελεχθεί ποιος

κλώνος από αυτούς που αποµονώθηκαν εκφράζει την LMP1. Στην Εικόνα 6 φαίνεται

πως ο κλώνος 3 εκφράζει την LMP1, ενώ ο κλώνος 9, ο οποίος επιλέχθηκε ως

αρνητικός κλώνος, δεν την εκφράζει.

Εικόνα 6: Αποτελέσµατα του στυπώµατος Western για την ανίχνευση των κλώνων που

εκφράζουν την LMP1. Φαίνεται τόσο η ανίχνευση της LMP1 µε το αντίσωµα S12, όσο και η

ανίχνευση της α-τουµπουλίνης. Mαζί µε τους κλώνους φορτώθηκε και δείγµα από τη µαζική

καλλιέργεια που επιµολύνθηκε µε τα πλασµίδια pE-selectin-zeo και pcDNA3-LMP1 (Μαζική

καλλιέργεια pcDNA3-LMP1). H LMP1 εντοπίζεται στα 62kDa, ενώ η α-τουµπουλίνη στα 52kDa.

Είναι φαναιρό, πως ο κλώνος 3 εκφράζει την LMP1, ενώ οι υπόλοιποι κλώνοι (από τους οποίους

επιλέχθηκε ο κλώνος 9) δεν την εκφράζουν.

5.1.2. Πρότυπες καµπύλες oπτικής απορρόφησης της µεθόδου ΜΤΤ

Κατά τη µελέτη της βιωσιµότητας των κλώνων µε το άλας MTT πραγµατοποιήθηκαν

µετρήσεις της οπτικής απορρόφησης (OD-Optical Density) της φορµαζάνης που

ελευθερώνεται σε κάθε οπή του τριβλίου 96 οπών. Όσο περισσότερα κύτταρα είναι

βιώσιµα, τόσο περισσότερη φορµαζάνη ελευθερώνεται. Για να επιβεβαιωθεί πως οι

µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν στη γραµµική περιοχή της καµπύλης οπτικής

απορρόφησης-ποσότητας φορµαζάνης και όχι στο πλατό (όπου η απορρόφηση δεν

αντικατοπτρίζει µε ακρίβεια την ποσότητα φορµαζάνης) πραγµατοποιήθηκε πρότυπη

καµπύλη οπτικής απορρόφησης για κάθε κλώνο. Στην καµπύλη αυτή φαίνεται η

49

οπτική απορρόφηση της φορµαζάνης που παράγεται όταν διαφορετικοί αριθµοί

κυττάρων τοποθετούνται στις οπές του τριβλίου 96 οπών [Διαγράµµατα 4,5]. Τα

αποτελέσµατα έδειξαν πως τόσο στην περίπτωση του κλώνου 8, όσο και του κλώνου

67 (LMP1+), o αριθµός των 5000 κυττάρων ανά οπή που επιλέχθηκε για τη

διεξαγωγή των πειραµάτων βιωσιµότητας δίνει µετρήσεις οπτικής απορρόφησης που

αντιστοιχούν στη γραµµική φάση της καµπύλης, και όχι στο πλατό.

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

Οπτικήαπ

ορρόφησ

η(OD)σ

τα570nm

Αριθμόςκυττάρων

Πρότυπηκαμπύληοπτικήςαπορρόφησης στα570nm κλώνου8

Διάγραµµα 4: Πρότυπη καµπύλη οπτικής απορρόφησης (OD) στα 570nm για τον κλώνο 8 για την

εκτίµηση της βιωσιµότητας µε τη µέθοδο ΜΤΤ. Τιµές οπτικής απορρόφησης µικρότερες του 0,8

αντιστοιχούν στη γραµµική φάση της καµπύλης, ενώ τιµές οπτικής απορρόφησης από 0,8 και

πάνω συναντούν το πλατό, στο οποίο η απορρόφηση δεν αντικατοπτρίζει µε ακρίβεια την

ποσότητα φορµαζάνης που παράγεται.

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.450

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

Οπτικ

ήαπ

ορρόφη

ση(O

D)στα57

0nm

Αριθμόςκυττάρων

Πρότυπηκαμπύληοπτικήςαπορρόφησης στα570nm κλώνου67(LMP1+)

Διάγραµµα 5: Πρότυπη καµπύλη οπτικής απορρόφησης (OD) στα 570nm για τον κλώνο 67 για

την εκτίµηση της βιωσιµότητας µε τη µέθοδο ΜΤΤ. Τιµές οπτικής απορρόφησης µικρότερες του

0,35 αντιστοιχούν στη γραµµική φάση της καµπύλης, ενώ τιµές οπτικής απορρόφησης από 0,35

50

και πάνω συναντούν το πλατό, στο οποίο η απορρόφηση δεν αντικατοπτρίζει µε ακρίβεια την

ποσότητα φορµαζάνης που παράγεται.

5.1.3. Μέτρηση βιωσιµότητας µε τη µέθοδο ΜΤΤ

Μετά την επιµόλυνση των κλώνων 8 και 67(LMP1+) µε τα siRNA που καταστέλλουν

την έκφραση των γονιδίων της λουσιφεράσης και της TRAF5 πραγµατοποιήθηκε

µελέτη της βιωσιµότητας των κλώνων αυτών. Χρησιµοποιήθηκαν 5 οπές τριβλίου 96

οπών για κάθε επιµολυσµένο κλώνο, µε 5000 κύτταρα στην κάθε οπή. Μετά το

πέρασµα 3 ηµερών, τα κύτταρα που απέµειναν στις οπές επωάστηκαν µε το άλας

MTT και µετά από 4 ώρες µετρήθηκε στα 570nm η οπτική απορρόφηση της

φορµαζάνης που απελευθερώθηκε, η οποία αντιστοιχεί στον αριθµό των βιώσιµων

κυττάρων.

Στον Πίνακα 4 απεικονίζονται οι µέσοι όροι της οπτικής απορρόφησης των 4

δοκιµών που πραγµατοποιήθηκαν. Οι µέσοι όροι αντιστοιχούν στις 3 καλύτερες τιµές

(3 πιο κοντινές µεταξύ τους τιµές) οπτικής απορρόφησης από τις 5 οπές σε κάθε

δοκιµή. Στο Διάγραµµα 6 γίνεται φαναιρό το γεγονός ότι ο µέσος όρος της οπτικής

απορρόφησης του κλώνου 67 (LMP1+) που επιµολύνθηκε µε το siRNA κατά του

γονιδίου της TRAF5 είναι αρκετά χαµηλότερος από το µέσο όρο της οπτικής

απορρόφησης του κλώνου 67 (LMP1+) που επιµολύνθηκε µε το siRNA κατά του

γονιδίου της λουσιφεράσης. Αντιθέτως, στην περίπτωση του κλώνου 8, ο οποίος δεν

εκφράζει την LMP1, δεν υπάρχει αυτή η διαφορά στην οπτική απορρόφηση όταν ο

κλώνος επιµολύνθηκε µε το siRNA κατά του γονιδίου της ΤRAF5, σε σχέση µε όταν

αυτός επιµολύνθηκε µε το siRNA κατά του γονιδίου της λουσιφεράσης. Το γεγονός

αυτό σηµαίνει ότι η βιωσιµότητα των κυττάρων που εκφράζουν την LMP1 µειώνεται

σηµαντικά όταν καταστέλλεται η έκφραση του γονιδίου της TRAF5, κάτι το οποίο

δεν παρατηρείται στα κύτταρα που δεν εκφράζουν την LMP1. H παρατήρηση αυτή

µάλιστα είναι στατιστικά σηµαντική, καθώς όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, η τιµή του

Student’s t-test για τον κλώνο 67 (LMP1+) είναι χαµηλότερη από 0,05.

51

Δοκιμή1 Δοκιμή2 Δοκιμή3 Δοκιμή4 Μέσοςόρος Τυπικήαπόκλιση Τυπικόσφάλμα ΤιμήpΚλώνος67siTRAF5 0,140 0,200 0,164 0,116 0,155 0,036 0,018 0,0411Κλώνος67siluc 0,176 0,328 0,21 0,190 0,226 0,070 0,035Kλώνος8siTRAF5 0,375 0,426 0,291 0,279 0,343 0,070 0,035 0,890Κλώνος8siluc 0,359 0,316 0,312 0,36 0,337 0,026 0,013

Μέσοςόρος

Πίνακας 4: Στον πίνακα απεικονίζονται οι µέσοι όροι της οπτικής απορρόφησης των 4 διαφορετικών

δοκιµών ΜΤΤ για τον κάθε κλώνο που επιµολύνθηκε είτε µε το siRNA που στοχεύει το γονίδιο της

λουσιφεράσης (siluc), είτε µε το siRNA που στοχεύει το γονίδιο της TRAF5 (siTRAF5), καθώς και ο

µέσος όρος, η τυπική απόκλιση και το τυπικό σφάλµα όλων των µέσων όρων των 4 δοκιµών. Τέλος,

στον πίνακα απεικονίζεται η τιµή p του Student’s t-test (two tailed distribution, paired type), η οποία

υποδεικνύει πως οι διαφορές στη βιωσιµότητα του κλώνου 67 (LMP1+) είναι στατιστικά σηµαντικές.

Διάγραµµα 6: Στο διάγραµµα απεικονίζονται οι µέσοι όροι της οπτικής απορρόφησης των 4 δοκιµών

MTT που πραγµατοποιήθηκαν για κάθε επιµολυσµένο κλώνο. Είναι φανερό πως η οπτική

απορρόφηση (άρα και η βιωσιµότητα) είναι σηµαντικά χαµηλότερη στην περίπτωση του κλώνου 67

(LMP1+) όταν πραγµατοποιείται καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της TRAF5 (Κλώνος 67

siTRAF5) απ’ότι όταν πραγµατοποιείται επιµόλυνση µε το siRNA που στοχεύει το mRNA του

γονιδίου της λουσιφεράσης (Κλώνος 67 siluc). Αντίθετα, στην περίπτωση του κλώνου 8, ο οποίος δεν

εκφράζει την LMP1, δεν παρατηρείται σηµαντική διαφορά στη βιωσιµότητα όταν πραγµατοποείται

επιµόλυνση µε το siRNA που καταστέλλει την έκφραση της TRAF5 (Κλώνος 8 siTRAF5) σε σχέση µε

όταν πραγµατοποιείται επιµόλυνση µε το siRNA που στοχεύει το mRNA του γονιδίου της

λουσιφεράσης (Κλώνος 8 siluc). Oι διαφορές στη βιωσιµότητα του κλώνου 67 (LMP1+) είναι

στατιστικά σηµαντικές (τιµή p = 0,041).

52

5.1.4. Επιβεβαίωση της έκφρασης της LMP1 από τον κλώνο 67 και

επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 µε στύπωµα

Western

Προκειµένου να επιβεβαιωθεί η καταστολή της έκφρασης της πρωτεϊνης ΤRAF5

στους κλώνους που διαµολύνθηκαν µε το siRNA που στοχεύει το mRNA της (siRNA

TRAF5), αλλά και η συνεχιζόµενη έκφραση της LMP1 από τον κλώνο 67, µετά τις 4

δοκιµές µε το άλας MTT πραγµατοποιήθηκε στύπωµα Western. Στην Εικόνα 7

φαίνονται τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσµατα από τα δείγµατα µίας δοκιµής.

Βλέπουµε πως στην περίπτωση της LMP1 το σήµα στον κλώνο 67 είναι πολύ έντονο,

κάτι που υποδηλώνει την παρουσία της πρωτεϊνης στον κλώνο αυτό. Στην περίπτωση

της TRAF5, γίνεται φανερό πως τα επίπεδα της πρωτεϊνης αυτής είναι χαµηλότερα

όταν πραγµατοποιείται επιµόλυνση µε το siRNA TRAF5, απ’ότι µε το siRNA luc,

κάτι που επιβεβαιώνει την επιτυχή καταστολή της.

Εικόνα 7: Αντιπροσωπευτικά αποτελέσµατα του στυπώµατος Western µίας αντιπροσωπευτικής

δοκιµής για την επιβεβαιώση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 όταν γίνεται

επιµόλυνση µε το siRNA TRAF5 και για την επιβεβαίωση της έκφρασης της LMP1 από τον

κλώνο 67. H LMP1 εντοπίζεται στα 62kDa, η ΤRAF5 στα 58kDa και η β-ακτίνη στα 42 kDa.

Είναι φανερό πως ο κλώνος 67 εκφράζει την LMP1, ενώ ο κλώνος 8 όχι. Στην περίπτωση της

TRAF5, τα ενδογενή επίπεδα της πρωτεϊνης είναι µειωµένα όταν πραγµατοποιείται επιµόλυνση

µε το siRNA TRAF5, σε σχέση µε όταν πραγµατοποιείται επιµόλυνση µε το siRNA luc.

53

5.1.5. Επιβεβαίωση της καταστολής της έκφρασης της TRAF5 µε RT-

PCR

Προκειµένου να επιβεβαιωθεί η καταστολή της έκφρασης της TRAF5, αλλά και για

να υπολογιστούν τα ποσοστά αποσιώπησης της έκφρασης της TRAF5 σε κάθε

δοκιµή, πραγµατοποιήθηκε RT-PCR. Στον πίνακα 5 φαίνονται τα ποσοστά

αποσιώπησης της TRAF5 σε κάθε δοκιµή, ενώ στον πίνακα 6 φαίνεται η σταστιστική

ανάλυση των τιµών ΔCτ κάθε δοκιµής, οι οποίες µετά από εκτέλεση Student’s t-test

βγαίνουν στατιστικά σηµαντικές. Τέλος, στο Διάγραµµα 7 απεικονίζονται οι µέσοι

όροι των ποσοστών της καταστολής για τον κάθε κλώνο και για τις 4 δοκιµές.

Δοκιμή1 Δοκιμή2 Δοκιμή3 Δοκιμή4 Μέσοςόρος Τυπικήαπόκλιση Τυπικόσφάλμα

Κλώνος67(LMP1+) 34% 59% 39% 48% 45% 0,110 0,055Κλώνος8 60% 30% 57% 55% 51% 0,13820275 0,069101375

Πίνακας 5: Στον πίνακα απεικονίζονται τα ποσοστά αποσιώπησης της TRAF5 σε κάθε δοκιµή,

καθώς και ο µέσος όρος, η τυπική απόκλιση και το τυπικό σφάλµα των ποσοστών αυτών.

Μέσοςόρος Τυπικήαπόκλιση Τυπικόσφάλμα Τιμήp

Κλώνος67siTRAF5 8,562169552 9,458208089 13,21637821 9,960878372 10,29940856 2,028869327 1,014434664 0,011126186Κλώνος67siluc 7,979523658 8,175467011 12,52432823 9,037927628 9,429311632 2,113947389 1,056973695Kλώνος8siTRAF5 8,976511955 8,433815479 9,871038439 11,93327713 9,803660751 1,538446931 0,769223465 0,010358609Κλώνος8siluc 7,662096501 7,924500467 8,684231757 10,80571747 8,769136548 1,425227284 0,712613642

ΔCτ

Πίνακας 6: Στον πίνακα απεικονίζονται οι τιµές ΔCτ των 4 δοκιµών για κάθε κλώνο, ο µέσος

όρος, η τυπική απόκλιση και το τυπικό σφάλµα των τιµών αυτών. Τέλος, στον πίνακα

απεικονίζεται η τιµή p του Student’s t-test (two tailed distribution, paired type), η οποία

υποδεικνύει πως οι τιµές ΔCτ τόσο στον κλώνο 67 (LMP1+), όσο και στον κλώνο 8, και στις 4

δοκιµές που πραγµατοποιήθηκαν είναι στατιστικά σηµαντικές.

54

Διάγραµµα 7: Μέσοι όροι των ποσοστών αποσιώπησης του mRNA της TRAF5 στον κλώνο 67

(µπλε) και στον κλώνο 8 (πορτοκαλί) στις 4 δοκιµές που πραγµατοποιήθηκαν (για τον κλώνο 67:

τιµή p = 0,011, για τον κλώνο 8: τιµή p = 0,010).

6. Συζήτηση Στην παρούσα µελέτη διερευνήθηκε εάν η έκφραση της TRAF5 είναι απαραίτητη για

τη βιωσιµότητα επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν την LMP1, την κύρια

ογκογόνο πρωτεϊνη του ιού Epstein Barr και εξαρτώνται από αυτή για την επιβίωσή

τους. Αποδείχθηκε ότι µετά από καταστολή της έκφρασης της TRAF5, µειώνεται

σηµαντικά η βιωσιµότητα των επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν την LMP1,

αλλά όχι των αντίστοιχων κυττάρων ελέγχου που δεν εκφράζουν την LMP1.

Συνεπώς, η παρουσία της TRAF5 και η λειτουργική της αλληλεπίδραση µε την

LMP1 παίζει ένα πολύ σηµαντικό ρόλο για τη βιωσιµότητα των κυττάρων που

εκφράζουν τη δεύτερη. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι η TRAF5

δεν παίζει τόσο µεγάλο ρόλο στη µεταγωγή σήµατος από τον υποδοχέα CD40, που

εκφράζεται στα υγιή κύτταρα 77,78, καθιστά την TRAF5 κατάλληλο στόχο για το

σχεδιασµό νέων αντινεοπλασµατικών θεραπειών που στοχεύουν στο να αναστείλουν

τη σηµατοδότηση από την LMP1, χωρίς να διαταράσσουν τη φυσιολογική λειτουργία

του CD40 υποδοχέα. Τέτοιες αντινεοπλασµατικές προσεγγίσεις, για παράδειγµα θα

µπορούσαν να περιλαµβάνουν διάφορους αναστολείς της δράσης λιγάσης ουβικιτίνης

της TRAF5, οι οποίοι φυσικά θα πρέπει να εµφανίζουν ελάχιστη εώς µηδαµινή

τοξικότητα για τα υγιή κύτταρα. Μια ακόµα αντινεοπλασµατική προσέγγιση θα

55

µπορούσε να περιλαµβάνει τη γονιδιακή θεραπεία σε νεοπλασίες του αιµοποιητικού

συστήµατος, µε στόχο την καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της TRAF5. Η

γονιδιακή αυτή θεραπεία θα είχε σαν σκοπό τη µείωση της βιωσιµότητας των

κυττάρων που έχουν µολυνθεί από τον EBV και λόγω της έκφρασης της LMP1 έχουν

µετατραπεί σε καρκινικά κύτταρα.

Πρωτού όµως φτάσουµε στο µεταγενέστερο στάδιο του σχεδιασµού

αντινεοπλασµατικών θεραπειών, είναι απαραίτητο να διεξαχθεί µια σειρά νέων

πειραµάτων για την περαιτέρω διερεύνηση του µηχανισµού.

Κατ’ αρχάς τα παραπάνω πειράµατα καλό θα ήταν να επαναληφθούν σε κλώνουνς

κυτταρικών σειρών 293FT που εκφράζουν την LMP1 και δεν έχουν επιµολυνθεί µε

τον λεντι-ιϊκό φορέα έκφρασης shRNA pGIPZ, όπως ο κλώνος 3 που δηµιουργήθηκε

κατά το πρώτο µέρος της διπλωµατικής εργασίας, αλλά δυστυχώς θανατώθηκε µετά

από καταστροφή στην υπερκατάψυξη των -80οC.

Επιπλέον, θα πρέπει να ελεγχθεί το κατά πόσο η έκφραση µιας µεταλλαγµένης

µορφής της LMP1 που δεν µπορεί να αλληλεπιδράσει µε την TRAF5 απαιτεί επίσης

την ταυτόχρονη έκφραση της TRAF5 για τη βιωσιµότητα των κυττάρων. Στη

συνέχεια, θα πρέπει να διερευνηθεί εάν η υπερέκφραση της TRAF5 ενισχύει τον

πολλαπλασιασµό των κυττάρων που εκφράζουν την LMP1, σε σχέση µε τα

αντίστοιχα κύτταρα που δεν εκφράζουν την LMP1. Τα πειράµατα αυτά ενδέχεται να

ενισχύσουν τα στοιχεία που υποστηρίζουν τη θέση ότι η έκφραση της TRAF5 είναι

απραίτητη για τη βιωσιµότητα των επιθηλιακών κυττάρων όταν εκφράζεται η LMP1.

Στην τελική φάση της διερεύνησης θα µπορούσαν να σχεδιαστούν πειράµατα που θα

µας επιτρέψουν να εντοπίσουµε σε ποιο ακριβώς µονοπάτι σηµατοδότησης της

LMP1 επιδρά η TRAF5. Στο σηµείο αυτό αξίζει να σηµειωθεί ότι τα παραπάνω

πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν και χωρίς την παρουσία του αντιβιοτικού Ζεοσίνη

στο θρεπτικό µέσο που αναπτύχθηκαν τα κύτταρα. Τα πειράµατα απουσία Ζεοσίνης,

µάλιστα, έδωσαν ακριβώς τα ίδια αποτελέσµατα µε αυτά που πραγµατοποιήθηκαν

παρουσία Ζεοσίνης, κάτι που υποδεικνύει ότι η αλληλεπίδραση της LMP1 µε την

TRAF5 ίσως είναι ανεξάρτητη από το µονοπάτι του NFκΒ. Βέβαια, υπάρχει το

ενδεχόµενο το γονίδιο ανθεκτικότητας στη Ζεοσίνη να έχει ενσωµατωθεί στο

56

γονιδίωµα των κυττάρων και να εκφράζεται ανεξάρτητα από τον υποκινητή του

γονιδίου E-selectin (o οποίος περιέχει τρεις ρυθµιστικές περιοχές του µεταγραφικού

παράγοντα NF-κΒ). Εποµένως, θα πρέπει να γίνει ενδελεχής διερεύνηση του ρόλου

της TRAF5 σε επιθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν την LMP1 και δεν εξαρτώνται

από την LMP1 για την επιβίωσή τους.

Τέλος, θα µπορούσε να διερευνηθεί εάν η TRAF5 επιδρά άµεσα στη µεταγωγή

σήµατος από την LMP1, ή αν ασκεί µια έµµεση επίδραση, είτε επιδρώντας σε άλλους

παράγοντες καθοδικά της LMP1, είτε απλώς συµµετέχοντας στη σταθεροποίηση

άλλων πρωτεϊνών TRAF.

Όλα τα παραπάνω θα µας επιτρέψουν να σχηµατίσουµε µια πλήρη εικόνα για τη

σηµαντική αλληλεπίδραση της TRAF5 και της LMP1, η οποία θα µας φανεί ιδιαίτερα

χρήσιµη για το σχεδιασµό νέων θεραπειών κατά των νεοπλασιών που οφείλονται

στην έκφραση της LMP1 του ιού ΕBV.

57

7. Ευχαριστίες Θα ήθελα καταρχάς να ευχαριστήσω θερµά τον επιβλέποντα καθηγητή µου, κύριο

Γεώργιο Μόσιαλο για τη δυνατότητα που µου έδωσε να εκπονήσω στο Εργαστήριό

του τη διπλωµατική µου εργασία, καθώς και για τη διαρκή υποστήριξη, καθοδήγηση

και τις συµβουλές που µου παρείχε καθόλη τη διάρκεια της διπλωµατικής µου.

Ευχαριστώ ιδιαιτέρως το µεταδιδακτορικό ερευνητή Δρ. Πωλ Χάντουε για την

καθοδήγηση κατά τη διάρκεια της διπλωµατικής εργασίας, καθώς µε µεγάλη υποµονή

και όρεξη ανέλαβε να µου διδάξει όλες τις πειραµατικές τεχνικές που εφάρµοσα και

να µε µυήσει στον τρόπο σκέψης ενός ερευνητή. Η φιλική του στάση και οι

πολύτιµες συµβουλές του βοήθησαν τόσο στη διεκπεραίωση των πειραµάτων από

τεχνικής άποψης, όσο και στη δηµιουργία ενός κλίµατος εµπιστοσύνης που έκανε τη

δουλειά στο εργαστήριο πολύ ευχάριστη.

Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα Αθανάσιο Ψευτογκά, τον

υποψήφιο διδάκτορα Χρήστο Γωνίδα και τη µεταδιδακτορική ερευνήτρια Πανωραία

Κοταντάκη, οι οποίοι µε βοήθησαν να προσανατολιστώ στο εργαστήριο στην αρχή

της διπλωµατικής µου εργασίας και ήταν πάντα πρόθυµοι για συζήτηση, µε σκοπό να

λυθούν οι απορίες και οι προβληµατισµοί µου.

58

8. Παράρτηµα Στο παράρτηµα που ακολουθεί αναγράφεται η σύσταση όλων των διαλυµάτων που

χρησιµοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραµάτων της διπλωµατικής εργασίας.

Luria Broth (LB)

-20g σκόνης LB

-ddH2O έως το 1lt

-300µl NaOH 5Μ

Luria Broth (LB) -άγαρ

-20g σκόνη LB

-15g άγαρ

-ddH2O έως το 1lt

-300µl NaOH 5M

TE

-1ml Tris-Cl 1M, pH=8

-0,2ml EDTA 500 mM, pH=8

- ddH2O έως τα 100ml

BES 2X

-1,176 BES sodium salt

-1,637 NaCl

-0,0267 Na2HPO4*2H2O

- ddH2O έως τα 100ml

*το pH ρυθµίζεται ακριβώς στο 7

CaCl 2,5M-7,351g CaCl

- ddH2O έως τα 20ml

PBS 10X

-80g NaCl

-2g KCl

-14,4g Na2HPO4

-2,4g KH2PO4

- ddH2O έως το 1lt

*το pH ρυθµίζεται στο 7,4 µε NaOH

SDS – loadying dye 2X

-10ml γλυκερόλη 100%

-10ml SDS 20%

-1,25mg µπλέ της βρωµοφαινόλης

-12,5ml διάλυµα επιστοίβαξης 4Χ

-2,5ml β-µερκαπτοαιθανόλη

- ddH2O έως τα 50ml

59

PBST 0,1%

-100ml PBS 10X

-900ml ddH2O

-1ml Tween 20

Διάλυµα διαχωρισµού 4X

-90,83g Tris base

-10ml SDS 20%

- ddH2O έως τα 500ml

*το pH ρυθµίζεται στο 8,8 µε HCl

Διάλυµα επιστοίβαξης 4X

-12,12g Tris base

-4ml SDS 20%

-ddH2O έως τα 200ml

*το pH ρυθµίζεται στο 6,8 µε HCl

Διάλυµα τρεξίµατος 10X

-30,2g Tris base

-144g γλυκίνη

-50ml SDS 20%

- ddH2O έως το 1lt

Διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς 10X

-30,2g Tris base

-144g γλυκίνη

- ddH2O έως το 1lt

*το διάλυµα 1Χ περιέχει κατά 8/10 ddH2O, κατά 1/10

µεθανόλη και κατά 1/10 διάλυµα 10Χ

Ponceau S

-1g σκόνη Ponceau S

-50ml oξικό οξύ

-ddH2O έως το 1lt

60

9. Βιβλιογραφία

1. Humanherpesviruses:biology,therapy,andimmunoprophylaxis.(Cambridge

UniversityPress,2007).

2. Epstein,M.A.,Achong,B.G.&Barr,Y.M.VIRUSPARTICLESINCULTURED

LYMPHOBLASTSFROMBURKITT’SLYMPHOMA.LancetLond.Engl.1,702–703

(1964).

3. Henle,W.,Diehl,V.,Kohn,G.,ZurHausen,H.&Henle,G.Herpes-typevirusand

chromosomemarkerinnormalleukocytesaftergrowthwithirradiatedBurkitt

cells.Science157,1064–1065(1967).

4. Thompson,M.P.&Kurzrock,R.Epstein-Barrvirusandcancer.Clin.CancerRes.

Off.J.Am.Assoc.CancerRes.10,803–821(2004).

5. Kieff,E.&Rickinson,A.B.Epstein–Barrvirusanditsreplication.2511–2574

(2001).

6. Young,L.S.&Rickinson,A.B.Epstein-Barrvirus:40yearson.Nat.Rev.Cancer

4,757–768(2004).

7. Epstein-BarrVirus.Int.AgencyRes.Cancer49–92(1997).

8. Kieff,E.&Liebowitz,D.Epstein-Barrvirus.TheHumanHerpesvirus107–172

(1993).

9. Epstein-BarrVirusandInfectiousMononucleosis.CentersforDiseaseControl

10. Merlo,A.etal.TheinterplaybetweenEpstein-Barrvirusandtheimmune

system:arationaleforadoptivecelltherapyofEBV-relateddisorders.

Haematologica95,1769–1777(2010).

11. Swaminathan,S.&Kenney,S.inDNATumorViruses(eds.Damania,B.&Pipas,

J.M.)285–315(SpringerUS,2009).

61

12. Nemerow,G.R.,Wolfert,R.,McNaughton,M.E.&Cooper,N.R.Identification

andcharacterizationoftheEpstein-BarrvirusreceptoronhumanB

lymphocytesanditsrelationshiptotheC3dcomplementreceptor(CR2).J.

Virol.55,347–351(1985).

13. Cheung,R.K.&Dosch,H.M.Thetyrosinekinaselckiscriticallyinvolvedinthe

growthtransformationofhumanBlymphocytes.J.Biol.Chem.266,8667–8670

(1991).

14. Alfieri,C.,Birkenbach,M.&Kieff,E.EarlyeventsinEpstein-Barrvirusinfection

ofhumanBlymphocytes.Virology181,595–608(1991).

15. Tanner,J.,Weis,J.,Fearon,D.,Whang,Y.&Kieff,E.Epstein-Barrvirus

gp350/220bindingtotheBlymphocyteC3dreceptormediatesadsorption,

capping,andendocytosis.Cell50,203–213(1987).

16. Tanner,J.E.,Alfieri,C.,Chatila,T.A.&Diaz-Mitoma,F.Inductionofinterleukin-

6afterstimulationofhumanB-cellCD21byEpstein-Barrvirusglycoproteins

gp350andgp220.J.Virol.70,570–575(1996).

17. Thorley-Lawson,D.A.Epstein-Barrvirus:exploitingtheimmunesystem.Nat.

Rev.Immunol.1,75–82(2001).

18. Bajaj,B.G.,Murakami,M.&Robertson,E.S.MolecularbiologyofEBVin

relationshiptoAIDS-associatedoncogenesis.CancerTreat.Res.133,141–162

(2007).

19. Hong,G.K.etal.Epstein-BarrVirusLyticInfectionContributesto

LymphoproliferativeDiseaseinaSCIDMouseModel.J.Virol.79,13993–14003

(2005).

62

20. Cheung,A.&Kieff,E.LonginternaldirectrepeatinEpstein-BarrvirusDNA.J.

Virol.44,286–294(1982).

21. Klein,E.,Kis,L.L.&Klein,G.Epstein-Barrvirusinfectioninhumans:from

harmlesstolifeendangeringvirus-lymphocyteinteractions.Oncogene26,

1297–1305(2007).

22. Wang,D.,Liebowitz,D.&Kieff,E.AnEBVmembraneproteinexpressedin

immortalizedlymphocytestransformsestablishedrodentcells.Cell43,831–

840(1985).

23. Kaye,K.M.,Izumi,K.M.&Kieff,E.Epstein-Barrviruslatentmembraneprotein

1isessentialforB-lymphocytegrowthtransformation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.

S.A.90,9150–9154(1993).

24. Dawson,C.W.,Rickinson,A.B.&Young,L.S.Epstein-Barrviruslatent

membraneproteininhibitshumanepithelialcelldifferentiation.Nature344,

777–780(1990).

25. Cuomo,L.etal.ExpressionoftheEpstein-Barrvirus(EBV)-encodedmembrane

proteinLMP1impairstheinvitrogrowth,clonabilityandtumorigenicityofan

EBV-negativeBurkittlymphomaline.Int.J.Cancer51,949–955(1992).

26. Peng,M.&Lundgren,E.TransientexpressionoftheEpstein-BarrvirusLMP1

geneinhumanprimaryBcellsinducescellularactivationandDNAsynthesis.

Oncogene7,1775–1782(1992).

27. Wang,F.etal.Epstein-Barrviruslatentmembraneprotein(LMP1)andnuclear

proteins2and3CareeffectorsofphenotypicchangesinBlymphocytes:EBNA-

2andLMP1cooperativelyinduceCD23.J.Virol.64,2309–2318(1990).

63

28. Eliopoulos,A.G.&Young,L.S.LMP1structureandsignaltransduction.Semin.

CancerBiol.11,435–444(2001).

29. Henderson,S.etal.Inductionofbcl-2expressionbyEpstein-Barrviruslatent

membraneprotein1protectsinfectedBcellsfromprogrammedcelldeath.Cell

65,1107–1115(1991).

30. Laherty,C.D.,Hu,H.M.,Opipari,A.W.,Wang,F.&Dixit,V.M.TheEpstein-Barr

virusLMP1geneproductinducesA20zincfingerproteinexpressionby

activatingnuclearfactorkappaB.J.Biol.Chem.267,24157–24160(1992).

31. D’Souza,B.,Rowe,M.&Walls,D.Thebfl-1geneistranscriptionallyupregulated

bytheEpstein-BarrvirusLMP1,anditsexpressionpromotesthesurvivalofa

Burkitt’slymphomacellline.J.Virol.74,6652–6658(2000).

32. Hong,S.Y.etal.InvolvementoftwoNF-kappaBbindingelementsintumor

necrosisfactoralpha-,CD40-,andepstein-barrviruslatentmembraneprotein

1-mediatedinductionofthecellularinhibitorofapoptosisprotein2gene.J.

Biol.Chem.275,18022–18028(2000).

33. Eliopoulos,A.G.etal.Epstein-Barrvirus-encodedLMP1andCD40mediateIL-6

productioninepithelialcellsviaanNF-kappaBpathwayinvolvingTNFreceptor-

associatedfactors.Oncogene14,2899–2916(1997).

34. Eliopoulos,A.G.,Gallagher,N.J.,Blake,S.M.,Dawson,C.W.&Young,L.S.

Activationofthep38mitogen-activatedproteinkinasepathwaybyEpstein-Barr

virus-encodedlatentmembraneprotein1coregulatesinterleukin-6and

interleukin-8production.J.Biol.Chem.274,16085–16096(1999).

64

35. Yoshizaki,T.,Sato,H.,Furukawa,M.&Pagano,J.S.Theexpressionofmatrix

metalloproteinase9isenhancedbyEpstein-Barrviruslatentmembraneprotein

1.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,3621–3626(1998).

36. Kaye,K.M.,Izumi,K.M.,Mosialos,G.&Kieff,E.TheEpstein-BarrvirusLMP1

cytoplasmiccarboxyterminusisessentialforB-lymphocytetransformation;

fibroblastcocultivationcomplementsacriticalfunctionwithintheterminal155

residues.J.Virol.69,675–683(1995).

37. Yang,X.,He,Z.,Xin,B.&Cao,L.LMP1ofEpstein-Barrvirussuppressescellular

senescenceassociatedwiththeinhibitionofp16INK4aexpression.Oncogene

19,2002–2013(2000).

38. Gruhne,B.,Kamranvar,S.A.,Masucci,M.G.&Sompallae,R.EBVandgenomic

instability--anewlookattheroleofthevirusinthepathogenesisofBurkitt’s

lymphoma.Semin.CancerBiol.19,394–400(2009).

39. Gires,O.Latentmembraneprotein1ofEpstein-Barrvirusmimicsa

constitutivelyactivereceptormolecule.EMBOJ.16,6131–6140(1997).

40. Kilger,E.Epstein-Barrvirus-mediatedB-cellproliferationisdependentupon

latentmembraneprotein1,whichsimulatesanactivatedCD40receptor.EMBO

J.17,1700–1709(1998).

41. Banchereau,J.etal.TheCD40antigenanditsligand.Annu.Rev.Immunol.12,

881–922(1994).

42. Uchida,J.etal.MimicryofCD40signalsbyEpstein-BarrvirusLMP1inB

lymphocyteresponses.Science286,300–303(1999).

43. Aviel,S.,Winberg,G.,Massucci,M.&Ciechanover,A.Degradationofthe

epstein-barrviruslatentmembraneprotein1(LMP1)bytheubiquitin-

65

proteasomepathway.TargetingviaubiquitinationoftheN-terminalresidue.J.

Biol.Chem.275,23491–23499(2000).

44. Huen,D.S.,Henderson,S.A.,Croom-Carter,D.&Rowe,M.TheEpstein-Barr

viruslatentmembraneprotein-1(LMP1)mediatesactivationofNF-kappaBand

cellsurfacephenotypeviatwoeffectorregionsinitscarboxy-terminal

cytoplasmicdomain.Oncogene10,549–560(1995).

45. Gires,O.Latentmembraneprotein1ofEpstein-BarrvirusinteractswithJAK3

andactivatesSTATproteins.EMBOJ.18,3064–3073(1999).

46. Devergne,O.etal.AssociationofTRAF1,TRAF2,andTRAF3withanEpstein-

BarrvirusLMP1domainimportantforB-lymphocytetransformation:roleinNF-

kappaBactivation.Mol.Cell.Biol.16,7098–7108(1996).

47. Devergne,O.etal.RoleoftheTRAFbindingsiteandNF-kappaBactivationin

Epstein-Barrviruslatentmembraneprotein1-inducedcellgeneexpression.J.

Virol.72,7900–7908(1998).

48. Schneider,F.etal.TheviraloncoproteinLMP1exploitsTRADDforsignalingby

maskingitsapoptoticactivity.PLoSBiol.6,e8(2008).

49. Eliopoulos,A.G.etal.Epstein-Barrvirus-encodedlatentinfectionmembrane

protein1regulatestheprocessingofp100NF-kappaB2top52viaan

IKKgamma/NEMO-independentsignallingpathway.Oncogene22,7557–7569

(2003).

50. Eliopoulos,A.G.etal.TheOncogenicProteinKinaseTpl-2/CotContributesto

Epstein-BarrVirus-EncodedLatentInfectionMembraneProtein1-InducedNF-B

SignalingDownstreamofTRAF2.J.Virol.76,4567–4579(2002).

66

51. Eliopoulos,A.G.&Young,L.S.ActivationofthecJunN-terminalkinase(JNK)

pathwaybytheEpstein-Barrvirus-encodedlatentmembraneprotein1(LMP1).

Oncogene16,1731–1742(1998).

52. Kieser,A.Epstein-Barrviruslatentmembraneprotein-1triggersAP-1activity

viathec-JunN-terminalkinasecascade.EMBOJ.16,6478–6485(1997).

53. Roberts,M.L.&Cooper,N.R.ActivationofaRas–MAPK-DependentPathway

byEpstein–BarrVirusLatentMembraneProtein1IsEssentialforCellular

Transformation.Virology240,93–99(1998).

54. Higuchi,M.,Kieff,E.&Izumi,K.M.TheEpstein-BarrVirusLatentMembrane

Protein1PutativeJanusKinase3(JAK3)BindingDomainDoesNotMediate

JAK3AssociationorActivationinB-LymphomaorLymphoblastoidCellLines.J.

Virol.76,455–459(2002).

55. Izumi,K.M.etal.Theresiduesbetweenthetwotransformationeffectorsites

ofEpstein-Barrviruslatentmembraneprotein1arenotcriticalforB-

lymphocytegrowthtransformation.J.Virol.73,9908–9916(1999).

56. Puls,A.etal.ActivationofthesmallGTPaseCdc42bytheinflammatory

cytokinesTNF(alpha)andIL-1,andbytheEpstein-Barrvirustransforming

proteinLMP1.J.CellSci.112(Pt17),2983–2992(1999).

57. Dawson,C.W.,Tramountanis,G.,Eliopoulos,A.G.&Young,L.S.Epstein-Barr

viruslatentmembraneprotein1(LMP1)activatesthephosphatidylinositol3-

kinase/Aktpathwaytopromotecellsurvivalandinduceactinfilament

remodeling.J.Biol.Chem.278,3694–3704(2003).

67

58. Chen,F.,Castranova,V.,Shi,X.&Demers,L.M.Newinsightsintotheroleof

nuclearfactor-kappaB,aubiquitoustranscriptionfactorintheinitiationof

diseases.Clin.Chem.45,7–17(1999).

59. Cahir-McFarland,E.D.,Davidson,D.M.,Schauer,S.L.,Duong,J.&Kieff,E.NF-

kappaBinhibitioncausesspontaneousapoptosisinEpstein-Barrvirus-

transformedlymphoblastoidcells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6055–6060

(2000).

60. Cavallini,L.,Francesconi,M.A.,Zoccarato,F.&Alexandre,A.Involvementof

nuclearfactor-kappaB(NF-kappaB)activationinmitogen-inducedlymphocyte

proliferation:inhibitoryeffectsoflymphoproliferationbysalicylatesactingas

NF-kappaBinhibitors.Biochem.Pharmacol.62,141–147(2001).

61. Karin,M.&Greten,F.R.NF-κB:linkinginflammationandimmunitytocancer

developmentandprogression.Nat.Rev.Immunol.5,749–759(2005).

62. Brasier,A.R.TheNF-kappaBregulatorynetwork.Cardiovasc.Toxicol.6,111–

130(2006).

63. Mosialos,G.etal.TheEpstein-BarrvirustransformingproteinLMP1engages

signalingproteinsforthetumornecrosisfactorreceptorfamily.Cell80,389–

399(1995).

64. Dirmeier,U.etal.Latentmembraneprotein1iscriticalforefficientgrowth

transformationofhumanBcellsbyepstein-barrvirus.CancerRes.63,2982–

2989(2003).

65. Kaye,K.M.etal.Tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor2isa

mediatorofNF-kappaBactivationbylatentinfectionmembraneprotein1,the

68

Epstein-Barrvirustransformingprotein.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,

11085–11090(1996).

66. Senftleben,U.etal.ActivationbyIKKalphaofasecond,evolutionaryconserved,

NF-kappaBsignalingpathway.Science293,1495–1499(2001).

67. Vatsyayan,J.,Qing,G.,Xiao,G.&Hu,J.SUMO1modificationofNF-

kappaB2/p100isessentialforstimuli-inducedp100phosphorylationand

processing.EMBORep.9,885–890(2008).

68. Häcker,H.&Karin,M.RegulationandfunctionofIKKandIKK-relatedkinases.

Sci.STKESignalTransduct.Knowl.Environ.2006,re13(2006).

69. Karin,M.&Gallagher,E.TNFRsignaling:ubiquitin-conjugatedTRAFficsignals

controlstop-and-goforMAPKsignalingcomplexes.Immunol.Rev.228,225–

240(2009).

70. Bishop,G.A.ThemultifacetedrolesofTRAFsintheregulationofB-cell

function.Nat.Rev.Immunol.4,775–786(2004).

71. Ha,H.,Han,D.&Choi,Y.TRAF-mediatedTNFR-familysignaling.Curr.Protoc.

Immunol.Ed.JohnEColiganAlChapter11,Unit11.9D(2009).

72. Wajant,H.,Henkler,F.&Scheurich,P.TheTNF-receptor-associatedfactor

family:scaffoldmoleculesforcytokinereceptors,kinasesandtheirregulators.

Cell.Signal.13,389–400(2001).

73. Arron,J.R.,Walsh,M.C.&Choi,Y.TRAF-mediatedTNFR-familysignaling.Curr.

Protoc.Immunol.Ed.JohnEColiganAlChapter11,Unit11.9D(2002).

74. Rowe,M.etal.Upregulationofbcl-2bytheEpstein-Barrviruslatentmembrane

proteinLMP1:aB-cell-specificresponsethatisdelayedrelativetoNF-kappaB

69

activationandtoinductionofcellsurfacemarkers.J.Virol.68,5602–5612

(1994).

75. Luftig,M.etal.Epstein-Barrviruslatentinfectionmembraneprotein1TRAF-

bindingsiteinducesNIK/IKKalpha-dependentnoncanonicalNF-kappaB

activation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,141–146(2004).

76. Cahir-McFarland,E.D.etal.RoleofNF-kappaBincellsurvivalandtranscription

oflatentmembraneprotein1-expressingorEpstein-BarrviruslatencyIII-

infectedcells.J.Virol.78,4108–4119(2004).

77. Kraus,Z.J.,Nakano,H.&Bishop,G.A.TRAF5isacriticalmediatorofinvitro

signalsandinvivofunctionsofLMP1,theviraloncogenicmimicofCD40.Proc.

Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,17140–17145(2009).

78. Nakano,H.etal.TargeteddisruptionofTraf5genecausesdefectsinCD40-and

CD27-mediatedlymphocyteactivation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96,9803–

9808(1999).

79. Xie,P.&Bishop,G.A.RolesofTNFreceptor-associatedfactor3insignalingtoB

lymphocytesbycarboxyl-terminalactivatingregions1and2oftheEBV-

encodedoncoproteinlatentmembraneprotein1.J.Immunol.Baltim.Md1950

173,5546–5555(2004).

80. Xie,P.,Hostager,B.S.,Munroe,M.E.,Moore,C.R.&Bishop,G.A.Cooperation

betweenTNFreceptor-associatedfactors1and2inCD40signaling.J.Immunol.

Baltim.Md1950176,5388–5400(2006).

81. Xie,P.,Hostager,B.S.&Bishop,G.A.RequirementforTRAF3insignalingby

LMP1butnotCD40inBlymphocytes.J.Exp.Med.199,661–671(2004).

70

82. Hadweh,P.Μηχανισμοίρύθμισηςτηςγονιδιακήςέκφρασηςαπότονιό

Epstein-Barr.(ΑριστοτέλειοΠανεπισήμιοΘεσσαλονίκης,2014).

83. Li,X.etal.Mutantcellsthatdonotrespondtointerleukin-1(IL-1)reveala

novelroleforIL-1receptor-associatedkinase.Mol.Cell.Biol.19,4643–4652

(1999).

84. Towbin,H.,Staehelin,T.&Gordon,J.Electrophoretictransferofproteinsfrom

polyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications.

1979.Biotechnol.Read.Mass24,145–149(1992).

85. Renart,J.,Reiser,J.&Stark,G.R.Transferofproteinsfromgelsto

diazobenzyloxymethyl-paperanddetectionwithantisera:amethodfor

studyingantibodyspecificityandantigenstructure.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

76,3116–3120(1979).

86. Shapiro,A.L.,Viñuela,E.&Maizel,J.V.Molecularweightestimationof

polypeptidechainsbyelectrophoresisinSDS-polyacrylamidegels.Biochem.

Biophys.Res.Commun.28,815–820(1967).

87. Weber,K.&Osborn,M.Thereliabilityofmolecularweightdeterminationsby

dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis.J.Biol.Chem.244,4406–

4412(1969).

88. Shi,Q.&Jackowski,G.One-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis.1–

52(1998).

89. Macrae,I.J.etal.Structuralbasisfordouble-strandedRNAprocessingbyDicer.

Science311,195–198(2006).

90. Daneholt&Bertil.AdvancedInformation:RNAinterference.

71

91. Bagasra,O.&Prilliman,K.R.RNAinterference:themolecularimmunesystem.

J.Mol.Histol.35,545–553(2004).

92. Dalby,B.etal.AdvancedtransfectionwithLipofectamine2000reagent:

primaryneurons,siRNA,andhigh-throughputapplications.MethodsSanDiego

Calif33,95–103(2004).

93. Berridge,M.V.&Tan,A.S.Characterizationofthecellularreductionof3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT):subcellular

localization,substratedependence,andinvolvementofmitochondrialelectron

transportinMTTreduction.Arch.Biochem.Biophys.303,474–482(1993).

94. Heid,C.A.,Stevens,J.,Livak,K.J.&Williams,P.M.RealtimequantitativePCR.

GenomeRes.6,986–994(1996).

95. Higuchi,R.,Fockler,C.,Dollinger,G.&Watson,R.KineticPCRanalysis:real-time

monitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnol.Nat.Publ.Co.11,1026–

1030(1993).

96. Jin,X.,Yue,S.,Wells,K.S.&Singer,V.L.SYBRGreeenI:anewfluorescentdye

optimizedfordetectionofpicogramamountsofDNAingels.Biophys.J.66,

(1994).

97. Giulietti,A.etal.Anoverviewofreal-timequantitativePCR:applicationsto

quantifycytokinegeneexpression.MethodsSanDiegoCalif25,386–401

(2001).

98. Simpson,D.A.,Feeney,S.,Boyle,C.&Stitt,A.W.RetinalVEGFmRNAmeasured

bySYBRgreenIfluorescence:AversatileapproachtoquantitativePCR.Mol.

Vis.6,178–183(2000).

72

99. Ririe,K.M.,Rasmussen,R.P.&Wittwer,C.T.Productdifferentiationby

analysisofDNAmeltingcurvesduringthepolymerasechainreaction.Anal.

Biochem.245,154–160(1997).

100.Houghton,S.G.&Cockerill,F.R.Real-timePCR:overviewandapplications.

Surgery139,1–5(2006).

101.Gerard,G.F.&D’Alessio,J.M.Reversetranscriptase(EC2.7.7.49):theuseof

clonedmaloneymurineleukemiavirusreversetranscriptasetosynthesizeDNA

fromRNA.MethodsMol.Biol.CliftonNJ16,73–93(1993).

102.Livak,K.J.&Schmittgen,T.D.Analysisofrelativegeneexpressiondatausing

real-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method.MethodsSan

DiegoCalif25,402–408(2001).