1

ДВНЗ “Тернопільський державний медичний університет імені

І. Я. Горбачевського МОЗ України ”,

Корпорація “Артеріум”, ПАТ “Галичфарм”

На правах рукопису

СМАЛЮХ ОКСАНА ГРИГОРІВНА

УДК 615.322:615.21/.24.074

РОЗРОБКА МЕТОДІВ КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ

БАГАТОКОМПОНЕНТНИХ РОСЛИННИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

СЕДАТИВНОЇ ТА ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЇ ДІЇ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата

фармацевтичних наук

Науковий керівник:

Сур Сергій Володимирович,

доктор фармацевтичних наук

Львів-2015

2

ЗМІСТ

Перелік умовних скорочень 6

ВСТУП 7

РОЗДІЛ 1. Сучасний стан досліджень лікарської рослинної сировини та

лікарських засобів на їх основі

1.1. Фітохімічне дослідження лікарської рослинної, що

застосовується для виробництва екстрактів Седавіту, Цмину

піщаного квіток, Моркви дикої плодів та Нагідок квіток,

Куркуми

13

1.2. Сучасний стан методів ідентифікації та кількісного визначення

біологічно активних речовин лікарської рослинної, що

застосовується для виробництва екстрактів Седавіту, Цмину

піщаного квіток, Моркви дикої плодів та Нагідок квіток,

Куркуми

24

1.3. Тенденції вибору маркерів при дослідженні вмісту біологічно

активних речовин у ланцюжку сировина – екстракт – готовий

лікарський засіб

27

1.4. Підходи до вибору критеріїв ідентифікації та кількісного

визначення лікарської рослинної сировини та лікарських засобів

на їх основі

31

Висновки 33

РОЗДІЛ 2. Об’єкти і методи дослідження

2.1. Характеристика об’єктів дослідження 34

2.1.1. Екстракти Седавіту, Цмину піщаного квіток, Моркви дикої

плодів та Нагідок квіток , Куркуми 34

2.1.2. Готові лікарські засоби Седавіт таблетки та Холелесан, капсули 35

2.2. Обґрунтування і вибір методів досліджень

2.2.1 Екстракти Седавіту, Цмину піщаного квіток, Моркви дикої

плодів та Нагідок квіток , Куркуми 40

2.2.2 Готові лікарські засоби Седавіт таблетки та Холелесан, капсули 41

3

Висновки 42

РОЗДІЛ 3 Дослідження та розробка методів якісного складу та

кількісного вмісту екстракту Седавіту.

3.1. Обґрунтування вибору сполук та маркерів для ідентифікації

основних біологічно активних речовин у екстракті Седавіту 43

3.2. Обґрунтування вибору сполук та маркерів для кількісного

визначення основних біологічно активних речовин у екстракті

Седавіту

48

3.3. Дослідження подібності складу і вмісту біологічно активних

речовин комплексних рослинних екстрактів, отриманих за

різними технологіями

50

3.4. Розробка та валідація методик ідентифікації основних груп

біологічно активних сполук в комплексному густому екстракті

Седавітy

58

3.5. Розробка та валідація методів кількісного визначення біологічно

активних сполук комплексному густому екстракті Седавіт 67

Висновки 77

РОЗДІЛ 4. Дослідження та розробка методів якісного складу та

кількісного вмісту екстрактів Цмину піщаного квіток, Моркви дикої

плодів та Нагідок квіток, Куркуми довгої

4.1. Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин

екстракту цмину піщаного квіток 79

4.2. Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин екстракту

моркви дикої плодів та нагідок квітів 87

4.3 Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин

екстрактів Куркуми довгої 109

4.4. Обґрунтування вибору сполук та маркерів для якісного та

кількісного визначення основних біологічно активних речовин у

екстрактах

111

4

4.5. Розробка методик ідентифікації основних груп біологічно

активних сполук екстракту сухого цмину піщаного квіток та

густого екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток

114

4.6. Розробка методів кількісного визначення біологічно активних

сполук екстракту сухого цмину піщаного квіток та густого

екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток

116

4.7. Валідація методик ідентифікації і кількісного визначення цмину

піщного квіток екстракту сухого та моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракту густого

118

Висновки 142

РОЗДІЛ 5. Розробка методів контролю якості Седавіт, таблеток та

Холелесан, капсул

5.1. Обґрунтування вибору маркерів, розробка та валідація методів

контролю якості Седавіт, таблеток 145

5.1.1 Розробка та валідація методик ідентифікації і кількісного

визначення КГЕ Седавіт у таблетках 145

5.1.2 Розробка та валідація методик ідентифікації і кількісного

визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у

таблетках Седавіт

158

5.2 Обґрунтування маркерів, розробка та валідація методів контролю

якості капсул Холелесан 165

5.2.1 Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення сухого екстракту цмину піщаного квіток та густого

екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток

168

5.2.2 Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення сухого екстракту куркуми 179

5.2.3 Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення ефірних олій куркуми та м’яти 186

Висновки 297

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ 200

5

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 203

ДОДАТКИ 220

6

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

АФІ – активний фармацевтичний інгредієнт

БАР – біологічно активна речовина

ВЕРХ – високоефективна рідинна хроматографія

ГЛЗ – готовий лікарський засіб

ГРХ – газорідинна хроматографія

ГХ – газова хроматографія

ДФУ – Державна Фармакопея України

ЄФ – Європейська Фармакопея

КГЕ – комплексний густий екстракт

ЛЗ – лікарський засіб

ЛРС – лікарська рослинна сировина

ПАТ – публічне акціонерне товариство

РП – реєстраційне посвідчення

СЗ – стандартний зразок

ТШХ – тонкошарова хроматографія

УФ – ультрафіолет

Rf – величина утримування

7

ВСТУП

Актуальність теми. Препарати на основі лікарської рослинної сировини

(ЛРС) широко застосовуються у сучасній медичній практиці. Перелік

лікарських фітопрепаратів достатньо широкий: настойки, екстракти, таблетки,

мазі, комбіновані препарати, сумарні препарати типу бальзамів та ін.. При

виробництві лікарських засобів із рослинної сировини активними

фармацевтичними інгредієнтами (АФІ) виступають як індивідуальні речовини,

виділені з рослин, так і комплекс сполук, які містяться у сировині.

Механізм впливу таких фітозасобів на організм вивчається досить давно,

однак і досі у ряді випадків однозначну відповідь на питання, які саме класи

сполук зумовлюють біологічну активність препарату, дати важко. Виділена з

рослинної сировини у чистому вигляді сполука може не виявляти очікуваного

фармакологічного ефекту, у той час як комплексні препарати (екстракти,

настойки) з тієї ж сировини мають фармакологічну дію. В іншій ситуації

супутні речовини не виявляють необхідної фармакологічної активності.

У зв’язку з такими особливостями лікарських засобів з ЛРС, особливого

значення набуває стандартизація та контроль їх якості, які повинні забезпечити

достатню постійність складу і вмісту комплексу АФІ та передбачуваний

терапевтичний ефект препарату від серії до серії. Сучасні вимоги до якості

лікарських препаратів зумовлюють необхідність розробки нових методів

стандартизації рослинної сировини і препаратів на її основі. Аналітична

нормативна документація (АНД) повинна бути створена таким чином, щоб

усунути можливість фальсифікації лікарських засобів, а також не допустити

випуску неефективних ліків за рахунок використання неякісної ЛРС (Сур С.

В.,2002). Із вищевикладеного видно, що вивчення складу рослинної сировини,

дослідження залежності біологічної активності фітопрепаратів від сполук, що

входять до складу рослинної субстанції, розробка нових методів стандартизації,

на сьогодні є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

8

Дисертаційна робота виконана згідно з планами науково-дослідних робіт

кафедри управління та економіки фармації з технологією ліків Тернопільського

державного медичного університету імені І. Я. Горбачевського: «Фармако-

економічне обґрунтування створення, отримання, розробки субстанцій

лікарських речовин і лікарських засобів на основі продуктів хімічного синтезу

й біологічно активних речовин рослинного походження, їх стандартизація та

фармакологічне вивчення» (номер державної реєстрації 0111U003756) та плану

роботи дослідного центру ПАТ «Галичфарм».

Мета і завдання дослідження. Розробка специфікацій та методів

контролю якості багатокомпонентних рослинних лікарських засобів (ЛЗ)

«Седавіт», таблеток та «Холелесан», капсул.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Проаналізувати дані літератури, вимоги провідних фармакопей

світу щодо питань аналізу і стандартизації ЛРС та рослинних ЛЗ, підходи щодо

вибору та використання біологічно активних речовин (БАР) або маркерів для

оцінки їх вмісту у ланцюжку ЛРС – екстракт – готовий лікарський засіб (ГЛЗ).

2. Провести фітохімічне дослідження якісного складу та кількісного

вмісту БАР ЛРС валеріани коренів з кореневищами, глоду плодів, хмелю

шишок, звіробою трави, м'яти листя, нагідок квіток, цмину піщаного квіток,

моркви дикої плодів.

3. Провести фітохімічне дослідження якісного складу та кількісного

вмісту БАР комплексного густого екстракту (КГЕ) Седавіту, моркви дикої

плодів та нагідок квіток екстракту густого, цмину піщаного квіток екстракту

сухого і обрати БАР та/або маркери для контролю якості вибраних екстрактів

та ГЛЗ на їх основі.

4. Розробити методики ідентифікації і кількісного визначення БАР

та/або маркерів, обраних для контролю якості ЛРС, екстрактів та ГЛЗ на їх

основі.

5. Запропонувати показники якості досліджуваних екстрактів і ГЛЗ та

визначити для них критерії прийнятності.

9

6. Провести валідацію розроблених методик ідентифікації і

кількісного визначення БАР та/або маркерів для екстрактів та ГЛЗ.

7. Розробити проекти методів контролю якості (МКЯ) на «Седавіт»,

таблетки і «Холелесан», капсули.

8. Розробити методологічні підходи для порівняльної оцінки складу

екстрактів, отриманих за різними технологіями.

Об’єкти дослідження. Розробка методів контролю якості КГЕ Седавіту,

цмину піщаного квіток екстракту сухого, моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого, куркуми довгої коренів екстракту сухого.

Предмет дослідження: вивчення якісного складу та кількісного вмісту

БАР та маркерів у ЛРC, екстрактах та ГЛЗ, обґрунтування та розробка методик

ідентифікації та кількісного визначення БАР у ЛРС, екстрактах та ГЛЗ.

Методи дослідження. При виконанні досліджень було використано

методи якісного та кількісного аналізу діючих речовин: тонкошарова

хроматографія (ТШХ), газорідинна хроматографія (ГРХ), високоефективна

рідинна хроматографія (ВЕРХ), хромато-мас-спектрометрія, УФ-

спектрофотометрія. Всі прилади, що використовувалися у дослідженні,

пройшли державну метрологічну повірку та атестацію, а також відповідну

кваліфікацію (IQ, PQ) відповідно поточних вимог GMP/GСLP.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено вивчення

компонентного складу різних класів БАР КГЕ Седавіту. Отримало подальший

розвиток обґрунтування показників і критеріїв якості в ланцюзі ЛРС - рідкий

екстракт – густий екстракт. Вперше науково обґрунтовано і експериментально

апробовано методики стандартизації моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого.

Запропоновано науково обґрунтований методологічний підхід у вигляді

комплексу аналітичних методів для проведення порівняльної оцінки хімічного

складу комплексних екстрактів, отриманих за різними технологіями.

Досліджуючи динаміку якісного складу та кількісного вмісту БАР

активних фармацевтичних інгредієнтів у ланцюжку ЛРС – екстракт – ГЛЗ,

запропоновано якісні та кількісні критерії стандартизації ГЛЗ «Седавіт»,

10

таблеток та «Холелесан», капсул. Вперше розроблено методики ідентифікації

флавоноїдів, компонентів ефірних олій та методики кількісного визначення

флавоноїдів, ментолу і турмеронів, куркуміноїдів у ГЛЗ «Холелесан», капсули.

Розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення флавоноїдів,

нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у ГЛЗ «Седавіт», таблетки.

Практичне значення одержаних результатів.

За результатами фітохімічних досліджень розроблено специфікації та

методи контролю на:

- Седавіт, екстракт густий (Реєстраційне посвідчення № UA/9342/01/01,

наказ МОЗ України № 968 від 12.11.2013 р.).

- Седавіт, таблетки (Реєстраційні посвідчення № UA/7821/01/01, Наказ

МОЗ України № 179 від 01.03.2013 р., № РК-ЛС-5№015865, наказ МОЗ

Республіки Казахстан № 866, від 12.12.2014 р., № 9109/09/14 наказ МОЗ

Республіки Білорусь від 23.10.2014 р., № Б-250-95 №24809, наказ МОЗ

Республіки Узбекистан від 16.05.2014 р).

- Цмину піщаного екстракт сухий (Реєстраційне посвідчення №

UA/13551/01/01, наказ МОЗ України № 241 від 02.04.2014).

- Моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракт густий (Реєстраційне

посвідчення № UA/13985/01/01, наказ МОЗ України № 771 від 24.10.2011).

- Холелесан, капсули (проект МКЯ).

Результати роботи впроваджено на ПАТ «Галичфарм» та ПАТ

«Київмедпрепарат» в технологічній та аналітичній документації, згідно якої

виготовляються вказані екстракти та ГЛЗ «Седавіт», таблетки.

Розроблені МКЯ на ГЛЗ «Холелесан», капсули пройшли експертизу в

ДЕЦ МОЗ України, отримано дозвіл МОЗ на проведення клінічних

випробувань, які завершені, лікарський засіб знаходиться на етапі реєстрації.

Фрагменти роботи впроваджені у навчальний процес кафедри фармації

ННІ ПО Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я.

Горбачевського (акт впровадження від 10.03.2015 р.), кафедри управління та

економіки фармації з технологією ліків Тернопільського державного медичного

університету ім. І. Я. Горбачевського (акт впровадження від 16.03.2015 р.),

11

кафедри технології ліків і біофармації Львівського національного медичного

університету імені Данила Галицького (акт впровадження від 16.03.2014 р.),

кафедри технології біологічно-активних сполук, фармації та біотехнології

Національного університету «Львівська політехніка» (акт впровадження від

24.03.2015 р.).

Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно:

- проведено патентно-інформаційний пошук за темою дисертаційної роботи,

визначено мету та задачі досліджень;

- проведено фітохімічне дослідження БАР цмину піщаного квіток, моркви

дикої плодів, нагідок квіток;

- обґрунтовано і вибрано критерії для стандартизації ЛРС, КГЕ Седавіту,

цмину піщаного квіток екстракту сухого, моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого;

- обґрунтовано і вибрано показники якості для стандартизації ГЛЗ «Седавіт»,

таблеток та «Холелесан», капсул;

- розроблено методики ідентифікації і кількісного визначення БАР в ланцюзі

ЛРС – екстракт – ГЛЗ;

- розроблено проекти МКЯ на КГЕ Седавіту, цмину піщаного квіток екстракт

сухий, моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракт густий, «Седавіт»,

таблетки та «Холелесан», капсули;

- проведено порівняльні дослідження зразків КГЕ Седавіту, отриманих за

різними технологіями, запропоновані критерії для оцінки різниці складу БАР та

маркерів в таких продуктах.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної

роботи викладені та обговоренні на ХV Міжнародному медичному конгресі

студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2009), 3-ій Міжнародній науково-

практичній конференції «Науково-технічний прогрес і оптимізація

технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2011), ІІІ

Всеукраїнській науково-практичній конференції «Хімія природних сполук»

(Тернопіль, 2012), 2nd

European Conference on Biology and Medical Science

(Австрія, Відень, 2014).

12

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, у тому

числі 7 статей у наукових фахових журналах, 4 тез у матеріалах конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Загальний обсяг дисертації становить

285 сторінок. Робота складається зі вступу, п’яти розділів, загальних висновків,

списку використаних джерел літератури (15 с.) та 24 додатків (64 с.). Список

використаної літератури містить 153 джерела, у тому числі 41 іноземних

авторів. Робота ілюстрована 47 таблицями (19 с.) та 94 рисунками (30 с.).

13

РОЗДІЛ 1

СУЧАСНИЙ СТАН ДОСЛІДЖЕНЬ ЛІКАРСЬКОЇ РОСЛИННОЇ СИРОВИНИ

ТА ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ НА ЇХ ОСНОВІ

1.1 Фітохімічне дослідження лікарської рослинної сировини, що

застосовується для виробництва екстрактів Седавіту, Цмину піщаного квіток,

Моркви дикої плодів та Нагідок квіток, Куркуми

Складовими компонентами комплексного густого екстракту Седавіту є

п’ять компонентів: Валеріани кореневища з коренями, Глоду плоди, Звіробою

трава, М’яти перцевої листя, Хмелю шишки, тому доцільним є вивчення даних

літератури по хімічному складу та методах аналізу БАР у даних видах

сировини.

Валеріана (Valeriana officinalis L.) – багаторічна трав’яниста рослина

родини валеріанові (Valerianaсеае).

Монографії Європейської, Британської та інших провідних фармакопей

світу передбачають ідентифікацію валеренової кислоти і її похідних, кількісне

визначення вмісту ефірних олій та валеренової і ацетоксивалеренової кислот,

які є маркерними речовинами для ЛРС валеріани лікарської [1, 2, 3, 4].

Встановлено, що терапевтична дія валеріани обумовлена наявністю в ЛРС

валепотріатів і сесквітерпеноїдів ефірної олії: валеренової кислоти,

валеренолової кислоти, ацетилвалеренової кислоти, валеранола та ін. Це дало

можливість вибору більш достовірних показників для стандартизації препаратів

валеріани [5, 6].

Авторами [7, 8, 9, 10] проведено огляд методів ідентифікації і кількісного

визначення валепотріатів методами тонкошарової хроматографії (ТШХ) і

спектрофотометрії. В основу визначення валепотріатів покладена

загальноприйнята гідроксамова реакція визначення складних ефірів, в

результаті гідролізу яких утворюються з гідроксиламіном гідроксамові кислоти,

які при взаємодії з іонами феруму (ІІІ) утворюють забарвлений комплекс з

14

максимумом поглинання при довжині хвилі 512 нм. Вміст валепотріатів у ЛРС

перераховують на валтрат, а в таблетках - на кислоту валеренову, застосовуючи

різні питомі показники поглинання [11, 12]

Авторами [13, 14] проведено хромато-мас-спектрофотометричне

дослідження складу ЛРС валеріани, а також мас-спектрометричний аналіз

елементного складу надземних і підземних органів валеріани закарпатської.

Авторами [15, 16] здійснено ВЕРХ-аналіз фенольних сполук квіток валеріани

лікарської, а в роботі [17] наведено результати кількісного визначення

сумарного вмісту валепотріатів в надземній частині Valeriana officinalis і деяких

лікарських рослинних зборах. Авторами використано поглинання 2,6-

дихлорфеноліндофеноляту натрію у фосфатному буфері при довжині хвилі

595 нм для кількісної оцінки сумарного вмісту валепотріатів

спектрофотометричним методом.

Групою вчених [17] були розроблені методики якісного та кількісного

визначення БАР комбінованого фітопрепарату - таблеток і капсул, що містять

тонко здрібнені порошки кореневищ з коренями валеріани, трави пустирника і

плодів глоду. Приведено оптимальні умови визначення складних ефірів

(іридоїдів та ін. БАР, що містять складноефірну групу), валепотріатів і

сесквітерпенових компонентів ефірної олії валеріани, а також суми флавоноїдів

у перерахунку на рутин.

Для кількісного визначення валеренових кислот і лігнанів з метою

контролю стабільністі сировини й екстрактів валеріани вченими [18, 19, 20]

було розроблено нову методику з використанням високоефективної рідинної

хроматографії (ВЕРХ). Була ідентифікована гідроксивалеренова кислота, а в

екстрактах з рослини відзначена висока стійкість лігнанів до дії різних

факторів, хоча і виявлене деяке зниження в них концентрації

ацетоксивалеренової кислоти при різних температурах і зберіганні в

поліетиленових і алюмінієвих контейнерах.

Було проведено експериментальні дослідження екстракції валеренової,

ацетоксивалеренової кислот з висушеного і здрібненого кореневища валеріани.

Встановлено оптимальні параметри концентрації етанолу, використовуваного в

15

якості екстрагента, температури і тривалості екстракції, співвідношення маси

сухого екстракту до маси сировини і розмір часток рослинної сировини, і

показано, що ці фактори впливають на процес екстракції [21, 25].

Авторами [23, 24] запропоновано метод ТШХ в системі розчинників

гексан – етилацетат – льодяна ацетатна кислота (65:35:0,5) для ідентифікації

валеренової, гідроксивалеренової і ацетоксивалеренової кислот та їх похідних.

Для кількісного визначення вони використали пряму спектрофотометрію в УФ-

ділянці спектру. Група авторів [22] повідомляє, що метод ТШХ дозволяє

ідентифікувати валеренову кислоту у краплях, таблетках, капсулах. Ними ж

запропоновано кількісне визначення валеренової кислоти методом ВЕРХ в ГЛЗ

із використанням в якості рухомої фази чистого ацетонітрилу.

В роботі [25] запропоновано метод ТШХ для розділення, ідентифікації і,

після проявки анісово-сульфатнокислим реактивом та сканування при довжині

хвилі 700 нм, кількісного визначення валеренової кислоти в межах вмісту 500

нг – 2,5 мкг.

Глід колючий (Crataegus oxyacantha) - кущ або невелике дерево родини

розових (Rosaceae). Плоди збирають у період повного достигання,

без плодоніжок; сушать при температурі 50 –60°С.

Основними діючими речовинами ЛРС глоду плодів є флавоноїди

(гіперозид), фенолокислоти (хлорогенова та кофейна), кумарини, тритерпенові

кислоти. У плодах знайдено органічні кислоти, вуглеводи та споріднені

кислоти: цукри, сорбіти, пектинові речовини (1,9–6,1 %); вітаміни: аскорбінова

кислота (вітамін С) — 18–100 мг %, β-каротин — 0,4–2,7 мг%, філохінон

(вітамін К); фенольні сполуки: антоціани — до 1200 мг%; лейкоантоціани —

400–1500 мг%; катехіни; флавоноли; фенолокислоти; кумарини (0,7–3,4%);

стерини; тритерпенові кислоти: урсолова, олеанолова, кратегова, акантова. [26,

27, 28].

Плоди глоду містить не менше 1,5% флавоноїдів, в перерахунку на

гіперозид (без попереднього гідролізу) і не менше 0,6% від флавонових C-

глікозидів у перерахунку на вітексин, який визначається спектрофотометрично

16

при 410 і 336 нм, відповідно. Кількісне визначення також можна проводити з

допомогою рідинної хроматографії [29].

Автором Т.Ю. Аббасовою із співавторами [30]; з допомогою двомірної

хроматографії та спектрофотометрії досліджено склад антоціанідів плоді глоду.

Із суми ціанідинів виділено і ідентифіковано ціанідин-3-глюкозид, ціанідин-3-

рутинозид, ціанідин-3,5-диглюкозид, пеларгонидин-3-глюкозид, пеларгонидин-

3,5-диглюкозид, пеонидин-3,5-диглюкозид. Найбільша кількість ціанідинів у

досліджуваних зразках припадає на ціанідин-3,5-диглюкозид (від 48 до 60%).

Авторами Н.Ф. Гончаров, А.М. Ковалева та А.Н. Комісаренко [31] із

досліджуваних зразків виділено та ідентифіковано гіперозид, біокверцетин,

витексин, хлорогенова, неохлорогенова та кофейна кислоти. Запропоновано

кількісний вміст флавоноїдів проводити в перерахунку на гіперозид, оскільки

основна біологічна дія глоду зумовлена флавоноїдами, серед яких гіперозид є

домінуючим компонентом. Вміст гіперозиду в плодах знаходиться в межах від

0.028 % до 0.04 % [32].

Хміль звичайний (Humulus lupulus, Canabaceae) – багаторічна трав'яниста

рослина родини шовковицевих.

У спеціалізованих господарствах його культивують як технічну рослину

[33 - 35]. Для медичних потреб використовують жіночі суцвіття – “шишки”

(Strobuli Humuli lupuli, синонім — Strobuli Lupuli) і лупулін (Lupulinum,

синонім — Glandulae Lupuli) [36].

Дозрілі шишки (супліддя) хмелю містять: ефірну олію (0,2 - 3 %), що

являє собою ароматну, світло- чи темно-жовтого кольору рідину, що

складається з вуглеводнів – мірцену, мірценолу, гумулену, фарнезену, спиртів

(ліналоолу, гераніолу), сесквітерпенів [37]; органічні кислоти –хмеледубильна,

валеріанова, ізовалеріанова, хлорогенова, хмелева, пеларгонова, капріонова,

каприлова; гірку речовину лупулін (16 - 26 %), що складається з двох хмелевих

кислот (ά-кислота гумулон, β-кислота лупулон) і продукти їх окиснення; ά,β-

смоли; алкалоїд хумулін, який має неприємний смак і запах [38]; флавоноїди –

астрагалін, кверцетин, ізокверцетин, рутин, мірицитин, кемпферол та інші;

17

вітаміни (В1, В3, В6, РР, С); смолисті сполуки (8 - 22 %); дубильні речовини (3

%); кумарини [38 - 41].

Флавоноїди шишок хмелю належать до різних хімічних груп, зокрема,

флавонів, ізофлавонів, флавонолів, флаванолів, флаванонів, халконів,

антоціанідинів [42, 43], які відповідають за різнопланову фармакологічну

активність сировини та препаратів на її основі.

Досліджуючи склад шишок хмелю, О. А. Горошко із співавт. [44],

методом ТШХ та хімічними реакціями встановили наявність у них флавоноїдів,

алкалоїдів та амінокислот. Методом ТШХ на пластинках фірми “Меrck” з

використанням рухомої фази етилацетат – оцтова кислота льодяна – вода (6:1:1)

в присутності свідків ідентифіковані кверцетин, рутин, гіперозид, ще 4 зони

флавоноїдних сполук не були ідентифіковані.

О. Ю. Григорчук із співавт. [45] запропонували проводити оцінку якості

шишок хмелю за вмістом флавоноїдів, поліфенолів та екстрактивних речовин,

запропоновано суму флавоноїдів перераховувати на рутин, а суму поліфенолів

– на кислоту кофейну.

Основними представниками флавоноїдів хмелю є ксантогумол та

ізоксантогумол, тому можливість їхнього якісного та кількісного визначення у

сировині та препаратах на її основі зацікавила науковців [46, 47], а вивчення

нових представників з цього класу БАР стало метою багатьох досліджень [48 -

52]. Так, у роботах [53, 54] авторами запропоновано використання методу

високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) для ідентифікації та

кількісного визначення пренільованих флавоноїдів, зокрема ксантогумолу,

ізоксантогумолу, 8-пренілнарінгеніну та інших.

М. А. Алексеєвою із співавт. [55], розроблено методики визначення

основних пренільованих флавоноїдів (ксантогумол, ізоксантогумол) в шишках

хмелю з використанням обернено-фазової ВЕРХ в ізократичному режимі з

спектрофотометричним і флуориметричним детектуванням. Халкони

детектуються за ультрафіолетовим (УФ)-поглинанням при довжині хвилі 370

нм, флавоноїди – при 290 нм. Показано, що за вмістом ксантогумолу та

18

ізоксантогумолу – продукту його ізомеризації, можна оцінювати якість та

автентичність препаратів на основі екстрактів хмелю.

Визначення якісного та кількісного складу поліфенольних сполук в

шишках хмелю методами ВЕРХ, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії,

проведено Алексеєвою М. А. із співав. [56].

В. І. Дейнека із співавт. [57] дослідили, що ізократичні умови обернено-

фазової ВЕРХ є прийнятними як для якісного, так і для кількісного визначення

флавоноїдів, зокрема рутину.

Багато робіт присвячено вивченню впливу режимів екстракції на вихід

діючих речовин з шишок хмелю звичайного, зокрема, досліджено вплив часу

екстракції, виду та концентрації екстрагенту на вихід поліфенолів та

флавоноїдів [58, 59].

Для дослідження шишок хмелю та ідентифікації відповідних їм кислот

запропоновано поєднання методів рідинної хроматографії та мас-спектрометрії

із хімічною іонізацією при атмосферному тиску. Доведена ефективність

використання запропонованої комбінованої системи для ідентифікації аналогів

та гомологів у сумішах [60].

Дослідження ліпофільних фракцій різної ЛРС зацікавило багатьох

науковців [61, 62].

Одержання та аналіз ліпофільної фракції шишок хмелю стало предметом

дослідження С. І. Берестової, В. М. Ковальова та інших [47]. Так, авторами

Берестовою С. І., Ковальовим В. М., Ковальовим С. В., Мазурець С. І.,

проведено ідентифікацію каротиноїдів та токоферолів методом ТШХ. Кількісне

визначення каротиноїдів проводили спектрофотометричним методом при

довжині хвилі 453 нм. Визначення якісного та кількісного вмісту жирних

кислот проводили методом газорідинної хроматографії (ГРХ), метилових

естерів жирних кислот методом газової хроматографії (ГХ) [47, 62].

Фармакопейною рослиною є трава звіробою (Hypericum perforatum L.).

Звіробій — багаторічна трав’яниста рослина родини звіробойних. З

лікувальною метою застосовують траву, яку збирають під час цвітіння до появи

незрілих плодів [28].

19

Із джерел літератури відомо, що трава звіробою містить конденсовані

антраценові похідні – гіперицин та псевдогіперицин. Їх кількість складає 0,5 %.

Гіперицин та псевдогіперицин супроводжуються смолами (до 10 %) [28, 63]. В

траві звіробою знаходяться флавоноїдні глікозиди: рутин, гіперозид, мірецетин,

лейкоантоцианидіни и антоціанидіни (5 - 6 %). Вміст гіперозиду в траві досягає

до 1 - 1,2 %, трава звіробою також містить дубильні речовини (до 10%), ефірну

олію (0,2 -0,3 %), сапоніни, аскорбінову кислоту, каротин (до 55 мг/100 г) [28,

64, 65].

В.А. Куркин із співавторами [66] встановили, що вміст флавоноїдів і

антрацен похідних у різних частинах сировини знаходяться в широких межах.

Найбільший вміст флавоноїдів виявлено в листях (5,9 %) та квітах (6,9 %), а

антраценпохідні в найбільшій кількості локалізуються у квітках звіробою

(0,81 %).

Авторами E. Moroydor Derun, Z. Eslek, and S. Piskin у свої роботі [67]

охарактеризовано компонентний склад ефірної олії трави звіробою. З

допомогою газової хроматографії та хромато-мас аналізу ідентифіковано

терпени такі як α-пінен, 2-β-пінен, β-мірцен, каріофілен (у культивованих

зразках), α-селінен (у культивованих зразках). Рідинною хроматографією

ідентифіковано кверцетин, гіперозид, адгіперфорін, кофейна кислота,

гіперфорин і кверцитрин.

У роботі [68] з допомогою ВЕРХ проведено порівняльні дослідження

флавоноїдів звіробою продірявленого та звіробою плямистого і встановлено,

що вміст гіперозиду складає 6,50 % ± 0,3 %, рутину – 0,10 % ± 0,02 %

кверцетину – 0,23 % ± 0,02 % в траві звіробою плямистого, в траві звіробою

продірявленого вміст гіперозиду – 1,30 % ± 0,2 %, рутину – 2,5 % ± 0,3 %,

бісапігеніну - 1,05 % ± 0,03 % і кверцетину - 0,40 % ± 0,05 %.

М’ята перцева (Mentha piperita L) - багаторічна культивована трав’яна

рослина з родини губоцвіті (Lamiaceae). М’ята перцева містить ефірну олії,

найбільше її міститься в суцвіттях (4 - 6 %), в листі м’яти може бути до 2,5 %

олій. Основними компонентами ефірної олії листя м’яти є ментол (40 – 70 %),

ментон (10 – 25 %), пулегон, ментофуран, а також ефіри ментолу і оцтової та

20

валеріанової кислот. В листі м’яти в незначних кількостях містяться урсолова

та олеїнова кислоти ( в сумі до 0,5 %), каротин (до 40 мг/100г), гісперидин,

бетаїн [27, 70].

Вивченню якісного складу ефірної олії м’яти перцевої присвячена велика

кількість робіт. Так, В. С. Доля із співавторами [69] методом ГРХ

ідентифікували 18 компонентів в ефірній олії м’яти перцевої, головними з яких

були ментол – 36,25 %, ментон – 24,94 % та ізоментон – 10,40 %. Ними ж

встановлено, що кількісний вміст олії в листі м’яти перцевої становить 1,5 %.

М. Т. Дмитрієвим та іншими [71] проведено хромато-мас-

спектрометричне вивчення летких компонентів 7 видів рослин південного

Криму (зокрема, м’яти перцевої). Ідентифікацію органічних речовин проводили

по мас-спектрах, порівнюючи їх з відомими. На основі проведених досліджень

встановлено, що головними компонентами летких речовин м’яти перцевої є

ментол, l-ментон, d-ментон, l-ментилацетат, лімонен, α-пінен.

Авторами [72, 73] розроблені газохроматографічні методики якісного та

кількісного визначення головних компонентів ефірних олій у їхніх сумішах та у

готових лікарських засобах (визначення ментолу, метилацетату й ментону в

м’ятно-ментолових таблетках).

У результаті досліджень ефірних олій різних видів м’яти (Mentha

longifolia L. Huds, Mentha arvensis L.) методом ГРХ [74, 75, 76] встановлено

кількісний вміст та компонентний склад олій, який змінюється залежно від

виду сировини та місця її зростання.

Морква дика (Daucus carota L.) – дворічна трав'яниста жорстко-волосиста

рослина родини селерових (зонтичних) [77, 78]. Вона росте як бур'ян на полях і

відкритих місцях по всій території України [77]. Для медичних потреб

використовують плоди рослини (Fructus Dauci carotae).

Плоди моркви дикої містять ефірну олію (0,5 - 2,9 %), яка складається з

60 % гераніолу, α-пінену, міоцену, n-цимолу, геранілацетату, цитралю,

каротолу, дауколу, дауцену, β-каріофілену; 0,8 % кумаринів (псорален,

бергаптен, ксантотоксин, умбеліферон); флавоноїди (похідні лютеоліну,

діосметину, кверцетину, апігеніну тощо); жирну олію (11 - 50 %), що містить

21

пальмітинову, петрозелінову, олеїнову, лінолеву, пеларгонову та інші жирні

кислоти; 1,4 % алкалоїдів; 0,2 % дубильних речовин; стероїди; органічні

кислоти, більше 20 мікроелементів [77, 27]. Головними компонентами ефірної

олії є каротол, даукол [79].

Хімічний склад плодів моркви дикої вивчений недостатньо, в основному

вивчалась ефірна олія, оскільки вона широко використовується в косметології.

Г. В. Пігулевським, В. І. Ковальовою та їхніми співробітниками

встановлено, що основним компонентом ефірної олії є гераніол та його естер, l-

α-пінен, d-дауцен, l-β-бісаболен, d-каротол, даукол, азарон, вміст та

співвідношення яких коливається в залежності від місця зростання та

кліматичних умов вирощування даної сировини [77].

Плоди моркви дикої є джерелом кумаринів та фурокумаринів. Так, Л. І.

Дранік і А. П. Прокопенко при вивченні кумаринового складу плодів моркви

дикої у спиртово-водному екстракті цих плодів після його хроматографічного

розділення на колонці поліамідного сорбента, використовуючи елюювання

сумішшю бензолу з хлороформом, отримали 18 фракцій, вміщуючих суміш 2 -

3 речовин. При проведенні хроматографії окремих фракцій на колонках з

поліамідом (елюент: вода – 96 % етанол) було виділено 10 сполук.

Використовуючи фізико-хімічні константи, УФ-спектроскопію і при порівнянні

з достовірними зразками, серед них ідентифікували 8 сполук, аналогічних

скополетину, ескулетину, умбеліферону, пеуцеданіну, оксипеуцеданіну,

прагненіну, остолу і ксантотоксину [77, 78].

Цмин піщаний (Helichrysum arenarium (L) Moench – багаторічна рослина з

родини складноцвітих. Як лікарську сировину використовують суцвіття, які

збирають на початку цвітіння. В суцвіттях містяться флавоноїди: флавон

нарінгенін і його 5-глюкозиди саліпурпузид, ізосаліпурпузид та геліхризин,

флавон апігенін і його 5-глюкозиди, флавонол - кепферол і його 3-глюкозиди,

похідні фталевого ангідриду: 5,7-диоксифталид, 5-метокси-7-оксифталид, 5-

метокси-7-глюкозилфталид, також дубильні речовини, ефірні олії (до 0,04 %),

кумарин (скополетин), органічні кислоти, каротиноїди [26].

22

Автором А.В. Куркин [80] із квітів цмину піщаного виділено та

ідентифіковано методом ВЕРХ ізосаліпурпузид, саліпурпузид, 5,7-дигідрокси

фталід, 5-метокси-7-глюкозилфталид. Розроблена методика кількісного

визначення ізосаліпурпузиду методом ВЕРХ при довжині хвилі 360 нм [80]. У

роботі [81] авторами проведено фітохімічне дослідження складу фенольних

сполук квітів цмину піщаного. Методами ТШХ та ВЕРХ виявлено 11 сполук,

встановлено, що близько 40 % становить ізосаліпурпузид.

Авторами Н.В. Попова, М.Ф. Ткаченко, П.В. Липовецький [82] в

надземних органах цмину піскового хромато-мас-спектрометричним методом

визначено наявність та вміст 44 летких сполук. В квітках цмину піскового

виявлено 21 компонент, з яких 5 монотерпеноїдів, 2 сесквітерпеноїди, 3

аліфатичні альдегіди, 3 ароматичні речовини, 6 алканів та інші речовини; в

стеблах з листками виявлено 34 компонента, з яких 2 монотерпеноїди, 11

сесквітерпеноїдів, 2 речовини терпеноїдної природи, 5 аліфатичних альдегідів,

6 ароматичних речовин та 6 алканів. Домінуючими сполуками квіток цмину

піскового є алкани трикозан (64.71 мг / кг) і пентакозан (96.37 мг / кг), стебел з

листками – сесквітерпеноїди шиобунон (82.09 мг / кг) і 1,4-цис-1,7-транс-

акоренон (106.72 мг / кг) та ароматична сполука цис-азарон (135.50 мг / кг).

У роботі [83] проведено дослідження в ЛРС цмину компонентного складу

флавоноїдів та фенолкарбонових кислот. Розроблено методику ідентифікації

методом ВЕРХ, встановлено що домінуючим компонентом є ізосаліпурпозид,

його вміст у сировині складає від 2,6 до 13,9 %. Ідентифіковано також

хлорогенову та ферулову кислоти.

Нагідки (Calendula officinalis L) – однорічна рослина з родини

складноцвітих. У квіткових корзинках містяться каротиноїди: каротин

(30 мг/100 г), лікопін, валоксантин, цитроксантин, флавоксантин [84].

Квітки нагідок містять ізопренові сполуки: моно-, сескві-, ди-, три-,

тетратерпеноїди. Серед монотерпенових сполук переважають біциклічні:

камфен, борнеол, камфора. Тритерпенові глікозиди (похідні олеанолової

кислоти): глікозид F (календулозид E), календулозид А (глікозид I), глікозид G,

календулозид А (глікозид II), глікозид D (календулозид G), календулозид F,

23

глікозид III, глікозид IV (календулозид С), глікозид В, глікозид С

(календулозид Н), календулозид В, глікозид V, календулозид D, глікозид А,

глікозид VI, глікозид VII, глікозид VIII [84, 85].

У квітках нагідок виявлено такі каротиноїди: β-, γ-, δ-каротин, лікопін,

неуроспорин, фітоєн, фітофлуїн, рубіксантин, ксантофіл (лютеїн), зеаксантин,

віолоксантин, флавохром, цитроксантин (мутатохром), флавоксантин,

хризантемаксантин. Вміст каротиноїдів у трубчастих жовтих квітках становить

91,2 мг/100 г, в язичкових жовтих — 195,4 мг/100 г; в язичкових темно-

жовтогарячих квітках — 1546,6 мг/100 г. Вміст флавоноїдів — від 0,33 –0,88 %,

основні з них ізорамнетин та його глікозиди, кверцетин, рутин. Нагідок квітки

містять етерну олію, кумарини — скополетин, умбеліферон і ескулетин; смолу

(3,4 %); слиз (2,5 – 4,0 %); дубильні речовини (6,4 %); гіркоти (календен);

аскорбінову кислоту; органічні кислоти; сліди алкалоїдів [27, 85].

У роботі [85] вивчено компонентний склад ефірної олії ківіток календули.

З допомогою ГХ – мас ідентифіковано 22 компоненти, серед ідентифікованих

компонентів 22,5 % складає δ-cadinen, 20,4 % - α – cadinol.

А.В. Гудзенко у роботі [86] розробив методику визначення флавоноїду

ізорамнетину в сировині квіток нагідок лікарських методом ВЕРХ. За

розробленою методикою було проаналізовано сім серій препарату квіток

нагідок лікарських. В усіх пробах був ідентифікований та кількісно визначений

ізорамнетин, вміст якого був у межах від 0,2936±0,0117 % до 0,4420±0,0224 %,

у перерахунку на висушену сировину. У роботі [87] проведено дослідження

кількісного вмісту флавоноїдів в перерахунку на гіперозид та досліджено

календулозиди методом ТШХ.

Куркума довга (Curcuma longa L., родина Zingiberaceaе) — багаторiчна

трав’яниста рослина висотою 60-100 см, за зовнiшнiм виглядом нагадує очерет.

В Україну сировина iмпортується. Куркума довга мiстить жовтi пігменти (3 -

6 %) — куркумiноїди, якi належать до групи дiарилгептаноїдiв [88]. Основними

куркумiноїдами є куркумiн (0,6 %), монодесметоксикуркумiн та

бiсдесметоксикуркумiн. Вiдносно недавно видiлено та встановлено структуру

нових дiарилгептаноїдiв — циклокуркумiну та каледіну [89].

24

У роботі (90) авторами розроблено методики ідентифікації та кількісного

визначення основних куркуміноїдів. Ідентифікацію запропоновано проводити

методом ТШХ з використанням системи розчинників метанол Р- хлороформ Р

(95:5), кількісне визначення запропоновано проводити методом ВЕРХ,

паралельно в даних умовах запропоновано проводити ідентифікацію за спів

падінням часі утримування основних піків на хроматограмі розчину порівняння

та випробовуваного розчину.

1.2 Сучасний стан методів ідентифікації та кількісного визначення

біологічно активних речовин лікарської рослинної сировини, що застосовується

для виробництва екстрактів Седавіту, Цмину піщаного квіток, Моркви дикої

плодів та Нагідок квіток, Куркуми.

Вимоги до якості лікарської рослинної сировини, що застосовується для

виробництва екстракту Седавіту, описані у монографіях ЕР та ДФУ. Для

ідентифікації біологічно активних речовин рослинної сировини

використовуються хроматографічні методи контролю, в більшості ТШХ.

В Україні до видання другого доповнення Державної Фармакопеї України

(ДФУ) контроль якості сировини валеріани здійснювався за ГФ ХІ. Монографії

провідних фармакопеї світу ідентифікували валеренову кислоту і її похідні,

спочатку визначаючи тільки вміст ефірних олій, а пізніше і кількісний вміст

валеренової і ацетоксивалеренової кислот, які є маркерними речовинами для

валеріани лікарської [1, 2, 91, 92]. В опублікованих монографій ЄФ на

кореневища з коренями валеріани, сухий екстракт і настойку валеріани

використовують той же підхід – запропоновано визначати суму гідрокси-,

ацетокси- і валеренової кислот в перерахунку на валеренову кислоту [91].

Згідно ДФУ [92], ЛРС валеріани ідентифікується методом ТШХ за

наявністю валеренової і ацетоксивалеренової кислот і повинна містити не

менше 0,17 % сесквітерпенових кислот у перерахунку на валеренову кислоту

(метод ВЕРХ).

25

У Європейській Фармакопеї (ЄФ) [91] та в монографії Державної

Фармакопеї України (ДФУ) [92] на “Глоду плоди” запропоновано

використовувати метод тонкошарової хроматографії (ТШХ) для ідентифікації в

ЛРС хлорогенової, кавової кислот, гіперозиду та рутину. Кількісну оцінку

запропоновано проводити по вмісту проціанідинів в перерахунку на ціанідину

хлорид спектрофотометричним методом. У зв’язку з тим, що ЛРС, яка присутня

на ринку України, не завжди відповідає вимогам ДФУ/ЕФ, у національній

частині монографії ДФУ на “Глоду плоди” запропоновано кількісне визначення

проводити методом диференціальної спектрофотометрії за вмістом флавоноїдів

в перерахунку на гіперозид. [92].

В Європейській Фармакопеї (ЄФ) [91], а зараз і в монографії Державної

Фармакопеї України (ДФУ) на “Хмелю шишки” запропоновано

використовувати метод тонкошарової хроматографії (ТШХ) для ідентифікації в

сировині лупулонів, хумулонів та ксантогумолу [92]. Разом з цією

ідентифікацією у третьому доповненні до ДФУ запропоновано випробування на

вміст речовин, що екстрагуються 70 % об/об спиртом, втрати в масі при

висушуванні (не більше 13 %), загальної золи (не більше 12 %), сторонніх

домішок (не більше 4 % плодів, 10 % інших сторонніх органів рослини, 1 %

сторонніх часток) [92]. Кількісне визначення окремих компонентів чи груп БАР

не передбачено, хоча дана ЛРС вміщує також інші класи БАР.

У траві звіробою ідентифікацію рутину, гіперозиду, псевдогіперицину та

гіперицину згідно монографій ДФУ [92, 94] та ЄФ [91], проводять методом

ТШХ з використанням в якості рухомої фази суміш розчинників кислота

мурашина безводна – вода- етилацетат та зразків-свідків рутин та гіперозод.

Кількісне визначення суми гіперицинів в перерахунку на гіперицин, згідно

вимог ДФУ [92] та ЄФ [91], проводиться методом спектрофотометрії. Вміст

гіперицинів в перерахунку на гіперицин та суху речовину повинен становити не

менше 0,08 %.

Відповідно до монографії ДФУ на “Звіробою траваN” [92], в даній ЛРС

проводиться кількісне визначення суми флавоноїдів диференціальною

26

спектрофотометрією у перерахунку на гіперозид та суху сировину [91, 91].

Вміст флавоноїдів у сировині має становити не менше 1,2 %.

Для ідентифікації ЛРС м’яти листя ЄФ [91] та ДФУ [93] передбачають

методи ТШХ. Відповідність розміщення зон на хроматограмах

випробовуваного розчину послідовності розміщення зон на хроматограмі

розчину порівняння дає можливість ідентифікувати ментол, цинеол,

ментилацетат та інші компоненти у складі ефірної олії м’яти, використовуючи

ТШХ в системі розчинників: етилацетат Р – толуол Р (5:95). Окрім того, на

хроматограмі випробовуваного розчину можуть бути присутні інші, менш

інтенсивно забарвлені зони. Для кількісних характеристик пропонується

визначати вміст ефірної олії, якої в перерахунку на безводну сировину має бути

не менше 12 мл/кг для цільної сировини та не менше 9 мл/кг для різаної

сировини.

Для аналізу ЛРС нагідок квітів ЄФ [91] пропонує методи ТШХ.

Відповідність розміщення зон на хроматограмах випробовуваного розчину

послідовності розміщення зон на хроматограмі розчину порівняння дає

можливість ідентифікувати рутин, кавову та хлорогенову кислоти,

використовуючи ТШХ в системі розчинників: мурашина кислота безводна Р –

вода Р - етилацетат Р (10:10:80). Окрім того, на хроматограмі випробовуваного

розчину можуть бути присутні інші, менш інтенсивно забарвлені зони. У ДФУ

монографія «Нагідок квіткиN» [94] ідентифікацію передбачено проводити за

наявністю календулозидів. Кількісне визначення суми флавоноїдів, згідно

вимог монографії, проводиться методом диференціальної спектрофотометрії,

усі розрахунки проводять в перерахунку на гіперозид.

Квітки цмину піщаного не описані в провідних фармакопеях світу, тому

роботи по розробці методів ідентифікації та кількісного визначення є

актуальними. Фітохімічні дослідження сировини, проведені А.В. Куркиним і

співавторами [80, 95] та інші літературні дані [83, 96] вказують на те, що

флавоноїди можуть бути обрані для якісної та кількісної характеристики

рослинної сировини. Маркерами для ідентифікації мажуть бути обрані

ізосаліпурпузид, нарінгенін, апігенін і його глюкозиди. Домінуючим

27

флавоноїдом є ізосаліпурпузид, тому його кількісний вміст може слугувати

критерієм якості сировини.

Хімічний склад плодів моркви дикої вивчений недостатньо, в основному

вивчалась ефірна олія, оскільки вона широко використовується в косметології.

Плоди моркви дикої містять ефірну олію (0,5-2,9 %), яка складається з 60 %

гераніолу, α-пінену, міоцену, n-цимолу, геранілацетату, цитралю, каротолу,

дауколу, дауцену, β-каріофілену; 0,8 % кумаринів (псорален, бергаптен,

ксантотоксин, умбеліферон); флавоноїди (похідні лютеоліну, діосметину,

кверцетину, апігеніну тощо); жирну олію (11-50 %), що містить пальмітинову,

петрозелінову, олеїнову, лінолеву, пеларгонову та інші жирні кислоти; 1,4 %

алкалоїдів; 0,2 % дубильних речовин; стероїди; органічні кислоти, більше 20

мікроелементів [77, 78]. Для ідентифікації плодів моркви дикої, пропонується

ідентифікація основних компонентів ефірної олії гераніолу та гераніолацетату,

а вміст ефірної олії характеризує кількісні показники ЛРС [79]. У роботах [97,

98, 99, 100] для ідентифікації фенольних сполук запропоновано методом ТШХ

ідентифіковувати флавоноїди лютеолінової та апігенінової груп. У роботі [97]

вивчено компонентний склад фенольних сполук плодів моркви дикої зібраних у

різних регіонах України, показано різницю у компонентному складі

флавоноїдів у зразках, зібраних у Західному регіоні України та в Криму.

Згідно літературних даних та фітохімічних досліджень, куркуміноїди є

основними компонентами екстракту Куркуми, тому їх ідентифікація та

сумарний вміст підтверджують та визначають якість екстракту [88, 90].

1.3. Тенденції вибору маркерів при дослідженні вмісту біологічно

активних речовин у ланцюжку сировина – екстракт – готовий лікарський засіб.

Актуальною проблемою фармацевтичного аналізу є стандартизація

лікарських засобів рослинного походження. Сучасний стан розвитку фізико-

хімічних методів аналізу та рівень дослідження хімічного складу лікарських

рослин дозволяють здійснювати стандартизацію рослинних ЛП за діючими БАР

[76, 148].

28

У процесі стандартизації рослинних препаратів важливою умовою є вибір

групи чи окремих БАР, які б відповідали за фармакологічну активність

готового ЛП. Якісні маркери рослинної сировини, напівпродуктів, а потім

готових ЛФ, повинні відображати як фармакологічну дію, так і склад достатньо

лабільних БАР, вміст яких може змінюватися у процесі зберігання протягом

всього терміну придатності [147].

Проблемною є стандартизація багатокомпонентних фітопрепаратів, які

поєднують в своєму складі різні групи БАР. При виборі підходів до оцінки

якості ЛП рослинного походження з різним хімічним складом потрібно

обґрунтувати вибір не тільки методів ідентифікації та визначення вмісту БАР,

але й визначитися з критеріями показників якості, які б характеризували

постійність хімічного складу рослинних лікарських засобів, а, отже, й очікувану

ефективність, безпеку та якість [148].

На фармацевтичному ринку присутні препарати різнопланової

фармакологічної дії на основі квіток календули. Так, стандартизація

“Карофілену” проводиться за кількісним вмістом суми каротиноїдів, а

флавоноїдний препарат “Калефлон” стандартизований за кількісним вмістом

флавоноїдів [87].

У процесі дослідження жовчогінного збору № 2, науковці [101],

зустрілися з проблемою вибору групи речовин з метою стандартизації

препарату, оскільки кожна із включеної ЛРС характеризується своїм хімічним

складом та стандартизується за відповідним складом БАР. Так, трава деревію,

листя м’яти перцевої, плоди коріандру стандартизуються за вмістом ефірних

олій (не менше 0,1 %, 1,0 %, 0,5 %), квітки цмину піщаного – за сумою

флавоноїдів (не менше 6 % у перерахунку на ізосаліпурпузид або не менше 3 %

в перерахунку на рутин). Оскільки кожен з компонентів збору містить

представники флавоноїдів та доведений факт жовчогінної дії суми флавоноїдів

з квіток цмину піщаного, тому доцільно цю групу БАР використати як маркери.

Запропонована авторами методика стандартизації збору ґрунтується на

спектрофотометричному визначенні суми флавоноїдів у перерахунку на рутин

[101].

29

Цікавими та проблемними є питання стандартизації рослин роду

Echinacea та препаратів на їх основі. Авторами описано важливість вивчення як

гідрофільних, так і ліпофільних речовин, оскільки достеменно невідомо за

рахунок яких БАР проявляється імуностимулююча дія [102].

Розробка нових ЛЗ рослинного походження вимагає їх стандартизації по

ланцюгу сировина – напівпродукт (екстракт) – готовий лікарський засіб (ГЛЗ)

(дозований).

Так, Дячок В.В., Кожарська І. М., Лебединець Л. О. [103] запропонували

газохроматографічний метод визначення ментолу, борнілацетату як в сировині,

так і в комплексних фітопрепаратах, що містять олії м’яти перцевої та ялиці

сибірської.

Вивчаючи проблему стандартизації комплексних фітопрепаратів, що

містять сировину кульбаби лікарської, Цуркан О.О. із співавт. [104], розробили

методику якісного та кількісного визначення цикорієвої кислоти як в траві

кульбаби лікарської, так і у відповідних препаратах (“Гепатофіт”, “Детоксифіт”,

“Нефрофіт”, “Тоніфіт”, “Тонзилонг Н”) методом ВЕРХ.

Складний багатокомпонентний склад екстрактивних речовин рослинного

походження, що наявні в екстрактах, потребує використання сучасних методів

аналізу для стандартизації як напівпродуктів, так і готових ЛЗ. Частина діючих

речовин рослин на даний час залишається невивченою.

З летких компонентів, наприклад, моно- та сесквітерпенових вуглеводнів,

таких речовин практично немає, оскільки для їх визначення, головним чином,

використовується хромато-мас-спектрометрія, яка забезпечена найбільш

інформативною системою (базами даних) порівняно з іншими методами. Цей

метод використовується для аналізу великої кількості ефірноолійної сировини

та препаратів на її основі, наприклад, для ромашки аптечної [105], деревію

[106], перстачу гусячого [107], буркуну білого [108], чебрецю [85, 109, 146],

шавлії лікарської [110], ялиці сибірської [111, 112] тощо.

Відомо, що якісний склад та кількісний вміст ефірної олії відповідної

сировини залежить від багатьох чинників, а саме від місця та умов

вирощування рослини, фази вегетації, метеорологічних умов збирання, а також

30

від умов сушіння та зберігання сировини від моменту збору до аналізу. [116,

117, 145] Тому вміст ефірної олії та її компонентний склад не має постійних та

сталих характеристик [113, 114, 115, 143, 144].

Частина представників групи флавоноїдів, поліфенолів, кумаринів,

танінів, які визначаються методом ВЕРХ, залишаються невивченими, оскільки

бази даних є недостатньо інформативними [118 - 121]. В такому разі для їх

ідентифікації необхідно використовувати стандартні взірці, що утруднює аналіз

через їхню обмежену кількість та високу вартість.

Для якісного та кількісного визначення флавоноїдів, зокрема рутину, у

ЛРС та у відповідних препаратах Дейнека В. І. із співавторами запропонували

використання методу ВЕРХ [122]. Для визначення флавоноїдного складу трави

мальви низької Литвиненко В. І. та інш. [123] використали метод ВЕРХ з

використанням стандартних взірців флавоноїдів.

З метою стандартизації рослинних препаратів за вмістом кумаринів часто

використовується метод ВЕРХ [124, 125]. Зокрема, розроблено методики

вивчення кумаринового складу трави коріандра посівного [126].

Згідно даних літератури [73, 74, 127], для стандартизації екстрактів

найчастіше використовуються такі методи як спектроскопія в УФ- та видимій

ділянках, ТШХ, ВЕРХ, ГРХ, хромато-мас-спектрометрія.

Спектроскопічні дослідження в УФ- та видимій областях широко

використовуються для стандартизації рослинної сировини та відповідних її

препаратів, що містять флавоноїди, кумарини, гідроксикоричні кислоти.

Зокрема, у літературі наведені методики визначення суми гідроксикоричних

кислот у перерахунку на хлорогенову кислоту у траві та плодах чумизи, у корі

та листі осики [128, 129], суми флавоноїдів – у перерахунку на рутин в пагонах

карагани деревовидної [130], суми полісахаридів – в перерахунку на глюкозу

[131], cуми кумаринів – у перерахунку на кумарин [132, 133] та умбеліферон

[128].

Для визначення суми флавоноїдів у сировині, екстрактах та в готових

лікарських засобах часто використовується диференціальна спектрофотометрія.

Так, Сосніна С. А. із співавт. [134], вивчаючи вміст флавоноїдів у листках

31

подорожника, Петриченко В. М. та інш. [135], досліджуючи флавоноїди

Euphrasia officinalis L., розробили методики визначення їх суми у перерахунку

на цинарозид. У роботах [105, 136 - 140] авторами запропоновані методики

визначення суми флавоноїдів у перерахунку на рутин в листі смородини,

жовчогінному зборі, протидіабетичному екстракті. При стандартизації

інтраназального препарату «Оксофіл» авторами використано флавоноїди як

маркер доброякісності ЛЗ, визначаючи суму флавоноїдів також у перерахунку

на рутин [138]. Для кількісного визначення флавоноїдів у сировині кукурудзи

(стовпчики з приймочками) Євдокімовою О. В. [139] розроблена методика їх

визначення у перерахунку на лютеолін.

На сьогоднішній день у ДФУ [92 - 94, 141, 142] наведені фармакопейні

статті на ЛРС та окремі рослинні препарати, які допомагають у виборі методів

контролю якості, як ЛРС, що не увійшла до ДФУ, так і ГЛЗ на рослинній

основі, і виборі критеріїв/показників стандартизації.

1.4. Підходи до вибору критеріїв ідентифікації та кількісного визначення

лікарської рослинної сировини та лікарських засобів на їх основі.

Автором С.В. Суром у роботах [147, 148] запропоновано методологію

обґрунтування критеріїв для оцінки якості лікарських засобів з рослинної

сировини, яка передбачає розробку специфікації для цієї групи препаратів з

урахуванням одно- та двограничних інтервалів вмісту БАР у лікарській

рослинній сировині, а також закономірностей їх переходу у рослинні

препарати, можливих втрат під час виробництва і точності методів аналізу, що

використовуються. Як критерій для ідентифікації запропоновано брати

виявлення в готовому ЛЗ БАР, маркерів або їх груп, характерних для всіх

складових компонентні. Якщо до ЛЗ входять рослинні компоненти з

подібним складом або дуже велика кількість компонентів, тоді у першому

випадку проводять ідентифікацію БАР, маркера або їх груп, характерних

для кількох складових, а у другому — характерних для складових, які

32

входять до рослинного ЛЗ у більшій кількості або мають найбільшу

активність [147].

Куркиною А.В. у роботі [95] обґрунтовано підхід до стандартизації

рослинної сировини і лікарських засобів, що містять флавоноїди. З допомогою

сучасних методів аналізу обґрунтовано методики якісного та кількісного аналізу

ЛРС в препаратів цмину піщаного, пижма звичайного, м’яти перцевої, ромашки

аптечної.

Гризодубом О.І. із співавторами [127] проведено систематичний аналіз

застосування різних підходів щодо кількісного визначення лікарської рослинної

сировини та сумарних препаратів у ДФУ. Розглянуто переваги та недоліки різних

підходів. Показано, що найбільш надійними способами стандартизації є

визначення умовних концентрацій методом спектрофотометрії та контроль

сигнальних компонентів хроматографічними методами.

У роботах [127, 148 - 150, 151] авторами описаний підхід до вибору

критеріїв меж вмісту в рослинних ЛЗ БАР або маркерів з урахуванням

вмісту БАР або маркерів у вихідній ЛРС чи в рослинних препаратах, їх

внеску у склад готового ЛЗ і особливостей технології виробництва. Як вихідні

дані запропоновано використовувати літературні дані та вимоги фармакопейних

монографій з урахуванням о вмісту БАР у ЛРС або рослинних препаратах,

можливих втрат під час виробництва і точності методів аналізу. Ці вимоги

повинні бути реальними і відображати той рівень БАР або маркерів, який може

характеризувати ефективність готових ЛЗ [147].

Для більшості готових рослинних ЛЗ, для яких невідомі індивідуальні

сполуки або групи БАР, єдино відповідальні за терапевтичну активність, критерії

для кількісних характеристик встановлюють як «не менше …», подібні

однограничні межі розраховують для готових ЛЗ [148, 152].

Таким чином, при теоретичних розрахунках критеріїв стандартизації

готових лікарських засобів (ГЛЗ) потрібно взяти до уваги результати

ідентифікації визначення БАР або маркерів, фармакопейні вимоги (до ЛРС,

діючих та ДР), інформацію про склад ГЛЗ та технологію виробництва (можливі

перетворення і втрати БАР під час виробництва). При цьому результати

33

кількісного визначення за обраною методикою повинні відображати

терапевтичну активність засобу. Разом з тим, методика аналізу діючих

компонентів у рослинних препаратах повинна виявляти ознаки нестабільності

ЛЗ, вона повинна мати низький поріг виявлення речовин і бути простою у

виконанні [147, 148].

ВИСНОВКИ

1. Для розробки методів аналізу готового лікарського засобу та вибору

критеріїв стандартизації слід ідентифікувати біологічно активні речовини, які

забезпечують, фармакологічну дію.

2. Вибір методу аналізу визначається природою визначуваної

речовини, складом активних фармацевтичних інгредієнтів і допоміжних

речовин готового лікарського препарату, технологією лікарського засобу,

чутливістю методу.

3. Критерії якості лікарського засобу визначаються фармакопейними

вимогами (до готового лікарського засобу, лікарської рослинної сировини,

допоміжних речовин), результатами ідентифікації і кількісного визначення

біологічно активних речовин або вибраних маркерів, технологією

виробництва, результатами дослідження стабільності готового препарату.

34

РОЗДІЛ 2

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Характеристика об’єктів дослідження

2.1.1. Екстракти Седавіту, цмину піщаного квіток, моркви дикої плодів та

нагідок квіток, куркуми

Седавіт екстракт рідкий - рідина від світло-коричневого до коричневого

кольору, отримують шляхом екстрагування суміші п’яти видів ЛРС: валеріани корені

з кореневищами (Valeriana officinalis L.), хмелю шишки (Humulus lupulus),

глоду плоди (Crataegі monogyna або Crataegus laevigata), м’яти листя (Mentha

piperita L.) звіробою трава (Hypericum perforatum L) 35 % (об/об) етанолом.

Шляхом упарювання комплексного рідкого екстракту Седавіту одержують

комплексний густий екстракт Седавіту (КГЕ Седавіту) - в’язку масу

коричневого кольору зі специфічним запахом.

Цмину піщаного квіток екстракт сухий – жовтий або жовтий з буруватим

чи зеленуватим відтінком порошок зі слабким специфічним запахом.

Гігроскопічний. Легко розчинний в етанолі, практично не розчинний у воді та

хлороформі.

Моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракт густий – в’язка маса від

зеленувато-коричневого до коричневого кольору зі специфічним запахом.

Отримують шляхом упарювання рідких екстрактів нагідок квіток (Caléndula

officinális L) та моркви дикої (Daucus сarota) (5:1). Моркви дикої плодів та

Нагідок квіток екстракт густий - в’язка маса коричневого кольору зі

специфічним запахом.

Куркуми довгої екстракт – кристалічний жовтий порошок, що легко

розчинний в ацетоні, основними компонентами є куркуміноїди (куркумін,

диметоксикуркумін та бісдиметоксикуркумін).

35

Куркуми олія - жовта рідина з характерним запахом та смаком, яка легко

розчинна в метанолі, етанолі, н-гексані та хлороформі, нерозчинна у воді,

основні її компоненти – турмерони (Ar-турмерону, α-турмерону та β-

турмерону).

М’яти перцевої олія – безбарвна, блідо-жовта або блідо-зеленувато-

жовта рідина з характерним запахом та смаком, яка змішується з етанолом,

ефіром та метиленхлоридом [91].

2.1.2. Готові лікарські засоби Седавіт таблетки та Холелесан, капсули

Седавіт, таблетки – таблетки від бежевого до коричневого кольору, з

вкрапленнями, овальної форми з двояко випуклою поверхнею з рискою. До

складу ГЛЗ «Седавіт» таблетки входять КГЕ Седавіту, піридоксину

гідрохлорид та нікотинамід, допоміжні речовини: крохмаль картопляний,

натрію кроскармельоза, лактози моногідрат, целюлоза мікрокристалічна,

кальцію стеарат.

Холелесан, капсула – тверді желатинові капсули, корпус і кришка

жовтого кольору. Вміст капсули – порошок від жовтого до жовто-оранжевого

кольору з зеленувато-коричневим відтінком, з вкрапленнями і специфічним

запахом. До складу ГЛЗ «Холелесан», капсули входять сухий екстракт цмину

піщаного квіток (Helichrysum arenarium (L.) Moench), екстракт моркви дикої

плодів(Daucus сarota) та нагідок квіток (Caléndula officinális L) густий (1:5),

сухий екстракт куркуми довгої коренів (Curcuma longa) у співвідношенні

0,8 : 1 : 0,3 і ефірні олії м’яти перцевої та куркуми.

В процесі проведення аналітичних досліджень використовували різні

стандартні взірці: ізовалеріанова кислота (Fluka), ізосаліпурпузид (ФСЗ),

нарінгенін (Fluka), апігенін-7-глюкозид (Fluka), ментол (Fluka), 1-тридеканол

(Fluka), гіперозид (ФСЗ ДФУ), апігенін (Fluka), лютеолін (ФСЗ), кверцетин

(Fluka), ізокверцетин (Sigma), рутин (Sigma), лютеолін-7-глюкозид (ФСЗ),

кемпферол (Sigma), хлорогенова кислота (Sigma), кофейна кислота (Fluka),

розмаринова кислота (Sigma), цикорієва кислота (Sigma), ферулова кислота

(Sigma), ar – турмерон (Fluka), куркумін (Sigma), календулозиди (ФСЗ), ментол

36

(Fluka), цинеол (Fluka), ментилацетат (Sigma), тимол (Fluka), лімонен (Sigma),

ментон (Fluka), ментофуран (Sigma), пулегон (Fluka), флуоресцеїн (Sigma),

cудан оранжевий G (Sigma), судану оранжевого Р (Sigma), куркуміну Р (Fluka),

диметиламінобензальдегід Р (Fluka), кумарин (Fluka), 7-метоксикумарин

(Fluka), скополетин (Fluka), умбеліферон (Sigma), 5,7-дигідрокси-4-

метоксикумарин (Fluka), ескулін (Sigma), епікатехін (Fluka).

Для проведення випробувань методом ТШХ використовували

хроматографічні пластинки Silica gel 60 F254 (фірми “Merсk”, Німеччина) Для

нанесення проб на пластинку використовували прилад для автоматичного

нанесення проб «CAMAG Linomat 5», хроматографування проводили в

хроматографічній камері «CAMAG».

Для ідентифікації фенольних сполук використовували систему

розчинників мурашина кислота безводна Р – вода Р – етилацетат Р

(10:10:80), для проявлення хроматограм використовували розчин 10 г/л

дифенілборної кислоти аміноетилового ефіру в метанолі Р та 50 г/л макроголу

400 Р в метанолі P. Для приготування розчину порівняння використовували

наступні стандартні зразки (Fluka) речовин-свідків: рутин, гіперозид, апігеніну-

7-глюкозид, лютеолін, апігенін, ізосаліпурпузид, кверцетин, хлорогенова

кислота, цикорієва кислота, кофейна кислота, ферулова і розмаринова кислоти.

Для ідентифікації календулозидів використовували систему розчинників

хлороформ Р – кислота оцтова льодяна Р – метанол Р – вода Р (35:16:6:4), для

проявлення пластинки використовували розчин анісового альдегіду.

Для ідентифікації кумаринів використовували систему розчинників:

верхній шар суміші кислота оцтова розведена Р : ефір Р : толуол Р (10:50:50).

Хроматограми проглядали в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм після обробки

їх специфічним реактивом – 2М розчином калій гідроксиду спиртового Р. Для

приготування розчину порівняння використовували наступні стандартні зразки

кумаринів: кумарин, 7-метоксикумарин, скополетин, умбеліферон, 5,7-

дигідрокси-4-метоксикумарин, ескулін, епікатехін.

Оцінку результатів проводили шляхом порівняння величин Rf зон на

хроматограмі розчину порівняння та випробовуваного розчину.

37

Перевірку хроматографічної розділювальної здатності пластинок та

збіжності величин Rf (рис. 2.1.) проводили за методиками, наведеними в ДФУ

[92-94], результати випробувань наведені в табл. 2.1.

Рис. 2.1. Хроматограма розчину для визначення придатності ТШХ пластинок.

На підставі результатів випробувань, наведених в таблиці 2.1, можна

зробити висновок, що вимоги ДФУ щодо хроматографічної розділювальної

здатності пластинок та збіжності величин Rf витримані.

38

Таблиця 2.1.

Результати перевірки хроматографічної розділювальної здатності

пластинок та збіжності величин Rf

Назва барвника

Судан

червоний

Метиловий

оранжевий

Метиловий

червоний

Бромкрез

оловий

зелений

Вимоги ДФУ до значення Rf

плям барвників

0,75 - 0,98 0,10 - 0,25 0,35 - 0,55 Не більше

0,15

Значення Rf плями барвника

хроматограми розчину для

визначення придатності

ТШХ пластинок

0,78

0,78

0,78

0,78

0,78

0,18

0,18

0,18

0,18

0,18

0,43

0,43

0,43

0,43

0,43

0,12

0,12

0,12

0,12

0,12

Вимоги ДФУ до різниці Rf

плям барвників

< 0,02 < 0,02 < 0,02 < 0,02

Різниця Rf плям барвників 0 0 0 0

Для проведення випробувань методом ВЕРХ використовували рідиний

хроматограф Agilent 1200.

Для ідентифікації фенольних сполук та календулозидів використовували

наступні умови хроматографування: хроматографічну колонка XTerra C18

(виробник фірма “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250 мм з розміром часток 5

мкм. Рухома фаза А: розчин натрію дигідрофосфату моногідрату 0,6 г/л,

доведений до рН 2,5 кислотою фосфорною; рухома фаза В: ацетонітрил.

Швидкість рухомої фази – 1 мл/хв, градієнтне елюювання. Детектування

проводили за допомогою діодно – матричного детектора при довжині хвилі 330

нм. Об’єм проби, що вводився – 100 мкл, температура колонки – 25 ºС, час

хроматографування 60 хв. При проведенні випробування методом ВЕРХ

використовували розчин стандартних зразків: хлорогенову, кофейну, ферулову,

цикорієву і розмаринову кислоти, лютеолін-7-глюкозид, рутин, гіперозид,

ізокверцетрин, апігенін-7-глюкозид, кверцетрин, ізосаліпурпузид, мірецетин,

лютеолін, кверцетин, нарінгенін, апігенін, кемферол (Fluka).

Для ідентифікації кумаринів використовували наступні умови

хроматографування: хроматографічна колонка XTerra C18, розміром 4,6 х 250

39

мм з розміром часток 5 мкм. Рухома фаза ацетонітрил Р- розчин 5 г/л кислоти

фосфорної (22:78). Швидкість рухомої фази – 1,7 мл/хв., градієнтне елюювання.

Детектування проводили за допомогою УФ-детектора при довжині хвилі 275

нм. Об’єм проби, що вводився – 20 мкл. При проведенні випробування

використовували розчин стандартних зразків: 7-метоксикумарин, скополетин,

умбеліферон, 5,7-дигідрокси-4-метоксикумарин, ескулін, епікатехін, пірогалол,

умкалін.

Ідентифікацію речовин проводили шляхом порівняння часів утримування

піків на хроматограмі випробовуваного розчину з часами утримування

стандартних речовин.

Для дослідження вмісту компонентів ефірних олій валеріани коренів з

кореневищами та м’яти перцевої листя, використовували метод ГРХ.

Хроматографування проводили на газовому хроматографі “Agilent 6890N” з

полуменево-іонізаційним детектором.

Для ідентифікації та визначення компонентного складу ефірної олії

плодів моркви дикої, рідкого екстракту моркви дикої плодів та комплексного

густого екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток використовували метод

ГРХ. Аналіз проводили на газовому хроматографі “Agilent technologies 6890N”

із мас-спектрометричним детектором 5975, колонка капілярна кварцева

розміром 60 м х 0,53 мм, вкрита шаром Макроголу 20000 Р товщиною 1 мкм.

Лінійна швидкість газу-носія гелію для хроматографії – 1,5 мл/хв. Ефірну олії

плодів моркви дикої отримували перегонкою з водяною парою, відповідно до

фармакопейної статті “Визначення вмісту ефірних олій у лікарських засобах

рослинного походження” (п. 2.8.12, С. 59 - 60). Ідентифікацію компонентів

проводили шляхом порівняння часів утримування компонентів досліджуваної

суміші з часами утримування стандартів та даними бібліотеки мас-спектрів.

Вимірювання оптичної густини і записи спектрів поглинання зразків

проводили на спектрофотометрі Cary–100 (Varian).

Розчини реактивів готували відповідно до вимог ДФУ [142].

40

2.2. Обґрунтування та вибір методів досліджень

2.2.1. Екстракти Седавіту, цмину піщаного квіток, моркви дикої плодів та

нагідок квіток, куркуми довгої

Для ідентифікації та кількісного визначення окремих речовин чи груп

БАР у сировині, екстрактах використовували сучасні чутливі та селективні

аналітичні методи.

Згідно вимог ДФУ [92-94, 142], для аналізу сировини, яка містить

флавоноїди запропоновано використовувати ТШХ при ідентифікації

відповідних флавоноїдів (зокрема, гіперозиду в листках, квітках та плодах

глоду, траві собачої кропиви, траві звіробою; 4-метилескулетину, скополетину

в листках кропиви; ізокверцитрину в квітках бузини; рутину в квітках нагідок,

траві звіробою тощо), ВЕРХ - для визначення відсоткового вмісту певних

флавоноїдів (апігенін-7-глюкозид у квітках ромашки) та спектрофотометрію

(диференціальну) – для кількісного визначення суми флавоноїдів (наприклад,

суми флавоноїдів у перерахунку на гіперозид у траві споришу, стеблах хвоща,

траві звіробою, квітках нагідок; суми флавоноїдів у перерахунку на лютеолін-7-

глюкозид у квітках ромашки; суми флавоноїдів у перерахунку на

ізокверцитрозид в квітках бузини та інш.).

Для ідентифікації гідроксикоричних кислот, відповідно до вимог ДФУ

[92 - 94, 142], використовували метод ТШХ (наприклад, кислоти хлорогенової у

траві споришу, листках кропиви, квітках, листі та плодах глоду, квітках бузини

та нагідок), а для кількісного аналізу – спектрофотометрію (сума

гідроксикоричних кислот у перерахунку на хлорогенову кислоту у листках

кропиви) та ВЕРХ (сума хлорогенової кислоти та кофеїл-яблучної кислоти у

перерахунку на хлорогенову кислоту в листках кропиви, сума флавоноїдів у

перерахунку на апігенін -7-глюкозид у квітках ромашки).

При аналізі ефірноолійної сировини ДФУ [92 - 94, 142] пропонує

використовувати хроматографічні методи, а саме, ТШХ – для ідентифікації

(ментол, цинеол в листі м’яти перцевої; хамазулен, α-бісаболен в квітках

41

ромашки, тощо), ГРХ – для ідентифікації та визначення кількісного вмісту

компонентів (наприклад, сумарний вміст тимолу та карвакролу в траві чебрецю,

компонентний склад ефірної олії м’яти перцевої за вимогами ЄФ [91].

Ідентифікацію лупулону, ксантогумолу у шишках хмелю проводили

методом ТШХ за вимогами ДФУ [93].

З метою ідентифікації кумаринів у плодах моркви дикої, відповідному

рідкому екстракті, комплексному густому екстракті використовували метод

ТШХ.

Ідентифікацію календулозидів у квітах нагідок, у рідкому екстракті та

комплексному густому екстракті використовували метод ТШХ згідно вимог

ДФУ [94] та рідинною хроматографією.

З метою ідентифікації валеренових кислот у валеріани коренях з

кореневищами використовували метод ТШХ, для ідентифікації ізовалеріанової

кислоти у комплексному густому екстракті використовували метод газової

хроматографії.

Для ідентифікації та кількісного визначення суми куркуміноїдів в сухому

екстракті куркуми використовували метод ВЕРХ.

Для вивчення ідентичності складу БАР у ланцюзі ЛРС – рідкий екстракт

– густий екстракт використовували метод хромато-мас-спектрометрії.

2.2.2. Готові лікарські засоби «Седавіт» таблетки та «Холелесан» капсули

Ідентифікацію кислоти ізовалеріанової у «Седавіт» таблетках, як

основного компонента валеріани коренів з кореневищами, проводили методом

ГРХ.

Ідентифікацію поліфенольних сполук у «Седавіт» таблетках, як основних

компонентів, як біологічно активних сполук глоду плодів, звіробою трави,

хмелю шишок та м’яти перцевої листя, проводили методом рідинної

хроматографії, визначення суми флавоноїдів проводили методом

диференціальної спектрофотометрії

42

Ідентифікацію та кількісне визначення нікотинаміду (вітамін Р) та

піридоксину гідрохлориду (вітамін В6) проводили методом ВЕРХ.

Ідентифікацію фенольних сполук у «Холелесан» капсулах проводили

методом ТШХ, визначення суми флавоноїдів проводили методом

диференціальної спектрофотометрії.

Для ідентифікації та кількісного визначення в «Холелесан» капсулах

ментолу та суми турмеронів, як основних компонентів ефірної олії м’яти та

олії куркуми відповідно, використовували метод ГРХ з використання

полуменево-іонізаційного детектора.

Для ідентифікації та кількісного визначення в «Холелесан» капсулах

суми куркуміноїдів, як основних компонентів куркуми екстракту,

використовували метод ВЕРХ.

Ідентифікацію та кількісний вміст компонентів ефірної олії м’яти

проводили методом ГРХ, керуючись вимогами ЄФ, наведеними в монографії

“Peppermint oil” [91].

Ідентифікацію та кількісний вміст компонентів ефірної олії куркуми

проводили методом ГРХ, керуючись вимогами, наведеними в документації

виробника олії (Sami Labs Limited, Індія).

Дані методики аналізу та результати досліджень описані в розділах 3, 4, 5

та додатках.

ВИСНОВКИ

1. Охарактеризовано діючі компоненти «Седавіт, таблеток та «Холелесан»,

капсул.

2. Розглянуто методи ідентифікації та кількісного визначення

досліджуваних біологічно активних речовин у сировині, екстрактах та

готових лікарських засобах.

43

РОЗДІЛ 3

ДОСЛІДЖЕННЯ ТА РОЗРОБКА МЕТОДІВ КОНТРОЛЮ ЯКІСНОГО

СКЛАДУ ТА КІЛЬКІСНОГО ВМІСТУ ГУСТОГО ЕКСТРАКТУ СЕДАВІТУ

3.1 Обґрунтування вибору сполук та маркерів для ідентифікації основних

класів біологічно активних речовин у комплексному густому екстракті Седавіту

Екстракт Седавіту містить БАР п’яти ЛРС, вимоги до яких описані у

ДФУ [92]. БАР і маркери для ідентифікації і кількісного визначення

представлені у табл. 3.1.

Таблиця 3.1.

Біологічно активні речовини та маркери ЛРС валеріани коренів, глоду

плодів, звіробою трави, м’яти листя, хмелю шишок згідно вимог ДФУ

Сировина

БАР/маркери і метод визначення

Ідентифікація Кількісне визначення

Валеріани

корені

Валеренова,

гідроксивалеренова кислоти

(ТШХ)

Не менше 5 мл/кг ефірної

олії в перерахунку на суху

речовину;

Не менше 0,17 %

сексвітерпенових кислот в

перерахунку на

ізовалеренову (ВЕРХ).

Глоду плоди Хлорогенова та кавова

кислоти, гіперозид, три зони

слабкої червонуватої

флуоресценції (ТШХ).

Не менше 0,05 %

флавоноїдів в перерахунку

на гіперозид та суху

речовину (СФ).

Звіробою трава Рутин, гіперозид, гіперицин,

псевдогіперицин (ТШХ).

Не менше 1.2 %

флавоноїдів в перерахунку

на гіперозид та суху

речовину (СФ).

М’яти листя Карвон, пулегон, ментол,

ментилацетат, ізоментон

(ТШХ).

Не менше 12 мл/кг ефірної

олії в перерахунку на суху

речовину.

Хмелю

шишики

Хумулони, лупуліни,

ксантохумулони (ТШХ).

-

44

За складом фенольних сполук маловивченими є валеріани корені, м’яти

листя та хмелю шишки, фармакопейні вимоги щодо їх складу та вмісту у ЛРС

на сьогодні відсутні. Тому нашим завданням було провести фітохімічне

дослідження ЛРС з метою подальшого вибору маркерів, які дозволять

об’єктивно ідентифікувати та визначати активні речовини кожної ЛРС у КГЕ

Седавіту.

Методом ТШХ при детектуванні в УФ-світлі з довжиною хвилі 254 нм

(рис. 3.1) у зразках КГЕ Седавіту були ідентифіковані, зони які відповідають

псевдогіперицину та гіперицину. При детектуванні в УФ-світлі при довжині

хвилі 365 нм були ідентифіковані рутин, хлорогенова, кофейна, розмаринова

кислоти, гіперозид, лютеолін-7-глікозид та кверцетин. Відповідні хроматограми

представлені на рисунку 3.2.

1 2 3 4 5

Рис. 3.1. Хроматограма, отримана при ідентифікації фенольних сполук

(перегляд при - 254 нм) для: 1 - випробовуваного розчину трави звіробою;

розчинів порівняння: 2 – гіперозид, апігенін -7-глікозид, мірцетин, кофейна

кислота, кверцитину, апігенін, 3 –рутин, хлорогенова кислота, гіперозид,

лютеоліну-7-глюкозид, розмаринова кислота, цикорієва кислота, лютеолін; 4,5

– випробовуваного розчину КГЕ Седавіту

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 3.2. Хроматограма, отримана при ідентифікації фенольних сполук

для випробовуваних розчинів: 1 – шишок хмелю, 2 – валеріани коренів з

кореневищами, 3 – плодів глоду, 4 – листя м’яти, 5 – звіробою трави, 8 і 9 –

КГЕ Седавіт; для розчинів порівняння: 6 – гіперозид, апігенін-7-глікозид,

мірцетин, кофейна кислота, кверцитину, апігенін (знизу – догори), 7 – рутин,

хлорогенова кислота, гіперозид, лютеоліну-7-глюкозид, розмаринова кислота,

цикорієва кислота, лютеолін (знизу – догори).

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот в КГЕ

Седавіту методом ТШХ наведена в додатку А.

Методом ВЕРХ у зразках КГЕ Седавіту були ідентифіковані хлорогенова,

розмаринова, ферулова, кофейна кислоти, рутин, лютеолін, кверцетин, апігенін.

Відповідні хроматограми наведені на рис. 3.3, 3.4.

46

Рис. 3.3. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах

ідентифікації фенольних сполук КГЕ Седавіту.

Рис. 3.4. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана в умовах

ідентифікації фенольних сполук КГЕ Седавіту.

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот в КГЕ

Седавіту методом ВЕРХ наведена в додатку Б.

Для дослідження компонентів ефірних олій валеріани коренів та м’яти

листя використовували метод ГРХ, з допомогою якого ідентифікували

ментилацетат, ментол, пулегон, карвон та кислоту ізовалеріанову (рис. 3,5, 3,6).

Методика ідентифікації компонентів ефірних олій в КГЕ Седавіту методом ГХ

наведена в додатку В.

47

Рис. 3.5. Хроматограма розчину порівняння, отримана при ідентифікації

компонентів ефірних олій листя м’яти та валеріани коренів.

Рис. 3.6. Хроматограма випробовуваного розчину КГЕ Седавіту,

отримана при ідентифікації компонентів ефірних олій листя м’яти та валеріани

коренів.

Для ідентифікації комплексного густого екстракту були вибрані маркери,

які ідентифікують як окремі складові екстракту так і комплексний екстракт в

цілому.

Згідно монографії ЕР на рідкий екстракт м’яти листя [91] маркером для

ідентифікації обрано розмаринову кислоту. Результати фітохімічних

досліджень показали, що основна кількість розмаринової кислоти екстрагується

з листя м’яти, тому розмаринова кислота обрана маркером ідентифікації листя

м’яти у КГЕ Седавіт. За результатами фітохімічних досліджень (рис. 3.6)

встановлено, що для ідентифікації БАР м’яти листя ідентифікаційними

48

маркерами також можуть служити ментол та ментилацетат. Оскільки КГЕ

Седавіту отримують шляхом упарювання рідкого екстракту, то кількість летких

компонентів в густому екстракті суттєво зменшується. У зв’язку з цим,

ідентифікація м’яти листя в густому екстракті за наявністю ментолу, ментону

та ментилацетату стає ненадійною. Для ідентифікації БАР глоду плодів

запропоновано обрати кислоту ферулову, для звіробою трави – гіперицин і

псевдогіперицин, для шишок хмелю – кверцитин.

Згідно з результатами фітохімічних досліджень валеріани корені з

кореневищами у своєму складі містять органічні кислоти, тому для

ідентифікації валеріани коренів з кореневищами у комплексному екстракті було

обрано кислоту ізовалеріанову, як специфічний компонент коренів валеріани.

За результатами проведених досліджень складу біологічно активних

речовин КГЕ Седавіту запропоновано ідентифікувати компоненти екстракту за

такими маркерами:

валеріани корені – кислота ізовалеріанова методом ГРХ;

м’яти листя – кислота розмаринова методом ТШХ або ВЕРХ;

глоду плоди – кислота ферулова методом ВЕРХ;

звіробою трави – гіперицин і псевдогіперицин методом ТШХ;

шишок хмелю – кверцетин методом ТШХ або ВЕРХ.

3.2. Обґрунтування вибору сполук та маркерів для кількісного визначення

основних класів біологічно активних речовин у КГЕСедавіту

Глоду плоди, звіробою трава та шишки хмелю містять флавоноїди, тому

як кількісний показник якості густого екстракту Седавіту запропоновано

визначення суми флавоноїдів у перерахунку на рутин. Валеріани корені та

м’яти листя характеризуються значним вмістом гідроксикоричних кислот, які

визначали за їхнім власним поглинанням.

Оцінку кількісного вмісту флавоноїдів в КГЕ Седавіту проводили

спектрофотометрично. Як розчин порівняння, використовували розчин

стандартного зразка рутину (Fluka). У диференціальному спектрі поглинання

49

комплексу алюміній хлориду з флавоноїдами комплексного густого екстракту,

в умовах вибраної пробопідготовки, спостерігали максимум поглинання в

діапазоні 417 - 423 нм. Як видно з рисунку 3.7, в умовах кількісного визначення

флавоноїдів, спектр комплексного екстракту, за ходом кривої світлопоглинання

та положенням максимуму поглинання, відповідає спектру поглинання

відповідного комплексу СЗ рутину, тому суму флавоноїдів розраховували у

перерахунку на рутин.

Коливання положення максимуму поглинання в діапазоні від 417 до

423 нм для зразків різних серій КГЕ Седавіту свідчить про різноманітність і

дещо різне співвідношення окремих сполук флавоноїдів у рослинній сировині,

що входить до складу комплексного екстракту, проте переважаючим

компонентом є рутин (рис. 3.7).

Оцінку кількісного вмісту гідроксикоричних кислот в КГЕ Седавіту

проводили спектрофотометрично, в якості розчину порівняння

використовували розчин стандартного зразка кислоти розмаринової (Fluka)

(рис. 3.8).

Рис. 3.7. Диференціальний

електронний спектр поглинання

комплексу алюміній хлориду з:

флавоноїдами КГЕ Седавіту (1) та

стандартним зразком рутину (2).

Рис. 3.8. Спектри поглинання

розчинів гідроксикоричних кислот

КГЕ Седавіту (2) та стандартного

зразка розмаринової кислоти (1).

50

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів, визначений у КГЕ Седавіту становив від 1,8 % до 3,2 % в

перерахунку на рутин, вміст гідроксикоричних кислот – від 0,32 % до 0,53 %

(табл. 3.2).

Таблиця 3.2

Результати визначення вмісту суми флавоноїдів у досліджуваних зразках

КГЕ Седавіту

Серія екстракту Вміст суми флавоноїдів в

перерахунку на рутин та суху

сировину, %

Вміст гідроксикоричних

кислот в перерахунку на

кислоту розмаринову та

суху сировину, %

120112 3,21 ± 0,11 0,32 ± 0,01

250312 2,82 ± 0,10 0,48 ± 0,02

350412 3,41 ± 0,12 0,32 ± 0,01

450512 2,63 ± 0,10 0,53 ± 0,02

500513 2,42 ± 0,11 0,49 ± 0,01

650513 1,81 ± 0,10 0,64 ± 0,02

750713 2,27 ± 0,12 0,50 ± 0,02

1191013 2,55 ± 0,12 0,39 ± 0,01

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів в КГЕ Седавіту

наведена в розділі 3.5.

3.3. Дослідженння подібності складу і вмісту біологічно активних

речовин комплексних рослинних екстрактів, отриманих за різними

технологіями.

При розробці нової або оптимізації існуючої технології виробництва

екстрактів з ЛРС виникає необхідність проведення порівняльних досліджень

складу екстрактів, вироблених за різними технологіями, для оцінки

51

ефективності цих технологій, розробки специфікацій та розуміння різниці між

складом, вмістом та співвідношенням БАР в цих екстрактах.

Нами був запропонований критерій для оцінки різниці складу екстрактів,

отриманих за різними технологіями: якщо різниця між складом екстрактів,

отриманих за різними технологіями не перевищує різницю складів різних серій,

отриманих однією технологією, то склад екстрактів вважається подібним.

Для оцінки подібності між складом та співвідношенням основних

компонентів зразків КГЕ Седавіт, отриманих методом настоювання та методом

реперколяції нами проведені дослідження методами спектрофотометрії,

тонкошарової хроматографії, рідинної та газової хроматографії

На хроматограмах досліджуваних зразків, отриманих методом ТШХ (рис.

3.9, табл. 3.3), спостерігаються оранжево-жовті зони, які вказують на наявність

сполук флавоноїдів.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 3.9 Хроматограма, отримана в умовах ідентифікації поліфенольних

сполук КГЕ Седавіту для випробовуваних розчинів: 1, 2, 3 – отриманих

методом настоювання; 4, 5, 6, 7 – отриманих методом реперколяції.

52

Таблиця 3.3

Результати аналізу КГЕ Седавіту, виготовленого за двома різними технологіями, отримані при хроматографічних

дослідженнях методом тонкошарової хроматографії

Серії виготовлені методом

настоювання ( хроматограми 1, 2, 3)

Серії виготовлені методом реперколяції ( хроматограми 4,5,6,7)

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

R(f) Забарвл

ення

плям

0,14 жовто -

оранжеве

0,14 жовто -

оранжеве

0,14 жовто -

оранжеве

0,15 жовто -

оранжеве

0,14 жовто -

оранжеве

0,13 жовто -

оранжеве

0,14 жовто -

оранжеве

0,28 голуба

флюорис.

0,30 голуба

флюорис.

0,29 голуба

флюорис.

0,28 голуба

флюорис.

0,29 голуба

флюорис.

0,27 голуба

флюорис.

0,27 голуба

флюорис.

0,29 оранжеве - - - - - - - - 0,29 оранжеве 0,29 оранжеве

0,33 оранжеве 0,33 оранжеве 0,33 оранжеве 0,33 оранжеве 0,33 оранжеве 0,33 оранжеве 0,33 оранжеве

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,53 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,71 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,70 голуба

флюорис.

0,80 жовто -

оранжеве

0,80 жовто -

оранжеве

0,80 жовто -

оранжеве

0,81 жовто -

оранжеве

0,81 жовто -

оранжеве

0,79 оранжеве 0,78 оранжеве

- - - - - - - - - - 0,82 оранжеве 0,82 оранжеве

0,86 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

0,85 голуба

флюорис.

53

На хроматограмах усіх зразків наявні зони зеленувато-голубої

флуоресценції, які засвідчують наявність в екстрактах гідроксикоричних

кислот. На хроматограмах зразків, отриманих за різними технологіями,

спостерігаються співпадіння основних зон, наявність додаткових зон

спостерігається як у зразках, отриманих за різними технологіями так і для

різних зразків екстрактів, отриманих за однією технологією. Методика

ідентифікації флавоноїдів у КГЕ Седавіту методом ТШХ наведена у додатку Г.

Вивченя складу, вмісту і співвідношення кількостей флавоноїдів

проводили методом ВЕРХ (метод «відбитків пальців»). Дослідження зразків

методом рідинної хроматографії (табл. 3.4, рис. 3.10, 3.11) дозволило

ідентифікувати флавоноїди рутин, гіперозид, лютеолін, кверцитин та апігенін

шляхом порівняння часів утримування основних піків на хроматограмі

досліджуваних зразків та розчину порівняння.

Таблиця 3.4

Результати аналізу КГЕ Седавіту, виготовленого за різними технологіями,

отримані при дослідженнях методом ВЕРХ

методом (серія) Площа

рутину

Площа

гіперозиду

Площа

лютеоліну

Площа

кверцитину

Площа

апігеніну

Настоювання (с. 1) 266 454 1880 354 255

Настоювання (с. 2) 256 464 1804 352 241

Настоювання (с. 3) 248 495 1778 360 237

Середнє 257 471 1821 355 243

Реперколяції (с. 4) 292 495 2051 350 265

Реперколяції (с. 5) 297 512 1974 363 260

Реперколяції (с. 6) 300 528 1942 389 278

Реперколяції (с. 7) 287 517 2023 362 280

Середнє 294 513 1998 366 271

54

Рис. 3.10. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана при

ідентифікації фенольних сполук густого екстракту Седавіту, виготовленого

методом настоювання (метод ВЕРХ, детектування при 220, 260 та 350 нм).

Рис. 3.11. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана при

ідентифікації фенольних сполук густого екстракту Седавіту, виготовленого

методом реперколяції (метод ВЕРХ, детектування при 220, 260 та 350 нм).

55

Ідентифіковані піки на хроматограмах зразків отриманих за різними

технологіями відрізняються за висотою і площею, однак різниця між вмістом

та співвідношенням основних компонентів в зразках густих екстрактів,

отриманих методом настоювання та методом реперколяції, не перевищує

різниці в зразках, отриманих за однією технологією. Методика ідентифікації

фенольних сполук у КГЕ Седавіту методом ВЕРХ наведена у додатку Д.

Вивчення складу, вмісту і співвідношення летких компонентів листя

м’яти та коренів валеріани здійснювали методом ГРХ (парофазний аналіз).

Дослідження зразків методом газової хроматографії дозволило порівняти

склад та співвідношення летких компонентів, які присутні у густих

екстрактах (табл. 3.5, рис. 3.12, 3.13). На хроматограмах досліджуваних

зразків були присутні піки, часи утримування яких характерні для екстрактів,

отриманих з різних технологічних схем.

Таблиця 3.5

Результати аналізу КГЕ Седавіту, виготовленого за різними

технологіями, отримані при дослідженнях методом ГРХ

Екстракт

виготовлений

методом (серія)

Площа піку характерного для речовини з часом

утримування

t- 1,52 t- 1,59 t- 1,7 t- 6,13 t- 9,12

Настоювання (с. 1) 4,3 5,7 8,0 7,2 5,5

Настоювання (с. 2) 4,5 6,1 7,3 6,8 4,6

Настоювання (с. 3) 4,6 5,9 7,9 8,0 5,2

Середнє 4,5 5,9 7,7 7,3 5,2

Реперколяції (с. 4) 5,8 6,6 8,0 8,8 5,8

Реперколяції (с. 5) 5,6 7,0 9,5 7,6 5,3

Реперколяції (с. 6) 5,7 6,3 8,5 8,1 5,6

Реперколяції (с. 7) 6,1 6,1 9,7 8,3 5,9

Середнє 5,8 6,5 8,9 8,2 5,7

56

Рис. 3.12. Хроматограма випробовуваного розчину КГЕ Седавіту,

виготовленого методом настоювання, отримана при вивчені летких

компонентів методом ГРХ

Рис. 3.13. Хроматограма випробовуваного розчину КГЕ Седавіту,

виготовленого методом реперколяції, отримана при вивчені летких

компонентів методом ГРХ

Площі піків основних сполук КГЕ Седавіту, виготовленого за двома

різними технологіями дещо відрізняються, однак їх різниця не перевищує

різниці площ в межах однієї технології. Методика визначення летких

компонентів у КГЕ Седавіту методом ГРХ наведена у додатку Е.

При спектрофотометричному дослідженні проводили порівняння

зразків за спектрами поглинання в діапазоні 300-500 нм: вивчали положення

максимумів та мінімумів та розраховували значення питомих показників

57

поглинання у максимумах спектрів. Комплекс алюміній хлориду з

флавоноїдами КГЕ Седавіт в умовах вибраної пробопідготовки в

диференціальному спектрі мав максимум поглинання при 420 ± 3 нм для

зразків отриманих методом настоювання та 418 ± 5 нм – для зразків

отриманих методом реперколяції (рис. 3.14), питомий показник поглинання

становив 2,77 ± 1,41 та 2,63 ± 0,76 відповідно (табл. 3.6). Різниця між

максимумами поглинання та питомими показниками поглинання для зразків

екстрактів отриманих методом настоювання та методом реперколяції

відрізнялася не суттєво і не перевищувала різниці між такими ж показниками

в межах однієї технології.

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів у КГЕ Седавіту

наведена у додатку Ж.

Рис. 3.14. Диференціальні спектри поглинання випробовуваних

розчинів Седавіту з алюміній хлоридом для КГЕ, отриманих методами: 1 –

настоювання; 2 – реперколяції.

Дослідження, проведені методами спектрофотометрії, тонкошарової

хроматографії, рідинної та газової хроматографії дозволили довести

подібність між складом та співвідношенням основних компонентів зразків

КГЕ Седавіт, отриманих методом настоювання та методом реперколяції.

58

Таким чином, для первинної оцінки різниці якості екстрактів нами

запропоновані доступні аналітичні методики – порівняння положення

максимумів поглинання і питомих показників спиртових розчинів екстрактів

та їх хроматографічних профілів за принципом «відбитків пальців».

Таблиця 3.6

Результати спектрофотометричного аналізу КГЕСедавіту, виготовленого

за двома різними технологіями

Екстракт

виготовлений

методом (серія)

Довжина хвилі,

при якій

спостерігається

максимум

Оптична густина

у максимумі

поглинання

Питомий

показник

поглинання у

максимумі

Настоювання (с. 1) 420 0,361 2,97

Настоювання (с. 2) 419 0,350 2,85

Настоювання (с. 3) 419 0,355 3,11

Середнє 419 0,355 2,98

Реперколяції (с. 4) 419 0,381 3,17

Реперколяції (с. 5) 417 0,380 3,19

Реперколяції (с. 6) 418 0,370 3,11

Реперколяції (с. 7) 421 0,372 3,20

Середнє 419 0,373 3,17

3.4. Розробка та валідація методик ідентифікації основних груп

біологічно активних сполук.

Ідентифікацію валеріани коренів з кореневищами запропоновано

проводити методом ГРХ за наявністю кислоти ізовалеріанової шляхом

порівняння часів утримування піків кислоти ізовалеріанової на

хроматограмах випробовуваних розчинів та на хроматограмі розчину

порівняння.

59

Ідентифікацію хлорогенової, кофейної, ферулової та розмаринової

кислот і кверцетину у комплексному густому екстракті проводили методом

ВЕРХ. Методика ідентифікації розроблена на основі методик кількісного

визначення флавоноїдів у траві звіробою та ромашки квітах, описаних у

монографії USP [153]. В результаті проведених хроматографічних

досліджень доведено тотожності комплексного густого екстракту.

Для ідентифікації гіперицину та псевдогіперицину використовували

метод ТШХ. Методика ідентифікації була розроблена на основі методики

ідентифікації гіперицинів у траві звіробою, описаній у монографії ЕР [91].

Для підтвердження придатності розроблених методик для контролю

якості екстрактів було проведено їх валідацію. Вибір та розрахунок

валідаційних характеристик проводили згідно вимог ДФУ [92].

Методика ідентифікації хлорогенової, кофейної, ферулової,

розмаринової кислот та кверцетину в КГЕ Седавіту методом ВЕРХ.

Випробуваний розчин 1,00 г ектракту поміщають у стакан місткістю 50

мл розчиняють у 10 мл розчинника, переносять за допомогою 20 мл води P у

ділильну лійку місткістю 100 мл, додають 15 мл етилацетату Р і струшують

протягом 5 хв. Після розділення шарів, нижній (водний) шар зливають у

конічну колбу місткістю 50 мл, а верхній (етилацетатний) збирають у конічну

колбу місткістю 100 мл. Водну фракцію поміщають знов у ділильну лійку і

екстракцію повторюють ще два рази з 15 мл етилацетату Р, струшуючи по

5 хв. Об’єднані етилацетатні витягнення кількісно, за допомогою 25 мл води

Р, переносять назад у ділильну лійку і струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл

і 50 мл, відповідно, протягом 2 хв. Фільтрують через фільтр «біла стрічка» з

5 г натрію сульфату безводного Р у мірну колбу місткістю 50 мл (фільтр з

натрію сульфатом безводним Р попередньо змочують етилацетатом Р),

ділильну лійку і фільтр промивають 5 мл етилацетату Р і доводять об’єм

фільтрату етилацетатом Р до позначки.

60

10 мл фільтрату відганяють на водяній бані при температурі 60˚С під

вакуумом до сухого. Сухий залишок розчиняють у 10 мл метанолу Р.

Розчин порівняння. 5,0 мг ферулової кислоти (Sigma-Aldrich), 5,0 мг

кверцетину (Fluka), 5,0 мг кофейної кислоти (Fluka), 2,0 мг розмаринової

кислоти (Fluka), 5,0 мг хлорогенової кислоти (Fluka), розчиняють у

розчиннику, доводять до 25 мл тим самим розчинником. 5,0 мл одержаного

розчину доводять до 100,0 мл рухомою фазою А.

Розчинник. Суміш 96 % спирт - вода Р (70:30).

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250

мм, заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: 0,6 г натрію дигідрофосфату моногідрату Р

розчиняють у 1000 мл води для хроматографії, доводять рН розчину

кислотою фосфорною Р до 2,5 (потенціометрично; ДФУ, 2.2.3).

- рухома фаза В: ацетонітрил;

- швидкість рухомої фази – 1,0 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 330 нм;

- температура колонки 25 0С;

- час хроматографування 45 хв.

Використовують таку програму градієнту:

Стадія Час,хв Рухома фаза А

(% об/об )

Рухома фаза В

(% об/об )

1 0-5 90 10

2 5-30 90 → 70 10 → 30

3 30-40 70 → 60 30 → 40

4 40-45 60 40

5 45-50 60 → 90 40 → 10

6 50-60 90 10

61

Хроматографують по 50 мкл розчину порівняння та випробовуваного

розчину.

Хроматографічна система вважається придатною, якщо:

- коефіцієнт розділення для піків хлорогенової та кофейної на

хроматограмі розчину порівняння становить не менше 1,0;

На хроматограмі випробуваного розчину мають бути присутніми піки,

які співпадають за часом утримування з піками, що відповідають пікам

ферулової кислоти, хлорогенової кислоти, розмаринової кислоти, кофейної

кислоти, кверцетину на хроматограмі розчину порівняння.

Відповідно до вимог ДФУ [92], для випробування “Ідентифікація”

необхідно дослідити такі валідаційні характеристики як специфічність та

придатність хроматографічної системи. При проведенні тесту на придатність

хроматографічної системи хроматографували розчин порівняння. З

отриманих хроматограм розраховано коефіцієнт розділення піків

хлорогенової та кофейної кислот, який становив 5,9, і відповідає

встановленим критеріям.

Специфічність методики підтверджували шляхом порівняння

хроматограм контрольного розчину, розчину порівняння та випробовуваного

розчину, тобто, на хроматограмі контрольного розчину немає піків, що

відповідають пікам хлорогенової, кофейної, ферулової, розмаринової кислот

чи кверцетину на хроматограмі розчину порівняння, а також, піки

хлорогенової, кофейної, ферулової, розмаринової кислот чи кверцетину на

хроматограмі випробовуваного розчину (рис. 3.16) співпадають за часами

утримування із піками хлорогенової, кофейної, ферулової, розмаринової

кислот чи кверцетину на хроматограмі розчину порівняння (рис. 3.15).

62

Рис. 3.15. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах

ідентифікації хлорогенової, кофейної, ферулової, розмаринової кислот та

кверцетину

Рис. 3.16. Хроматограма випробовуваного розчину КГЕ Седавіту,

отримана в умовах ідентифікації фенольних сполук

Таким чином, досліджувані валідаційні характеристики

(специфічність, придатність хроматографічної системи) відповідають

встановленим критеріям прийнятності.

63

Методика ідентифікації кислоти ізовалеріанової в КГЕ Седавіту методом

ГРХ.

Випробуваний зразок. 1,00 г густого екстракту розчиняють у 10 мл суміші

96 % спирт Р - вода Р (70:30)

Розчин порівняння: 25 мг кислоти ізовалеріанової розчиняють в етанолі Р

і доводять об’єм розчину тим же розчинником до 100,0 мл. 1,0 мл отриманого

розчину доводять етанолом Р до 10,0 мл.

Контрольний розчи: Етанол Р.

Хроматографують по 1 мкл контрольного розчину, випробовуваного

розчину та розчину порівняння на газовому хроматографі з полум’яно-

іонізаційним детектором за таких умов:

- колонка капілярна, розміром 60 м 0,53 мм, покрита шаром макроголу

20000 Р з товщиною шару 1 мкм або аналогічна;

- температуру колонки програмують: початкова температура 100 °С

протягом 5 хв, далі підвищують температуру з швидкістю 10 °С/хв до

230°С і витримують 22 хв;

- швидкість газу-носія (гелій Р для хроматографії) – 35 см/с (5 мл/хв);

- поділ потоку газу-носія – 1 : 1;

- температура випарювача – 200 °С;

- температура детектора – 300 °С.

Придатність хроматографічної системи:

- ефективність хроматографічної колонки розрахована за піком

ізовалеріанової кислоти на хроматограмі розчину порівняння становить не

менше 10000.

Порядок виходу піків на хроматограмі розчину порівняння: етанол,

кислота ізовалеріанова.

На хроматограмі випробовуваного розчину має бути присутній пік, час

утримування якого співпадає з часами утримування піку кислоти

ізовалеріанової на хроматограмі розчину порівняння.

64

В процесі валідації даної методики для вивчення придатності

хроматографічної системи хроматографували розчин порівняння. Розрахова

ефективність хроматографічної колонки за піком ізовалеріанової кислоти

склала 837438 теоретичних тарілок і відповідає встановленим критерія, отже,

придатність хроматографічної системи доведена.

Специфічність методики ідентифікації ізовалеріанової кислоти

підтверджували шляхом порівняння хроматограм контрольного розчину,

розчину порівняння та випробуваного розчину, тобто, на хроматограмі

контрольного розчину немає піку, що відповідає пікові ізовалеріанової

кислоти на хроматограмі розчину порівняння та на хроматограмі

випробовуваного розчину (рис. 3.18), часи утримування ізовалеріанової

кислоти на хроматограмі випробовуваного розчину співпадають з часом

утримування ізовалеріанової кислоти на хроматограмі розчину порівняння

(рис. 3.17).

Рис. 3.17. Хроматограма розчину порівняння, отримана при

ідентифікації ізовалеріанової кислоти.

65

Рис. 3.18. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана при

ідентифікації ізовалеріанової кислоти у КГЕ Седавіту.

Таким чином, досліджувані валідаційні характеристики

(специфічність, придатність хроматографічної системи) відповідають

встановленим критеріям прийнятності.

Методика ідентифікації гіперицину та псевдогіперицину у КГЕ

Седавіту методом ТШХ.

Випробуваний розчин. 2,0 г густого ексракту, поміщають у конічну

колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і кип’ятять на водяній бані

протягом 5 хв, охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат доводять до

об’єму 10 мл метанолом Р.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 наносять

смужкою, завдовжки 10 мм, 10 мкл випробовуваного розчину. Пластинку

сушать на повітрі протягом 10 хв, поміщають у камеру з рухомою фазою:

кислота мурашина безводна Р – вода Р – етилацетат Р (10:10:80) і

хроматографують висхідним методом. Коли фронт розчинників пройде 15

см, її виймають з камери і висушують при температурі 100 ºС. Пластинку

переглядають в УФ-світлі при довжині хвилі 254 нм. На хроматограмі

випробовуваного розчину у нижній частині верхньої третини мають

виявлятися зона псевдогіперицину, вище – гіперицину, обидві червоної

флуоресценції (рис. 3.19 - ІІ).

Відповідно до вимог ДФУ [92], для випробування “Ідентифікація”

досліджували валідаційні характеристики специфічність та придатність

хроматографічної системи. При проведенні тесту на придатність

хроматографічної системи перевіряли здатність хроматографічної системи

розділяти речовини, подібні за будовою. Для цього використовували розчини

порівняння:

66

Розчин порівняння (а). 5 мг гіперозиду, 2 мг апігенін-7-глюкозиду, 2 мг

мірцетину, 5 мг кофейної кислоти, 5 мг кверцетину, 2 мг апігеніну розчинять

в метанолі Р і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

Розчин порівняння (в). 2 мг кислоти кофейної Р, 5 мг рутину, 2 мг

хлорогенової кислоти, 5 мг гіперозиду, 5 мг лютеолін-7-глюкозиду, 5 мг

розмаринової кислоти, 5 мг цикорієвої кислоти, 2 мг лютеоліну, розчинять в

метанолі Р і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

Після перегляду при довжині хвилі 254 нм, пластинку нагрівають при

температурі 100 ºС протягом 5 хв і гарячу обприскують розчином 10 г/л

аміноетилового ефіру дифенілборної кислоти Р у метанолі Р, потім

розчином 50 г/л макроголу 400 Р у метанолі Р та висушують на повітрі

впродовж 30 хв та переглядають в УФ-світлі при 365 нм (рис. 3.19 - ІІ).

На хроматограмі розчину порівняння (а) мають виявлятися зони (у

порядку зростання Rf) гіперозид, апігенін-7-глюкозид, мірцетин, кофейна

кислота, кверцетин, апігенін. На хроматограмі розчину порівняння (в) мають

виявлятися зони (у порядку зростання Rf) рутин, хлорогенова кислота,

гіперозид, лютеолін-7-глюкозид, розмаринова кислота, цикорієва кислота,

лютеолін.

Специфічність методики підтверджували шляхом порівняння

хроматограм випробовуваного розчину звіробою трави та випробуваного

розчину комплексного густого екстракту. На хроматограмі випробовуваного

розчину у нижній частині верхньої третини наявні зони псевдогіперицину,

вище – гіперицину, обидві червоної флуоресценції, які за величиною

утримування співпадають з зонами псевдогіперицину та гіперицину на

хроматограмі випробовуваного розчину звіробою трави (рис. 3.19 – І).

Таким чином, досліджувані валідаційні характеристики

(специфічність, придатність хроматографічної системи) відповідають

встановленим критеріям прийнятності.

67

І 1 2 3 4 5 ІІ 1 2 3 4 5

Рис. 3.19. Хроматограма, отримана при ідентифікації фенольних

сполук у КГЕ Седавіту (І при – 254 нм, ІІ – після проявлення, при 365 нм)

для: 1 – випробовуваний розчин трави звіробою, 2 – розчин порівняння (а),

3 – розчин порівняння (в), 4, 5 – випробовуваний розчин густого екстракту

Седавіту.

3.5. Розробка методів кількісного визначення біологічно активних

сполук КГЕ Седавіту.

Кількісний вміст флавоноїдів у КГЕ визначали за двома методиками:

по реакції утворення забарвленої комплексної сполуки безпосередньо

флавоноїдів із алюміній хлоридом до та після попереднього їх гідролізу з

наступним комплексоутворенням утворених флавоноїдів-агліконів.

Диференціальні електронні спектри комплексу алюміній хлориду з

флавоноїдами КГЕ без попередньо проведеного гідролізу характеризуються

наявністю максимуму поглинання в області від 389 до 408 нм (рис. 3.20).

68

Рис. 3.20 Диференціальні електронні спектри поглинання в умовах

кількісного визначення флавоноїдів (без гідролізу флавоноїдів): 1 –

комплексного густого екстракту с. 500513, 2 – комплексного густого

екстракту с. 650513, 3 – комплексного густого екстракту с. 750713.

Положення максимуму поглинання у такому широкому діапазоні

довжин хвиль, що зумовлене наявністю флавонїдів у глікозидній та

агліконовій формах, може спричинити одержання значення недостовірного

вмісту суми флавоноїдів у КГЕ. Тому більш виправданим підходом

визначення вмісту флавоноїдів є проведення попереднього гідролізу. Це

дозволить стандартизувати умови вимірювання оптичної густини та вибір

стандартної речовини як маркера для перерахунку кількісного вмісту суми

флавоноїдів. В основу методики кількісного визначення покладена

фармакопейна спектрофотометрична методика визначення суми флавоноїдів

у сировині різних видів, суть якої зводиться спершу до проведення гідролізу

усіх глікозидних форм флавоноїдів, виділення шляхом екстракції

етилацетатом утворених агліконів з наступним їх комплексоутворенням з

алюміній хлоридом. В даних умовах диференціальні спектри поглинання

комплексів утворених флавоноїдів-агліконів з алюміній хлоридом для

69

комплексного густого екстракту характеризуються максимумом поглинання

при 423 нм. Суму флавоноїдів у екстрактах визначали у перерахунку на

рутин, вимірюючи оптичну густину випробовуваних розчинів при 421 ± 4 нм.

Відхилення у ± 4 нм пов’язане з наявністю різних видів агліконів

флавоноїдів, кількісне співвідношення яких у ЛРС може змінюватися,

завдяки чому випробовувані розчини можуть мати максимум поглинання у

діапазоні 421 ± 4 нм.

Вміст гідроксикоричних кислот визначали методом прямої

спектрофотометрії. Для вибору розчинника, який би забезпечував

максимальне вилучення гідроксикоричних кислот, проводили серію

досліджень з різними розчинниками. (табл. 3.7).

Таблиця 3.7

Результати вибору розчинника при кількісному визначенні

гідроксикоричних кислот

Розчинник Умови Вміст

гідроксикоричних

кислот, %

Довжина хвилі,

при якій

спостерігається

максимум, нм

Вода Струшування до повного

розчинення зразка

0,49 ± 0,02 325 ± 1

Етанол Струшування до повного

розчинення зразка

0,51 ± 0,02 324 ± 1

Як показують результати досліджень (табл 3.7), при використанні обох

розчинників максимум спостерігається при однаковій довжині хвилі, вміст

гідроксикоричних кислот суттєво не відрізняється, тому для рутинного

контролю обрано розчинник воду.

Для підтвердження придатності розроблених методик у контролі якості

екстрактів було проведено їх валідацію. Вибір та розрахунок валідаційних

характеристик проводили згідно вимог ДФУ [92].

70

Методика кількісного визначення флавоноїдів у КГЕ Седавіту методом

спектрофотометрії.

Вихідний розчин. 0,200 г екстракту поміщають у круглодонну колбу,

додають 1,0 мл розчину гексаметилентетраміну Р (5 г/л), 7,0 мл кислоти

хлористоводневої Р1 і 20 мл ацетону Р, кип’ятять зі зворотним

холодильником протягом 30 хв, охолоджують і кількісно з допомогою

ацетону Р переносять рідину у мірну колбу місткістю 50 мл, промивають

колбу ацетоном Р і доводять ацетоном Р до позначки.

20,0 мл одержаного розчину поміщають у ділильну лійку місткістю 100

мл, додають 20 мл води Р і 15 мл етилацетату Р, струшують протягом 15 хв.

Після розділення шарів, нижній шар зливають у конічну колбу місткістю 50

мл, а верхній зливають у конічну колбу місткістю 100 мл і закривають

корком. Екстракцію з нижнього шару повторюють ще 3 рази по 10 мл

етилацетату Р за вказаних вище умов. Об’єднані етилацетатні витяги

кількісно, за допомогою 25 мл води Р, переносять назад у ділильну лійку і

струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл і 50 мл, відповідно, протягом 5 хв.

Етилацетатні витяги фільтрують через фільтр “біла стрічка” з 10 г натрію

сульфату безводного Р, попередньо змоченого етилацетатом Р, у мірну

колбу місткістю 50 мл. Ділильну лійку і фільтр промивають 10 мл

етилацетату Р і доводять вміст в мірній колбі до позначки тим самим

розчинником.

Випробовуваний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають 1 мл реактиву алюмінію хлориду Р і доводять

до позначки 5 % (об/об) розчином оцтової кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Компенсаційний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, доводять до позначки 5 % (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р.

71

Через 30 хв записують спектр випробовуваного розчину у діапазоні від

370 нм до 520 нм і вимірюють оптичну густину у максимумі поглинання за

довжини хвилі 421 ± 4 нм, відносно компенсаційного розчину.

Вміст суми флавоноїдів (Х) в 1 г екстракту, в перерахунку на рутин і

суху речовину, розраховують за формулою:

1 50 50 25 100 0,766

408 100 20 10 (100 ) (100 )

A АX

m W m W

(3.1)

де: А – оптична густина випробовуваного розчину;

408 – питомий показник поглинання комплексу рутину з алюміній хлоридом

при довжині хвилі 421 нм;

m – маса наважки екстракту, взятої для аналізу, г;

W – втрата в масі при висушуванні, у відсотках.

Розрахунок валідаційних характеристик проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність. Зважаючи на те, що

пропобідготовка включає триразове екстрагування етилацетатом після

гідролізу, в ході валідації доводили, що вибрана кількість повторів операцій

достатня для повного вилучення, а вибрані кількості доданих реагентів –

достатні для забезпечення повноти протікання реакції.

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю у спектрі випробовуваного розчину, поглинання

при довжині хвилі 421 ± 4 нм. Хід та положення максимуму поглинання

випробовуваних розчинів КГЕ Седавіту співпали з положенням максимуму

поглинання розчину порівняння рутину (рис. 3.21).

72

Рис. 3.21. Диференціальний електронний спектр поглинання комплексу

алюміній хлориду із флавоноїдами КГЕ Седавіту.

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення флавоноїдів повинен

охоплювати концентрацію від 20 до 180 % відповідно до вимог ДФУ для

випробування “Кількісне визначення” із врахуванням декларованого вмісту

флавоноїдів у екстракті. Дана характеристика вивчалася при дослідженні

лінійності, правильності та прецизійності.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 20 до 180 % від середнього вмісту

суми флавоноїдів в перерахунку на рутин. Відібрані аліквоти розчинів

зважували на аналітичних вагах для точнішого переведення у нормалізовані

координати (табл. И. 1.). На основі визначення оптичних густин розчинів з

точно відомою концентрацією будували графік залежності оптичної густини

73

від концентрації флавоноїдів у нормалізованих координатах, та

розраховували параметри лінійності (табл. И. 2).

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,9998, залишкове стандартне

відхилення становить 0,961. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. И. 1). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. И. 3).

Дослідження прецизійності (збіжності). На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці И. 3, можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

Для доказу ефективності екстрагування агліконів етилацетатом після

гідролізу, проводили ще одну додаткову операцію вилучення. Відповідне

етилацетатне вилучення обробляли в умовах кількісного визначення,

аналогічно випробовуваному розчину. У спектрах поглинання розчину з

алюміній хлоридом жодного максимум поглинання в ділянці (421 ± 4) нм не

спостерігається, що доводить повноту вилучення флавоноїдів з розчину

запропонованою кількістю етилацетату.

При вивченні робасності методики було досліджено вплив кількостей

реагентів гексаметилентетраміну, алюмінію хлориду та тривалості операцій

кип’ятіння й утворення фотометрованої сполуки флавоноїдів з алюмінію

хлоридом. Результати проведених експериментів підтверджують коректність

запропонованої методики (табл. 3.8).

74

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення суми флавоноїдів у КГЕ Седавіту відповідає

критеріям специфічності, робасності, лінійності, правильності та

прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

Таблиця 3.8

Результати дослідження робасності методики кількісного

визначення суми флавоноїдів у КГЕ Седавіту

Досліджуваний фактор

впливу

Оптична

густина , А δ, % Вимоги Висновки

Об’єм доданого

розчину

гексаметилен-

тетраміну Р, мл

0,9 0,7444 0,67

≤ 1,6%

Відповідає

1,0 0,7494 - Відповідає

1,1 0,7507 0,17 Відповідає

Час кип’ятіння,

хв.

25 0,5789 0 Відповідає

30 0,5790 - Відповідає

35 0,5821 0,54 Відповідає

Об’єм доданого

розчину

хлористоводнево

ї кислоти Р1, мл

6,0 0,5659 1,01 Відповідає

7,0 0,5717 - Відповідає

8,0 0,5725 0,14 Відповідає

Об’єм доданого

реактиву

алюмінію

хлориду Р, мл

0,9 0,7510 0,64 Відповідає

1,0 0,7558 - Відповідає

1,1 0,7591 0,44 Відповідає

Час

комплексоутворен

ня, хв

25 0,5771 0,12 Відповідає

30 0,5764 - Відповідає

45 0,5768 0,07 Відповідає

Методика кількісного визначення гідроксикоричних кислот у КГЕ

Седавіту методом спектрофотометрії.

Випробовуваний розчин. 0,100 г екстракту поміщають у мірну колбу

місткістю 50 мл, розчиняють у 30 мл води Р, доводять цим же розчинником

до мітки. 5,0 мл отриманого розчину доводять до 25,0 мл водою Р.

Розчин порівняння. 0,020 г СЗ розмаринової кислоти поміщають у

мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 30 мл води Р і доводять до мітки

75

цим же розчинником. 5,0 мл отриманого розчину доводять до 100,0 мл водою

Р.

Компенсаційний розчин. Вода Р.

Записують спектр випробовуваного розчину у діапазоні від 250 нм до

400 нм і вимірюють оптичну густину у максимумі поглинання за довжини

хвилі 325 ± 2 нм, відносно компенсаційного розчину.

Вміст гідроксикоричних кислот (Х) у 1 г екстракту, в перерахунку на

кислоту розмаринову і суху речовину, розраховують за формулою:

Х= 0

0 1

100

8 (100 )

A m

A m W

(3.2)

де: А – оптична густина випробовуваного розчину;

А0 – оптична густина розчину порівняння;

m – маса наважки екстракту, взятої для аналізу, г;

m0 – маса наважки СЗ розмаринової кислоти, взятої для аналізу, г;

W – втрата в масі при висушуванні, у відсотках.

Розрахунок валідаційних характеристик проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність.

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю на спектрі випробовуваного розчину поглинання

при довжині хвилі 325 ± 4 нм. Хід та положення максимуму поглинання

випробовуваних розчинів комплексного екстракту Седавіту співпали з

положенням максимуму поглинання розчину порівняння розмаринової

кислоти (рис. 3.22).

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення гідроксикоричних вислот

повинен охоплювати концентрацію від 50 до 140 % відповідно до вимог

ДФУ для випробування “Кількісне визначення” із врахуванням

76

декларованого вмісту гідроксикоричних кислот у екстракті. Дана

характеристика вивчалася при дослідженні лінійності, правильності та

прецизійності.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 50 до 140 % від середнього вмісту

гідроксикоричних кислот в перерахунку на розмаринову кислоту. Відібрані

аліквоти розчинів зважували на аналітичних вагах для точнішого

переведення у нормалізовані координати (табл. К.1).

Рис. 3.22. Електронний спектр поглинання гідроксикоричних кислот

КГЕ Седавіту (2) та стандартного зразка розмаринової кислоти (1).

На основі визначення оптичних густин розчинів з точно відомою

концентрацією будували графік залежності оптичної густини від

концентрації гідроксикоричних кислот у нормалізованих координатах, та

розраховували параметри лінійності (табл. К.2).

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,9999, залишкове стандартне

77

відхилення становить 0,348. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. К.1). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. К.3).

Дослідження прецизійності (збіжності). На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці К.3, можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При вивченні робасності методики було досліджено стійкість розчинів

в часі. Доведено, що розчини стійкі протягом 60 хв від початку

приготування.

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення гідроксикоричних кислот у КГЕ відповідає критеріям

специфічності, робасності, лінійності, правильності та прецизійності

(збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено вміст біологічно активних речовин (гідроксикоричні

кислоти, флавоноїди) у сировині та комплексному густому екстракті.

Встановлено, що для ідентифікації валеріани коренів слід обрати кислоту

ізовалеріанову, для м’яти листя – кислоту розмаринову, для глоду плодів –

кислоту ферулову, для звіробою трави – гіперицин і псевдогіперицин, для

шишок хмелю – кверцетин.

2. Запропоновано методологічний підхід для проведення порівняльної

оцінки хімічного складу комплексних рослинних екстрактів, отриманих за

78

різною технологією за допомогою хроматографічних (тонкошарова

хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія) і

спектрофотометричних методів. Показано подібність складів КГЕ Седавіту,

отриманих за різними технологіями.

3. Розроблено методики ідентифікації хлорогенової, кофейної,

ферулової, розмаринової ізовалеріанової кислот, кверцетину та гіперицинів у

КГЕ Седавіту. Вивчено валідаційні характеристики для випробувань

ідентифікації відповідно до вимог Державної фармакопеї України, які

підтверджують коректність розроблених методик.

4. Розроблено методики кількісного вивчення вмісту флавоноїдів та

гідроксикоричних кислот у КГЕ. Вивчено основні валідаційні

характеристики для випробування кількісне визначення: специфічність,

лінійність, правильність, прецизійність, робасність, які підтверджують

коректність і доводять придатність розроблених методик. Кількісним

критерієм якості комплексного екстракту запропоновано сумарний вміст

флавоноїдів, який повинен бути 1,0 – 3,5 % в перерахунку на рутин та вміст

гідроксикоричних кислот, який повинен бути 0,3 – 0,7 % в перерахунку на

розмаринову кислоту.

79

РОЗДІЛ 4

ДОСЛІДЖЕННЯ ТА РОЗРОБКА МЕТОДІВ ЯКІСНОГО СКЛАДУ ТА

КІЛЬКІСНОГО ВМІСТУ ЕКСТРАКТІВ ЦМИНУ ПІЩАНОГО КВІТОК,

МОРКВИ ДИКОЇ ПЛОДІВ ТА НАГІДОК КВІТОК, КУРКУМИ ДОВГОЇ.

4.1 Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин екстракту цмину

піщаного квіток.

В медичній практиці квітки цмину піщаного (Helichrysum arenarium

(L.) Moench) застосовують для виробництва готових лікарських засобів

жовчогінної дії. Фармакологічну дію цього виду ЛРС зумовлюють

флавоноїди, дубильні, гіркі та інші біологічно активні речовини. Флавоноїди

(ізосаліпурпозид, нарінгенін і його 5-глюкозиди саліпурпозид, геліхризин;

флавон – апігенін і його 7-глюкозиди; флавонол – кемферол і його 3-

глюкозиди) вважаються основними діючими речовинами, з якими пов’язують

жовчогінну дію лікарських засобів, отриманих із цмину піщаного квіток.

Ідентифікацію флавоноїдів та фенолкарбрнових кислот у

досліджуваних зразках цмину піщаного квіток та екстракті сухому цмину

піщаного квіток проводили методами тонкошарової (ТШХ) та

високоефективної рідинної (ВЕРХ) хроматографії.

В результаті аналізу методом ТШХ при детектуванні в УФ-світлі при

довжині хвилі 365 нм у зразках цмину піщаного квіток та екстракту цмину

піщаного квіток було виявлено одинадцять зон з жовто-оранжевою, жовто-

зеленою та блакитною флуоресценцією, які є характерними для фенольних

сполук. За співпадінням забарвлення та величин Rf зон на хроматограмі

розчину порівняння та випробовуваного розчину в зразках цмину піщаного

квіток та екстракту цмину піщаного квіток були ідентифіковані хлорогенова і

80

кофейна кислоти, апігенін-7-глюкозид, ізосаліпурпозид, лютеолін, апігенін.

Фотографії хроматограм представлені на рисунку 4.1 та 4.2.

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот в квітах

цмину піщаного та сухому екстракті методом ТШХ наведена в додатку К.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15

Рис 4.1 Хроматограма, отримана при ідентифікації флавоноїдів та

фенолкарбонових кислот у цмину піщаного квітах для: 1- розчину

порівняння (рутин, хлорогенова кислота, гіперозид, апігеніну-7-глюкозид,

ізосаліпурпозид, цикорієва кислота, лютеолін, знизу – догори), 2-8, 13 -

спиртових витягів із зразків цмину піщаного квіток, 10 - розчину порівняння

(лютеолін-7-глюкозид, кофейна кислота, кверцетин, знизу – догори), 12 -

розчину порівняння (рутин, хлорогенова кислота, гіперозид, апігеніну-7-

глюкозид, ізосаліпурпозид, цикорієва кислота, лютеолін, апігенін, знизу –

догори), 14 - розчину порівняння (кофейна кислота, кверцетин, знизу –

81

догори), 15 - розчин порівняння (розмаринова кислота, ферулова кислота,

знизу – догори).

1 2 3 4 5

Рис. 4.2 Хроматограм, отримана при ідентифікації флавоноїдів та

фенол карбонових кислот у цмину піщаного екстракті сухому для: 1, 3, 4, 5 - :

випробовуваного розчину цмину пісчаного екстракту сухого, 2- розчину

порівняння (рутин, хлорогенова кислота, гіперозид, апігеніну-7-глюкозид,

ізосаліпурпозид, цикорієва кислота, лютеолін, апігенін знизу – догори)

Методом ВЕРХ у зразках цмину піщаного квіток, за співпадінням часів

утримування піків на хроматограмах розчину порівняння та випробовуваного

розчину були ідентифіковані хлорогенова, цикорієва, ферулова, кофейна

кислоти, ізокверцетрин, апігенгін-7-глюкозид, кверцетин, ізосаліпурпозид,

нарінгенін, апігенін, кемпферол. У випробовуваних зразках 4, 5 і 8 було

також ідентифіковано лютеолін. Оцінку кількісного вмісту кожного

ідентифікованого та не ідентифікованого компонента здійснювали методом

внутрішньої нормалізації, результати наведені у таблиці 4.1, типові

хроматограми приведені на рис. 4.3, 4.4.

82

Таблиця 4.1

Результати ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот у зразках цмину піщаного квіток методом

ВЕРХ

Речовина Час

утрим

уванн

я, хв.

Відносний вміст, %

Зразок 1

c.010101

Зразок 2

с.020202

Зразок 3

с.010711

Зразок 4

с. 060625

Зразок 5

с.014111

Зразок 6

с.251008

Зразок 7

с. 010102

Зразок 8

с. 361109

Зразок 9

с.060210

Хлорогенова

кислота

13,3 12,5 9,4 9,7 5,8 4,7 8,4 7,5 6,5 8,7

Кофейна кислота 16,5 1,4 1,0 0,7 1,1 1,2 0,9 1,1 1,1 0,7

Ферулова кислота 24,7 0,8 1,3 1,4 0,6 1,5 1,3 0,8 1,4 1,4

Неідентифікований

пік

26,5 3,8 3,7 7,4 5,5 6,1 4,6 3,2 5,5 6,9

Ізокверцетрин 30,2 1,4 1,2 1,4 1,4 1,0 1,1 1,4 1,4 1,4

Апігенін-7-

глюкозид

32,4 5,6 6,3 6,8 7,5 6,6 6,2 6,6 6,4 6,2

Цикорієва кислота 33,5 1,1 1,5 2,3 1,9 1,5 1,4 1,5 1,7 1,7

Неідентифікований

пік

34,1 21,1 17,6 13,8 21,5 13,7 17,8 12,8 13,6 21,9

Кверцетин 35,5 5,2 6,6 5,8 5,3 7,6 8,5 6,4 5,5 5,7

Ізосаліпурпозид 36,2 35,2 38,8 40,0 38,5 38,7 36,9 40,2 40,3 41,5

Лютеолін 40,7 - - - 0,5 1,6 - - 1,8 -

Нарінгенін 49,7 0,5 1,2 0,8 1,4 1,0 1,1 0,9 1,4 1,4

Апігенін 53,4 0,6 0,9 0,7 1,2 1,0 1,1 1,7 0,9 1,3

Кемпферол 54,2 0,8 1,2 1,4 0,9 0,5 0,6 0,7 1,5 1,4

83

Рис. 4.3. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах дослідження

фенольних сполук цмину піщаного квіток та сухого екстракту методом

ВЕРХ.

Рис. 4.4. Хроматограма випробовуваного розчину цмину піщаного квіток,

отримана в умовах ідентифікації фенольних сполук методом ВЕРХ.

Таким чином, методом ВЕРХ було ідентифіковано 12 компонентів у 9

досліджених зразках цмину піщаного квітках, серед ідентифікованих

компонентів більше 35 % становив ізосаліпурпозид.

84

Методом ВЕРХ у зразках екстракту цмину піщаного квітках, за

співпадінням часів утримування піків на хроматограмах розчину порівняння та

випробовуваного розчину були ідентифіковані хлорогенова, цикорієва,

ферулова та кофейна кислоти, ізокверцетрин, апігенгін-7-глюкозид, кверцетин,

ізосаліпурпозид, мірицетин, лютеолін, нарінгенін, апігенін, кепферол. Типова

хроматограма приведена на рис. 4.5.

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот в квітках

цмину піщаного та сухому екстракті методом ВЕРХ наведена в додатку Л.

Рис. 4.5. Хроматограма випробовуваного розчину цмину піщаного екстракту

сухого, отримана в умовах ідентифікації фенольних сполук методом ВЕРХ.

Оцінку кількісного вмісту флавоноїдів в цмину піщаного квітках та

сухому екстракті цмину піщаного квіток проводили спектрофотометричним

методом. Як розчин порівняння, використовували розчин стандартного зразку

ізосаліпурпозиду. У диференціальному спектрі поглинання комплексу алюміній

хлориду з флавоноїдами цмину піщаного квіток, в умовах вибраної

пробопідготовки, мав максимум поглинання в діапазоні 412 – 418 нм, спектр

розчину порівняння стандартного зразка ізосаліпурпозиду, отриманий у цих же

умовах, мав максимум при 418 нм (рис. 4.6).

85

Коливання положення максимуму поглинання в діапазоні від 412 до

418 нм свідчить про різноманітність і дещо різне співвідношення окремих

сполук флавоноїдів цмину піщаного квіток у різних зразках сировини, проте

переважаючим компонентом є ізосаліпурпозид (табл. 4.1).

Рис. 4.6. Диференціальний електронний спектр поглинання комплексу

алюміній хлориду з: флавоноїдами цмину піщаного квіток (1) та

ізосаліпурпозидом (стандартним зразком) (2).

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів, визначений у ЛРС цмину піщаного квітах становив від 1,1 % до

2,0 % в перерахунку на ізосаліпурпозид та на суху сировину (табл. 4.2).

Для кількісного визначення вмісту флавоноїдів у сухому екстракті цмину

піщагого квіток запропоновано методику, яка наведена в п. 4.7. При

спектрофотометричному дослідженні флавоноїдів сухого екстракту цмину

піщаного квіток встановлено, що у диференціальному спектрі поглинання

комплексу алюміній хлориду з флавоноїдами, в умовах вибраної

пробопідготовки, присутній максимум поглинання в діапазоні 412-418 нм,

спектр розчину порівняння стандартного зразка ізосаліпурпозиду, отриманий у

цих же умовах, маємаксимум при 418 нм (рис. 4.7).

86

Таблиця 4.2

Результати визначення вмісту суми флавоноїдів у досліджуваних зразках

цмину піщаного квіток

Серія

Вміст суми флавоноїдів в перерахунку на

ізосаліпурпозид та суху сировину, %

010101 1,53 ± 0,02

020202 1,82 ± 0,02

010711 2,01 ± 0,04

060625 1,22 ± 0,01

014111 1,76 ± 0,05

251008 1,36 ± 0,03

010102 1,43 ± 0,02

361109 1,11 ± 0,02

060210 1,34 ± 0,03

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів в квітках цмину

піщаного та сухому екстракті наведена в додатку М.

Рис. 4.7. Диференціальний електронний спектр поглинання комплексу

алюміній хлориду з: флавоноїдами цмину піщаного квіток екстракту сухого (1)

та ізосаліпурпозидом (стандартним зразком) (2).

87

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів у цмину піщаного екстракті сухому становив від 20 % до 32 % в

перерахунку на ізосаліпурпозид та на суху сировину (табл. 4. 3).

Таблиця 4 3.

Результати визначення вмісту суми флавоноїдів у досліджуваних зразках

цмину піщаного квіток екстракті сухому

Серія екстракту Вміст суми флавоноїдів в

перерахунку на ізосаліпурпозид та

суху речовину, %

10912 26,02 ± 0,06

20912 28,26 ± 0,07

30912 20,57 ± 0,06

10513 32,56 ± 0,06

20613 28,31 ± 0,05

4.2 Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин екстракту моркви

дикої плодів та нагідок квіток.

Фітохімічні дослідженні вмісту біологічно активних речовин проводили у

ланцюжку сировина – екстракт рідкий – густий екстракт. Для досліджень

відбирали зразки моркви дикої плодів, зібраних у різних регіонах України,

екстракту рідкого, отриманого із Моркви дикої плодів, екстрагованих етанолом

96 % (у співвідношенні сировина : одержаний екстракт 1 : 1), які

використовуються у виробництві АТ «Галичфарм», квітки нагідок та настойку

нагідок, отриманих із нагідок квіток, екстрагованих етанолом 70 % (у

співвідношенні сировина:одержаний екстракт 1 : 10), комплексний екстракт

Моркви дикої плодів та Нагідок квіток, ориманий шляхом змішування рідких

екстрактів у співвідношення 1:5 з подальшим упарюванням екстрагента.

88

Для ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот у досліджуваних

зразках використовували методи тонкошарової (ТШХ) та високоефективної

рідинної (ВЕРХ) хроматографії.

В результаті аналізу методом ТШХ в УФ – світлі при довжині хвилі 365 нм

у зразках моркви дикої плодів, зібраних у Західному регіоні, було виявлено

шість основних зон з жовто-оранжевою, жовто-зеленою та блакитною

флуоресценцією, які є характерними для фенольних сполук. За співпадінням

величини Rf та забарвленням зон на хроматограмі розчину порівняння та

випробовуваного розчину в зразках були ідентифіковані рутин, лютеоліну-7-

глюкозид та лютеолін. На хроматограмах випробовуваних зразків 3-8

спостерігалися додаткові зони жовто-зеленої флуоресценції. На хроматограмах

випробовуваних зразків 1, 5 та 8 спостерігалися зони блакитної флуоресценції,

що характерно для фенолкарбонових кислот. У зразках плодів моркви дикої,

зібраних у Криму, були ідентифіковані хлорогенова кислота, гіперозид,

лютеолін. Фотографії хроматограм представлені на рис.4.8.

Результати ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот у квітах

нагідок, екстракті рідкому моркви дикої плодів, настойці нагідок, густого

моркви дикої плодів та нагідок квіток методом ТШХ при перегляді

хроматограми в УФ світлі при довжині хвилі 365 нм наведені на рисунку 4.9.

За результатами проведених досліджень у екстракті рідкому моркви дикої

плодів ідентифіковано рутин, хлорогенову кислоту, лютеоліну – 7 глюкозид,

апігеніну-7-глюкозид, лютеолін.

За результатами проведених досліджень у сировині нагідок квітах

ідентифіковано рутин, хлорогенову кислоту, лютеоліну – 7 - глюкозид,

апігеніну-7-глюкозид, цикорієву кислоту, у настойці нагідок квіток

ідентифіковано рутин, хлорогенову кислоту, лютеоліну – 7 глюкозид, апігеніну-

7-глюкозид, цикорієву кислоту. В результаті проведених досліджень у зразках

комплексного екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток ідентифіковано

89

рутин, хлорогенова кислота, апігеніну-7-глюкозид, цикорієва кислота, лютеолін,

апігенін.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 4.8. Хроматограма, отримана при ідентифікації флавоноїдів у моркви

дикої плодах для: 1, 10 - розчину порівняння (рутин, хлорогенова кислота,

гіперозид, апігеніну-7-глюкозид, цикорієва кислота, лютеолін, апігенін, знизу -

догори), 2-8 - випробовуваних зразків №№ 1-7 (зразки із Західного регіону

України), 9 - розчин порівняння (лютеолін-7-глюкозид, кофейна кислота,

кверцетин, знизу - догори), 11,12 - випробо-вуваних зразків №№ 8, 9 (зразки з

Криму), 13 - розчин порівняння (кофейна кислота, кверцетин, знизу - догори).

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот методом

ТШХ в моркви дикої плодаї та рідкому екстракті моркви дикої плодів наведена

в додатку К.

Для більш детального вивчення складу флавоноїдів та фенолкарбонових

кислот моркви дикої плодів та екстракту рідкого використовували метод ВЕРХ.

Досліджувалися зразки, приготовані для проведення випробування методом

ТШХ.

90

1 2 3 4 5 6

Рис. 4.9. Хроматограма, отриманих при ідентифікації флавоноїдів у рідких

екстрактах моркви дикої плодів та нагідок квіток та комплексному екстракті

густому моркви дикої плодів і нагідок квіток для: 1 - випробовуваного розчину

моркви дикої плодів, 2- випробовуваного розчину нагідок квіток, 3 - розчину

порівняння (рутин, хлорогенова кислота, гіперозид, лютеоліну – 7 – глюкозид,

апігеніну-7-глюкозид, цикорієва кислота, лютеолін, апігенін, знизу - догори), 4 -

випробовуваного розчину екстракту рідкого моркви дикої плодів, 5-

випробовуваного розчину настойки нагідок, 6 - випробовуваного розчину

комплексного екстракту густого моркви дикої плодів та нагідок квіток

Методом рідинної хроматографії у моркви дикої плодах, зібраних у

Західному регіоні України та Криму, за співпадінням часів утримування на

хроматограмі розчину порівняння та випробовуваного розчину були

ідентифіковані лютеолін-7-глюкозид, апігенін-7-глюкозид, розмаринова

кислота, лютеолін, апігенін, наявні не ідентифіковані піки з часами виходу

близько 26 хв, 35 хв та 38 хв. На хроматограмах випробовуваних зразків 1 та 5

спостерігався не ідентифікований пік з часом виходу близько 56 хв., на

хроматограмі випробовуваного зразка 2, 4, 7, та 9 - спостерігалися піки з часом

91

виходу 31 хв. У зразках плодів моркви дикої, зібраних у Криму, були

ідентифіковані хлорогенова та кофейна кислоти, гіперозид, були наявні піки з

часом виходу близько 39 хв. УФ-спектр речовини, яка позначена як

неідентифікований пік з часом виходу близько 26 та 31 хв, за ходом кривої

світлопоглинання і положенням максимуму в області поглинання флавоноїдів,

дозволяє припустити приналежність цієї речовини до флавоноїдів. УФ-спектр

речовин, які позначені як неідентифіковані піки часом виходу близько 35 хв та

39 хв, за ходом кривої світлопоглинання і положенням максимуму в області

поглинання фенолкарбонових кислот, дозволяє припустити приналежність цієї

речовини до фенолкарбонових кислот. Результати дослідження кожного

ідентифікованого компонента або неідентифікованого (згідно площі його піку)

методом внутрішньої нормалізації, наведені у таблиці 4.4, типові хроматограми

приведені на рис. 4.10, 4.11.

Рис. 4.10. Хроматограма випробовуваного розчину моркви дикої плодів

зібраних у західному регіоні України

Таким чином, результати ідентифікації методами ТШХ та ВЕРХ

підтверджують різницю складу і співвідношення фенольних сполук у зразках

плодів моркви дикої, зібраних у Західному регіоні України та Криму, що

зумовлено різними кліматичними умовами вирощування.

92

Таблиця 4.4.

Результати ідентифікація флавоноїдів та фенольних сполук у зразках моркви дикої плодів методом

високоефективної рідинної хроматографії

Речовина Час

утриму

вання,

хв

Відносний вміст, %

Зразок 1

Серія 2

Зразок

2 10/10

Зразок 3

Серія 1

Зразок 4

011208

Зразок 5

1-12.12.2011

Зразок 6

1010309

Зразок 7

031009

Зразок 8

20312

Зразок 9

102121402

12

Хлорогенова кислота 13,4 - - 0,6 - - - - 3,8 8,4

Неідентифікований пік 15,6 - - - - - - - 2,9 2,2

Кофейна кислота 16,6 - - - - - 0,6 - - 1,4

Ферулова кислота 24,9 - - - 0,7 - - - 0,5 1,4

Неідентифікований пік 25,8 34,1 5,7 11,0 2,2 35,1 17,4 3,4 27,2 7,2

Лютеолін-7-глюкозид 2277,,33 2233,,55 1166,,33 99,,22 77,,22 1133,,66 66,,77 55,,55 44,,11 33,,44

Рутин 27,8 - - 1,4 - - 3,4 1,2 - 0,4

Гіперозид 29,8 5,3 - - - - - 0,5 7,4 10,3

Неідентифікований пік 31,1 - 77,1 - 32,1 - - 8,4 - 9,2

Апігенін-7-глюкозид 32,6 2,6 0,6 - 1,6 3,8 1,1 2,4 1,4 2,6

Цикорієва кислота 33,3 0,5 - 0,6 1,3 0,5 2,5 0,8 - 3,2

Розмаринова кислота 34,5 4,1 1,9 2,9 4,8 6,4 4,6 1,0 7,8 10,2

Неідентифікований пік 35,5 2,9 2,1 3,1 9,5 7,2 1,7 6,8 2,5 14,2

Неідентифікований пік 38,8 - - - 1,6 0,6 - - 9,6 17,8

Мірицетин 39,7 0,3 - 1,5 3,4 0,8 2,8 2,6 2,7 0,5

Лютеолін 46,2 6,4 - - 2,8 3,5 0,9 - 3,5 2,7

Апігенін 47,2 1,4 0,1 0,5 0,7 1,4 1,3 0,5 1,7 0,7

Кемпферол 54,1 - 0,1 - - 0,3 - - - 0,5

Неідентифікований пік 55,9 8,9 6,5 - - 8,3 - - - -

93

Рис. 4.11. Хроматограма випробовуваного розчину моркви дикої плодів

зібраних у Криму.

Методом ВЕРХ за співпадінням часів утримування піків на

хроматограмах розчину порівняння та випробовуваних зразків рідких

екстрактів плодів моркви дикої ідентифіковано фенолкарбонові кислоти:

хлорогенову та кофейну, ферурову, флавоноїди лютеолін-7-глюкозид,

апігенін-7-глюкозид, лютеолін, апігенін, кемпферол. Типова хроматограма

випробовуваного розчину екстракту рідкого моркви дикої плодів на рисунку

4.12.

Рис. 4.12. Xроматограма випробовуваного розчину екстракту рідкого

моркви дикої плодів

94

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот в

моркви дикої плодів екстракті рідкому методом ВЕРХ наведена в додатку Л.

Аналізуючи зразки досліджуваної сировини нагідок квіток методом

ВЕРХ, ідентифікували фенолкарбонові кислоти: хлорогенову, кофейну,

розмаринову, цикорієву, флавоноїди рутин,гіперозид, лютеоліну-7-

глюкозид, мірцетин, кемпферол. Хроматограми випробовуваного розчину

нагідок квіток представлені на рисунку 4.13.

Рис. 4.13. Хроматограма випробовуваного розчину нагідок квіток

Аналізуючи зразки нагідок настойки методом ВЕРХ, ідентифікували

фенолкарбонові кислоти: хлорогенову, кофейну, розмаринову, флавоноїди

лютеоліну-7-глюкозид, рутин, гіперозид, мірцетин, кемферол. Хроматограми

випробовуваного нагідок настойки представлені на рисунку 4.14.

Рис. 4.14. Хроматограма випробовуваного розчину настойки нагідок

95

В результаті проведених досліджень у зразках комплексного екстракту

моркви дикої плодів та нагідок квіток методом ВЕРХ ідентифіковано

хлорогенову, кофейну, ферулову, розмаринову, флавоноїди лютеоліну-7-

глюкозид, рутин, гіперозид, апігені-7-глюкозид, мірцетин, апігенін та

кемферол. Типова хроматограма випробовуваного розчину комплексного

екстракту моркви дикох плодів та нагідок квіток представлені на рисунку

4.15.

Рис. 4.15. Хроматограма випробовуваного розчину плодів моркви дикої

та нагідок квіток екстракту густого.

На храматограмах випробовуваних розчинів нагідок квіток, настойки

нагідок та густого екстракту присунті не ідентифіковані піки з часами

виходу близько 26 хв, 32 хв та 36 хв. Дані піки співпадають з часами виходу

основних піків на хроматограмі розчину порівняння календулозидів (рис.

4.16).

Рис. 4.16. Хроматограма розчину порівняння каледулозидів ФСЗ ДФУ.

96

Методика ідентифікації флавоноїдів та фенолкарбонових кислот та

календулозидів методом ВЕРХ в нагідок квітках, нагідок настойці та

комплексному екстрактому густі моркви дикої плодів та нагідок квіток

наведена в додатку Л.

Для підтвердження наявності календулозидів у квітках нагідок, настойці

нагідок та густому екстракті плодів моркви дикої та нагідок квіток було

використано також метод ТШХ. Хроматограми проглядали при денному

світлі. На хроматограмах випробовуваних розчинів виявлені зони, які за

розміром, величиною Rf та забарвленням співпадають з зонами на

хроматограмі розчину порівняння календулозидів. Результати перегляду

хроматограми наведені на рисунку 4.17, методика наведена у додатку Н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 4.17. Хроматограма, отримана в умовах ідентифікації

календулозидів у ланцюзі ЛРС – настойка –моркви дикої плодів та нагідок

квіток екстракт густий для: 1, 2, 3 - випробовуваних розчинів нагідок квіток,

4, 5, 6 - випробовуваних розчинів настойки нагідок, 7 - розчину порівняння

календулозидів, 8, 9 - випробовуваних розчинів моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракту густого.

Однією з груп БАР моркви дикої плодів є кумарини. Для їх

ідентифікації використано метод ТШХ та ВЕРХ. Як видно з рисунку 4.18, у

97

плодах моркви дикої присутні такі представники групи кумаринів, як

ескулін, скополетин, умбеліферон, 7-метоксикумарин, у екстракті моркви

дикої плодів присутні такі представники групи кумаринів, як ескулін,

скополетин, умбеліферон, 7-метоксикумарин, у моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракті густому присутні такі представники групи

кумаринів, як ескулін, скополетин, умбеліферон та 7-метоксикумарин.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 4.18. Хроматограма, отримана в умовах ідентифікації кумаринів для:

1,3 – випробовуваних розчинів рідких екстрактів моркви дикої плодів, 2,4,7 –

випробовуваних розчинів плодів моркви дикої, 5 - розчину порівняння

ескуліну, 5,7-дигідрокси-4-метоксикумарину, скополетину, умбеліферон, 7-

метоксикумарин (знизу вверх), 6 – розчину порівняння епікатехіну, 8, 9 -

моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракту густого.

Методика ідентифікації кумаринів в моркви дикої плодах, рідкому

екстракті моркви дикої плодів та густий екстракт моркви дикої плодів та

нагідок квіток методом ТШХ наведена в додатку П.

98

Паралельно з ТШХ – дослідженнями проводили ідентифікацію

кумаринів методом ВЕРХ. Методом рідинної хроматографії у моркви дикої

плодах, за співпадінням часів утримування на хроматограмі розчину

порівняння та випробовуваного розчину були ідентифіковані ескулін,

скополетин, 5,7-дигідрокси-4-метоксикумарин, 7-метоксикумарин.

Хроматограми, отримані при ВЕРХ-аналізі кумаринів плодів моркви

дикої наведено в рисунку 4.19 та 4.20.

Рис. 4.19. Хроматограма розчину порівняння кумаринів, отримана при

ідентифікації кумаринів.

Рис. 4.20. Хроматограма випробовуваного розчину моркви дикої

плодів, отримана при ідентифікації кумаринів.

Методом рідинної хроматографії у екстракті моркви дикої плодів, за

співпадінням часів утримування на хроматограмі розчину порівняння та

випробовуваного розчину були ідентифіковані скополетин, ескулін та 7-

метоксикумарин, типовa хроматограмa представленa на рисунку 4.21.

99

Рис. 4.21. Хроматограма випробовуваного розчину моркви дикої плодів

екстракту рідкого, отримана при ідентифікації кумаринів.

Методом рідинної хроматографії у комплексному екстракті моркви

дикої плодів та нагідок квіток, за співпадінням часів утримування на

хроматограмі розчину порівняння та випробовуваного розчину були

ідентифіковані скополетин, ескулін, умбеліферон, 5,7-дигідрокси-4-

метоксикумарину та 7-метоксикумарин, типові хроматограми представлені

на рисунку 4.22.

Рис. 4.22. Хроматограма випробовуваного розчину моркви дикої плодів

та нагдок квіток екстракту густого, отримана при ідентифікації кумаринів.

Методика ідентифікації кумаринів в моркви дикої плодах, рідкому

екстракті моркви дикої плодів та моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракті густому методом ВЕРХ наведена в додатку Р.

100

Методом газової хромато-мас-спектрометрії в ефірній олії плодів моркви

дикої знайдено понад 150 сполук, ідентифіковано 14 компонентів, які, за

даними літератури, найчастіше зустрічаються в ній. У моркви дикої плодах,

зібраних у західному регіоні України та Криму ідентифіковані пінени,

феландрен, мірцен, лімонен, терпінеол, бергамотен, гераніолацетат, гераніол,

каріофілен. У зразках, зібраних у Західному регіоні України, ідентифіковані

також вербенолін, даукол та евкаліптол. Однак, якщо якісний склад

відрізняється не суттєво, то за кількісним співвідношенням основних

компонентів спостерігається суттєва різниця. У зразках, зібраних у Криму

основними компонентами були пінен, феландрен, гераніолу ацетат та

гераніол. Їх вміст складав 78 % від загального вмісту ефірних олій. У зразках,

зібраних у західному регіоні України, основними компонентами були пінен,

феландрен, каріофілен, мірцен та даукол. Їх вміст складав 70 % від

загального вмісту ефірних олій. Основними компонентами ефірних олії

плодів моркви дикої екстракту рідкого та густого екстракту моркви дикої

плодів та нагідок квіток були пінен, феландрен, каріофілен, мірцен та даукол.

Їх вміст складав 70 % від загального вмісту ефірних олій. Аналіз

компонентного складу ефірної олії плодів моркви дикої наведено в таблиці

4.5, хроматограми, отримані на газовому хроматографі з мас-детектором

наведені на рисунках 4.23 - 4.26.

Як випливає з представлених даних, при отриманні рідкого та густого

екстрактів зберігається компонентний склад, що вказує на коректність умов

оримання, зокрема, густого екстракту.

Результати ідентифікації методом газової хроматографії підтверджують

різницю складу і співвідношення компонентів ефірної олії у зразках плодів

моркви дикої, зібраних у західному регіоні України та Криму.

101

Таблиця 4.5.

Біологічно активні речовини ефірної олії плодів моркви дикої, моркви

дикої плодів екстракту рідкого та моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого

Назва речовини Сировина Рідкий екстракт Густий екстракт

Пінен + + +

Камфен + + +

Феландрен + + +

Мірцен + + +

Лімонен + + -

Евкаліптол + + -

Бергамотен + + +

Терпінеол + + +

Міртеналь + + +

Вербенол + + -

Вербенон + - -

Гераніолу ацетат + - -

Гераніол + + +

Каріофілен + + +

Даукол + + +

Оцінку кількісного вмісту флавоноїдів у моркви дикої плодах та

рідкому екстракті проводили спектрофотометричним методом. Як стандарт

для розрахунку кількісного вмісту флавоноїдів у моркви дикої плодах та

рідкому екстракті використовували зразок лютеоліну (Fluka).

102

Рис. 4.23. Хроматограма олій рідкого

екстракту моркви дикої плодів.

Рис. 4.24. Хроматограма олій моркви

дикої плодів зібраних у західному

регіоні України

Рис. 4.25. Хроматограма олій густого

екстракту моркви дикої плодів та

нагідок квіток..

Рис. 4.26. Хроматограма олій моркви

дикої плодів зібраних у Криму

Дослідження СФ методом моркви дикої плодів показали, що у вибраних

умовах пробопідготовки випробовувані розчини мали максимум поглинання

при 395 ± 3 нм, що відповідало максимуму поглинання лютеоліну в умовах

кількісного визначення, розчин порівняння лютеоліну мав максимум

поглинання при 395 нм (λмакс = 395 нм, рис. 4.27), Диференціальні спектри,

що відповідають зразкам 6 та 7 мали два максимуми поглинання при 397 нм

103

та 415 нм (рис. 4.28.), зразки 1, 3, 5 мали чіткий максимум при 393 нм і

розмите плече при 415 – 420 нм (рис. 4.29). Інші зразки мали один максимум

при 394 нм (рис. 4.30). Наявність другого максимуму чи плеча свідчить про

різноманітність флавоноїдного складу моркви дикої плодів, проте переважає

група лютеоліну. Зразки 8 та 9 мали чіткий максимум поглинання при 420 ± 2

нм (рис. 4.31), що характерно для флавоноїдів рутину та гіперозиду. Це

підтверджують і результати ідентифікації та кількісної оцінки флавоноїдів

методом ВЕРХ, наведені в таблиці 4.4.

Рис. 4.27. Диференціальний

електронний спектр поглинання

розчину поглинання лютеоліну в

умовах кількісного визначення.

Рис. 4.29. Диференціальний

електронний спектр поглинання

для зразків 1, 3, 5 в умовах

кількісного визначення.

Рис. 4.28. Диференціальний

електронний спектр поглинання для

зразків 6, 7 в умовах кількісного

визначення.

Рис. 4.30. Диференціальний

електронний спектр поглинання

для зразків 2, 4, в умовах

кількісного визначення.

104

Рис. 4.31. Диференціальний електронний спектр поглинання для зразків

8, 9, в умовах кількісного визначення.

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів у зразках моркви дикої плодів, зібраних у західному регіоні

України (зразки №№ 1-7) становив від 0,114 % до 0,792 % в перерахунку на

лютеолін. У зразках 8, 9, зібраних у Криму, вміст суми флавоноїдів

визначали в перерахунку на гіперозид, оскільки для них максимум

поглинання у вибраних умовах пробопідготовки спостерігався при 420 ±

2 нм. Вміст суми флавоноїдів у перерахунку на гіперозид у зразках 8, 9 був

суттєво меншим і становив 0,071-0,080 %. Результати визначення суми

флавоноїдів у досліджених зразках ЛРС представлені у таблиці 4.7.

На основі отриманих результатів можна зробити висновок, що

кількісний вміст флавоноїдів у плодах моркви дикої, зібраної в різних

регіонах України, може суттєво відрізнятися, що може бути пов’язано із

різними кліматичними умовами вирощування та наявністю різних хемотипів

моркви дикої. Наявність декількох чи одного максимумів у спектрах

поглинання, отриманих в умовах кількісного визначення флавоноїдів у

різних зразках сировини може бути важливою діагностичною або

критеріальною ознакою при розробці методології контролю якості і виборі

критеріїв якісності в процесі стандартизації сировин.

105

Таблиця 4.7

Результати кількісного визначення вмісту флавоноїдів та ефірних

олій у моркви дикої плодах

Зразок № Вміст суми флавоноїдів

у перерахунку на лютеолін, %

Вміст ефірної олії, %

1 0,353 ± 0,008 1,43 ± 0,02

2 0,792 ± 0,007 1,45 ± 0,01

3 0,261 ± 0,005 1,51 ± 0,03

4 0,434 ± 0,004 1,42 ± 0,01

5 0,645 ± 0,006 1,63 ± 0,02

6 0,114 ± 0,003 1,54 ± 0,01

7 0,213 ± 0,005 1,47 ± 0,01

Вміст суми флавоноїдів

у перерахунку на гіперозид, %

8 0,080 ± 0,004 2,42 ± 0,01

9 0,071 ± 0,003 2,23 ± 0,02

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів у зразках екстракту моркви дикої плодів становив від 0,014 % до

0,052 % в перерахунку на лютеолін. У вибраних умовах пробопідготовки

максимум поглинання випробовуваних зразків спостерігався при 395 ± 4 нм.

(рис. 4.32) що свідчить, що у досліджуваних зразках домінують флавоноїди

лютеолінової групи. Результати кількісного визначення суми флавоноїдів у

досліджених зразках екстракту моркви дикої плодів представлені у таблиці

4.8.

106

Таблиця 4.8

Вміст суми флавоноїдів у досліджуваних зразках екстракту моркви дикої

плодів

Серія

Вміст суми флавоноїдів у

перерахунку на лютеолін, %

10612 0,035 ± 0,008

20612 0,052 ± 0,007

30213 0,026 ± 0,005

40513 0,044 ± 0,004

50513 0,045 ± 0,006

60913 0,014 ± 0,003

71013 0,023 ± 0,005

Методика кількісного визначення флавоноїдів в моркви дикої плодах

та рідкому екстракті моркви дикої плодів наведена в додатку С.

Кількісний вміст флавоноїдів у квітках нагідок та настойці нагідок

визначали методом диференціальної спектрофотометрії. Визначення

проводили згідно монографії ДФУ НАГІДОК КВІТКИ та НАГІДОК

НАСТОЙКА. Спектри поглинаня випробовуваного розчину нагідок квіток та

Рис. 4.32. Диференціальний електронний спектр поглинання розчину

екстракту моркви дикої плодів в умовах кількісного визначення.

107

нагідок настойки в умовах кількісного визначення флавоноїдів представлені

на рисунку 4.33 та 4.34 відповідно.

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів у зразках нагідок квіток становив від 0,45 % до 0,52% в

перерахунку на гіперозид та суху речовину, сумарний вміст флавоноїдів,

визначений у настойці нагідок становив від 0,042 % до 0,054 % в

перерахунку на гіперозид. Результати кількісного визначення суми

флавоноїдів у зразках нагідок квіток настойки наведено у таблиці 4.9.

Спектри поглинаня зразків нагідок настойки в умовах кількісного

визначення флавоноїдів представлені на рисунку 4.34.

Рис. 4.33. Диференціальний

електронний спектр поглинання

комплексу алюміній хлориду з

флавоноїдами нагідок квіток в

умовах кількісного визначення.

Рис. 4.34. Диференціальний

електронний спектр поглинання

комплексу алюміній хлориду з

флавоноїдами нагідок настойки в

умовах кількісного визначення.

108

Таблиця 4.9

Вміст суми флавоноїдів у досліджуваних зразках ЛРС нагідок квіток та

нагідок настойці

Серія

Вміст суми флавоноїдів у

перерахунку на гіперозид, %

ЛРС

10712 0,453 ± 0,008

20712 0,512 ± 0,007

30813 0,451 ± 0,005

40813 0,524 ± 0,004

50813 0,485 ± 0,006

Настойка

10912 0,045 ± 0,05

20912 0,042 ± 0,05

30912 0,050 ± 0,04

10513 0,049 ± 0,03

20613 0,054 ± 0,05

Кількісний вміст флавоноїдів у густому екстракті моркви дикої плодів

та нагідок квіток визначали методом диференціальної спектрофотометрії.

Зважаючи на те, що у екстрактах містяться як флавоноїди як у формі

глюкозидів так і у формі агліконів, кількісного визначення флавоноїдів

проводили після гідролізу, згідно методики, описаної у монографії ДФУ

Нагідок квітки [94], вміст суми флавоноїдів розраховували у перерахунку на

гіперозид. Результати кількісного визначення суми флавоноїдів у моркви

дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому наведено в таблиці 4.10.

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів в нагідок квітках

та настойці наведена в додатку Т, у комплексному екстракті густому моркви

дикої плодів та нагідок квіток у розділі 4.7.

109

Таблиця 4.10

Результати визначення вмісту суми флавоноїдів у досліджуваних зразках

моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

Серія екстракту Вміст суми флавоноїдів в перерахунку на

гіперозид, %

10512 1,42 ± 0,03

10512-1 2,05 ± 0,04

300512 1,78 ± 0,02

10513 2,62 ± 0,03

20613 1,63 ± 0,02

4.3 Фітохімічне дослідження біологічно активних речовин екстракту

сухого куркуми довгої.

Згідно літературних джерел, основними біологічна активними

речовинами коріння куркуми є ефірна олія, яка складає близико 5 % та

куркуміноїди 50 - 60% з яких складають куркумін, диметоксикуркумін та

бісдиметоксикуркумін.

Ідентифікацію куркуміноїдів проводили методом ВЕРХ. Як розчин

порівняння використовували стандартний зразок куркуміну та робочий

стандартний зразок комплексу куркуміноїдів, наданого виробником

екстракту (Sabinsa Europe GmbH, Німеччина, виробництво розміщене в Індії).

Згідно даних валідаційного пакету часи утримування диметоксикуркуміну та

бісдиметоксикуркуміну відносно куркуміну становлять 1,15 та 1,35. Типові

хроматограми стандартного зразка куркуміну, розчину робочого

стандартного зразка та виробобовуваного розчину екстракту куркуми

представлені на рисунках 4.35, 4.36 та 4.37.відповідно.

110

Рис. 4.35. Хроматограма стандартного зразка куркуміну.

Рис. 4.36. Хроматограма робочого стандартного зразка комплексу

куркуміноїдів.

Рис. 4.37. Хроматограма випробовуваного розчину екстракту куркуми.

Результати кількісного визначення куркуміноїдів у зразках сухого

екстракту куркуми наведено в таблиці 4.11.

111

Таблиця 4.11

Результати визначення вмісту куркуміноїдів у сухому екстракту

куркуми.

Серія Куркумін,

%

Диметоксикуркумін,

%

Бісдиметоксикуркумін,

%

J110142 78,1 18,8 3,1

J110152 76,4 22,1 4,8

J110184 79,0 18,6 4,2

Згідно вимог специфікації вміст куркуміну має бути від 70,0 % до

80,0 %, диметоксикуркуміну від 15,0 % до 25,0 %, бісдиметоксикуркуміну від

2,5 % до 6,5 %.

Методика ідентифікації та кількісного визначення куркуміноїдів у

екстракті куркуми сухому наведена у додатку У.

4.4 Обґрунтування вибору сполук та маркерів для якісного та кількісного

визначення основних класів біологічно активних речовин у екстрактах.

Результати проведених фітохімічних досліджень демонструють нявність

складного комплексу біологічно активних речовин в ЛРС та виготовлених з

них екстрактів. Тому необхідно провести вибір маркерів, які є характерні для

кожного з видів ЛРС і які будуть відповідати за якісні та кількісні

характеристики екстрактів.

Згідно результатів фітохімічних досліджень та даних літератури,

ізосаліпурпозид та апігенін-7-глюкозид є основними представниками

флавоноїдів цмину пісчаного квіток та сугохо екстракту на їх основі. Вміст

ізосаліпурпозиду у ЛРС складає блзько 40 %, а у сухому екстракті близько

25 %, апігенін-7-глюкозид у ЛРС близько 8 %, у сухому екстракті – 5 %.

Зважаючи на специфічність та домінуючий вміст, ізосаліпурпозид та

112

апігенін-7-глюкозид обрано для підтвердження тотожності сухого екстракту

квіток цмину пісчаного.

Оскільки флавоноїди є основними діючими речовинами цмину пісчаного

ківітів, то їх сумарний вміст буде кількісною характеристикою сухого

екстакту цмину пісчаного квіток. Хід та положення максимуму поглинання

випробовуваних розчинів екстракту сухого цмину пісчаного співпадають з

положенням максимуму поглинання розчину порівняння ізосаліпурпозиду,

тому кількісний вміст флавоноїдів у сухому екстракті цмину пісчпного

квіток розраховували у перерахунку на ізосаліпурпозид. Спектри поглинання

зразків екстракту сухого цмину пісчаного в умовах кількісного визначення

флавоноїдів представлені на рисунку 4.7.

Аналіз результататів фітохімічних досліджень комплексного екстракту

моркви дикої плодів та нагідок квіток при проведенні ідентифікації

флавоноїдів та фенолкарбонових показав, що наявність зони лютеоліну на

ТШХ - хроматограмі підтверджує наявність моркви дикої плодів у

комплексному екстракті моркви дикої плодів та нагідок квіток, оскільки ця

речовини відсутня на хроматограмі рідкого екстракту нагідок квіток (рис.

4.9). В результаті проведених хроматографічних досліджень можна зробити

висновок про доцільність використання лютеоліну, як маркера, з метою

доведення тотожності комплексного густого екстракту за наявністю

біологічно активних речовин моркви дикої плодів.

Для нагідок квіток фенольні сполуки є також одним з основних класів

БАР, що зумовлюють їх фармакологічну дію. Аналіз результатів

фітохімічних досліджень при проведенні ідентифікації флавоноїдів та

фенолкарбонових у ланцюзі ЛРС – настойка – комплексний густий екстракт

(рис. 4.9) показав, що хлорогенова кислота може бути маркером для

ідентифікації біологічно активних речовин нагідок квіток у комплексному

екстракті, оскільки у екстракті моркви дикої плодів хлорогенова кислота

відсутня.

Маркером для ідентифікації комплексного густого екстракту обрано

рутин. Рутин присутній як у плодах моркви так і у квітах нагідок, тому

113

наявність зони рутину на хроматограмі випробовуваного розчину буде ще

одним підтвердженням наявності біологічно активних речовин плодів

моркви та нагідок квіток у комплексному екстракті.

Іншим класом сполук, за яким підтверджено наявність основних БАР

плодів моркви дикої в ланцюзі ЛРС - рідкий екстракт – комплексний густий

екстракт є кумарини. За наявністю на хроматограмі випробовуваних розчинів

зони скополетину, яка співпадає по величині Rf з відповідною зоною на

хроматограмі розчину порівняння підтверджено наявність БАР моркви дикої

плодів у комплексному екстракті. Результати хроматографічних досліджень

кумаринів в ланцюзі ЛРС – рідкий екстракт – комплексний густий екстракт

наведено на рисунку 4.17. В результаті проведених хроматографічних

досліджень можна зробити висновок про доцільність використання

скополетину, як маркера, з метою доведення тотожності комплексного

густого екстракту за наявністю біологічно активних речовин моркви дикої

плодів.

Специфічним класом сполук для нагідок квіток є календулозиди, тому

їх обрано як маркер, з метою доведення наявності діючих речовин нагідок

квіток у комплексному густому екстракті. Тотожність встановлювали

шляхом порівняння забарвлення, розміру та величин Rf зон на хроматограмах

випробовуваних розчинів та розчину порівняння календулозидів (рис. 4.18).

Зважаючи на те, що специфічні компоненти кумарини чи

календулозиди, за якими проведена ідентифікація моркви дикої плодів та

нагідок квіток знаходяться у густому екстракті у незначних кількостях, для

встановлення кількісного критерію вибрано флавоноїди. Останні

представлені у кожній ЛРС, а отже, будуть міститися у комплексному

густому екстракті моркви дикої плодів та нагідок квіток.

В зв’язку з наявністю флавоноїдів в складі двох видах

використовуваної ЛРС, їхній сумарний вміст у густому екстракті

контролюватиме співвідношення відповідних рідких екстрактів і буде

кількісною його характеристикою. Згідно результатів фітохімічних

досліджень, у плодах моркви дикої та її рідкому екстракті серед флавоноїдів

114

переважає група лютеоліну. Однак, враховуючи співвідношення рідких

екстрактів у комплексному густому екстракті, очевидно, домінуючими

будуть флавоноїди нагідок настойки. Відповідно до вимог монографії ДФУ,

Нагідок настойка, терапевтичним маркером для розрахунку суми флавоноїдів

обрано гіперозид.

Куркуміноїди являться основним класом біологічно активних речовин у

сухому екстракті куркуми, і згідно фітохімічних досліджень та даних

літератури представлені трьома речовинами: куркумін, диметоксикуркумін

та бісдиметоксикуркумін. Саме за наявністю на хроматограмі

випробовуваного розчину трьох характерних піків, які за часами

утримування співпадають з піками на хроматограмі розчину порівняння

проводили ідентифікацію екстракту куркуми, а їх компонентний вміст та

сума характеризувала якість сухого екстракту куркуми.

4.5 Розробка методик ідентифікації основних груп біологічно активних сполук

екстракту сухого цмину піщаного квіток та густого екстракту моркви дикої

плодів та нагідок квіток.

Продовжуючи стандартизацію в ланцюзі ЛРС - сухий екстракт цмину піщаного

квіток було запропоновано ідентифікацію фенольних сполук проводити

методом ТШХ. Розділення компонентів вивчали в багатьох системах

розчинників: етилацетат Р - кислота оцтова Р – вода Р (5 : 1 : 1), спирт н-

бутиловий Р - кислота оцтова льодяна Р - вода Р (9 : 1 : 0,5), етилацетат Р -

мурашина кислота безводна Р - вода Р (8 : 1 : 1), хроматографували розчин

порівння СЗ апігенін-7-глюкозиду та ізосаліпурпозиду та випробовувані

розчини. Хроматограми проглядали в УФ-світлі (при довжині хвилі 254 та 365

нм) до та після обробки їх специфічним реактивом – розчином 10 г/л

дифенілборної кислоти аміноетилового ефіру в метанолі Р та 50 г/л макроголу

400 Р в метанолі P. Результати ТШХ-аналізу флавоноїдів цмину піщаного

квіток екстракту сухого у різних рухомих фазах наведено в таблиці 4.12.

115

Таблиця 4.12

Результати дослідження флавоноїдів екстракту сухого цмину піщаного

квіток в різних системах розчинників

етилацетат Р - кислота

оцтова Р – вода Р

(5:1:1)

спирт н-бутиловий Р -

кислота оцтова льодяна

Р - вода Р

(9:1:0,5)

етилацетат Р -

мурашина кислота

безводна Р - вода Р

(8:1:1)

Rf Забарвлення

плями

Rf Забарвлення

плями

Rf Забарвлення

плями

0,45 Жовто-

зелене

0,25 Зелене 0,49 Жовто-

зелене

0,61 Коричневе 0,50 Коричневе 0,57 Коричневе

На хроматограмі

випробовуваних

розчинів у верхній

третині немає чіткого

розділення плям

На хроматограмі

випробовуваних

розчинів немає чіткого

розділення плям, плями

зливаються

На хроматограмі

випробовуваних

розчинів плями

розділені

На підставі результатів, наведених в таблиці 4.12, можна зробити висновок про

те, що рухома фаза етилацетат Р - мурашина кислота безводна Р - вода Р

(8 : 1 : 1) є найбільш вдалою для розділення та визначення флавоноїдів

екстракту сухого цмину піщаного квіток. Методика ідентифікації апігенін-7-

глюкозиду, ізосаліпурпозиду та ТШХ - хроматограми наведена у розділі 4.7.

Для ідентифікації БАР нагідок квіток та моркви дикої плодів в комплексному

густому екстракті обрано метод ТШХ. Методика розроблена на основі

методики ідентифікації фенольних сполук у Нагідок квітках, описаної у

монографіях ДФУ Нагідок квітки [94]. Методика ідентифікації лютеоліну,

хлорогенової кислоти та рутину, ТШХ - хроматограми наведена у розділі 4.7.

Ідентифікацію календулозидів у густому екстракті моркви дикої плодів

та нагідок квіток проводили методом ТШХ в системі розчинників хлороформ

Р – кислота оцтова льодяна Р – метанол Р – вода Р (35 : 16 : 6 : 4), для

проявлення пластинки використовували розчин анісового альдегіду. Як

розчин порівняння використовували СЗ календулозидів ФСЗ ДФУ. Методика

розроблена на основі методики ідентифікації каледулозидів у нагідок квітках,

116

описаної у монографії ДФУ Нагідок квітки [94]. Методика ідентифікації

календулозидів та ТШХ - хроматограми наведена у розділі 4.7.

Для ідентифікації кумаринів у густому екстракті нами використано

метод ТШХ. Методика розроблена на основі методики ідентифікації

кумаринів, описаної у монографії ДФУ Буркун [94]. Визначення проводили в

системі розчинників: верхній шар суміші кислота оцтова розведена Р : ефір Р

: толуол Р (10 : 50 : 50). Хроматограми проглядали в УФ-світлі при довжині

хвилі 365 нм після обробки їх специфічним реактивом – 2 М розчином калій

гідроксиду спиртового Р. Для приготування розчину порівняння

використовували стандартний зразок скополетину. Методика ідентифікації

скополетину та ТШХ - хроматограми наведена у розділі 4.7.

4.6. Розробка методів кількісного визначення біологічно активних сполук цмину

піщаного квіток екстракту сухого та моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого.

Кількісне визначення флавоноїдів цмину піщаного квіток екстракту

сухого проводили спектрофотометрично. Згідно монографії «Квіток

безсмертника пісчаного», включеної в фармакопею ГФ ХІ видання, кількісне

визначення флавоноїдів проводять методом прямої спектрофотометрії,

вимірюючи оптичну густину на плечі кривої світлопоглинання ( = 315 нм),

що призводить до значного завищення результатів, через врахування

поглинання інших БАР. У вибраних умовах пробопідготовки

випробовуваний розчин, підготовлений для прямої спектрофотометрії мав

два максимуми поглинання при 334 та 295 нм, тоді як розчин порівняння –

спиртовий розчин стандартного зразка ізосаліпурпозиду, мав максимум

поглинання при 370 нм (λмакс= 370 нм, рис. 4.38). У вказаній ділянці довжин

хвиль мають максимуми поглинання інші речовини: хлорогенова кислота –

328 нм, розмаринова кислота – 326 нм, цикорієва кислота – 330 нм, які

присутні в досліджуваній сировині та сухому екстракті (див. п. 4.1).

117

У диференціальному спектрі поглинання комплекс алюміній хлориду з

флавоноїдами цмину піщаного квіток екстракту сухого, в умовах вибраної

пробопідготовки, мав максимум поглинання в діапазоні 412-418 нм, спектр

розчину порівняння стандартного зразка ізосаліпурпозиду, отриманий у цих

же умовах, мав максимум при 418 нм (рис. 4.39). Коливання положення

максимуму поглинання в діапазоні від 412 до 418 нм свідчить про

різноманітність і дещо різне співвідношення окремих сполук флавоноїдів

цмину піщаного квіток у різних зразках сировини, проте переважаючим

компонентом є ізосаліпурпозид.

В результаті проведених досліджень встановлено, що сумарний вміст

флавоноїдів, визначений у екстракті сухому цмину пісчаного квіток становив

від 20 % до 32 % в перерахунку на ізосаліпурпозид та суху речовину.

Визначення суми флавоноїдів у моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракті густому проводили спектрофотометрично. Зважаючи на те, що у

екстрактах міститься як флавоноїди як у формі глюкозидів так і у формі

агліконів, кількісного визначення флавоноїдів проводили після гідролізу,

Рис. 4.38. Диференціальний

електронний спектр поглинання

цмину піщаного квіток екстракту

сухого (1) та стандартного зразка

ізосаліпурпозиду (2).

Рис. 4.39. Диференціальний

електронний спектр поглинання

комплексу алюміній хлориду з:

флавоноїдами цмину піщаного

квіток екстракту сухого (1) та

ізосаліпурпозидом (2).

118

згідно методики, описаної у монографії ДФУ Нагідок квітки [94], вміст суми

флавоноїдів розраховували у перерахунку на гіперозид. Для розрахунків

використовували питомий показник поглинання, який в умовах даної

методики становить 500.

Диференціальні електронні спектри комплексу алюміній хлориду з

флавоноїдами моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракту густого

характеризуються наявністю максимуму поглинання при 425±5 нм. (рис.

4.40).

Рис. 4.40 - Диференціальні електронні спектри поглинання в умовах

кількісного визначення флавоноїдів: 1 – моркви дикої плодів та нагідок

квіток екстракту густого с. 10512, 2 – моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого с.300512.

4.7. Валідація методик ідентифікації і кількісного визначення цмину

піщного квіток екстракту сухого та моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого.

Для доказу придатності розроблених методик було проведено їх

валідацію. Вибір та розрахунок валідаційних характеристик проводили згідно

вимог ДФУ [92].

Методика ідентифікації ізосаліпурпозиду та апігенін-7-глюкозиду у

цмину піщаного квіток екстракті сухому методом ТШХ.

119

Випробовуваний розчин. 0,05 г субстанції розчиняють в 10 мл

метанолу Р .

Розчин порівняння. 2,5 мг апігенін-7-глюкозиду Р, 5 мг

ізосаліпурпозиду Р розчиняють в 10 мл метанолу Р.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 з товщиною

шару 0,25 мм наносять у вигляді смуги довжиною 10 мм, 20 мкл

випробовуваного розчину і 10 мкл розчину порівняння. Пластинку сушать на

повітрі протягом 10 хв, поміщають в камеру з сумішшю розчинників:

мурашина кислота безводна Р - вода Р - етилацетат Р (10:10:80) і

хроматографують висхідним методом. Коли фронт розчинників пройде 12 см

від лінії старту, пластинку виймають з камери, сушать протягом 10 хв у

витяжній шафі, після чого - в сушильній шафі при температурі від 100 ºС до

105 ºС протягом 10 хв і обприскують гарячу пластинку розчином 10 г/л

дифенілборной кислоти аміноетиловим ефіром Р в метанолі Р. Сушать

протягом 10 хв у витяжній шафі і обприскують розчином 50 г/л макрогола

400 Р в метанолі Р, знову сушать у витяжній шафі протягом 30 хв і

переглядають в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм.

На хроматограмі розчину порівняння повинні виявлятися: в середній

частині пластинки – жовто-зелена флуоресціююча зона (апігенін-7-

глюкозид), вище неї – коричнева зона (ізосаліпурпозид).

На хроматограмі випробовуваного розчину мають виявлятися зони, що

відповідають за забавленням та значенням Rf зоні апігенін-7-глюкозиду та

ізосаліпурпозиду на хроматограмі розчину порівняння. Крім основних зон, на

хроматограмі випробовуваного розчину допускається наявність інших зон.

Придатність хроматографічної системи підтверджували наявністю двох

зон на хроматограмі розчину порівняння (а): в середній частині – жовто

зелена флуоресціююча зона апігенін-7-глюкозиду на рівні зони розчину

порівняння (с); вище неї - коричнева зона ізосаліпурпозиду на рівні зони

розчину порівняння (b). Розчин порівняння (b) готували шляхом розчинення

5 мг ізосаліпурпозиду Р в 10 мл метанолу Р. Розчин порівняння (с) готували

шляхом розчинення 2,5 мг апігенін-7-глюкозиду Р в 10 мл метанолу Р.

120

Результати випробувань представлені на рис. 4.41. Як видно з рисунку 4.41 і

таблиці 4.13 вимоги до придатності хроматографічної системи виконані,

максимальна різниця величин Rf зон, які відповідають розчину порівняння

(а), розчину порівняння (b) і розчину порівняння (с) в межах однієї

пластинки, не перевищуює 0,02 одиниці Rf.

Таблиця 4.13

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації флавоноїдів

цмину піщаного квіток екстракту сухого

Хроматограма розчину

порівняння (а)

Хроматограма

розчину

порівняння (b)

Хроматограа розчину

порівняння (с)

Δ Rf

Rf Забарвлення

зон Rf

Забарвлення

зон Rf

Забарвлення

зон

0,475 Жовто-

зелене - - 0,475 Жовто-зелене 0

0,575 Коричневе 0,575 Коричневе - - 0

Специфічність методики визначали шляхом хроматографування

трьох серій випробовуваного розчину та розчину порівняння, при цьому на

хроматограмах випробовуваних розчинів повинні бути жовто-зелені

флуоресціюючі зони апігенін-7-глюкозиду, вище неї - коричнева зона

ізосаліпурпозиду на рівні зони розчин на хроматограмі розчину порівняння

після обприскування їх 50 г/л макрогола 400 Р в метанолі Р (рис. 4.42). За

оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на хроматограмі

випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину порівняння (а) в

межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf, отже, методика

відповідає критеріям прийнятності (табл. 4.14).

121

1 2 3 1 2 3 4

Рис. 4.41. Хроматограма,

отримана в при ідентифікації

флавоноїдів для: 1- розчину

порівняння (а) (апігенін-7-

глюкозид, ізосаліпурпозид знизу

–догори), 2- розчину порівняння

(в) (ізосаліпурпозид), 3 – розчину

порівняння (с), (апігенін-7-

глюкозид).

Рис. 4.42. Хроматограма,

отримана в при ідентифікації

флавоноїдів для: 1 - розчину

порівняння (апігенін-7-глюкозид,

ізосаліпурпозид знизу –догори), 2 -

випробовуваного розчину цмину

піщаного квіток екстракту сухого, с

11011, 3 - випробовуваного розчину

цмину піщаного квіток екстракту

сухого, с 101012, 4 - випробовуваного

розчину цмину піщаного квіток

екстракту сухого , с 81012.

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину

порівняння (а) в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf,

отже, методика відповідає критеріям прийнятності (табл. 4.14)

122

В межах визначення специфічності методики визначали стійкість

розчинів в часі, а саме, хроматографували свіжоприготовлений та витримані в

часі (30 хв, 60 хв) випробовувані розчини і розчин порівняння (рис. 4.43).

1 2 3 4 І) 1 5 6 7 ІІ) 1 5 6 7

Рис. 4.43. Хроматограма, отримана в при ідентифікації флавоноїдів

цмину піщаного квіток екстракту сухого для: 1 - розчину порівняння

(апігенін-7-глюкозид, ізосаліпурпозид знизу – догори), 2 - випробовуваного

розчину свіжопригованого, 3 - випробовуваного розчину, витриманого в часі

протягом 30 хв, 4 – випробовуваного розчину, витриманого в часі протягом 60

хв, 5 - хроматограма випробовуваного розчину, с 11011, 6 - хроматограма

випробовуваного розчину, с 101012, 7 -хроматограма випробовуваного

розчину, с 81012, І) + 2 % абсолютних (10:12:80), ІІ) - 2 % абсолютних

(10:8:80).

Візуальна оцінка зон за розміром та інтенсивністю забарвлення в усіх

випробовуваних розчинах дає можливість стверджувати про стійкість

розчинів в часі.

При проведенні валідації вивчено стабільність хроматографічної

системи, а саме хроматографували випробовувані розчини та розчин

123

порівняння у різних системах з варіювання вмісту води, як мінорного

компонента, на + 2% абсолютних (10:12:80) та на - 2% абсолютних

(10:8:80). Результати випробувань представлені на рис. 4.43.

Таблиця 4.14

Результати специфічності методики ідентифікації флавоноїдів в цмину

піщаного квіток екстракті сухому

Зони

розчину

порівняння

Зони

випробовува

ного розчину

с. 11011

ΔRf

Зони

випробовув

аного

розчину

с. 101012

ΔRf

Зони

випробовува

ного розчину

с. 81012

ΔRf

Значе

ння Rf

0,49 0,49 0 0,49 0 0,48 0,01

0,57 0,58 0,01 0,57 0 0,57 0

забарв

лення

зони

Жовто-

зелене

Жовто-

зелене

- Жовто-

зелене

- Жовто-

зелене

-

Коричневе Коричневе - Коричневе - Коричневе -

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину

порівняння (а) в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf,

отже, хроматографічна система стабільна. Таким чином, досліджені

валідаційні характеристики (специфічність, придатність хроматографічної

системи та стійкість хроматографічної системи) методики ідентифікації

апігенін-7-глюкозиду та ізосаліпурпозиду в цмину піщаного квіток

екстракті сухому відповідають критеріям прийнятності.

Методика кількісного визначення флавоноїдів у цмину піщаного квіток

екстракті сухому.

Вихідний розчин 1. 0,020 г розтертої в порошок субстанції розчиняють в

етанолі Р і доводять об'єм розчину тим же розчинником до 50,0 мл.

124

Випробовуваний розчин. До 2,0 мл вихідного розчину 1 додають 5,0 мл

розчину 50 г /л алюміній хлориду Р в етанолі Р, доводять об'єм розчину

етанолом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 1. 2,0 мл вихідного розчину 1 доводять

етанолом Р до 25,0 мл.

Вихідний розчин 2. 0,020 г СЗ ізосаліпурпозиду, висушеного до постійної

маси при температурі 100-105°С, розчиняють в етанолі Р, доводять об'єм

розчину тим же розчинником до 200,0 мл.

Розчин порівняння. До 2,0 мл вихідного розчину 2 додають 5,0 мл

розчину 50 г/л алюміній хлориду Р в етанолі Р, доводять об'єм розчину

етанолом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 2. 2,0 мл вихідного розчину 2 доводять

етанолом Р до 25,0 мл.

Через 30 хв після приготування записують спектр випробовуваного

розчину відносно компенсаційного розчину 1 в діапазоні від 350 нм до 500

нм (ДФУ, 2.2.25) і вимірюють оптичну густину випробуваного розчину в

максимумі поглинання (максимум повинен знаходитися в діапазоні (418 ± 5)

нм). Паралельно записують спектр розчину порівняння щодо

компенсаційного розчину 2 і вимірюють оптичну густину в максимумі.

Вміст суми флавоноїдів (Х) (в г), в перерахунку на ізосаліпурпозид і

суху речовину, розраховують за формулою:

WmA

mAX

100

25

0

0 (4.1)

А - оптична густина випробовуваного розчину;

А0 - оптична густина розчину порівняння;

m - маса наважки субстанції, в грамах;

m0 - маса наважки СЗ ізосалпурпузиду, в грамах;

W - втрата в масі при висушуванні, у відсотках.

125

Розрахунок валідаційних характеристик проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність.

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю на спектрі випробовуваного розчину, максимуму

поглинання при довжині хвилі 418 ± 5 нм. Хід та положення максимуму

поглинання випробовуваних розчинів екстракту сухого цмину пісчаного

співпали з положенням максимуму поглинання розчину порівняння

ізосаліпурпозиду (рис. 4.44).

Рисунок 4.44 - Диференціальний електронний спектр поглинання

комплексу алюміній хлориду з: флавоноїдами цмину піщаного квіток

екстракту сухого (1) та ізосаліпурпозидом (стандартним зразком) (2)

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення флавоноїдів повинен

охоплювати концентрацію від 20 до 180 % відповідно до вимог ДФУ для

випробування “Кількісне визначення” із врахуванням декларованого вмісту

флавоноїдів у екстракті. Дана характеристика вивчалася при дослідженні

лінійності, правильності та прецизійності.

126

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 20 до 180 % від середнього вмісту

суми флавоноїдів в перерахунку на ізосаліпурпозид. Відібрані аліквоти

розчинів зважували на аналітичних вагах для точнішого переведення у

нормалізовані координати (табл. Ф. 1). На основі визначення оптичних

густин розчинів з точно відомою концентрацією будували графік залежності

оптичної густини від концентрації флавоноїдів у нормалізованих

координатах, та розраховували параметри лінійності (табл. Ф. 2).

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,9998, залишкове стандартне

відхилення становить 0,825. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Ф. 1). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Ф. 3).

Дослідження прецизійності (збіжності). На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці Ф. 3, можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При вивченні робасності методики було досліджено вплив кількостей

алюміній хлориду на утворення фотометрованої сполуки флавоноїдів з

алюміній хлоридом та стійкість розчинів в часі В результаті проведених

досліджень встановлено, що відхилення ± 0,5 мл розчину алюміній хлориду

не впливає на результати випробувань, стійкість розчинів підтверджена

протягом 60 хв (табл. 4.15).

127

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення суми флавоноїдів у екстракті сухому цмину піщаного

відповідає критеріям специфічності, робасності, лінійності, правильності та

прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

Таблиця 4.15

Результати дослідження робасності методики кількісного

визначення суми флавоноїдів в цмину піщаного квіток екстракті

сухому

Досліджуваний фактор Оптична

густина , А δ, % Вимоги Висновки

Об’єм реактиву

алюміній хлориду

Р, мл

4,5 0,591 0,17

≤ 1.6

Відповідає

5,0 0,592 - Відповідає

5,5 0,594 0,34 Відповідає

Час

комплексоутворе

ння, хв

25 0,529 0 Відповідає

30 0,529 - Відповідає

60 0,530 0,19 Відповідає

Методика ідентифікації лютеоліну, хлорогенової кислоти та рутину у

моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому.

Випробовуваний розчин. 0,20 г субстанції розчиняють в 10 мл

метанолу Р за допомогою магнітної мішалки і фільтрують через фільтр з

діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння. 2,5 мг лютеоліну Р, 1 мг хлорогенової кислоти Р і

2,5 мг рутину Р розчиняють в 10 мл метанолу Р.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 з товщиною

шару 0,25 мм наносять у вигляді смуги довжиною 10 мм, 20 мкл

випробовуваного розчину і 10 мкл розчину порівняння. Пластинку сушать на

повітрі протягом 10 хв, поміщають в камеру з сумішшю розчинників:

мурашина кислота безводна Р - вода Р - етилацетат Р (10:10:80) і

хроматографують висхідним методом. Коли фронт розчинників пройде 12 см

від лінії старту, пластинку виймають з камери, сушать протягом 10 хв у

витяжній шафі, після чого - в сушильній шафі при температурі 100 ºС –

128

105 ºС протягом 10 хв і обприскують гарячу пластинку розчином 10 г / л

аміноетиловим ефіром дифенілборної кислоти Р в метанолі Р. Сушать

протягом 10 хв у витяжній шафі і обприскують розчином 50 г / л макроголу

400 Р в метанолі Р, знову сушать у витяжній шафі протягом 30 хв і

переглядають в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм.

На хроматограмі розчину порівняння повинні виявлятися: у нижній

частині - жовтувато-оранжева флуоресціююча зона (рутин), в середній

частині - блакитна флуоресціююча зона (хлорогенова кислота), у верхній

частині - жовта флуоресціююча зона (лютеолін).

Придатність хроматографічної системи підтверджували наявністю трьох

зон на хроматограмі розчину порівняння (а): в нижній частині жовто-

оранжева флуоресціююча зона рутину на рівні зони на хроматограмі розчину

порівняння (d), в середній частині – голуба флуорисціююча зона кислоти

хлорогенової на рівні зони на хроматограмі розчину порівняння (с) і у

верхній частині – жовта флуорисціююча зона лютеоліну на хроматограмі

розчину порівняння (b). Розчин порівняння (b) готували шляхом розчинення

2,5 мг лютеоліну Р в 10 мл метанолу Р. Розчин порівняння (с) готували

шляхом розчинення 1,0 мг хлорогенової кислоти Р в 10 мл метанолу Р.

Розчин порівняння (d) готували шляхом розчинення 2,5 мг рутину Р в 10 мл

метанолу Р. Результати випробувань представлені на рис. 4.46.

Як видно з рисунку 4.45 та таблиці 4.16, вимоги до придатності

хроматографічної системи виконані, максимальна різниця величин Rf зон,

які відповідають розчину порівняння (а), розчину порівняння (b), розчину

порівняння (с) розчину порівняння (d) в межах однієї пластинки, не

перевищуює 0,02 одиниці Rf.

Специфічність методики визначали шляхом хроматографування

трьох серій випробовуваного розчину та розчину порівняння, при цьому на

хроматограмах випробовуваних розчинів повинні бути жовто- оранжева

флуоресціююча зона рутину, вище неї – голуба зона хлорогенової кислоти,

у верхній частині пластики жовта зона лютеоліну на рівні відповідних зон

на хроматограмі розчину порівняння після обприскування їх 50 г/л

129

макроголу 400 Р в метанолі Р (рис. 4.46).

1 2 3 4 1 5 6 7

Рис. 4.45. Хроматограма,

отримана в при ідентифікації

флавоноїдів густого екстракту

для: 1- розчину порівняння (а)

(рутин, хлорогенова кислота,

лютеолін, знизу – догори), 2-

розчину порівняння (в)

(лютеолін), 3 – розчину

порівняння (с) (хлорогенова

кислота), 4 - розчин порівняння

(d) (рутин)

Рис. 4.46. Хроматограма, отримана в

при ідентифікації флавоноїдів для: 1

- розчину порівняння (рутин,

хлорогенова кислота, лютеолін,

знизу – догори), 5 - випробовуваного

розчину екстракту густого, с 10512, 6

- випробовуваного розчину

екстракту густого, с 10512-1, 7 -

випробовуваного розчину екстракту

густого, с 300512

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину

порівняння (а) в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf,

отже, методика відповідає критеріям прийнятності (табл. 4.17).

130

В межах визначення специфічності методики визначали стійкість

розчинів в часі, а саме, хроматографували свіжоприготовлений та витримані

в часі (30 хв, 60 хв) випробовувані розчини і розчин порівняння (рис. 4.47).

Таблиця 4.16

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації флавоноїдів

в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

Хроматограма

розчину

порівняння (а)

Хроматограма

розчину

порівняння (b)

Хроматограа

розчину

порівняння (с)

Хроматограма

розчину

порівняння (d)

Rf Забарвленн

я зон Rf

Забарвлен

ня зон Rf

Забарвлен

ня зон Rf

Забарвленн

я зон

0,18 Жовто-

оранжеве - - - - 0,18

Жовто-

оранжеве

0,32 Голубе - - 0,32 Голубе

0,85 Жовте 0,85 Жовте - -

Таблиця 4.17

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації флавоноїдів

в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

Зони

розчину

порівняння

Зони

випробовуван

ого розчину

с. 10512

ΔRf

Зони

випробовуван

ого розчину

с. 10512-1

ΔRf

Зони

випробовува

ного розчину

с. 300512

ΔRf

Значе

ння Rf

0,18 0,17 0,01 0,18 0 0,18 0

0,32 0,31 0,01 0,32 0 0,31 0,01

0,85 0,85 0 0,85 0 0,84 0,01

Забарв

лення

зон

Жовто-

оранжеве

Жовто-

оранжеве

- Жовто-

оранжеве

- Жовто-

оранжеве

-

Голубе Голубе - Голубе - Голубе -

Жовте Жовте Жовте Жовте

131

1 2 3 4 І 1 5 6 7 ІІ 1 5 6 7

Рис. 4.47. Хроматограма, отримана в при ідентифікації флавоноїдів

моркви дикої плодів та нагідок ківток екстракту густого для: 1 - розчину

порівняння (рутин, хлорогенова кислота, лютеолін, знизу – догори), 2 -

випробовуваного розчину свіжопригованого, 3 - випробовуваного розчину,

витриманого в часі протягом 30 хв, 4 – випробовуваного розчину,

витриманого в часі протягом 60 хв, 5 - хроматограма випробовуваного

розчину, с 10512, 6 - хроматограма випробовуваного розчину, с 10512-1, 7 -

хроматограма випробовуваного розчину, с 300512, І) + 2 % абсолютних

(10:12:80), ІІ) - 2 % абсолютних (10:8:80).

Візуальне оцінювання зон за розміром та інтенсивністю забарвлення

в усіх випробовуваних розчинах дає можливість стверджувати про

стійкість розчинів в часі.

При проведенні валідації вивчено стабільність хроматографічної

системи, а саме хроматографували випробовувані розчини та розчин

порівняння у різних системах з варіювання вмісту води, як мінорного

компонента, на + 2% абсолютних (10:12:80) та на - 2% абсолютних

(10:8:80). Результати випробувань представлені на рис. 4.47.

132

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину

порівняння (а) в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf, отже,

хроматографічна система стабільна.

Таким чином, досліджені валідаційні характеристики (специфічність,

придатність хроматографічної системи та стійкість хроматографічної

системи) методики ідентифікації рутину, хлорогенової кислоти та

лютеоліну в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

відповідають критеріям прийнятності.

Методика ідентифікації скополетину у моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракті густому.

Випробовуваний розчин. 0,20 г субстанції розчиняють в 10 мл метанолу

Р за допомогою магнітної мішалки і фільтрують через фільтр з діаметром пор

не більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння. 2,5 мг скополетину Р розчиняють в 10 мл

метанолу Р.

Рухома фаза: верхній шар сумішші розчинників кислота оцтова

розведена Р : ефір Р : толуол Р (10:50:50).

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 з товщиною

шару 0,25 мм наносять у вигляді смуги довжиною 10 мм, 20 мкл

випробовуваного розчину і 10 мкл розчину порівняння. Пластинку сушать на

повітрі протягом 10 хв, поміщають в камеру з рухомою фазою і

хроматографують двічі висхідним методом, фронт розчинників - 12 см від

лінії старту. Пластинку сушать на пвітрі протягом 10 хв і обприскують 2М

розчином калій гідроксиду спиртового Р. Переглядають в УФ-світлі при

довжині хвилі 365 нм.

На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися зона на рівні

зони на хроматограмі розчину порівняння голубої флуоресценції

(скополетин).

133

Придатність хроматографічної системи підтверджували наявністю чітко

розділених зон на хроматограмі розчину порівняння: в середній частині –

голубі флуорисціюючі зони ескуліну та скополетину, вище голуба

флюрисціююча зона умбеліферону, у верхній частині – 7-метоксикумарину

(рис. 4.49). Як видно з рисунку 4.48, та таблиці 4.18 дана хроматографічна

система дозволяє розділити кумарини, що продемонстровано на

хроматограмі розчину порівняння.

Специфічність методики визначали шляхом хроматографування

трьох серій випробовуваного розчину та розчину порівняння, при цьому на

хроматограмах випробовуваних розчинів повинна бути зона голубої

флуорисценціїї на рівні зони скополетину після обприскування їх 2М

розчином калій гідроксиду спиртового Р (рис. 4.49). В межах визначення

специфічності методики визначали стійкість розчинів в часі, а саме,

хроматографували свіжоприготовлений та витримані в часі (30 хв, 60 хв)

випробовувані розчини і розчин порівняння. Візуальне оцінювання зон за

розміром та інтенсивністю забарвлення в усіх випробовуваних розчинах

дає можливість стверджувати про стійкість розчинів в часі. Результати

представлені на хроматограмі рис. 4.48 та у таблиці 4.19.

Таблиця 4.18

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації скополетину

в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

Хроматограма

розчину

порівняння

Хроматограма

розчину

порівняння (1)

Хроматограа

розчину

порівняння (2)

Хроматограма

розчину

порівняння (3)

Хроматограма

розчину

порівняння (4)

Rf Забарвле

ння зон Rf

Забарвле

ння зон Rf

Забарвле

ння зон Rf

Забарвле

ння зон Rf

Забарвле

ння зон

0,42 Голубе 0,42 Голубе - - - - - -

0,54 Голубе - - - - - - 0,54 Голубе

0,68 Голубе - - - - 0,68 Голубе - -

0,85 Голубе - - 0,85 Голубе - - - -

134

1 2 3 4 5 6 7 8 8 9 10 11

Рис. 4.48. Хроматограма, отримана при ідентифікації скополетину в

моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому для: 1 - розчин

порівняння ескуліну, 2 – розчин порівняння 7-метоксикумарину, 3 – розчин

порівняння умбеліферону, 4 – розчин порівняння скополетину, 5 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 10512, 6 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 10512-1, 7 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 300512, 8 – розчину

порівняння, 9 - випробовуваного розчину свіжопригованого, 10 -

випробовуваного розчину, витриманого в часі протягом 30 хв, 11 -

випробовуваного розчину, витриманого в часі протягом 60 хв.

Таким чином, досліджені валідаційні характеристики (специфічність,

придатність хроматографічної системи) методики ідентифікації

скополетину в комплексному густому екстракті моркви дикої плодів та

нагідок квіток відповідають критеріям прийнятності.

135

Таблиця 4.19

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації скополетину

в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

Зона

розчину

порівнянн

я

Зони

випробовуваног

о розчину

с. 10512

ΔRf

Зони

випробовув

аного

розчину

с. 10512-1

ΔRf

Зони

випробовува

ного розчину

с. 300512

ΔRf

Значення

Rf

0,54 0,55 0,01 0,54 0 0,54 0

Забарвле

ння зон

Голубе Голубе - Голубе - Голубе -

Методика ідентифікації календулозидів у моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракті густому.

Випробовуваний розчин. 0,5 г екстракту розчиняють в 5 мл води Р,

фільтрують крізь паперовий фільтр. Осад на фільтрі промивають змивають

5,0 мл метанолу Р. Використовують одержаний метанольний фільтрат.

Розчин порівняння. До 5,0 мг ФСЗ ДФУ календулозидів додають 5 мл

метанолу Р, перемішують, витримують і використовують надосадову рідину.

На лінію старту хроматографічної пластинки Merсk Silica gel F254

наносять у вигляді смуг довжиною 10 мм 20 мкл випробовуваного розчину та

20 мкл розчину порівняння. Пластинку сушать на повітрі протягом 10 хв,

потім поміщають у камеру з сумішшю розчинників: хлороформ Р – кислота

оцтова льодяна Р – метанол Р – вода Р (35:16:6:4) і хроматографують

висхідним способом. Коли фронт розчинників пройде 10 см від лінії старту,

пластинку виймають з камери, сушать протягом 10 хв у витяжній шафі

обприскують розчином анісового альдегіду Р, витримують у сушильній шафі

при температурі 100 – 105 ºС і переглядають при денному світлі. На

хроматограмі розчину порівняння у середній частині мають виявлятися дві

основні чітко розділені зони синьо-фіолетового кольору. На хроматограмі

випробовуваного розчину має виявлятися не менше двох чітко розділених зон

синьо-фіолетового кольору на рівні відповідних зон на хроматограмі розчину

136

порівняння (календулозиди).

Придатність хроматографічної системи підтверджували наявністю чітко

розділених зон на хроматограмі розчину порівняння у середній частині мають

виявлятися дві основні чітко розділені зони синьо-фіолетового кольору. Як

видно з рисунку 4.49 хроматографічна система дозволяє розділити

календулозиди, що продемонстровано на хроматограмі розчину порівняння.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4.49. Хроматограм, отримана при ідентифікації календулозидів в

нагідок квіток та моркви дикої плодів екстракті густому для: 1 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 10512, 2 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 10512-1, 3 -

випробовуваного розчину комплексного екстракту с 300512, 4 -

випробовуваного розчину свіжопригованого, 5 - випробовуваного розчину,

витриманого в часі протягом 30 хв, 6 - випробовуваного розчину,

витриманого в часі протягом 60 хв, 7 - розчину порівняння календулозидів.

Специфічність методики визначали шляхом хроматографування трьох

серій випробовуваного розчину та розчину порівняння, при цьому на

хроматограмах випробовуваних розчинів мають виявлятися не менше двох

чітко розділених зон синьо-фіолетового кольору на рівні відповідних зон на

137

хроматограмі розчину порівняння календулозидів (рис. 4.49, табл. 4.20).

В межах визначення специфічності методики визначали стійкість

розчинів в часі, а саме, хроматографували свіжоприготовлений та витримані

в часі (30 хв, 60 хв) випробовувані розчини і розчин порівняння (рис. 4.49).

Візуальне оцінювання зон за розміром та інтенсивністю забарвлення в

усіх випробовуваних розчинах дає можливість стверджувати про стійкість

розчинів в часі.

Таблиця 4.20

Результати вивчення специфічності методики ідентифікації

календулозидів в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті

густому

Зона

розчину

порівняння

Зони

випробовуван

ого розчину

с. 10512

ΔRf

Зони

випробовув

аного

розчину

с. 10512-1

ΔRf

Зони

випробовува

ного розчину

с. 300512

ΔRf

Значення

Rf

0,15 0,15 0,01 0,15 0 0,15 0

0,24 0,24 0,24 0,24

Забарвле

ння зон

Синьо-

фіолетове

Синьо -

фіолетове

- Синьо -

фіолетове

- Синьо -

фіолетове

-

Синьо -

фіолетове

Синьо -

фіолетове

Синьо -

фіолетове

Синьо -

фіолетове

Таким чином, досліджені валідаційні характеристики (специфічність,

придатність хроматографічної системи) методики ідентифікації

скополетину в комплексному моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракті густому відповідають критеріям прийнятності.

Методика кількісного визначення флавоноїдів у моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракті густому.

Вихідний розчин. 0,200 г екстракту поміщають у круглодонну колбу,

додають 1,0 мл розчину гексаметилентетраміну Р (5 г/л), 7,0 мл кислоти

хлористоводневої Р1 і 20 мл ацетону Р, кип’ятять зі зворотним

138

холодильником протягом 30 хв, охолоджують і кількісно з допомогою

ацетону Р переносять рідину у мірну колбу місткістю 50 мл, промивають

колбу ацетоном Р і доводять ацетоном Р до мітки.

20,0 мл одержаного розчину поміщають у ділильну лійку місткістю 100

мл, додають 20 мл води Р і 15 мл етилацетату Р, струшують протягом 15 хв.

Після розділення шарів, нижній (водний) шар зливають у конічну колбу

місткістю 50 мл, а верхній (органічний) зливають у конічну колбу місткістю

100 мл і закривають корком. Екстракцію з водного шару повторюють ще 3

рази по 10 мл етилацетату Р за вказаних вище умов. Об’єднані етилацетатні

витяги кількісно, за допомогою 25 мл води Р, переносять назад у ділильну

лійку і струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл і 50 мл, відповідно, протягом 5

хв. Етилацетатні витяги фільтрують через фільтр “біла стрічка” з 10 г натрію

сульфату безводного Р, попередньо змоченого етилацетатом Р, у мірну

колбу місткістю 50 мл. Ділильну лійку і фільтр промивають 10 мл

етилацетату Р і доводять вміст в мірній колбі до мітки тим самим

розчинником.

Випробовуваний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають 1 мл реактиву алюміній хлориду Р і доводять

до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Компенсаційний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, доводять до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Через 30 хв знімають спектр випробовуваного розчину у діапазоні від

370 нм до 520 нм і вимірюють оптичну густину у максимумі поглинання за

довжини хвилі 425 ± 5 нм, відносно компенсаційного розчину.

Вміст суми флавоноїдів (Х) у 1 г екстракту, в перерахунку на

гіперозид і суху речовину, розраховують за формулою:

1 50 50 25 100 0,625

500 100 20 10 (100 ) (100 )

A АX

m W m W

, (4.2)

де: А – оптична густина випробовуваного розчину;

139

500 – питомий показник поглинання комплексу гіперозиду з алюміній

хлоридом при довжині хвилі 425 нм;

m – маса наважки екстракту, взятої для аналізу,г;

W - втрата в масі при висушуванні, у відсотках.

Розрахунок валідаційних характеристик був проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність [92, 94]. Зважаючи на те,

що пропобідготовка включає триразове екстрагування етилацетатом після

гідролізу, в ході валідації доводли, що вибрана кількість повторів операцій

достатня для повного вилучення, а вибрані кількості доданих реагентів –

достатні для забезпечення повноти протікання реакції.

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю на спектрі випробовуваного розчину, максимум

поглинання при довжині хвилі 425 ± 5 нм. Хід та положення максимуму

поглинання випробовуваних розчинів комплексного екстракту моркви дикої

плодів та нагідок квіток співпали з положенням максимуму поглинання

розчину порівняння гіперозиду в максимумі поглинання при 425 ± 2 нм.

(рис. 4.50.).

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення флавоноїдів повинен

охоплювати концентрацію від 20 до 180 % відповідно до вимог ДФУ для

випробування “Кількісне визначення” із врахуванням декларованого вмісту

флавоноїдів у екстракті. Дана характеристика вивчалася при дослідженні

лінійності, правильності та прецизійності.

140

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 20 до 180 % від середнього вмісту

суми флавоноїдів в перерахунку на гіперозид. Відібрані аліквоти розчинів

зважували на аналітичних вагах для точнішого переведення у нормалізовані

координати (табл. Х. 1). На основі визначення оптичних густин розчинів з

точно відомою концентрацією будували графік залежності оптичної густини

від концентрації флавоноїдів у нормалізованих координатах, та

розраховували параметри лінійності (табл. Х. 2).

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції складав 0,9998, залишкове стандартне

відхилення становило 0,961. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Рис. 4.50. Диференціальні електронні спектри поглинання в умовах

кількісного визначення флавоноїдів: 1 – комплексного густого екстракту с.

10512, 2 –гіперозиду.

141

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Х. 1). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Х. 3).

Дослідження прецизійності (збіжності). На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці Х. 3, можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При вивченні робасності методики було досліджено вплив кількостей

реагентів гексаметилентетраміну, алюміній хлориду та тривалості операцій

кип’ятіння й утворення фотометрованої сполуки флавоноїдів з алюміній

хлоридом. Результати проведених експериментів підтверджують коректність

запропонованої методики (табл. 4.21).

Таблиця 4.21

Результати дослідження робасності методики кількісного

визначення суми флавоноїдів у моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракті густому

Досліджуваний фактор Оптична

густина , А δ, % Вимоги Висновки

Об’єм

гексаметилен-

тетраміну Р, мл

0,9 0,7444 0,67

≤ 1,6%

Відповідає

1,0 0,7494 - Відповідає

1,1 0,7507 0,17 Відповідає

Час кип’ятіння,

хв.

25 0,5789 0 Відповідає

30 0,5790 - Відповідає

35 0,5821 0,54 Відповідає

Об’єм

хлористоводнево

ї кислоти Р1, мл

6,0 0,5659 1,01 Відповідає

7,0 0,5717 - Відповідає

8,0 0,5725 0,14 Відповідає

Об’єм реактиву

алюміній хлориду

Р, мл

0,9 0,7510 0,64 Відповідає

1,0 0,7558 - Відповідає

1,1 0,7591 0,44 Відповідає

Час

комплексоутворе

ння, хв

25 0,5771 0,12 Відповідає

30 0,5764 - Відповідає

45 0,5768 0,07 Відповідає

142

Для доказу ефективності екстрагування агліконів етилацетатом після

гідролізу проводили ще одну додаткову операцію вилучення. Відповідне

етилацетатне вилучення обробляли в умовах кількісного визначення,

аналогічно випробовуваному розчину. На спектрах розчину з алюміній

хлоридом максимум поглинання в області (425 ± 5) нм не спостерігався, що

доводить повноту вилучення флавоноїдів з розчину запропонованою

кількістю етилацетату.

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення суми флавоноїдів у моркви дикої плодів та нагідок

квіток екстракті густому відповідає критеріям специфічності, робасності,

лінійності, правильності та прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні

застосування методики.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено склад і вміст біологічно активних речовин

(гідроксикоричні кислоти, флавоноїди) у ЛРС та сухому екстракті цмину

піщаного квіток. Встановлено, що при ідентифікації сировини

ідентифікаційними маркерами слід обрати ізосаліпурпозид та апігенін -7-

глюкозид. Кількісним критерієм якості ЛРС запропоновано встановити

сумарний вміст флавоноїдів, який повинен бути не меншим 1,0 % в

перерахунку на ізосаліпурпозид та суху речовину. Кількісним критерієм

якості цмину піщаного квіток екстракту сухого запропоновано також

сумарний вміст флавоноїдів, який повинен бути від 20 до 40 % в перерахунку

на ізосаліпурпозид та суху речовину.

2. Вивчено вміст біологічно активних речовин у ЛРС нагідок квіток.

Хроматографічними (ТШХ, ВЕРХ) і спектрофотометричними методами

досліджено поліфенольний склад нагідок квіток. Встановлено, що зразки

сировини характеризуються наявністю різних представників флавоноїдів

(рутин, гіперозид, лютеолін-7-глюкозид, мірцетин, кемферол) та

фенолкарбонових кислот (хлорогенова, розмаринова, кофейна, цикорієва).

143

Методами ТШХ та ВЕРХ у ЛРС квітках нагідок доведено наявність

календулозидів. Кількісним критерієм сировини запропоновано визначення

вмісту флавоноїдів, яких повинно бути не менше 0,4 % в перерахунку на

гіперозид.

3. Проведено фітохімічне вивчення складу і вмісту біологічно

активних речовин у ЛРС плодів моркви дикої, зібраних у західних регіонах

України та Криму. Хроматографічними (ТШХ, ВЕРХ) і

спектрофотометричними методами досліджено флавоноїдний склад

сировини (лютеолін-7-глюкозид, апігенін-7-глюкозид, гіперозид, лютеолін),

гідроксикоричні кислоти (розмаринова, у кримських зразках – хлорогенова,

кофейна та ферулова) і встановлено, що головним і характеристичним

представником флавоноїдів із західного регіону є лютеолін і його 7-

глюкозид. Методом газової хроматографії досліджено склад ефірних олій у

плодах моркви дикої, зібраних у Західному регіоні України та Криму.

Встановлено, що у зразках, зібраних у Криму основними компонентами були

пінен, феландрен, гераніолу ацетат та гераніол. Їх вміст склада 78 % від

загального вмісту ефірних олій, у зразках, зібраних у Західному регіоні

України, основними компонентами були пінен, феландрен, каріофілен,

мірцен та даукол. Їх вміст складав 70% від загального вмісту ефірних олій.

Кількісним критерієм ЛРС запропоновано встановити вміст флавоноїдів,

яких в ЛРС повинно бути не менше 0,1 % в перерахунку на лютеолін.

4. Проведено фітохімічне вивчення складу і вмісту біологічно

активних речовин у моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому.

Хроматографічними (ТШХ, ВЕРХ) і спектрофотометричними методами

досліджено флавоноїдний склад екстракту (рутин, гіперозод, апігенін-7-

глюкозид, мірецитин, апігенін, кемферол) гідроксикоричні кислоти

(розмаринова, хлорогенова, кофейна та ферулова). Методами ТШХ та ВЕРХ

доведено присутність календулозидів у комплексному екстракті.

Хроматографічними (ТШХ, ВЕРХ) досліджено склад кумаринів (ескулін,

скополетин, умбеліферон, 7-метоксикумарин, 5,7 – дигідрокси – 4 -

метоксикумарин). Маркерами для встановлення тотожності БАР моркви

144

дикої плодів було обрано лютеолін та скополетин, за наявністю кислоти

хлорогенової та календулозидів проводитли ідентифікацію БАР нагідок

квіток у моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому. Кількісним

критерієм для комплексного екстракту моркви дикої плодів та нагідок квіток

запропоновано використовувати вміст флавоноїдів (від 1,0 % до 3,0 % в

перерахунку на гіперозид).

5. Розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення

вмісту флавоноїдів у цмину піщаного квіток екстракті сухому. Вивчено

валідаційні характеристики для методики ідентифікації відповідно до вимог

ДФУ. Проведено валідацію методики кількісного висначення флавоноїдів за

характеристиками: специфічність, лінійність, правильність, прецизійність,

робасність.

6. Розроблено методики ідентифікації скополетину та

календулозидів у моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

методом ТШХ. Вивчено основні валідаційні характеристики для методик

кількісного визначення та ідентифікації, які підтверджують придатність

розроблених методик.

7. Розроблено методики ідентифікації та кількісного вивчення

вмісту флавоноїдів у моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті

густому. Вивчено основні валідаційні характеристики для для методик

кількісного визначення та ідентифікації, які підтверджують придатність

розроблених методик.

145

РОЗДІЛ 5

РОЗРОБКА МЕТОДІВ КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ СЕДАВІТ, ТАБЛЕТОК ТА

ХОЛЕЛЕСАН КАПСУЛ

5.1 Обґрунтування вибору маркерів, розробка та валідація методів контролю

якості «Седавіт» таблеток.

5.1.1. Розробка та валідація методик ідентифікації і кількісного визначення

КГЕ Седавіту у таблетках.

З урахуванням складу БАР у КГЕ Седавіту та розроблених методик для

контролю його якості, для контролю якості «Седавіт» таблеток є доцільним

використовувати ті ж маркери та методи ідентифікації та кількісного

визначення. Тому в якості маркерів, що ідентифікують КГЕ Седавіту у

складі таблеток нами було обрано хлорогенову, кофейну, розмаринову

кислоти та кверцетин. Для ідентифікації валеріани коренів з кореневищами

у готовому лікарському засобі було обрано кислоту ізовалеріанову, як

специфічного компонента коренів валеріани.

Комплексний густий екстракт кількісно характеризується за вмістом

флавоноїдів, відповідно, даний клас сполук було обрано для кількісної

характеристики готового лікарського засобу. Як маркер для розрахунку

вмісту флавоноїдів у таблетках, вибрали рутин. Критерії для мінімального

та максимального вмісту діючих речовин в таблетках розраховували,

виходячи із вмісту досліджуваних компонентів в АФІ та вмісту останніх в

одній таблетці. Згідно проведених розрахунків, вміст суми флавоноїдів має

становити не менше 1,2 мг/табл.

Ідентифікацію компонентів валеріани коренів з кореневищами

проводили методом газової хроматографії на газовому хроматографі “Agilent

6890N” з полуменево-іонізаційним детектором. Тотожність таблеток за

наявністю кислоти ізовалеріанової підтверджували шляхом порівняння часів

146

утримування піків кислоти ізовалеріанової на хроматограмах

випробовуваних розчинів та на хроматограмі розчину порівняння. При

виборі хроматографічної колонки було досліджено характеристики піків

кислоти ізовалеріанової, застосовуючи ряд колонок з макрогол 20000 Р, як

наприклад DB-WAX, НР-WAX. Найкращі значення було отримано на

колонці фірми Agilent, HP-Innowax, 19091N-133.

Ідентифікацію фенольних сполук у таблетках проводили методом

ВЕРХ. Методика ідентифікації була розроблена на основі методик

кількісного визначення флавоноїдів у траві звіробою та ромашки квітах,

описаних у монографії USP [153]. Тотожність таблеток за наявністю

хлорогенової, кофейної, розмаринової кислот та кверцитину підтверджували

шляхом порівняння часів утримування піків на хроматограмах

випробовуваних розчинів та на хроматограмі розчину порівняння.

Кількісний вміст флавоноїдів у таблетках Седавіту визначали методом

спектрофотометрії. У зв’язку з різноманітністю флавоноїдного складу, суму

флавоноїдів у таблетках визначали після попереднього гідролізу

глікозидних форм флавоноїдів до відповідних агліконів. Диференціальний

електронний спектр поглинання комплексу флавоноїдів з алюміній

хлоридом характеризується наявністю максимума поглинання при довжині

хвилі 421 ± 2 нм, що співпадає з максимумом поглинання рутину. Тому

вміст флавоноїдів розраховували у перерахунку на рутин, використовуючи

значення питомого показника поглинання комплексу рутину з алюміній

хлоридом при довжині хвилі 421 нм.

З метою вибору оптимальних умов екстракції флавоноїдів із розтертої в

порошок таблетної маси проводили випробування повноти вилучення при

ультразвуковій обробці суміші та в умовах струшування з розчинниками:

ацетоном та етанолом. (табл. 5.1).

Як видно з результатів дослідження, наведених в таблиці 5.1, найбільш

повне вилучення флавоноїдів із таблетної маси досягається у випадку

використанням ацетону при дії ультразвуку.

147

Таблиця 5.1

Результати дослідження умов виділення флавоноїдів із таблетної маси

«Седавіт» таблеток

Розчинник Умови Вміст флавоноїдів,

мг/табл

Ацетон Обробка в ультразвуковій бані

протягом 5 хв

1,716±0,002

Струшування протягом 5 хв 1,527±0,002

Етанол Обробка в ультразвуковій бані

протягом 5 хв

1,636±0,002

Струшування протягом 5 хв 1,477±0,002

Для визначення тривалості ультразвукової обробки, яка б забезпечила

максимальне вилучення флавоноїдів із таблетної маси, проводили серію

досліджень з різною тривалістю обробки (табл. 5.2).

Аналіз даних, наведених в таблиці 5.2, дає можливість стверджувати

що оптимальною тривалістю ультразвукової обробки є 10 хв, при якій

вилучається максимальна кількість флавоноїдів із таблетної маси.

Таблиця 5.2

Вплив тривалості ультразвукової обробки на вилучення флавоноїдів із

таблетної маси «Седавіт» таблеток

Тривалість ультразвукової

обробки, хв

Вміст флавоноїдів, мг/табл.

5 1,716 ± 0,002

10 1,798 ± 0,002

15 1,786 ± 0,002

Для підтвердження коректності розроблених методик було проведено

їх валідацію. Вибір та розрахунки валідаційних характеристик проводили

згідно вимог ДФУ [92].

148

Ідентифікація хлорогенової, кофейної і розмаринової кислот, та

кверцетину у «Седавіт» таблетках.

Випробовуваний розчин. До 1,0 г розтертої на порошок таблетної

маси додають 15 мл метанолу Р, нагрівають на водяній бані зі зворотним

холодильником протягом 20 хв, охолоджують і фільтрують.

2,0 мл одержаного розчину доводять до 10 мл рухомою фазою А і

фільтрують через фільтр із діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння. 5 мг кверцетину, 2,5 мг кофейної кислоти, 5 мг

хлорогенової кислоти, 5,0 мг розмаринової кислоти розчиняють у метанолі і

доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20,0 мл. 1,0 мл

одержаного розчину доводять до 10 мл рухомою фазою А і фільтрують через

фільтр із діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х

250 мм, заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для

якої виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: 0,6 г натрію дигідрофосфату моногідрату Р

розчиняють у 1000 мл води для хроматографії, доводять рН розчину

кислотою фосфорною Р до 2,5 (потенціометрично; ДФУ, 2.2.3);

- рухома фаза В: ацетонітрил;

- швидкість рухомої фази – 1,0 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 330

- температура колонки 25 0С;

- час хроматографування 60 хв.

Використовували наступну програму градієнту:

Стадія Час, хв Рухома фаза А

(% об/об )

Рухома фаза В

(% об/об )

1 0-30 90 10

2 30-40 90 → 75 10 → 25

3 40-45 75 → 65 25 → 35

149

4 45-50 65→55 35→45

5 50-55 55 → 90 45 → 10

6 55-60 90 10

Хроматографують почергово по 100 мкл розчину порівняння та

випробовуваного розчину.

Порядок виходу піків на хроматограмі розчину порівняння:

хлорогенова кислота, кофейна кислота, розмаринова кислота, кверцетин.

Хроматографічна система вважається придатною, якщо коефіцієнт

розділення піків хлорогенової та кофейної кислоти складає не менше 2,0.

На хроматограмі випробовуваного розчину мають бути присутні піки,

які за часами утримування співпадають з піками хлорогенової, кофейної,

розмаринової кислот та кверцетину на хроматограмі розчину порівняння.

Відповідно до вимог ДФУ [92], для випробувань ідентифікації

необхідно дослідити такі валідаційні характеристики як специфічність та

придатність хроматографічної системи. При проведенні тесту на придатність

хроматографічної системи хроматографували розчин порівняння. З

отриманих хроматограм розраховано коефіцієнт розділення піків

хлорогенової та кофейної кислот, який становив 5,3, що відповідає вимоги

ДФУ. Розраховано ефективність хроматографічної колонки за піками

хлорогенової, кофейної, розмаринової кислот та кверцитину. Отримані

значення для хлорогенової кислоти – 5094, кофейної кислоти – 15083,

розмаринової кислоти - 102791 кверцетин – 159394, відповідали критеріям

прийнятності придатності хроматографічної системи (> 2000).

Специфічність методики підтверджували шляхом порівняння

хроматограм контрольного розчину, розчину порівняння та випробуваного

розчину: на хроматограмі контрольного розчину не повинно бути піків, що

відповідають пікам хлорогенової, кофейної, розмаринової кислот та

кверцитину на хроматограмі розчину порівняння; піки хлорогенової,

кофейної, розмаринової кислот та кверцетину на хроматограмі

випробовуваного розчину (рис. 5.2) мають співпадати за часами утримування

150

із піками хлорогенової, кофейної, розмаринової кислот та кверцетину на

хроматограмі розчину порівняння (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Хроматограма розчину порівняння (хлорогенової, кофейної,

розмаринової кислот та кверцетину)

Рис. 5.2. Хроматограма випробовуваного розчину «Седавіт», таблеток

Таким чином, досліджувані валідаційні характеристики

(специфічність, придатність хроматографічної системи) відповідали

встановленим критеріям прийнятності.

Методика ідентифікації кислоти ізовалеріанової у «Седавіт» таблетках.

Випробовуваний розчин. 2,50 г таблетної маси поміщають у флакон,

додають 5,0 мл етанолу Р, струшують протягом 5 хв, залишають до

осадження нерозчинних часток, декантують і обережно фільтрують

151

надосадову рідину в мірну колбу місткістю 5,0 мл крізь попередньо змочений

етанолом Р фільтр “біла стрічка”, на який поміщено 3,0 г натрію сульфату

безводного Р. Фільтр промивають етанолом Р, об’єднуючи фільтрати, розчин

перемішують і доводять до позначки етанолом Р.

Розчин порівняння. 2,0 мг кислоти ізовалеріанової розчиняють у 10,0 мл

етанолу Р. 1,0 мл отриманого розчину доводять до 10,0 мл етанолом Р.

Контрольний розчин. Етанол Р.

Хроматографування проводять на газовому хроматографі з

полуменево-іонізаційним детектором за таких умов:

- колонка капілярна кварцова довжиною 60 м з внутрішнім діаметром

0,53 мм, внутрішня поверхня якої покрита шаром поліетиленгліколю Р

завтовшки 1 мкм або аналогічна, для якої виконуються умови придатності

хроматографічної системи;

- температуру колонки програмують: початкова температура 80 °С,

потім підвищують температуру до 180 °С зі швидкістю 2°С/хв, витримують

протягом 10 хв, потім підвищують температуру до 230 °С зі швидкістю

25 °С/хв і витримують протягом 12 хв;

- лінійна швидкість газу-носія (гелій для хроматографії Р) – 1,5 мл/хв;

- поділ потоку газу-носія - 1:1;

- температура блока вводу проб – 200 °С;

- температура детектора – 240 °С.

Хроматографують по 1 мкл контрольного розчину, випробовуваного розчину

та розчину порівняння. Порядок виходу піків на хроматограмі розчину

порівняння: етанол, ізовалеріанова кислота.

Придатність хроматографічної системи:

- ефективність хроматографічної колонки розрахована за піком

ізовалеріанової кислоти на хроматограмі розчину порівняння становить не

менше 10000.

На хроматограмі випробовуваного розчину мають бути присутні піки,

які за часами утримування співпадають з піками ізовалеріанової кислоти на

хроматограмі розчину порівняння.

152

При проведенні тесту на придатність хроматографічної системи

хроматографували розчин порівняння та розраховували ефективність

хроматографічної колонки за піком ізовалеріанової кислоти. Встановлено,

що розраховане число теоретичних тарілок (113512) відповідає

запропонованому критерію прийнятності (> 10000).

Специфічність методики підтверджували шляхом порівняння

хроматограм контрольного розчину, розчину порівняння та випробуваного

розчину, тобто, на хроматограмі контрольного розчину неповинно бути піків,

що відповідають пікові ізовалеріанової кислоти на хроматограмі розчину

порівняння; а пік ізовалеріанової кислоти на хроматограмі випробовуваного

розчину (рис. 5.4) має співпадати за часом утримування із піком

ізовалеріанової кислоти на хроматограмі розчину порівняння (рис. 5.3).

Рис. 5.3. Хроматограма розчину порівняння, отримана при ідентифікації

ізовалеріанової кислоти.

Рис. 5.4. Хроматограма випробовуваного розчину «Седавіт» таблеток,

отримана при ідентифікації ізовалеріанової кислоти.

153

Таким чином, досліджувані валідаційні характеристики (специфічність,

придатність хроматографічної системи) відповідають встановленим

критеріям прийнятності.

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів у «Седавіт»

таблетках.

Вихідний розчин. У центрифужну пробірку відважують 3,000 г порошку

розтертої таблетної маси, додають 8,0 мл кислоти хлористоводневої Р 1 і

10 мл ацетону Р. Пробірку поміщають в ультразвукову баню на 10 хв, після

чого центрифугують протягом 5 хв при 5000 об/хв; надосадову рідину

переносять у конічну колбу зі шліфом місткістю 100 мл. Вимивання

проводять ще два рази по 10 мл ацетону Р та 4,0 мл кислоти

хлористоводневої Р 1 за вище вказаних умов. Осад промивають двома

порціями по 5 мл ацетону Р з наступним центрифугуванням та виливанням

надосадової рідини в ту ж саму колбу.

До одержаного розчину додають 1,0 мл розчину

гексаметилентетраміну Р (5 г/л), кип’ятять зі зворотним холодильником

протягом 30 хв, охолоджують і переносять рідину у мірну колбу місткістю

100 мл, промивають колбу ацетоном Р і доводять ацетоном Р до мітки.

25,0 мл одержаного розчину поміщають у ділильну лійку місткістю

100 мл, додають 20 мл води Р і 15 мл етилацетату Р, струшують протягом

15 хв. Після розділення шарів, нижній (водний) шар зливають у конічну

колбу місткістю 50 мл, а верхній (органічний) зливають у конічну колбу

місткістю 100 мл і закривають корком. Екстракцію з водного шару

повторюють ще 2 рази по 15 мл етилацетату Р за вказаних вище умов.

Об’єднані етилацетатні витяги кількісно, за допомогою 25 мл води Р,

переносять назад у ділильну лійку і струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл і

50 мл, відповідно, протягом 5 хв. Етилацетатні витяги фільтрують через

фільтр “біла стрічка” з 5 г натрію сульфату безводного Р, попередньо

змоченого етилацетатом Р, у мірну колбу місткістю 50 мл. Ділильну лійку і

154

фільтр промивають 10 мл етилацетату Р і доводять вміст в мірній колбі до

мітки тим самим розчинником.

Випробовуваний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають 1 мл реактиву алюмінію хлориду Р і доводять

до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Компенсаційний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, доводять до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Через 30 хв записують спектр випробовуваного розчину у діапазоні від

350 нм до 500 нм і вимірюють оптичну густину у максимумі поглинання за

довжини хвилі 421 ± 4 нм, відносно компенсаційного розчину.

Вміст суми флавоноїдів (Х) у 1 таблетці, в перерахунку на рутин, у

грамах, обчислюють за формулою:

(5.1)

де: А – оптична густина випробовуваного розчину;

408 – питомий показник поглинання комплексу рутину з алюміній

хлоридом при довжині хвилі 421 нм;

m – маса наважки таблетної маси, взятої для аналізу, г;

b – середня маса таблетки, г.

Розрахунок валідаційних характеристик було проводено, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

досліджували наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність [92]. Зважаючи на те, що

пропобідготовка включає триразове екстрагування етилацетатом після

гідролізу, в ході валідації доводили, що вибрана кількість повторів операцій

достатня для повного вилучення, а вибрані кількості доданих реагентів –

достатні для забезпечення повноти протікання реакції.

Х = А∙100∙50∙25∙b∙1000

= А∙5∙b

408∙100 m 25∙10 408 m

155

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю на спектрі випробовуваного розчину максимуму

поглинання при довжині хвилі 421 ± 4 нм. Хід та положення максимуму

поглинання випробовуваних розчинів таблеток Седавіт співпадали з

положенням максимуму поглинання розчину порівняння рутину (рис. 5.5),

на спектрі розчину плацебо максимум при довжині хвилі 421 ± 4 нм

відсутній.

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення флавоноїдів повинен

охоплювати концентрацію від 20 до 180 % відповідно до вимог ДФУ для

випробування «Кількісне визначення» із врахуванням декларованого вмісту

флавоноїдів у екстракті. Дана характеристика вивчалася при дослідженні

лінійності, правильності та прецизійності.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 20 до 180 % від середнього вмісту

суми флавоноїдів в перерахунку на рутин. Відібрані аліквоти розчинів

зважували на аналітичних вагах для точнішого переведення у нормалізовані

координати (табл. Ц.1). На основі визначення оптичних густин розчинів з

точно відомою концентрацією будували графік залежності оптичної густини

від концентрації флавоноїдів у нормалізованих координатах, та

розраховували параметри лінійності (табл. Ц.2).

156

Рис. 5.5. Диференціальний електронний спектр поглинання комплексу

флавоноїдів «Седавіт» таблеток (1), та розчину порівняння рутину (2) із

алюміній хлоридом в умовах кількісного визначення

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції був рівний 0,9997, залишкове стандартне

відхилення становило 1,12. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходив практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал a підтверджував статистичну і практичну незначущість

константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Ц.1). Результати проведених досліджень свідчили

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Ц.3).

Дослідження прецизійності (збіжності). Збіжність методики

характеризує ступінь близькості результатів для серії вимірювань за

методикою при її виконанні в одних і тих самих умовах протягом невеликого

проміжку часу. На підставі результатів досліджень, наведених в таблиці Ц.3,

можна зробити висновок про збіжність методики, оскільки жоден з

157

результатів за величиною похибки не вийшов за межі максимально

допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При вивченні робасності методики було досліджено вплив кількостей

реагентів гексаметилентетраміну, алюмінію хлориду та тривалості операцій

кип’ятіння i утворення фотометрованої сполуки флавоноїдів з алюмінію

хлоридом. Результати проведених експериментів підтвердили коректність

запропонованої методики (табл. 5.3).

Таблиця 5.3

Результати дослідження робасності методики кількісного

визначення суми флавоноїдів «Седавіт» таблетках

Досліджуваний фактор Оптична

густина , А δ, % Вимоги Висновки

Об’єм доданого

розчину

гексаметилентет

раміну Р, мл

0,9 0,289 1,5

≤ 1,6%

Відповідає

1,0 0,276 - Відповідає

1,1 0,281 1,4 Відповідає

Час кип’ятіння, хв.

25 0,290 1,2 Відповідає

30 0,282 - Відповідає

35 0,276 1,1 Відповідає

Об’єм доданого

реактиву

алюмінію хлориду

Р, мл

0,9 0,262 1,1 Відповідає

1,0 0,276 - Відповідає

1,1 0,283 1,5 Відповідає

Час

комплексоутворенн

я, хв

25 0,274 0,7 Відповідає

30 0,276 - Відповідає

45 0,273 1,1 Відповідає

Для доказу ефективності вилучення фенольних сполук з таблетної маси

та екстрагування агліконів етилацетатом після гідролізу, проводили ще одну

додаткову операцію вилучення. Вилучення обробляли в умовах кількісного

визначення, аналогічно випробовуваному розчину. На спектрах розчину з

алюміній хлоридом максимум поглинання в області (421 ± 4) нм не

спостерігався, що доводить повноту вилучення флавоноїдів з таблетної маси,

а запропонована кількість етилацетату достатня для екстрагування агліконів з

розчину після гідролізу.

158

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення суми флавоноїдів у «Седавіт» таблетках відповідає

критеріям специфічності, робасності, лінійності, правильності та

прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

5.1.2. Розробка та валідація методик ідентифікації і кількісного визначення

нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у «Седавіт» таблетках.

Ідентифікацію нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду проводили

методом ВЕРХ шляхом порівняння часів утримування піків на

хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння, отриманих

в умовах кількісного визначення.

Кількісне визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду

проводили методом ВЕРХ. Для досягнення повноти вилучення

нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду з таблетної маси застосовували

ультразвук. За результатами (табл. 5.4) оптимальна тривалість обробки

становить 10 хв.

Таблиця 5.4

Вплив тривалості ультразвукової обробки на вилучення нікотинаміду

та піридоксину гідрохлориду з «Седавіт» таблеток

Тривалість

ультразвукової

обробки, хв

Вміст

нікотинаміду,

мг/табл.

Вміст піридоксину

гідрохлориду,

мг/табл.

5 14,2 ±0,2 2,9 ±0,2

10 14,8 ±0,2 3,1 ±0,2

15 14,9 ±0,2 3,0 ±0,2

Вдало підібрані умови хроматографування (тип хроматографічної

колонки, тип нерухомої фази, температура колонки, тощо) забезпечують

можливість одночасного визначення вмісту двох діючих речовин в складі

ГЛЗ, при цьому, детектування нікотинаміду проводили при 260 нм,

159

піридоксину гідрохлориду – 290 нм. Найкраще вимоги до придатності

хроматографічної системи виконувалися на колонці Zorbax SB-Aq (Agilent,

CШA) розміром 4,6 мм х 250 мм заповненій силікагелем

диізопропілсилильним ендкепованим з розміром часток 5 мкм (табл. 5.5).

Розраховані хроматографічні характеристики піків визначуваних речовин

вказують на придатність хроматографічної системи [92].

Таблиця 5.5

Хроматографічні характеристики піків нікотинаміду та піридоксину

гідрохлориду в умовах кількісного визначення на колонці Zorbax SB-

Aq (в умовах, вказаних нижче)

Речовина Час

утримування,

хв

Коефіцієнт

розділення

Коефіцієнт

симетрії

Відносне

стандартне

відхилення

(RSD, %)

Нікотинамід 8,2

11,8

1,2 0,18

Піридоксину

гідрохлорид

13,6 1,4 0,22

Методика кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину

гідрохлориду в таблетках Седавіт.

Розчинник: 0,01 М розчин кислоти хлористоводневої.

Випробовуваний розчин. До 1,300 г порошку розтертих таблеток

поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, додають 70 мл розчинника,

поміщають в ультразвукову баню на 10 хв, доводять до 100,0 мл

розчинником, перемішують і фільтрують через фільтр з діаметром пор не

більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння. 30,0 мг СЗ піридоксину гідрохлориду

розчиняють в розчиннику і доводять ним до 200,0 мл (розчин А). 37,5 мг СЗ

нікотинаміду розчиняють в розчиннику і доводять ним до 50,0 мл (розчин В).

8,0 мл розчину А і 8,0 мл розчину В доводять до 20,0 мл розчинником.

160

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-детектором

в наступних умовах:

- колонка «Zorbax SB-Aq» розміром 250 мм х 4,6 мм, заповнена

силікагелем диізопропілсилильним ендкепованим з розміром частинок

5 мкм;

- рухома фаза: 0,1% (об/об) розчин трифтороцтової кислоти Р;

- швидкість рухомої фази – 0,5 мл/хв.;

- детектування при довжині хвилі 260 нм та 290 нм;

- температура колонки 35 0С.

Хроматографують 10 мкл розчину порівняння при довжині хвилі

290 нм. Порядок виходу піків: нікотинамід, піридоксину гідрохлорид.

Хроматографічна система вважається придатною, якщо коефіцієнт

розділення піків нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду не менше 2,0.

Хроматографують 10 мкл розчину порівняння декілька раз при довжині

хвилі 260 нм та 290 нм. Хроматографічна система вважається придатною,

якщо відносне стандартне відхилення для піку нікотинаміду із хроматограм

отриманих при довжині хвилі 260 нм, і піридоксину гідрохлориду із

хроматограм, отриманих при довжині хвилі 290 нм, відповідає вимогам ДФУ,

діюче видання, 2.2.29.

Почергово хроматографують по 10 мкл випробовуваного розчину і

розчину порівняння при довжині хвилі 260 нм і 290 нм.

Вміст нікотинаміду (Хн) в одній таблетці, в грамах, розраховують за

формулою:

(5.2)

де: S1 – середнє значення площ піків нікотинаміду, розраховане із

хроматограм випробовуваного розчину, отриманих при довжині хвилі

260 нм;

S0 - середнє значення площ піків нікотинаміду, розраховане із

хроматограм розчину порівняння, отриманих при довжині хвилі 260 нм;

Х = S1∙ m0 ·8 100∙P·b∙(100-W)

= S1∙ m0 ·P∙b∙(100-W)

S0 · m1 ·50∙20 100 ∙100 S0 · m1 ·12500

161

m0 – маса наважки СЗ нікотинаміду, в грамах;

m1 – маса наважки порошку розтертих таблеток, в грамах;

Р – вміст нікотинаміду в СЗ нікотинаміду, в перерахунку на суху

речовину, у відсотках;

W – втрата в масі при висушуванні СЗ нікотинаміду, у відсотках;

b – середня маса таблетки, в грамах.

Вміст піридоксину гідрохлориду (Хп) в одній таблетці, в грамах,

розраховують за формулою:

(5.3)

де: S1 – середнє значення площ піків піридоксину гідрохлориду,

розраховане із хроматограм випробовуваного розчину, отриманих при

довжині хвилі 290 нм;

S0 - середнє значення площ піків піридоксину гідрохлориду,

розраховане із хроматограм розчину порівняння, отриманих при довжині

хвилі 290 нм;

m0 – маса наважки СЗ піридоксину гідрохлориду, в грамах;

m1 – маса наважки порошку розтертих таблеток, в грамах;

Р – вміст піридоксину гідрохлориду в СЗ піридоксину гідрохлориду, в

перерахунку на суху речовину, у відсотках;

W – втрата в масі при висушуванні СЗ піридоксину гідрохлориду, у

відсотках;

b – середня маса таблетки, в грамах.

Розрахунок валідаційних характеристик був проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність [92].

Х = S1∙ m0 ·8 100∙P·b∙(100-W)

= S1∙ m0 ·P∙b∙(100-W)

S0 · m1 ·200∙20 100 ∙100 S0 · m1 ·50000

162

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували відсутністю на хроматограмі розчину плацебо (рис. 5.7)

піків, які за часами утримування співпадали з піками нікотинаміду чи

піридоксину гідрохлориду на хроматограмі розчину порівняння (рис. 5.8), а

також за співпадінням часів утримування піків нікотинаміду чи піридоксину

гідрохлориду (рис 5.9, 5.10) з часами утримування піків нікотинаміду чи

піридоксину гідрохлориду на хроматограмі розчину порівняння (табл. 5.6).

Таблиця 5.6

Результати дослідження специфічності в умовах кількісного

визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у «Седавіт»

таблетках

Досліджуваний розчин Час утримування, хв

Нікотинамід Піридоксину гідрохлорид

Розчин плацебо - -

Розчин порівняння 8,20 13,34

Випробовуваний розчин 8,20 13,30

Рис. 5.7. Хроматограма розчину плацебо, отримана в умовах

кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду

163

Рис. 5.8. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах

кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду

Рис. 5.9. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана в умовах

кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду

(детектування при 260 нм, нікотинамід).

Рис. 5.10. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана в умовах

кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду

(детектування при 290 нм, піридоксину гідрохлориду).

164

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення нікотинаміду чи піридоксину

гідрохлориду повинен охоплювати концентрацію від 20 до 180 % відповідно

до вимог ДФУ для випробування «Кількісне визначення» із врахуванням

номінального вмісту визначуваних речовин у таблетці. Дана характеристика

вивчалася при дослідженні лінійності, правильності та прецизійності.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 9 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 80 до 120 % від номінального

вмісту нікотинаміду чи піридоксину гідрохлориду у таблетці. Відібрані

аліквоти розчинів зважували на аналітичних вагах для точнішого

переведення у нормалізовані координати (табл. Ц.4 та табл. Ц.7 ). На основі

визначення площ піків нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду з точно

відомою концентрацією будували графік залежності площ від концентрації

нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у нормалізованих координатах,

та розраховували параметри лінійності (табл. Ц.5. та табл.Ц.8).

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується на всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,99969, залишкове стандартне

відхилення становить 0,34. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Ц.4, табл. Ц.7). Результати проведених досліджень

свідчать про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки

в порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Ц.6,

табл. Ц.9).

165

Дослідження прецизійності (збіжності). Збіжність методики

характеризує ступінь близькості результатів для серії вимірювань за

методикою при її виконанні в одних і тих самих умовах протягом невеликого

проміжку часу. На підставі результатів досліджень, наведених в таблиці Ц.6,

можна зробити висновок про збіжність методики, оскільки жоден з

результатів за величиною похибки не вийшов за межі максимально

допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При проведені валідації методики вивчено стійкість розчину

порівняння та випробовуваного розчину в часі. За результатами випробувань

розчини стабільні протягом 24 год.

При зміні температури колонки на ± 10 0 С, при зміні довжини колонки

на - 40 % та при зміні колонки (інша серія колонки) вимоги до придатності

хроматографічної системи витримуються, отже, методика відповідає

встановленим критеріям до робасності.

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення нікотинаміду та піридоксину гідрохлориду у

«Седавіт» таблетках відповідає критеріям специфічності, робасності,

лінійності, правильності та прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні

застосування методики.

5.2 Обґрунтування маркерів, розробка та валідація методів контролю

якості «Холелесан» капсул.

5.2.1. Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення цмину піщаного квіток екстракту сухого та моркви дикої плодів

та нагідок квіток екстракту густого.

Ідентифікацію цмину піщаного квіток екстракту сухого у капсулах

підтверджували наявністю ізосаліпурпозиду та апігенін-7-глюкозиду, які є

специфічними речовинами для цмину піщаного квіток.

166

Ідентифікацію моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракту густого

запропоновано здійснювати за флавоноїдами, як маркери використовували

рутин та хлорогенову кислоту. Ідентифікацію лютеоліну – маркера моркви

дикої плодів у комплексному густому екстракті не проводили, оскільки його

кількість є незначною в комплексному екстракті, а капсула, в свою чергу,

також містить малу кількість цього екстракту (60 мг в одній капсулі). Тому

для ідентифікації комплексного екстракту було обрано речовини, які у

капсулі підтверджують наявність густого екстракту моркви дикої плодів та

нагідок квіток – рутин і хлорогенова кислота. Підтвердження наявності в ГЛЗ

рутину, хлорогенової кислоти, ізосаліпуопузиду та апігенін-7-глюкозиду

проводили методом ТШХ. Дослідження проводили відповідно до методики

ідентифікації фенольних сполук, наведеної у ЄФ/ДФУ для Глоду плоди,

Звіробою трава, Нагідок квітки [92, 94].

Як було показано в розділі 4, кількісним критерієм якості моркви

дикої плодів та нагідок квіток екстракту густого та цмину піщаного квіток

екстракту сухого є вміст флавоноїдів. Зважаючи на те, що компонентний

склад флавоноїдів в екстрактах різний, для вибору маркера при розрахунках

вмісту флавоноїдів у капсулі було проведено дослідження компонентного

вмісту флавоноїдів методом ВЕРХ в «Холелесан» капсулах. Ідентифікацію

речовин проводили шляхом порівняння часів утримування піків на

хроматограмі випробовуваного розчину з часами утримування розчину

стандартних речовин. Результати досліджень представлені у таблиці 5.7 та на

рисунку 5.11.

Згідно з отриманими даними, ізосаліпурпозид складав близько 40 % від

вмісту суми флавоноїдів у ГЛЗ, тому дана речовина була вибрана як маркер

для перерахунку кількісного вмісту флавоноїдів у капсулах.

167

Рис. 5.11. Хроматограма, отримана в умовах ідентифікації флавоноїдів в

«Холелесан» капсулах.

Таблиця 5.7.

Результати ідентифікації і визначення флавоноїдів у зразках

«Холелесан» капсул методом ВЕРХ

Речовина Відносний міст, визначений

методом внутрішньої нормалізації, %

Гіперозид 1,6

Неідентифікований пік 9,3

Апігенін-7-глюкозид 13,7

Ізосаліпурпозид 41,4

Лютеолін 8,4

Нарінгінін 5,1

Апігенін 20,5

Примітка. УФ-спектр речовини, яка позначена як неідентифікований пік,

за ходом кривої світлопоглинання і положенням максимуму в області

поглинання флавоноїдів, дозволяє припустити приналежність цієї

речовини до флавоноїдів, тому площу піку цієї речовини враховували при

розрахунку вмісту окремих представників методом внутрішньої

нормалізації.

168

З метою забезпечення стабільної терапевтичної дії «Холелесан», капсул

для суми флавоноїдів було введено вимоги до вмісту з верхньою та

нижньою межами. Критерії для мінімального та максимального вмісту

діючих речовин в капсулах розраховували, виходячи із вмісту

досліджуваних компонентів в екстрактах та вмісту останніх в одній капсулі.

Згідно проведених розрахунків вміст суми флавоноїдів має становити від

3,0 мг до 10,0 мг в одній капсулі.

Кількісний вміст суми флавоноїдів в капсулах визначали

спектрофотометрично. Випробовували дві методики: по реакції утворення

забарвленої комплексної сполуки безпосередньо флавоноїдів із алюміній

хлоридом (методика 1) та після попереднього гідролізу їх глюкозидів з

наступним комплексоутворенням утворених флавоноїдів-агліконів

(методика 2). Спектри, отримані в умовах методики 1 представлені на рис.

5.11, спектри, отримані в умовах методики 2 представлені на рис.5.12. Як

видно з Рисунка 5.11, в умовах кількісного визначення флавоноїдів згідно

методики №1, диференціальний електронний спектр випробовуваного

розчину має чітко виражений максимум при довжині хвилі 427 ± 2 нм і

плече в області 470 нм. Це зумовлено тим, що у ГЛЗ присутні різні сполуки

флавоноїдів, комплекси яких з алюміній хлоридом мають максимуми

поглинання, що різняться за довжиною хвилі. Це може спричиняти похибку

визначення, оскільки максимум поглинання завжди буде «дрейфувати»

внаслідок того, що для різних серій екстрактів може спостерігатись

коливання вмісту окремих флавоноїдів та їх співвідношення. Як видно з

рис. 5.12, завдяки проведеному гідролізу глікозидів флавоноїдів та

наступній екстракції агліконів етилацетатом, вдалося отримати більш

однорідні значення максимумів поглинання (рис. 5.12), максимум

поглинання випробовуваного розчину знаходився в діапазоні 417 - 422 нм.

169

Рис. 5.11. Диференціальний

електронний спектр поглинання

розчину ізосаліпурпозиду (1) та

випробовуваного розчину (2)

умовах кількісного визначення

згідно методики № 1.

Рис. 5.12 Диференціальний

електронний спектр поглинання

розчину ізосаліпурпозиду (1) та

випробовуваного розчину (2) умовах

кількісного визначення згідно

методики № 2.

Таким чином, для визначення вмісту флавоноїдів у ГЛЗ було обрано

методику № 2 (наведена нижче), методика 1 наведена в додатку Ш.

В процесі підбору оптимальних умов для вилучення флавоноїдів із

капсульної маси проводили дослідження з вибору оптимального

розчинника та умов вилучення флавоноїдів із капсульної маси. З метою

вибору екстрагента для вилучення флавоноїдів, проводили випробування,

застосовуючи ацетон, метанол та етанол при ультразвуковій обробці суміші

та безпосередньому струшуванні (табл. 5.8). Як видно з результатів

дослідження, наведених в таблиці 5.8, найбільш повне вилучення

флавоноїдів із капсульної маси досягало у випадку використання ацетону

при дії ультразвуку.

170

Таблиця 5.8

Результати дослідження умов вилучення флавоноїдів із капсульної

маси «Холелесан», капсул

Розчинник

Вміст флавоноїдів, мг/капс.

Обробка в ультразвуковій

бані протягом 5 хв

Струшування

протягом 5 хв

Метанол 4,812±0,002 4,042±0,001

Ацетон 5,327±0,002 4,053±0,001

Етанол 4,904±0,002 4,040±0,001

Для визначення тривалості ультразвукової обробки, яка б забезпечила

максимальне вилучення флавоноїдів із капсульної маси, проводили серію

досліджень з різною тривалістю обробки (табл. 5.9).

Таблиця 5.9

Вплив тривалості ультразвукової обробки на вилучення флавоноїдів із

капсульної маси «Холелесан» капсул

Тривалість ультразвукової обробки, хв Вміст флавоноїдів, мг/капс.

5 5,327±0,002

10 5,892±0,002

15 5,864±0,002

30 5,902±0,002

Аналіз даних, наведених в таблиці 5.9, дає можливість стверджувати

що оптимальною тривалістю ультразвукової обробки є 10 хв, при якій

вилучається максимальна кількість флавоноїдів із капсульної маси.

Для підтвердження придатності розроблених методик було проведено

їх валідацію.

Методика ідентифікації рутину, хрологенової кислоти, апігенін-7-

глікозиду та ізосаліпурпозиду в «Холелесан» капсулах.

171

Випробовуваний розчин. До 0,50 г порошку розтертих капсул додають

15 мл метанолу Р і 20 мл води Р, кип’ятять зі зворотнім холодильником

протягом 10 хв, охолоджують, фільтрують через фільтр з діаметром пор не

більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння. 5 мг ізосаліпурпозиду, 2,5 мг апігенін-7-глюкозиду,

2,5 мг рутину, 1 мг хлорогенової кислоти розчиняють в 10 мл метанолу.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel 60 F254 з

товщиною шару 0,25 мм наносять у вигляді смуг довжиною 10 мм 70 мкм

випробовуваного розчину і 10 мкм розчину порівняння. Пластинку сушать

на повітрі протягом 10 хв, поміщають в камеру з сумішшю розчинників

мурашина кислота безводна – вода – етилацетат (10:10:80) і

хроматографують висхідним способом. Коли фронт розчинників пройде 12

см від лінії старту, пластинку виймають з камери, сушать у витяжній шафі

протягом 10 хв, після чого в сушильній шафі при температурі від 100 0С до

105 0С протягом 10 хв і обприскують гарячу розчином 10 г/л дифенілборної

кислоти аміноетилового ефіру в метанолі Р. Сушать протягом 10 хв у

витяжній шафі і обприскують розчином 50 г/л макроголу 400 Р в метанолі

P, знову сушать у витяжній шафі протягом 30 хв і переглядають в УФ-світлі

при довжині хвилі 365 нм.

На хроматограмі розчину порівняння мають проявлятися: в нижній

частині – жовтувато-оранжева зона рутину, вище неї – голуба зона

хлорогенової кислоти, вище хлорогенової кислоти жовто-зелена зона

апігенін-7-глікозиду, вище неї – коричнева зона ізосаліпурпозиду.

На хроматограмі випробовуваного розчину мають проявлятися зони

на рівні відповідних зон на хроматограмі розчину порівняння, що

відповідають їм за забарвленням та значенням Rf . На хроматограмі

випробовуваного розчину допускається наявність інших зон.

При валідації даної методики необхідно довести специфічність та

придатність хроматографічної системи.

Специфічність методики визначали шляхом хроматографування

трьох серій випробовуваного розчину та розчину порівняння, при цьому на

172

хроматограмах випробовуваних розчинів повинні бути жовтувато-оранжева

зона рутину, вище неї – голуба зона хлорогенової кислоти, вище

хлорогенової кислоти жовто-зелена зона апігенін-7-глюкозиду, вище неї –

коричнева зона ізосаліпурпозиду на рівні зони на хроматограмі розчину

порівняння після обприскування їх 50 г/л макроголу 400 Р в метанолі Р

(рис. 5.13).

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваного розчину і на хроматограмі розчину

порівняння (а) в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf,

отже, методика відповідає критеріям прийнятності (табл. 5.10).

Таблиця 5.10

Результати отримані при вивченні специфічності методики ідентифікації

рутину, хрологенової кислоти, апігенін-7-глікозиду та ізосаліпурпозиду в

«Холелесан» капсулах методом ТШХ

Зона розчину

порівняння

Зона

випробовуваного

розчину

с. 10612

ΔRf

Зона

випробовува

ного розчину

с. 20512

ΔRf

Зона

випробовувано

го розчину

с. 10113

ΔRf

Значен

ня Rf

0,18 0,18 0 0,18 0 0,18 0

0,23 0,25 0,02 0,24 0,01 0,25 0,02

0,39 0,49 0 0,49 0 0,48 0,01

0,46 0,47 0,01 0,46 0 0,46 0

Забарв

лення

зони

Жовто-

оранжеве

Жовто-

оранжеве

- Жовто-

оранжеве

- Жовто-

оранжеве

-

Голубе Голубе - Голубе - Голубе -

Жовто-

зелене

Жовто-зелене - Жовто-

зелене

- Жовто-

зелене

-

Коричневе Коричневе -- Коричневе - Коричневе -

Візуальне оцінювання зон за розміром та інтенсивністю забарвлення

в усіх випробовуваних розчинах дає можливість стверджувати про

стійкість розчинів в часі.

В межах визначення специфічності методики визначали стійкість

розчинів в часі, а саме, хроматографували свіжоприготовлений та

витримані в часі (30 хв, 60 хв) випробовувані розчини і розчин порівняння

173

(рис. 5.13).

При проведенні валідації вивчено стабільність хроматографічної

системи, а саме хроматографували випробовувані розчини та розчин

порівняння у різних системах з варіювання вмісту води, як мінорного

компонента, на + 2 % абсолютних (10:12:80) та на – 2 % абсолютних

(10:8:80). Результати випробувань представлені на рис. 5.13.

1 2 3 4 1 5 6 7 І 1 2 3 4 ІІ 1 2 3 4

Рис. 5.13. Хроматограми, отримані в умовах ідентифікації капсул

Холелесан для: 1 - розчину порівняння (рутин, хлорогенова кислота,

апігенін-7-глюкозид, ізосаліпурпозид знизу –догори), 2 - випробовуваного

розчину свіжопригованого, 3 - ипробовуваного розчину, витриманого в часі

протягом 30 хв, 4 - випробовуваного розчину, витриманого в часі протягом

60 хв, 5 - випробовуваного розчину, с 10612, 6 - випробовуваного розчину, с

20512, 7 - випробовуваного розчину, с 10113, І – випробовуваних розчинів та

розчину порівняння, в системі + 2 % абсолютних (10:12:80), ІІ -

випробовуваних розчинів та розчину порівняння, в системі - 2 % абсолютних

(10:8:80).

За оцінкою результатів максимальна різниця величин Rf зон, на

хроматограмі випробовуваному розчину і на хроматограмі розчину

174

порівняння в межах однієї пластинки, не перевищує 0,02 одиниці Rf, отже,

хроматографічна система стабільна.

Таким чином, досліджені валідаційні характеристики (специфічність,

придатність хроматографічної системи та стійкість хроматографічної

системи) методики ідентифікації рутину, хлорогенової кислоти, апігені-7-

глюікозиду та ізосаліпурпозиду в «Холелесан», капсулах відповідали

критеріям прийнятності.

Методика кількісного визначення суми флавоноїдів у «Холелесан»

капсулах.

Вихідний розчин. 500 мг (точна наважка) порошку розтертої капсульної маси

поміщали у центрифужну пробірку, додавали 8,0 мл розчину

хлористоводневої кислоти Р1 і 15 мл ацетону Р. Пробірку поміщали в

ультразвукову баню на 10 хв, після чого центрифугували 5 хв при 5000 об/хв,

надосадову рідину фільтрували через фільтр "біла стрічка" в конічну колбу з

шліфом місткістю 100 мл. Фільтр промивали тричі по 5,0 мл розчину

хлористоводневої кислоти Р1 і 20 мл води Р при вищевказаних умовах. До

отриманого розчину додавали 1,0 мл розчину гексаметилентетраміну Р (5

г/л) і 30 мл ацетону Р, кип'ятили із зворотним холодильником протягом 30

хв, охолоджували і кількісно переносили рідину в мірну колбу місткістю 200

мл, колбу промивали ацетоном Р і доводили цим же розчинником до

позначки. 25,0 мл отриманого розчину поміщали в ділильну лійку місткістю

100 мл, додавали 20 мл води Р і 15 мл етилацетату Р, струшували протягом

5 хв. Після поділу шарів нижній (водний) шар зливали у склянку місткістю

100 мл, а верхній (органічний) - у конічну колбу місткістю 100 мл, яку

закривали корком. Водну фракцію знову поміщали в ділильну лійку і

повторювали екстракцію ще три рази порціями по 15 мл, 15 мл і 10 мл

етилацетату Р, струшуючи щоразу 5 хв. Об'єднані етилацетатні вилучення

кількісно, за допомогою 25 мл води Р, переносили в ділильну лійку і

струшували 2 рази з водою Р, по 25 мл і 50 мл відповідно, протягом 5 хв.

Етилацетатне вилучення фільтрували через фільтр "біла стрічка" з 10 г

175

натрію сульфату безводного Р у мірну колбу місткістю 50 мл (фільтр з

натрію сульфатом безводним Р попередньо змочували етилацетатом Р).

Ділильну лійку і фільтр промивали 5 мл етилацетату Р і доводили вміст в

мірній колбі до 50,0 мл етилацетатом Р.

Випробуваний розчин. До 10,0 мл вихідного розчину додавали 1,0 мл реактиву

алюмінію хлориду Р, доводили об'єм розчину 5% (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 1. 10,0 мл вихідного розчину доводили 5% (об/об)

розчином оцтової кислоти льодяної Р в метанолі Р до 25,0 мл.

Вихідний розчин 2. 20 мг ФСЗ ізосаліпурпозиду, висушеного до постійної

маси при температурі 100-105 °С, розчиняли в 30 мл етилацетату Р на

ультразвуковій бані протягом 10 хв, доводили об’єм розчину тим самим

розчинником до 50,0 мл. 5,0 мл одержаного розчину доводили

етилацетатом Р до 50,0 мл.

Розчин порівняння. До 10,0 мл вихідного розчину 2 додавали 1,0 мл реактиву

алюмінію хлориду Р, доводили об'єм розчину 5% (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 2: 10,0 мл вихідного розчину 2 доводили 5% (об/об)

розчином оцтової кислоти льодяної Р в метанолі Р до 25,0 мл.

Через 30 хв після приготування записували спектр випробовуваного розчину в

діапазоні від 350 нм до 500 нм і вимірювали оптичну густину в максимумі

спектра при довжині хвилі (420 ± 5) нм в кюветі з товщиною шару 10 мм

відносно компенсаційного розчину. За тих же самих умов проводили

вимірювання оптичної густини розчину порівняння відносно

компенсаційного розчину 2.

Вміст суми флавоноїдів (Х) (в мг), в перерахунку на ізосаліпурпозид,

розраховували за формулою:

mA

bmАX

0

0 10

де:

176

А - оптична густина випробовуваного розчину в максимумі спектру при

довжині хвилі (420 ± 5) нм;

А0 - оптична густина розчину порівняння в максимумі спектру при

довжині хвилі (420 ± 5) нм;

m - маса наважки досліджуваного зразка , в міліграмах;

m0 - маса наважки ФСЗ ізосаліпурпозиду, у міліграмах;

b - середня маса вмісту однієї капсули, в міліграмах.

Розрахунок валідаційних характеристик проведений, виходячи з

повної невизначеності аналізу (ΔAS) ≤ 5 %. Для запропонованої методики

нами досліджувались наступні валідаційні характеристики: специфічність,

лінійність, правильність і прецизійність, робасність [92]. Зважаючи на те, що

пропобідготовка включає триразове екстрагування етилацетатом після

гідролізу, в ході валідації доводили, що вибрана кількість повторів операцій

достатня для повного вилучення, а вибрані кількості доданих реагентів –

достатні для забезпечення повноти протікання реакції.

Дослідження специфічності методики. Специфічність методики

підтверджували наявністю на спектрі випробовуваного розчину максимуму

поглинання при довжині хвилі 420 ± 4 нм. Хід та положення максимуму

поглинання випробовуваних розчинів капсул Холелесан співпав з

положенням максимуму поглинання розчину порівняння ізосаліпурпозиду

(рис. 5.14). На спектрі розчину плацебо відсутній пік з максимумом

поглинання при довжині хвилі 420 ± 4 нм. Отже, вимоги до специфічності

виконуються.

Дослідження діапазону застосування. Діапазон застосування

аналітичної методики кількісного визначення флавоноїдів повинен

охоплювати концентрацію від 20 до 200 % відповідно до вимог ДФУ для

випробування «Кількісне визначення» із врахуванням декларованого

сумарного вмісту флавоноїдів у екстрактах. Дана характеристика вивчалася

при дослідженні лінійності, правильності та прецизійності.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 10 модельних розчинах,

177

які охоплювали діапазон концентрацій від 20 до 200 % від середнього вмісту

суми флавоноїдів в перерахунку на ізосаліпурпозид. Відібрані аліквоти

розчинів зважували на аналітичних вагах для точнішого переведення у

нормалізовані координати (табл. Щ.1). На основі визначення оптичних

густин розчинів з точно відомою концентрацією будували графік залежності

оптичної густини від концентрації флавоноїдів у нормалізованих

координатах, та розраховували параметри лінійності (табл. Щ.2).

Рис. 5.14 - Диференціальний електронний спектр поглинання розчину

ізосаліпурпозиду (1) та випробовуваного розчину «Холелесан» капсул (2)

умовах кількісного визначення

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,9998, залишкове стандартне

відхилення становить 0,82. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал константи a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Щ.1). Результати проведених досліджень свідчать

178

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Щ.3).

Дослідження прецизійності (збіжності). Збіжність методики

характеризує ступінь близькості результатів для серії вимірювань за

методикою при її виконанні в одних і тих самих умовах протягом невеликого

проміжку часу. На підставі результатів досліджень, наведених в таблиці Щ.3,

можна зробити висновок про збіжність методики, оскільки жоден з

результатів за величиною похибки не вийшов за межі максимально

допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

Для доказу ефективності вилучення фенольних сполук з капсульної

маси та екстрагування агліконів етилацетатом після гідролізу, проводили ще

одну додаткову операцію вилучення. Вилучення обробляли в умовах

кількісного визначення, аналогічно випробовуваному розчину. На спектрах

розчину з алюміній хлоридом максимум поглинання в області (421 ± 4) нм не

спостерігався, що доводить повноту вилучення флавоноїдів з капсульної

маси, а запропонована кількість етилацетату достатня для екстрагування

агліконів з розчину після гідролізу.

При вивченні робасності методики було досліджено вплив кількостей

реагентів гексаметилентетраміну, алюмінію хлориду та тривалості операцій

кип’ятіння й утворення фотометрованої сполуки флавоноїдів з алюмінію

хлоридом. Результати проведених експериментів підтверджують коректність

запропонованої методики (табл.5.12).

В результаті проведених досліджень було встановлено, що розроблена

методика кількісного визначення суми флавоноїдів у капсулах Холелесан

відповідає критеріям специфічності, робасності, лінійності, правильності та

прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

179

Таблиця 5.12

Результати дослідження робасності методики кількісного

визначення суми флавоноїдів у «Холелесан» капсулах

Досліджуваний фактор Оптична

густина ,

А

δ, % Вимоги Висновки

Об’єм доданого

розчину

гексаметилен-

тетраміну Р, мл

0,9 0,472 0,63

≤ 1,6%

Відповідає

1,0 0,477 - Відповідає

1,1 0,474 1,05 Відповідає

Час кип’ятіння, хв.

25 0,335 1,2 Відповідає

30 0,339 - Відповідає

35 0,331 1,1 Відповідає

Об’єм доданого

реактиву алюмінію

хлориду Р, мл

0,9 0,336 1,5 Відповідає

1,0 0,341 - Відповідає

1,1 0,342 0,3 Відповідає

Час

комплексоутворенн

я, хв

25 0,468 0,6 Відповідає

30 0,471 - Відповідає

45 0,472 0,2 Відповідає

5.2.2. Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення сухого екстракту куркуми у «Холелесан» капсулах.

Ідентифікацію куркуміноїдів екстракту куркуми у складі капсул

проводили методом рідинної хроматографії. Наявність куркуміноїдів

(куркуміну, диметоксикуркуміну та бісдиметоксикуркуміну) у складі

капсул підтверджували шляхом порівняння часів утримування цих речовин

на хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння,

отриманих в умовах кількісного визначення куркуміноїдів у складі готового

препарату.

Кількісне визначення суми куркуміноїдів у Холелесан капсулах

проводили методом ВЕРХ. Виходячи з вмісту куркуміноїдів у екстракті та

його кількості у складі капсули, розраховано межі вмісту куркуміноїдів,

яких в одній капсулі має бути від 16,0 мг до 24,0 мг.

180

Для досягнення повноти вилучення куркуміноїдів з таблетної маси

застосовували ультразвук. За результатами досліджень (табл. 5.13)

оптимальна тривалість обробки ультразвуком склала 10 хв.

Таблиця 5.13

Вплив тривалості ультразвукової обробки на вилучення

куркуміноїдів з капсульної маси Холелесану

Тривалість ультразвукової

обробки, хв

Вміст суми куркумоноїдів ,

мг/табл.

5 17,9 ±0,2

10 18,8 ±0,2

15 18,9 ±0,2

Найкраще вимоги до придатності хроматографічної системи

виконувалися на колонці XTerra C18 розміром 4,6 мм х 250 мм заповненій

силікагелем диізопропілсилільним ендкепованим з розміром часток 5 мкм,

рухома фаза: суміш тетрагідрофурану та розчину 10 г/л кислоти лимонної,

температура колонки 40 0С, детектування проводили при 420 нм.

Хроматографічні характеристики піків куркуміноїдів наведені у звіті

валідації методики. Розраховані хроматографічні характеристики піків

визначуваних речовин вказують на придатність хроматографічної системи

[92].

Методика кількісного визначення суми куркуміноїдів у «Холелесан»

капсулах.

Вихідний розчин 1. 90 мг розтертої в порошок капсульної маси поміщають в

мірну колбу місткістю 50 мл, додають 40 мл тетрагідрофурану Р,

витримують на ультразвуковій бані протягом 10 хв, доводять

тетрагідрофураном Р до мітки, перемішують і фільтрують через паперовий

фільтр «синя стрічка», відкидаючи перші 5 мл фільтрату.

181

Випробовуваний розчин. 10 мл вихідного розчину 1 доводять до 25,0 мл

рухомою фазою і фільтрують через фільтр з діаметром пор не більше

0,45 мкм.

Вихідний розчин 2. 20 мг СЗ куркуміну (ФСЗ ДФУ або РСЗ) розчиняють в

тетрагідрофурані Р і доводять об’єм цим же розчинником до 50,0 мл.

Розчин порівняння. 5,0 мл вихідного розчину 2 доводять до об’єму 50,0 мл

рухомою фазою і фільтрують через фільтр з діаметром пор не більше

0,45 мкм.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-детектором

в наступних умовах:

- колонка «XTerra С18» (фірми «Waters» США), розміром 4,6 х 250 мм,

заповнена сорбентом з розміром частин 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту «Придатність хроматографічної системи»;

- рухома фаза: суміш тетрагідрофурану Р і розчину 10 г/л лимонної

кислоти Р (40:60);

- швидкість рухомої фази: 1,0 мл/хв.;

- температура колонки: 400С;

- детектування при довжині хвилі 420 нм;

- об’єм проби що вводиться: 20 мкл.

Хроматографують розчин порівняння. Порядок виходу піків: куркумін,

диметоксикуркумін, бісдиметоксикуркумін.

Придатність хроматографічної системи: розчин порівняння:

- ефективність хроматографічної колонки, розрахована за основними

піками, складає не менше 2000 теоретичних тарілок;

- коефіцієнт симетрії основних піків від 0,8 до 1,3;

- коефіцієнт розділення основних піків має бути не менше 2,0;

- відносне стандартне відхилення, розраховане для площ основних піків,

має відповідати вимогам ДФУ.

182

Вміст куркуміноїдів (Х) в міліграмах, в одній капсулі, в перерахунку на

куркумін, розраховують за формулою:

1 0 1 0

0 1 0 1

5 50 25

50 50 10 100 400

S m P b S m P bХ

S m S m

, (5.4)

∑S1 - середнє значення площ піків куркуміну, диметоксикуркуміну,

бісдиметоксикуркуміну, розраховане із хроматограм

випробовуваного розчину;

S1 - середнє значення площ піків куркуміну, розраховане з хроматограм

розчину порівняння;

m1 - маса наважки досліджуваного зразка , в міліграмах;

m0 - маса наважки СЗ куркуміну, у міліграмах;

Р - вміст куркуміну, вказаний у сертифікаті на СЗ куркуміну, у

відсотках;

b - середня маса вмісту однієї капсули, в міліграмах.

За вимогами ДФУ [92], для випробування «Ідентифікація» потрібно

визначати такі валідаційні характеристики як специфічність та придатність

хроматографічної системи, а для випробування “Кількісне визначення” –

лінійність, правильність, специфічність, придатність хроматографічної

системи, збіжність в діапазоні застосування методики.

Придатність хроматографічної системи оцінювали з хроматограм

розчину порівняння. Параметри придатності хроматографічної системи і

характеристики хроматографічних піків куркуміну, диметоксикуркуміну,

бісдиметоксикуркуміну представлено в таблиці 5.14. Як свідчать приведені

дані, коефіцієнти розділення піків куркуміну, диметоксикуркуміну,

бісдиметоксикуркуміну, задовольняють вимоги ДФУ, оскільки є більшими

від 2. Відносне стандартне відхилення, розраховане за площами піків

куркуміну, диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну, відповідає вимогам

ДФУ, число теоретичних тарілок, розраховане за основними піками на

хроматограмі розчину порівняння більше 2000.

183

Таблиця 5.14

Параметри придатності хроматографічної системи та

характеристики хроматографічних піків куркуміну,

диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну в умовах кількісного

визначення у «Холелесан» капсулах

Таким чином запропонована методика дозволяє надійно ідентифікувати

діючі речовини та кількісно їх визначати.

Дослідження специфічності методики. Вивчаючи специфічність

методики, нами проведено порівняльний аналіз хроматограм розчину

порівняння, випробовуваного розчину та розчину плацебо. На хроматограмі

розчину плацебо немає піків, які співпадають за часами утримування з

піками куркуміну, диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну на

хроматограмі розчину порівняння (рис. 5.15), а на хроматограмі

випробовуваного розчину (рис. 5.16) часи утримування піків куркуміну,

диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну співпадають з часами

утримування піків куркуміну, диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну

на хроматограмі розчину порівняння. Таким чином, запропоновано

хроматографічні умови кількісного визначення куркуміну,

Параметри Куркумін Диметокси

куркумін

Бісдиметокси

куркумін

Середнє значення часу

утримання, хв

13,09 15,11 17,50

Коефіцієнт симетрії 1,1 1,1 1,0

Кількість теоретичних

тарілок

10 348 11154 12021

Відносне стандартне

відхилення для відношень

площ піків

0,35 0,53 0,26

Коефіцієнт розділення піків 3,0 3,2

184

диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну витримують вимоги

валідаційної характеристики “специфічність”.

Рис. 5.15. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах

кількісного визначення куркуміноїдів у «Холелесан» капсулах.

Рис. 5.16. Хроматограма випробовуваного розчину, отримана в умовах

кількісного визначення куркуміноїдів у «Холелесан» капсулах.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 11 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 50% до 150 % від декларованого

вмісту суми куркуміноїдів.

На основі площ піків куркуміну, диметоксикуркуміну,

бісдиметоксикуркуміну на хроматограмах розчинів з точно відомою їх

концентрацією будували графіки залежності відношень площ відповідних

піків від концентрації модельних розчинів у нормалізованих координатах, та

185

розраховували параметри лінійності, результати яких наведені у таблицях

Щ.4 та Щ.5.

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції рівний 0,9999, залишкове стандартне

відхилення становить 0,25. Графік залежності оптичної густини від

концентрації проходить практично через початок координат, розрахований

довірчий інтервал a підтверджує статистичну і практичну незначущість

константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Щ.4). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Щ.6).

Дослідження прецизійності (збіжності). На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці Щ.6, можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

При проведені валідації методики вивчено стійкість розчину

порівняння та випробовуваного розчину в часі. За результатами випробувань

розчини стабільні протягом 24 год.

При зміні температури колонки на ± 10 0 С, та при зміні колонки (інша

серія колонки) вимоги до придатності хроматографічної системи

витримуються, отже, методика відповідає встановленим критеріям щодо

робасності.

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення куркуміноїдів відповідає критеріям специфічності,

робасності, лінійності, правильності та прецизійності (збіжності) у всьому

діапазоні застосування методики.

186

5.2.3. Розробка і валідація методик ідентифікації та кількісного

визначення ефірних олій куркуми та м’яти.

Якість ефірної олії м’яти, як активного фармацевтичного інгредієнта,

нормується вимогами ЄФ, згідно яких хроматографічний профіль має

відповідати наступним вимогам: лімонену від 1,0 % до 5,0 %, цинеолу від

3,5 % до 14,0 %, ментону від 14,0 % до 32,0 %, ментофурану від 1,0 % до

9,0 %, ізоментону від 1,5 % до 10,0 %, ментилацетату від 2,8 % до 10,0 %,

ізопулеголу не більше 0,2 %, ментолу від 30,0 % до 55,0 %, пулегону не

більше 4,0 %, карвону не більше 1,0 % [91].

Нами були проаналізовані різні зразки ефірної олії м’яти, які

застосовуються на виробництві ПАТ «Галичфарм». Вміст ментолу за

даними хроматографічних визначень та результатами розрахунків з

використанням стандартного зразка ментолу у різних зразках олії коливався

в межах від 45 % до 50 %, що вказує на відповідність використовуваних

зразків олії м’яти за показником «вміст ментолу» вимогам ЄФ [91].

Таким чином, враховуючи результати дослідження різних зразків олії

м’яти та зважаючи на необхідність її ідентифікації і кількісного визначення

у багатокомпонентному ГЛЗ «Холелесан» капсулах нами було вирішено як

її аналітичний маркер обрати ментол.

Згідно даних літератури основними компонентами олії куркуми є

турмерони: Ar-турмерон, α-турмерон та β-турмерон.

Нами було проведено дослідження компонентного складу ефірної олії

куркуми з використанням стандартного зразка ефірної олії куркуми на

газовому хроматографі з масселективним детектором, внаслідок чого

встановлено віднесення хроматографічних піків основним представникам

α-, β- і Ar-турмеронам. На рисунках 5.17 - 5.20 наведені хроматограми

випробовуваного розчину куркуми олії та масспектри турмеронів.

187

Рис. 5.17. Хроматограма спиртового розчину олії куркуми.

Рис. 5.18. Масспектр α-турмерону, час утримування α-турмерону –

19,23 хв.

Рис. 5.19. Масспектр β-турмерону (курлону), час утримування β-турмерону

– 20,97 хв.

188

Рис. 5.20. Масспектр Аr-турмерону, час утримування Аr-турмерону –

21,43 хв.

Аналізуючи різні зразки ефірної олії куркуми, встановлено, що вміст

турмеронів коливався в межах від 55 % до 78 %, при цьому вміст Ar-

турмерону становив від 23 % до 29 %, α-турмерону - від 20 % до 26 %, β-

турмерону - від 22 % до 25 %.

З метою встановлення тотожності ГЛЗ щодо наявності в ньому

куркуми олії, запропоновано ідентифікувати її основні компоненти –

турмерони: наявність на хроматограмі піків, Ar-турмерону, α-турмерону та

β-турмерону підтверджує ідентичність олії, а їх сумарний вміст має

відповідати кількісному показнику «вміст турмеронів» у специфікації на

олію куркуми.

З метою забезпечення стабільної терапевтичної дії Холелесан, капсул

для ментолу, суми турмеронів було введено нормування по верхній та

нижній межі.

Критерії для мінімального та максимального вмісту діючих речовин в

капсулах розраховували, виходячи із вмісту досліджуваних компонентів в

ефірних оліях та вмісту останніх в одній капсулі. Згідно проведених

розрахунків вміст ментолу в одній капсулі має бути від 2,0 мг до 4,5 мг,

вміст суми турмеронів – від 2,0 мг до 5,0 мг,

Кількісне визначення ментолу та турмеронів (компонентів ефірних олій

м’яти та куркуми) у «Холелесан» капсулах проводили методом ГРХ. Вміст

189

діючих речовин в ГЛЗ розраховували за середніми значеннями відношення

площі піка визначуваної речовини до площі піка внутрішнього стандарту - 1

тридеканол.

В процесі підбору оптимальних умов для вилучення ментолу та

турмеронів із капсульної маси проводили дослідження з вибору

оптимального розчинника та умов вилучення основних компонентів. З

метою вибору екстрагента для вилучення проводили випробування при

ультразвуковій обробці та безпосередньому струшуванні із різними

розчинниками (табл. 5.15).

Таблиця 5.15

Результати дослідження умов виділення компонентів ефірних олій із

капсульної маси «Холелесан» капсул

Розчинник Умови Вміст

ментолу,

мг/капс.

Вміст суми

турмеронів

мг/капс.

Метанол Обробка в ультразвуковій

бані протягом 5 хв

3,1±0,2 3,6±0,2

Струшування протягом 5 хв 2,9±0,2 3,7±0,2

Етанол Обробка в ультразвуковій

бані протягом 5 хв

3,9±0,2 4,5±0,2

Струшування протягом 5 хв 3,4±0,2 4,3±0,2

Як видно з результатів дослідження, наведених в таблиці 5.15,

найбільш повне вимивання компонентів ефірних олій із капсульної маси

досягається у випадку використанням етанолу при дії ультразвуку.

Для визначення оптимальної тривалості ультразвукової обробки, яка б

забезпечила максимальне вилучення ментолу та турмеронів із таблетної

маси, проводили серію досліджень з різною тривалістю обробки (табл.

5.16).

Для пришвидшення процесу осадження твердих частинок допоміжних

речовин зразки після ультразвукової обробки центрифугували.

190

Таблиця 5.16

Вплив тривалості ультразвукової обробки на вилучення ментолу та

турмеронів з капсульної маси «Холелесан» капсул

Тривалість ультразвукової

обробки, хв

Вміст ментолу,

мг/капс.

Вміст суми

турмеронів мг/капс.

5 3,9±0,2 4,5±0,2

10 3,8±0,1 4,6±0,2

15 3,9±0,2 4,4±0,03

Таким чином, проведені нами дослідження, дали змогу запропонувати

етанол 96 % для вилучення компонентів олій з проби; ультразвукову

обробку протягом 5 хв для підвищення ефективності вилучення з капсульної

маси; центрифугування – для покращення осадження видимих твердих

частинок і зменшення часу пробопідготовки.

При виборі хроматографічної колонки було досліджено характеристики

піків ментолу і турмеронів, застосовуючи ряд колонок з макроголом 20000

Р, як наприклад DB-WAX, НР-WAX. Найкращі значення коефіцієнтів

розділення піків β-турмерону і α-турмерона, Аr-турмерону і β-турмерону,

числа теоретичних тарілок, розрахованого за піком ментолу, параметрів

придатності хроматографічної системи було отримане на колонці фірми

Agilent, HP-Innowax, 19091N-133.

Методика ідентифікації та кількісного визначення ментолу та

турмеронів у «Холелесан» капсулах.

Випробовуваний розчин. В центрифужну пробірку зважували 500 мг

порошку розтертої капсульної маси, додавали 10 мл етанолу 96 % Р,

інтенсивно струшували протягом 5 хв, витримували в ультразвуковій бані

протягом 5 хв і центрифугували зі швидкістю 5000 об / хв протягом 5 хв;

надосадову рідину фільтрували в мірну колбу місткістю 25 мл через фільтр

«біла стрічка» з 3 г натрію сульфату безводного Р, попередньо змоченого

етанолом 96% Р. Екстракцію повторювали двічі по 6 мл етанолу 96 % Р в

191

цих же умовах, фільтрати об’єднували. Фільтр з натрій сульфатом промивали

2 мл етанолу 96 % Р, до отриманого розчину додавали 2,0 мл розчину

внутрішнього стандарту, розчин перемішували і доводили до позначки

етанолом 96 % Р.

Розчин порівняння. 72,0 мг СЗ куркуми олії і 45,0 мг СЗ ментолу

розчиняли в етанолі 96 % Р і доводили об'єм розчину до 50,0 мл цим же

розчинником. 5,0 мл отриманого розчину і 2,0 мл розчину внутрішнього

стандарту доводили етанолом 96 % Р до 25,0 мл, перемішували.

Розчин внутрішнього стандарту. 100,0 мг 1-тридеканолу розчиняли в

етанолі 96 % Р і доводили об'єм розчину етанолом 96 % Р до 50,0 мл.

Контрольний розчин. Етанол 96 % Р.

Колонка:

- матеріал: кварц;

- розмір: 30 м х 0,25 мм;

- нерухома фаза: макрогол 20000 Р (товщина шару 0.25 мкм);

- газ-носій: гелій для хроматографії Р;

- лінійна швидкість газу-носія: 1,5 мл / хв.;

- поділ потоку: 1 : 1;

- температура колонки: початкова температура 100 °С, потім

підвищували температуру зі швидкістю 5 °С/хв до 180 °С, витримували

протягом 5 хв, потім підвищували температуру до 220 °С зі швидкістю 10 °С

/ хв і витримували при даній температурі протягом 3 хв;

- температура блоку вводу проб 220 ° С;

- температура детектора 250 ° С;

- детектор: полум'яно-іонізаційний.

Хроматографували по 1 мкл контрольного розчину, розчину порівняння і

випробовуваного розчину.

Порядок виходу піків на хроматограмі розчину порівняння: етанол,

ментол, 1-тридеканол, α-турмерон, β-турмерон, Аr-турмерон.

Придатність хроматографічної системи:

- коефіцієнти розділення піків α -турмерону і β-турмерону, Аr-турмерону

і β-турмерону, отримані для розчину порівняння, повинні бути не менше 1,0;

192

- число теоретичних тарілок, розраховане за піком ментолу на

хроматограмі розчину порівняння, повинно бути не менше 10 000;

- відносне стандартне відхилення, розраховане за відношенням площ

піків ментолу або суми площ α-турмерону, β-турмерону, і Аr-турмерону до

площі піку 1-тридеканолу, повинно відповідати вимогам ДФУ.

Вміст ментолу (Х) в капсулі, в міліграмах, розраховують за формулою:

10001002550

525

10

01

10

01

mB

PbmB

mB

PbmBX (5.5)

де:

В1 - середнє значення відношення площі піку ментолу до площі піку 1-

тридеканола (внутрішній стандарт), розраховане з хроматограм

випробовуваного розчину;

В0 - середнє значення відношення площі піку ментолу до площі піку 1-

тридеканола (внутрішній стандарт), розраховане з хроматограм

розчину порівняння;

m1 - маса наважки капсульної маси, в міліграмах;

m0 - маса наважки СЗ ментолу, взятої для приготування розчину

порівняння, в міліграмах;

Р - вміст ментолу, вказаний у сертифікаті, у відсотках;

b - середня маса вмісту капсули, в міліграмах.

Вміст суми турмеронів (Х) в капсулі, в міліграмах, розраховують за

формулою:

10001002550

525

10

01

10

01

mB

PbmB

mB

PbmBX , ( 5.6 )

де:

∑В1 - середнє значення відношення суми площ піків Аr-турмерону, α-

турмерону і β-турмерону до площі піку 1-тридеканолу (внутрішній

стандарт), розраховане з хроматограм випробовуваного розчину;

∑В0 - середнє значення відношення суми площ піків Аr-турмерону, α-

турмерону і β-турмерону до площі піку 1-тридеканолу (внутрішній

стандарт), розраховане з хроматограм розчину порівняння;

m0 - маса наважки олії куркуми, взятої для приготування розчину

порівняння, в міліграмах;

m1 - маса наважки капсульної маси, в міліграмах;

Р - вміст турмеронів, вказаний у сертифікаті на СЗ куркуми олії, у

відсотках;

193

b - середня маса вмісту капсули, в міліграмах.

За вимогами ДФУ [92], для випробування на ідентифікацію потрібно

визначати такі валідаційні характеристики як специфічність та придатність

хроматографічної системи, а для випробування кількісного визначення –

лінійність, правильність, специфічність, придатність хроматографічної

системи, збіжність в діапазоні застосування методики.

Параметри придатності хроматографічної системи і

характеристики хроматографічних піків ментолу та Аr-турмерону, α-

турмерону і β-турмерону розраховували з розчину порівняння і представлено

в таблиці 5.17.

Таблиця 5.17

Параметри придатності хроматографічної системи та

характеристики хроматографічних піків ментолу та турмеронів при їх

ідентифікації та кількісному визначенні в «Холелесан» капсулах

Характеристики

хроматографічних

піків

Ментол

α -турмерон

β-турмерон

Аr-турмерон

Середнє значення часу

утримання, хв

8,3 19,2 20,7 21,0

Коефіцієнт симетрії 1,1 0,9 0,9 0,8

Кількість теоретичних

тарілок

57850 666311 1001118 1086300

Відносне стандартне

відхилення для

відношень площ піків

0,36 0,45 0,19 0,25

Коефіцієнт розділення

піків - 3,8 1,6

194

Як свідчать приведені дані, коефіцієнти розділення піків α -турмерону

і β-турмерону, Аr-турмерону і β-турмерону, задовольняють вимоги ДФУ,

оскільки є більшими від одиниці. Відносне стандартне відхилення,

розраховане за відношенням площ піків ментолу або суми площ α-

турмерону, β-турмерону, і Аr-турмерону до площі піку 1-тридеканолу,

відповідає вимогам ДФУ, число теоретичних тарілок, розраховане за піком

ментолу на хроматограмі розчину порівняння, повинно бути не менше

10 000.

Таким чином запропонована методика дозволяє надійно

ідентифікувати діючі речовини та кількісно їх визначати.

Дослідження специфічності методики. Вивчаючи специфічність

методики, нами проведено порівняльний аналіз хроматограм контрольного

розчину, розчину порівняння та випробовуваного розчину та розчину

плацебо. На хроматограмі контрольного розчину та розчину плацебо немає

піків, які співпадають за часами утримування з піками ментолу, Аr-

турмерону, α-турмерону і β-турмерону на хроматограмі розчину порівняння,

а на хроматограмі випробовуваного розчину (рис. 5.21) часи утримування

піків ментолу, Аr-турмерону, α-турмерону і β-турмерону співпадають з

часами утримування піків ментолу. Аr-турмерону, α-турмерону і β-

турмерону на хроматограмі розчину порівняння (рис. 5.22). Таким чином,

запропоновано хроматографічні умови кількісного визначення ментолу, Аr-

турмерону, α-турмерону і β-турмерону витримують вимоги валідаційної

характеристики “специфічність”.

195

Рис. 5.21. Хроматограма розчину порівняння, отримана в умовах

кількісного визначення ефірних олій м’яти перцевої та куркуми.

Рис. 5.22 - Хроматограма випробовуваного розчину «Холелесан»

капсул, отримана в умовах кількісного визначення ефірних олій м’яти

перцевої та куркуми.

Дослідження лінійності методики. Дослідження лінійності,

правильності і прецизійності вивчали одночасно на 12 модельних розчинах,

які охоплювали діапазон концентрацій від 40% до 150 % від декларованого

вмісту ментолу та суми турмеронів відповідно.

196

На основі відношень площ піків ментолу та Аr-турмерону, α-турмерону

і β-турмерону до площ піків внутрішнього стандарту на хроматограмах

розчинів з точно відомою їх концентрацією будували графіки залежності

відношень площ відповідних піків від концентрації модельних розчинів у

нормалізованих координатах, та розраховували параметри лінійності,

результати яких наведені у таблицях Щ.7 і Щ.8 для кількісного визначення

ментолу та у таблицях Щ.10 і Щ.11 для кількісного визначення суми

турмеронів.

Валідаційні характеристики методики кількісного визначення ментолу

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що лінійність

методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених концентрацій:

коефіцієнт кореляції був рівний 0,9999, залишкове стандартне відхилення

становило 0,21. Графік залежності оптичної густини від концентрації

проходить практично через початок координат, розрахований довірчий

інтервал a підтверджує статистичну і практичну незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Щ.7).Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Щ.9).

Дослідження прецизійності (збіжності). Збіжність методики

кількісного визначення ментолу характеризує ступінь близькості результатів

для серії вимірювань за методикою при її виконанні в одних і тих самих

умовах протягом невеликого проміжку часу. На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці Щ.9 можна зробити висновок про збіжність

методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не вийшов за

межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As (5)).

Валідаційні характеристики методики кількісного визначення суми

турмеронів.

197

На основі проведених досліджень можна зробити висновок, що

лінійність методики підтверджується у всьому діапазоні досліджених

концентрацій: коефіцієнт кореляції був рівний 0,99941, залишкове

стандартне відхилення становив 1,299. Графік залежності оптичної густини

від концентрації проходить практично через початок координат,

розрахований довірчий інтервал a підтверджує статистичну і практичну

незначущість константи а.

Дослідження правильності. Випробування проводили за методом

“введено-знайдено” (табл. Щ.10). Результати проведених досліджень свідчать

про статистичну та практичну незначущість систематичної похибки в

порівняні з максимально допустимою невизначеністю аналізу (табл. Щ.12).

Дослідження прецизійності (збіжності). Збіжність методики

кількісного визначення суми турмеронів характеризує ступінь близькості

результатів для серії вимірювань за методикою при її виконанні в одних і тих

самих умовах протягом невеликого проміжку часу. На підставі результатів

досліджень, наведених в таблиці Щ.12, можна зробити висновок про

збіжність методики, оскільки жоден з результатів за величиною похибки не

вийшов за межі максимально допустимої невизначеності аналізу ( d % As

(5)).

В результаті проведених досліджень встановлено, що дана методика

кількісного визначення ментолу та суми турмеронів у капсулах Холелесан

відповідає критеріям специфічності, робасності, лінійності, правильності та

прецизійності (збіжності) у всьому діапазоні застосування методики.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення

біологічно активних речовин комплексного густого екстракту Седавіту в

“Седавіт” таблетках. Ідентифікаційними критеріями обрано наявність

ізовалеріанової кислоти, хлорогенової, кофейної та розмаринової кислот,

198

кверцитину; кількісними критеріями – вміст флавоноїдів – не менше 1,2 мг,

нікотинаміду – 13,9-16,1 мг, тіаміну гідрохлориду – 2,7-3,3 мг на одну

таблетку. Вивчено валідаційні характеристики розроблених методик

відповідно до вимог ДФУ, діюче видання.

2. Розроблено методики ідентифікації біологічно активних речовин

цмину піщаного екстракту сухого та моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого у “Холелесан” капсулах. Ідентифікаційним критерієм для

“Холелесан” капсул обрано наявність ізосаліпурпозиду, апінгенін-7-

глікозиду, хлорогенової кислоти та рутину, кількісним критерієм якості –

вміст флавоноїдів 3,0-10,0 мг, на одну капсулу. Вивчено валідаційні

характеристики розроблених методик: специфічність, лінійність,

правильність, прецизійність, робасність відповідно до вимог ДФУ, діюче

видання.

3. Розроблені методики ідентифікації та кількісного визначення суми

куркуміноїдів, як основних представників біологічно активних речовин

екстракту куркуми в ГЛЗ «Холелесан» капсулах, кількісним критерієм

якості обрано вміст куркуміноїдів – 16 - 24 мг на одну капсулу. Вивчено

основні валідаційні параметри, які підтверджують можливість

використання розробленої методики для ідентифікації та кількісного

визначення куркуміноїдів в капсулах.

4. Розроблені методики ідентифікації та кількісного визначення

ментолу та суми турмеронів, як основних представників біологічно

активних речовин олій м’яти перцевої та куркуми в ГЛЗ «Холелесан»

капсулах. Кількісним критерієм якості запропоновано встановити вміст

ментолу – 2,0 - 4,5 мг, турмеронів – 2,0 - 5,0 мг в одній капсулі. Вивчено

основні валідаційні параметри, які підтверджують можливість

використання розробленої методики для ідентифікації та кількісного

визначення ментолу та суми турмеронів в капсулах.

5. З метою забезпечення стабільної терапевтичної дії «Холелесан»,

капсул для усіх діючих речовин (ментолу, суми турмеронів, суми

199

куркуміноїдів та суми флавоноїдів) запропоновано обмеження вмісту по

верхній та нижній межам.

200

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення та вирішення

наукової задачі, що виявляється у виборі маркерів для ідентифікації та

кількісного визначення при обґрунтуванні критеріїв якості якісних та

кількісних випробувань, в розробці та валідації методів контролю якості

екстрактів Седавіту, цмину піщаного квіток, моркви дикої плодів і нагідок

квіток, куркуми та лікарських засобів на їх основі: «Седавіт», таблеток та

«Холелесан», капсул.

2. За результатами проведених фітохімічних досліджень валеріани

коренів з кореневищами, хмелю шишок, глоду плодів, м’яти листя, звіробою

трави обрано характеристичні речовини-маркери для їх ідентифікації у КГЕ

Седавіту: для валеріани коренів – кислоту ізовалеріанову, для м’яти листя –

кислоту розмаринову, для звіробою трави – гіперицин і псевдогіперицин, для

хмелю шишок – кверцетин, для глоду плодів – кислоту ферулову.

3. На підставі результатів фітохімічних досліджень якісного складу і

кількісного вмісту БАР цмину піщаного квіток, моркви дикої плодів та

нагідок квіток визначено ідентифікаційні маркери: ізосаліпурпозид та

апігенін-7-глюкозид для цмину піщаного квіток, скополетин, рутин та

лютеолін для моркви дикої плодів, рутин, кислота хлорогенова та

календулозиди – для нагідок квіток. Розроблено методики їх ідентифікації та

спектрофотометричні методики кількісного визначення суми флавоноїдів,

проведено їх валідацію. Встановлено, що кількісним критерієм якості цмину

піщаного квіток є вміст флавоноїдів – не менше 1,0 % в перерахунку на

ізосаліпурпозид, для моркви дикої плодів – не менше 0,1 % у перерахунку на

лютеолін, для нагідок квіток – не менше 0,4% в перерахунку на гіперозид.

Додатково для моркви дикої плодів запропоновано кількісним критерієм

якості вміст ефірної олії – не менше 1,4 %.

4. Обґрунтовано критерії якості КГЕ Седавіту, встановлено показники

якості, розроблено відповідні методики та проведено їх валідацію. Як

ідентифікаційні маркери обрано хлорогенову, ферулову, кофейну,

201

розмаринову та ізовалеріанову кислоти, кверцетин, гіперицин і

псевдогіперицин. Кількісними показниками якості КГЕ Седавіту обрано

вміст флавоноїдів – для врахування вмісту БАР хмелю шишок, звіробою

трави й глоду плодів і вміст гідроксикоричних кислот – для врахування БАР

м’яти листя і валеріани коренів. Кількісним критерієм якості є вміст

флавоноїдів – 1,0 - 3,5 % в перерахунку на рутин, вміст гідроксикоричних

кислот – 0,3 - 0,7 % в перерахунку на кислоту розмаринову.

5. Запропоновано критерії якості цмину піщаного квіток екстракту

сухого і моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракту густого. Визначено

ідентифікаційними маркерами для цмину піщаного квіток екстракту сухого

ізосаліпурпозид та апігенін-7-глюкозид; для моркви дикої плодів та нагідок

квіток екстракту густого - скополетин, рутин, кислоту хлорогенову,

лютеолін, календулозиди. Кількісним критерієм якості запропоновано вміст

флавоноїдів: для цмину піщаного екстракту сухого – від 20 до 40 % в

перерахунку на ізосаліпурпозид, для моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого – 1,0–3,0 % в перерахунку на гіперозид. Розроблено

відповідні методики та проведено їх валідацію.

6. Встановлено показники якості «Седавіт» таблеток, обґрунтовано

критерії їх стандартизації з урахуванням вмісту БАР або маркерів у ланцюзі

ЛРС – рідкий екстракт – КГЕ – ГЛЗ, розроблено відповідні методики аналізу.

Ідентифікаційними критеріями обрано наявність ізовалеріанової,

хлорогенової, кофейної та розмаринової кислот, кверцетину; кількісними

критеріями – вміст флавоноїдів – не менше 1,2 мг, нікотинаміду – 13,9-

16,1мг, піридоксину гідрохлориду – 2,7-3,3 мг в одній таблетці.

7. Обґрунтовано показники якості «Холелесан» капсул, розроблено

відповідні методики аналізу, проведено їх валідацію, обрано критерії

стандартизації у ланцюзі ЛРС – рідкий екстракт/настойка – КГЕ – ГЛЗ.

Ідентифікаційним критерієм обрано наявність ізосаліпурпозиду, апінгенін-7-

глюкозиду, кислоти хлорогенової та рутину, куркуміноїдів, ментолу,

турмеронів; кількісним критерієм якості – вміст флавоноїдів – 3,0-10,0 мг,

202

ментолу – 2,0-4,5 мг, турмеронів – 2,0-5,0 мг, куркуміноїдів – 16-24 мг в

одній капсулі.

8. Розроблено МКЯ на ЛЗ «Седавіт» таблетки, які впроваджено у

виробництво на ПАТ «Київмедпрепарат» корпорації «Артеріум» та МКЯ на

ЛЗ «Холелесан» капсули, які будуть впроваджені у виробництво і в даний час

перебувають на етапі реєстрації.

9. Обґрунтовано методики порівняльної оцінки хімічного складу

комплексних екстрактів, отриманих за різними технологіями, вибрані

критерії їх подібності. Для первинної оцінки різниці якості екстрактів

запропоновано наступні аналітичні методики: порівняння положення

максимумів поглинання і питомих показників розчинів екстрактів та їх

хроматографічних профілів за принципом «відбитків пальців».

203

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. European Pharmacopoeia. – 6th ed. – Strasbourg: European Directorate for the

Quality of Medicines & Health Care, 2007 – 3292 p.

2. ВР Pharmacopoeia [Електронний ресурс] – електронний оптичний диск,

2001.

3. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium. Valerian

Root. Valeriana officinalis. Analytical, quality control and therapeutical

monographs – Santa Cruz, California: American Herbal Pharmacopoeia,

1999.

4. British Herbal Pharmacopoeia (BHP). - British Herbal Medicine Association,

1996. - Р. 29-30.

5. Валерианотерапия нервно-психических болезней / [Фурса Н. С.,

Григорьева Е. А., Корниевская В. Г., Соленникова С. Н., Каграманян И.

Н, Корниевский Ю. И.].– Запорожье, 2000. – 287с.

6. Фурса М. С. Валепотріати – перспективна група природних біологічно

активних сполук видів родини валеріанових / М. С. Фурса, В. І.

Литвиненко, Д. А. Пакалн // Фармацевтичний журнал. – 1983. – № 3. –

С. 27-30.

7. Фурса М. С. Валепотріати – перспективна група природних біологічно

активних сполук видів родини валеріанових / М. С. Фурса, В. І.

Литвиненко, Д. А. Пакалн // Фармацевтичний журнал. – 1995. – № 3. –

С. 38-42

8. Фурса Н. С. Возможности обнаружения, количественного определения

основных действующих веществ и прогноза на их основе седативного

эффекта сырья валерианы, его лекарственных форм заводского и

аптечного приготовления // Н. С. Фурса, А. А. Парфенов, П. Ю.

Шкроботько // Вестник Пермской государственной фармацевтической

академии. – 2007. – № 2. – С. 319-322.

204

9. Кабишев К. Э. Определение екстрактивных веществ в ЛРС при

различной технологии получения екстрактов / К. Э. Кабишев, Е. И.

Саканян, Б. Я. Молдаев // Хим. – фарм. журн. – 2002. – № 5. – С. 34-37.

10. Lamaison J. Medicinal Lamiaceae with antioxidant properties, a potential

source of rosmarinic acid / J. Lamaison, C. Petitjean-Freytet, A. Carnat //

Pharm. Acta Helv.— 1991. – Vol. 66, № 7. – Р. 185–188.

11. Фурса М. С. Деякі аспекти хімічних досліджень сполук первинного та

вторинного обміну видів родини валеріанових / М. С. Фурса, С. В.

Талашова, С. А. Кручинкіна, В. І. Литвиненко, М. Ф. Комісаренко, О. С.

Амосов, А. В. Дьоготь, С. Д. Тржецінський, Ю. І. Корнієвський //

Фармацевтичний журнал. – 1992. – № 5-6. – С. 24-29.

12. Рибальченко А. С. Сучасні дані хіміко-фармакологічних досліджень

валеріани лікарської // А. С. Рибальченко, М. С. Фурса, В. І. Литвиненко

// Фармацевтичний журнал. – 1980. – № 4. – С. 28-33.

13. Чекалюк Л.С. До питання стандартизації комплексного лікарського

засобу на основі екстрактів валеріани і меліси та гліцину / Л. С. Чекалюк

// Матеріали ХІІІ міжнародного медичного конгресу студентів і молодих

вчених. – Тернопіль, 2009. – С.229.

14. Чекалюк Л.С. До питання аналізу комплексних лікарських засобів на

основі екстрактів валеріани та меліси // Матеріали ХІV міжнародного

медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2010. –

С.891

15. Коновалова О. А. Содержание валепотриатов и эфирных масел в

подземных органах некоторых дикорастущих видов Valeriana officinalis

флоры СССР / О. А. Коновалова, Ю. Н. Горбунов, К. С. Рыбалко //

Растительные ресурсы. – 1984. – № 2. – С. 387-391

16. Комарова Е. Л. Выделение и идентификация валереновой кислоты из

подземных органов валерианы (Valeriana officinalis) / Е. Л. Комарова, Н.

С. Цыбулько, В. И. Шейченко, А. Я. Хорлин, В. С. Фонин, Ж. Ю.

Ивлева, Д. М. Попов // Химико-фармацевтический журнал. – 2000. – №

10. – С. 22-24.

205

17. Хишова О. М. Cтандартизация лекарственных форм на основе

растительного сырья корневищ с корнями валерианы, травы пустырника

и плодов боярышника / О. М. Хишова, Л. Н. Дунец // Химико

фармацевтический журнал. – 2004. – № 2. – С. 37-40.

18. Шкроботько П. Ю. Кількісне визначення складних ефірів біологічно

активних сполук у настоянках валеріани різних виробників / П. Ю.

Шкроботько, Д. М. Попов, М. С. Фурса // Фармац. журн. – 2010. – № 2. –

С. 54-58.

19. Панченко С. В. Сучасні дані фітохімічних і фармакологічних досліджень

роду Valeriana L / С. В. Панченко, В. Г. Корнієвська, Ю. І. Корнієвський

// Запорізький медичний журнал. – 2010. – № 4. – С. 54-59.

20. Anderson L., Barqnes L.Herbal medicines. – 3 edition. - Electronic version

21. Birnbaum G.J. Stereochemistry of Valerianae sesquiterpenoids: Crystal

structure of Valerianic acid / G.J. Birnbaum, J.A. Findlay, J.J. Krepinsky // J.

Org. Chem. – 1978. – V. 43. – № 2. – P. 272–276.

22. Bos Rein. Determination of valepotriates / Bos Rein, Woerdenbag Herman J. ,

Pras Niesko // J. Chromatogr. A. - 2002. - 967, № 1. - С. 131-146

23. Bos R. A structure of faurinone, a sesquiterpene ketone isolated from

Valeriana officinalis / R. Bos, H. Hendriks, J. Kloosterman and al. //

Phytochemistry. – 1983. – V. 22. – № 6. – P. 1505–1506

24. Bos R. Analytical aspects of phytotherapeutic valerian preparations / Bos, R.,

Woerdenbag, H.J., Hendriks, H., Zwaving, J.H., De Smet, P.A.G.M., Tittlel,

G., Wikström, H.V., Scheffer. // Phytochem Anal. – 1996. –№ 7. – P. 143–

151.

25. Boyadzhiev L. Extraction of valerenic acids from valerian (Valeriana

officinalis L.) rhizomes / L. Boyadzhiev, D. Kancheva, C. Gourdon //

Pharmazie. - 2004. – 59, № 9. – С. 727-728.

26. Муравьева Д. А., Фармакогнозия/Д.А. Муравьева.// Москва.: Медицина,

1981.- 656 с.

206

27. Фармацевтическая энциклопедия Украины / Голова ред. рады В.П.

Черных. —2-е изд., — К.: «МОРІОН», 2010. - 1632 с

28. Максютина Н. П., Растительные лекарственные средства/Н.П.

Максютина, Н.Ф. Комисаренко, А.П. Прокопенко, и др.// К.: Здоров’я,

1985.- 280 с.

29. WНО monographs on selected medicinal plants. Vol. 2. CRATAEGUS —

World Health Organization. — Geneva, 2002.

30. Аббасова Т. Ю. Антоцианы плодов некоторых видов CRATAEGUS L./

Т.Ю.Аббасова, Э.Н. Новрузов, Э.И. Мамедов // Химия растительного

сырья. – 2012. – №3. – С.177-180

31. Гончаров Н. Ф. Фенольные соединения североамериканских видов рода

боярышник/ Н.Ф. Гончаров, А.М. Ковалева, А.М. Комисаренко //

Российский медико-биологический вестник имени академика И.П.

Павлова. – 2008. – №3. –С.150 – 154.

32. Котова Е.Е. Стандартизация плодов боярышника и лекарственных

препаратов на их основании по показателю «Количественное

определение»/ Е.Е. Котова, А.Г. Котов, Н.П. Хованская // Фармаком. –

2004. –№4– С. 1-7

33. Формазюк В. И. Енциклопедия пищевых лекарственных ростений:

Культурные и дикоростущие растения в практической медицине /

Формазюк В. И.; под ред. Н. П. Максютиной. – К.: Издательство А. С. К.,

2003. – 792 с.

34. Ліпкан Г. М. Хміль звичайний – лікарська та харчова рослина / Г. М.

Ліпкан // Фітотерапія в Україні. – 2004. – № 3-4. – С. 37-40.

35. Мамчур Ф.І. Довідник з фітотерапії / Мамчур Ф. І. – [2-е вид. перер. і

доп.] – К.: Здоров’я, 1986. – 280 с.

36. Григорчук О. Хмiль у народнiй та науковiй медицинi / О. Григорчук, О.

Тихонов // Фармацевтичний журнал. – 2002. – № 5. – С. 90-93.

37. Ляшенко М. Кориснi речовини хмелю / М. Ляшенко, Н. Кравчук //

Харчова i переробна промисловість. – 2003. – № 8-9. – С. 23-25.

207

38. Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология: Руковод. для врачей /

Соколов С. Я. – М.: Мед. информ. агентство, 2000. – 976 с.

39. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. А.М.

Гродзінський. – К.: Голов. ред. УРЕ, 1989. – 544 с.

40. Lermusieau G. Varietal discrimination of hop pellets. II. Comparison between

fresh and aged samples / Guillaume Lermusieau, Sonia Collin // J. Amer. Soc.

Brew. Chem. – 2001. – Vol. 59, № 1. – P. 39-43.

41. Зузук Б. Хмель вьющийся (син. хмель обыкновенный). Humulus lupulus

L. / Б. Зузук, Р. Куцик // Провизор. – 2004. – № 13. – С. 45-53.

42. Chemistry and biology of hop flavonoids / J. F. Stevens, C. L. Miranda, D. R.

Buhler [et al.] // J. Am. Soc. Brew. Chem. – 1998. – Vol. 56, № 4 – P. 136-

145.

43. Fate of xanthohumol and related prenylflavonoids from hops to beer / J.F.

Stevens [et al.] // J. Agric. Food Chem. – 1999. – Vol. 47. – P. 2421- 2428.

44. Исследование состава шишек хмеля / О. А. Горошко, В. П. Пахомов, И.

А. Самылина [и др.] // Фармация. – 2000. – № 4. – С. 48-50.

45. Григорчук О. Ю. Ідентифікація та кількісне визначення діючих речовин

шишок хмелю / О. Ю. Григорчук, О. І. Тихонов, Л. В. Вронська // Вісник

фармації. – 2002. – № 1. – С. 17-20.

46. Stevens J. F. Quantitative analysis of xanthohumol and related

prenylflavonoids in hops and beer by liquid chromatography – tandem mass

spectrometry / J. F. Stevens, A. W. Taylor, M. L. Deinzer // J. Chromatoge A.

– 1999. – Vol. 832. – P. 97-107.

47. Хімічне вивчення ліпофільної фракції шишок хмелю звичайного / С. І.

Берестова, В. М. Ковальов, С. В. Ковальов [та ін.] // Вісник фармації. –

2006. – № 1. – С. 22-25.

48. Stevens J. F. Xanthohumol and related prenylflavonoids from hops and beer:

to your good health / J. F. Stevens, Page J.E. // Phytochemistry. – 2004. – Vol.

65, № 10. – P. 1317 – 1330.

208

49. A novel prenylchalcone from Humulus lupulus / Wang Wen Shu, Zhou Ya

Wei, Ye Yun Hua [et al.] // Chin. Chem. Lett. – 2004. – Vol. 15, № 10. – P.

1195-1196.

50. Prenylflavonoids and phloroglucinol derivatives from hops (Humulus lupulus)

/ Zhao Feng, Watanabe Yuki, Nozawa Hajime [et al.] // J. Natur. Prod. –

2005. – Vol. 68, № 1. – P. 43-49.

51. Photolysis of hop-derived trans-iso-б-acids and trans-tetrahydroiso-б-acids:

Product identification in relation to the lightstruck flavour of beer / Heyerick

Arne, Zhao Yining, Sandra Pat [et al.] // Photochem. and Photobiol. Sci.: An

International Journal. – 2003. – Vol. 2, № 3. – P. 306-314.

52. Prenylflavonoids from Humulus lupus. / J. F. Stevens, M. A. Ivancic, V. L.

Hsu [et al.] // Phytochemistry. – 1997. – Vol. 44. – P. 1575-1585.

53. Stevens J. F. Quantitative analysis of xanthohumol and related

prenylflavonoids in hops and beer by liquid chromatography-tandem mass

spectrometry / J.F. Stevens, A.W. Taylor, M. L. Deinzer // J. Chromatogr. A.

– 1999. – Vol. 832. – P. 97-107.

54. Identification of a potent phytoestrogen in hops (Humulus lupulus L.) and

beer / S.R. Milligan, J.C. Kalita, A. Heyerick [et al.] // J. Clin. Endocrinol.

Metab. – 1999. – Vol. 84, № 6. – P. 2249-2252.

55. Определение пренилированных флавоноидов хмеля и фитопрепаратов на

его основе с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ / М. А. Алексеева, К.

С. Сычев, К. И. Эллер [и др.] // Вопросы биолог. медиц. и фармац.

химии. – 2004. – № 3. – С. 45-48.

56. Арзамасцев А. П. Определение полифенольных компонентов хмеля с

помощью обращено-фазовой ВЭЖХ / А. П. Арзамасцев, М. А.

Алексеева, К. И. Эллер, // Химико-фармацевтический журнал. – 2004. –

№ 12. – С. 39-41.

57. Дейнека В. И. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина

/ В. И. Дейнека, А. М. Григорьев, В. М. Староверов // Химико-

фармацевтический журнал. – 2004. – Т. 38, № 9. – С. 23-25.

209

58. Григорчук О. Ю. Вплив режимів екстракції на вихід діючих речовин

шишок хмелю / О. Ю. Григорчук, О. І. Тихонов, Т. А. Грошовий //

Вісник фармації. – 2002. – № 3. – С. 47-50.

59. Optimization of condition for extracting polyphenols from Humulus Hupulus /

He Quoqing, Xiong Haoping, Ruan Hui [et al.] // Transactions of the Chinese

Society of Agricultural Engineering. – 2005. – Vol. 21, № 4. – P. 163-166.

60. Direct characterization of bitter acids in a crude hop extract by liquid

chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

/ Zhang X., Liang X., Xiao H. [et al.] // J. Amer. Soc. Mass Spectrom. – 2004.

– Vol. 15, № 2. – P. 180-187.

61. Попова Н. Вивчення ліпофільного екстракту з листя бадану

товстолистого / Н. Попова, І. Кожух // Вісник фармації. – 2001. – № 3. –

С. 36-37.

62. Мазурець С. Хроматографічне вивчення ліпофільної фракції з листя

хмелю звичайного / С. Мазурець, С. Ковальов // ФАРМАГНОЗІЯ ХХІ

СТОЛІТТЯ. Досягнення та перспективи: Тези доп. Ювілейної науково-

практичної конференції з міжнародною участю (м. Харків, 26 березня

2009 р.). – Х.: Вид-во НФаУ, 2009. – 305 с.

63. European Medicines Agency, COMMITTEE ON HERBAL MEDICINAL

PRODUCTS, ASSESSMENT REPORT ON HYPERICUM PERFORATUM

L., HERBA, London, 12 November 2009

64. Hypericum Perforatum L. Protective Effects on Fatand Water-soluble

Vitamins after Administration of 7, 12-Dimethylbenz(a)anthracene in Rats,

Abdulkadir Levent, Gökhan Oto, Suat Ekin, Volume 1 Issue 5 - 2014

65. WHO monographs on selected medicinal plants, Volume 2, Hypericum

perforatum - Geneva: World Health Organization, 2004

66. О.Е. Правдивцева, В.А. Куркин. Сравнительные исследования

химического состава надземной части некоторых видов рода Hypericum

L.- Химия растительного сырья. - № 1. – 2009.- С.79-82

67. E. Moroydor Derun, Z. Eslek, and S. Piskin, Extraction and Analysis of

Hypericum perforatum L. from Turkey. World Academy of Science,

210

Engineering and Technology International Journal of Chemical, Nuclear,

Metallurgical and Materials Engineering Vol:7 No:7, 201

68. Зіміна Л. М. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПО

ОБОСНОВАНИЮ СОЗДАНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ТРАВЫ ЗВІРОБОЯ / автореф. дис. на

здобуття наук. ступеня докт. фарм. наук: спец. 14.00.02 «Фармацевтична

хімія та фармакогнозія» / Л.М. Зіміна. – Самара, 2011.

69. Доля В. С. Исследование эфирных масел растений рода мята / В. С.

Доля, В. И. Мозуль, В. В. Карпенко // Вісник фармації. – 1999. – № 2. –

С. 158-159.

70. WHO monographs on selected medicinal plants, Volume 2, Menthae Piperitae -

Geneva: World Health Organization, 2004

71. Хромато-масс-спектрометрическое исследование летучих выделений

растений южного Крыма / М. Т. Дмитриев, Е. Г. Растянников, Ю. А.

Акимов [и др.] // Растительные ресурсы. – 1988. – № 1. – С. 81-84.

72. Сур С. В. Iдентифiкацiя та визначення головних активних компонентiв

протизастудних препаратiв на основi сумiшi ефiрних олiй за допомогою

газо-рiдинної хроматографії / С. В. Сур, І. Р. Дiдух, І. І. Танасов // Лiки

України. – 2001. – № 6. – С. 33-37.

73. Сур С. В. Обґрунтування критеріїв для стандартизації та розробка

методів ідентифікації й кількісного визначення активних компонентів

таблеток з екстрактами лікарських рослин / С. В. Сур, І. Р. Дідух, Т. В.

Герасимчук [та ін.] // Ліки України. – 2002. – № 2. – С. 33-36.

74. Шикимака А. Состав эфирного масла Mentha longifolia (L.) Huds. и его

изменчивость в семенном потомстве (Молдавская ССР) / А. Шикимака,

Э. Воробьова // Растительные ресурсы. – 1988. – № 4. – С. 597-605.

75. Николаев А. Эфирные масла Mentha arvensis L. из флоры Вьетнама / А.

Николаев, Ле Зуй Хай // Растительные ресурсы. – 1986. – № 1. – С. 96-99.

76. Настойки, екстракты, эликсиры и их стандартизация / под ред. В. Л.

Багировой, В. А. Северцева. – Санкт-Петербург: СпецЛит, 2001. – 223 с.

211

77. Морковь дикая, морковь обыкновенная / Б. Зузук, Р. Куцик, И. Гресько

[и др.] // Провизор. – 2005. – № 10. – С. 37-41.

78. Морковь дикая, морковь обыкновенная / Б. Зузук, Р. Куцик, И. Гресько

[и др.] // Провизор. – 2005. – № 11. – С. 30-33.

79. Сур С. В. Состав эфирных масел лекарственных растений / С. В. Сур //

Растительные ресурсы. – 1993. – № 1. – С. 98-117

80. А.В. Куркина. Исследования компонентного состава цветков

Helichrysum arearium L. Moench – Химия растительного сырья. – 2011. –

№ 2 – С.113-116.

81. Смалюх О., Нестер М., Сур С.В., Стандартизація Цмину піщаного квітів

за складом і вмістом флавоноїдів //Актуальні питання фармацевтичної і

медичної науки та практики - Запоріжжя, Запорізький державний

медичний університет. – 2013. – №3. – С. 95- 98.

82. Н.В. Попова, М.Ф.Ткаченко, П.В. Липовецкий. Исследование летучих

соединений бессмертника песчаного / Збірник наукових праць

співробітників НМАПО імені П.Л. Шупика 23(4)/2014.

83. M.Bryksa-Godzisz, Z.Weglarz, J.Przybyl. Phenolic compounds in yellow

everlasting (Helichrysum arearium L. Moench) growing wild in the middle

part of the Bug river valley // Herba polonica, Vol. 52. – 2006. – № 4 – Р. 26-

31.

84. WHO monographs on selected medicinal plants, Volume 2, Flos Calendulae -

Geneva: World Health Organization, 2004.

85. Z.C.Gazim, C.M.Rezende, S.R.Fraga, B.P. Filho, C.V.Nakamura,

D.A.G.Cortez. Analysis of the essential oils from Caledula officinalis growing

in Brazil using three different extraction procedures / Brazilian journal of

Pharmaceutical Sciences.-vol.44, n.3, jul./set., 2008. – Р. 391-395.

86. А.В. Гудзенко. Розробка підходів до стандартизації квітів нагідок

лікарських у багатокомпонентних рослинних сумішах / Фітотерапія.

Часопис — № 1, 2011. – С. 80-83.

212

87. Вопросы введения в Государственную Фармакопею Украины

монографии «Ноготков цветки» / А. Г. Котов, Э. Э. Котова, Т. М.

Тихоненко [и др.] // Фармаком. – 2005. – № 2-3. – С. 128-134.

88. WHO monographs on selected medicinal plants, Rhizoma Curcumae Longae.-

Geneva: World Health Organization, 1999

89. I.О.Журавель. Визначення кiлькiсного вмiсту куркумiноїдiв в

кореневищах куркуми довгої / Український журнал клiнiчної та

лабораторної медицини, 2012. – том 7, № 3. – С. 226 – 228

90. S. J. Kulkarni, K. N. Maske, M. P. Budre, R. P. Mahajan. Extraction and

purification of curcuminoids from Turmeric (curcuma longa L. ) /

International Journal of Pharmacology and Pharmaceutical Technology

(IJPPT), Volume 1, Issue-2. – 2012. – Р. 81-84.

91. European Pharmacopoeia - 7.5the. – 2011

92. Державна фармакопея України/ Державне підприємство “Науково-

експертний фармакопейний центр”. – І-е вид. – Доповнення 2. – Харків:

Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр”

РІРЕГ, 2008.–603с.

93. Державна фармакопея України/ Державне підприємство “Науково-

експертний фармакопейний центр”. – І-е вид. – Доповнення 3. – Харків:

Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр”

РІРЕГ, 2009. – 280 с.

94. Державна Фармакопея України / Державне підприємство “Науково-

експертний фармакопейний центр”. – І-е вид. – Доповнення 4. – Харків:

Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр”,

РІРЕГ. – 2011. – С. 538.

95. А.В. Куркина. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного

растительного сырья, содержащего флавоноиды – Бюллетень сибирской

медицины. – 2011. – № 5 – С.150-154.

213

96. А.В. Куркина, В.М. Рыжов, Е.В. Авдеева. Определение содержания

изосалипурпузида в сырье и препаратах бессмертника песчаного –

Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – Том 46, №3. – С.28-33

97. Смалюх О., Сур С.В., Стандартизація плодів Моркви дикої за складом і

вмістом флавоноїдів // Актуальні питання фармацевтичної і медичної

науки та практики - Запоріжжя, Запорізький державний медичний

університет. –№1. – 2013. – С. 88-93.

98. Чубка М.Б., Вронська Л.В., Сур С.В., Смалюх О.Г., Кернична

Н.З. Спектрофотометричне визначення флавоноїдів у плодах моркви

дикої // Медична хімія. – 2011. – Т.13, № 1. – С. 88-94.

99. Чубка М.Б., Вронська Л.В. Дослідження флавоноїдного складу насіння

моркви дикої // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних

процесів створення лікарських препаратів: Матеріали 3-ї науково-

практичної конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація

технологічних процесів створення лікарських препаратів” (1-2 жовтня

2009 р., м. Тернопіль) / Ред. кол.: Л.Я. Ковальчук та ін.. – Тернопіль:

ТДМУ. – 2009. – С. 34.

100. Чубка М.Б. Валідація методики кількісного визначення суми флавоноїдів

у плоду моркви дикої – Управління, економіка та забезпечення якості в

фармації. – 2013. – №1(27). – С.18-21.

101. Смирнова Л. Количественное определение суммы флавоноидов в

желчегонном сборе / Л. Смирнова, Л. Первых // Химико-

фармацевтический журнал. – 1999. – Т. 33, № 3. – С. 37-39.

102. Середа А. В. Биологически активне вещества и стандартизация

лекарственных растений рода Echinacea / А. В. Середа, Г. Ф. Моисеева //

Фармаком. – 1998. – № 3. – С. 13-23.

103. Дячок В. В. Количественное определение терпеноидов в комплексном

фитопрепарате / В. В. Дячок, И. М. Кожарская, Л. А. Лебединец //

Химико-фармацевтический журнал. – 2004. – Т. 38, № 9. – С. 26-27.

104. Цуркан О. О. Визначення біологічно активних речовин надземної

частини кульбаби лікарської та розробка підходів до стандартизації

214

показників якості рослини у складних фітокомпозиціях / О. О. Цуркан,

Т. В. Ковальчук, А. В. Гудзенко // Фармацевтичний журнал. – 2008. – №

2. – С. 123-128

105. Берже Уанкпо Бие. Оценка качества препаратов ромашки аптечной /

Уанкпо Бие Берже, А. О. Карасавиди, Е. И. Саканян // Фармация. – 2008.

– № 6. – С. 19-24.

106. Вивчення компонентного складу ефірних олії деревію паннонського і

деревію степового флори України / В. М. Герасимов, О. В. Мазулін, С. В.

Сур [та ін.] // Фармацевтичний журнал. – 2006. – № 1. – С. 86-88.

107. Ковальова А. Хромато-масс-спектрометричне дослідження компонентів

ефірної олії трави Potenyilla anserina / А. Ковальова, E. Абдулкафарова //

ФАРМАКОГНОЗІЯ ХХІ СТОЛІТТЯ. Досягнення та перспективи: Тези

доп. Ювілейної науково-практичної конференції з міжнародною участю

(м. Харків, 26 березня 2009 р.). – Х.: Вид-во НФаУ. – 2009. – 305 с.

108. Ковальова А. Хромато-масс-спектрометричне дослідження компонентів

ефірної олії квіток Melilotus albus / А. Ковальова, І. Грудько //

ФАРМАКОГНОЗІЯ ХХІ СТОЛІТТЯ. Досягнення та перспективи: Тези

доп. Ювілейної науково-практичної конференції з міжнародною участю

(м. Харків, 26 березня 2009 р.). – Х.: Вид-во НФаУ, – 2009. – 305 с.

109. Дослідження ефірної олії чебрецю кримського / В. С. Доля, В. І. Мозуль,

Л. А. Фуклева [та ін.] // ФАРМАКОГНОЗІЯ ХХІ СТОЛІТТЯ.

Досягнення та перспективи: Тези доп. Ювілейної науково-практичної

конференції з міжнародною участю (м. Харків, 26 березня 2009 р.). – Х.:

Вид-во НФаУ, 2009. – 305 с.

110. Ковальова А. М. Хімічний скринінг БАР листя хромато-масс-

спектрометричне дослідження ефірної олії шавлії лікарської / А. М.

Ковальова, А. В. Русанова, О. М. Якименко // ФАРМАКОГНОЗІЯ ХХІ

СТОЛІТТЯ. Досягнення та перспективи: Тези доп. Ювілейної науково-

практичної конференції з міжнародною участю (м. Харків, 26 березня

2009 р.). – Х.: Вид-во НФаУ, 2009. – 305 с.

215

111. Ефремов Е. А. Компонентный состав эфирного масла октябрьской

лапки пихты сибирской Красноярского края / Е. А. Ефремов, А. А.

Ефремов // Химия растительного сырья. – 2010. – № 3. – С. 121-124.

112. Ефремов Е. А. Компонентный состав эфирного масла июльской лапки

пихты сибирской Красноярского края / Е. А. Ефремов, А. А. Ефремов //

Химия растительного сырья. – 2010. – № 2. – С. 135-138.

113. Сравнительный анализ состава пихтового масла, полученного водно-

паровой дистилляцией и эфиромасличной фракции СО2-экстракта лапки

пихты сибирской / В. Н. Сидельников, Ю. В. Патрушев, Н. В. Сизова [и

др.] // Химия растительного сырья. – 2003. – № 1. – С. 79-85.

114. Сур С. В. Хромато-масс-спектрометрическая идентификация

компонентов эфирных масел, входящих в состав лекарственных средств

/ С. В. Сур, И. И. Танасов, И. Р. Дидух // Фармаком. – 1998. – № 2. – С.

11-17.

115. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. А.М.

Гродзінський. - К.: Голов. ред. УРЕ, 1989. - 544 с.

116. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья /

А. В. Ткачев, Е. А. Королюк, М. С. Юсубов [и др.] // Химия

растительного сырья. – 2002. – № 1. – С. 19–30.

117. Фракционный состав эфирного масла душицы обыкновенной

красноярского края / А. А. Алякин, А. А. Ефремов, С. В. Качин [и др.] //

Химия растительного сырья. – 2010. – № 1. – С. 99–104.

118. Настойки, екстракты, эликсиры и их стандартизация / под ред. В. Л.

Багировой, В. А. Северцева. – Санкт-Петербург: СпецЛит, 2001. – 223 с.

119. Wang L.H. General method for determining flavonoids in medicinal plants

and raw cosmetics using HPLC with a photodiode array detector / L.-H.

Wang, W.-H. Li // Химико-фармацевтический журнал. – 2007. – Т. 41, №

4. – С. 46-51.

120. The simultaneous separation and determination of six flavonoids and

troxerutin in rat urine and chicken plasma by reversed-phase high-

performance liquid chromatography with ultraviolet-visible detection / Gong-

216

Jun Yang, Ping Liu, Xi-Long Qu [et al.] // Journal of Chromatography B. –

2007. – Vol. 856. – P. 222-228.

121. Antioxidant flavonols from fruits, vegetables and beverages: measurements

and bioavailability / Crozier Alan, Burns Jennifer, Aziz Azlina [et al.] // Biol.

Res. – 2000. – Vol. 33, № 2. – P. 42-48.

122. Дейнека В. И. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина

/ В. И. Дейнека, А. М. Григорьев, В. М. Староверов // Химико-

фармацевтический журнал. – 2004. – Т. 38, № 9. – С. 23-25.

123. Литвиненко В. И. Изучение состава флавоноидов и полисахаридов травы

мальвы низкой (Malva pusilla Smith.) / В. И. Литвиненко, В. Н.

Бубунчикова, И. Л. Дроздова // Фармаком. – 2004. – № 4. – С. 42-46.

124. Duncan Ira J. Quantitative Determination of Coumarin in Plant Material / Ira

Duncan, R. Dustman // Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. – 1994. – Vol. 6, № 3. – P.

210-213.

125. Celeghini Renata M. S. Extraction and Quantitative HPLC Analysis of

Coumarin in Hydroalcoholic Extracts of Mikania glomerata Spreng.

(«guaco») Leaves / Celeghini Renata M. S., Vilegas Janete H. Y., Lancas

Fernando M. // J. Braz. Chem. Soc. – 2001. – Vol. 12, № 6. – P. 706-709.

126. Оганесян Є. Т. Изучение химического состава травы кориандра

посевного / Э. Т. Оганесян, З. М. Нерсесян, А. Ю. Пархоменко //

Химико-фармацевтический журнал. – 2007. – Т. 41, № 3. – С. 30-33.

127. Гризодуб О. І. Особливості фармакопейних підходів щодо кількісного

визначення лікарської рослинної сировини та сумарних фітопрепаратів. /

О. І. Гризодуб, О. А. Євтіфєєва, К. І. Проскуріна // Фармаком. – 2012. –

№ 3. – С. 7-31.

128. Омельченко З. І. Дослідження фенольних сполук Setaria italica (L.) / З. І.

Омельченко, В. С. Кисличенко, О. І. Нещерет // Фармацевтичний

журнал. – 2008. – № 1. – С. 79-83.

129. Бородіна Н. Кількісне визначення фенольних сполук Populus tremula L. /

Н. Бородіна, В. Ковальов // Фармаком. – 2004. – № 1. – C.1-4.

217

130. Хасаншина А. Р. Определение флавоноидов в побегах караганы

древовидной /А. Р. Хасаншина, Е. И. Барабанов, Л. И. Бабаскина //

Фармация. – 2009. – № 5. – С. 20-22.

131. Цуркан О. О. Ідентифікація та кількісне визначення полісахаридів у

квітках конюшини лучної / О. О. Цуркан, Т. В. Ковальчук, О. В. Бурмака

// Фармацевтичний журнал. – 2008. – № 6. – С. 109-111.

132. Вишневська Л. І. Розробка методик визначення якості настойки складної

«Простатофіт» / Л. І. Вишневська // Журнал органічної та

фармацевтичної хімії. – 2008. – Т. 6, № 1. – С. 76-80.

133. Вишневська Л. І. Наукове й експериментальне обґрунтування розробки

складу і технології настойок складних та їх стандартизація: автореф. дис.

на здобуття наук. ступеня д. фарм. наук: спец. 15.00.01 “Технологія ліків

та організація фармацевтичної справи” / Л. І. Вишневська. – Харків,

2009.

134. Виды подорожника: содержание действующих веществ / С. А. Соснина,

Г. И. Олешко, Л. Г. Печерская [и др.] // Фармация. – 2008. – № 8. – С. 21-

24.

135. Петриченко В. М. Спектрофотометрический метод определения

содержания флавоноидов в Euphrasia brevipila Burn. et Gremli / В. М.

Петриченко, Т. В. Сухинина, Н. С. Фурса // Растительные ресурсы. –

2002. – № 2. – С. 104-108.

136. Криворучко О. В. Кількісне визначення флавоноїдів і полісахаридів у

лікарських засобах з листя смородини чорної / О. В. Криворучко, О. Ю.

Ткаченко, В. С. Кисличенко // Фармацевтичний журнал. – 2002. – № 4. –

С. 76-77.

137. Фогт В. Содержание флавоноидов в противодиабетическом экстракте /

В. Фогт, Т. Степанова // Фармация. – 2007. – № 4. – С. 248-252

138. Кабишев К. Количественное определение суммы флавоноидных

соединений в интраназальных лекарственных формах препарата

«Оксофил» с полиэкстрактом из надземной части Oxytropis oxyphylla

218

(Pall.) DC. / К. Кабишев, Е. Саканян // Растительные ресурсы. – 2002. –

№ 4. – С. 120-127.

139. Евдокимова О. В. Валидация методики количественного определения

суммы флавоноидов в столбиках с рыльцами кукурузы / О. В.

Евдокимова // Фармация. – 2008. – № 7. – С. 14-17.

140. Шпичак О. С. Ідентифікація та кількісне визначення фенолкарбонових

кислот у препараті «Апісед» методом диференціальної УФ-

спектрофотометрії / О. С. Шпичак, О. І. Тихонов // Вісник фармації –

2012. – № 3 (71). – С. 32 -35.

141. Державна фармакопея України/ Державне підприємство “Науково-

експертний фармакопейний центр”. – І-е вид.– Харків: Державне

підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр” РІРЕГ, 2001.

– 556 с.

142. Державна фармакопея України/ Державне підприємство “Науково-

експертний фармакопейний центр” – І-е вид. – Доповнення 1.– Харків:

Державне підприємство “Науково-експертний фармакопейний центр”

РІРЕГ. - 2004.– 494с.

143. Кустова С. Д. Справочник по эфирных маслах / Кустова С. Д. - М.:

Пищевая промишленость, 1978. – 207 с.

144. Исследование качественного состава эфирного масла душицы

обыкновенной, произрастающей в восточной Сибири / В. М. Мирович,

Т. А. Коненкина , Г. М. Федосеева [и др.] // Химия растительного сырья.

– 2008. – № 2. – С. 61-64.

145. Выход и состав выделяемого различными способами пихтового масла /

О. Г. Панькив, В. В. Мирошниченко, В. Н. Паршикова [и др.] // Химия

растительного сырья. – 2009. – № 3. – С. 95-98.

146. ГЖХ-определение тимола и карвакрола в растительном вырье и настоях

травы чабреца / С. В. Сур, Ф. М. Тулюпа, А. Я. Толок [и др.] // Химико-

фармацевтический журнал. – 1990. – № 10. – С. 69-71.

219

147. Сур С. В. Методологія оцінки якості рослинних лікарських засобів на

підставі результатів, одержаних за допомогою сучасних аналітичних

методів // С. В. Сур // Фармацевтичний журнал. – 2002. – № 6. – С. 64-71.

148. Сур С. В. Стандартизація підходів до оцінки якості рослинних

лікарських засобів в умовах належної лабораторної практики: автореф.

дис. на здобуття наук. ступеня докт. фарм. наук: спец. 15.00.03

«Стандартизація і організація виробництва лікарських засобів» / С. В.

Сур. – Харків, 2005. – 37 с.

149. Аналитическая химия в создании, стандартизации и контроле качесва

лекарственных средств: в 3-х томах/ Под редакцией член-кор. НАН

Украины В.П. Георгиевского – Харьков: изд. «НТМТ» 2011 г. – С. 142

150. Аналитическая химия в создании, стандартизации и контроле качесва

лекарственных средств: в 3-х томах/ Под редакцией член-кор. НАН

Украины В.П. Георгиевского – Харьков: изд. «НТМТ» 2011 г. – С. 948

151. Смалюх О.Г. Стандартизація багатокомпонентного лікарського

засобу/О.Г. Смалюх, С.В. Сур // Фармацевтичний часопис, 2(30)/2014 -

Тернопіль, ТДМУ. – 2014. – С. 52-57

152. Guidelines for the assessment of herbal medicines / WHO Expert Committee

on Specification for Pharmaceutical Preparation.- Thirty-fourth Report.-

Geneva: World Health Organization, 1996.- (WHO Technical Report Series,

No.863).

153. United States Pharmacopeia (USP) [Електронний ресурс] – електронний

оптичний диск.

220

Додатки

221

Додаток А

Методика ідентифікації флавоноїдів та гідроксикоричних кислот в звіробою

траві, глоду плодах, м’яти листі, хмелю шишках, валеріани коренях та КГЕ

Седавіту методом ТШХ.

Випробовуваний розчин (а). 0,5 г подрібненої сировини звіробою трави,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 400С протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат доводять до об’єму близько

10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (b). 1,000 г подрібненої сировини глоду плодів,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 650С протягом 5 хв при

енергійному струшуванні, охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат

доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (с). 2,000 г подрібненої сировини м’яти листя,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 650С протягом 5 хв при

енергійному струшуванні, охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат

доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (d). 2,000 г подрібненої сировини хмелю шишок,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

кип’ятять на водяній бані протягом 5 хв при охолоджують і фільтрують.

Одержаний фільтрат доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (е). 2,000 г подрібненої сировини валеріани

коренів, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл

метанолу Р і кип’ятять на водяній бані протягом 5 хв при охолоджують і

фільтрують. Одержаний фільтрат доводять до об’єму близько 10 мл

метанолом Р.

Випробуваний розчин (є). 2,000 г густого екстракту, поміщають у

конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і кип’ятять на

222

Продовження додатку А

водяній бані протягом 5 хв при охолоджують і фільтрують. Одержаний

фільтрат доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Розчин порівняння(а). 5 мг гіперозиду Р, 2 мг апігенін-7-глікозиду, 2 мг

мірцетину, 5 мг кавової кислота, 5 мг кверцитину, 2 мг апігеніну розчинять в

метанолі і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

Розчин порівняння(в). 2 мг кислоти кавової Р, 5 мг рутину, 2 мг

хлорогенова кислоти, 5 мг гіперозиду, 5 мг лютеолін-7-глюкозиду, 5 мг

розмаринова кислоти, 5 мг цикорієва кислоти, 2 мг лютеоліну, розчинять в

метанолі і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 наносять у вигляді

смуги, завдовжки 10 мм, 10 мкл випробовуваного розчину ((a), (в), (с), (d) (е)

(є)) та 20 мкл розчину порівняння (а) та (в). Пластинку сушать на повітрі

протягом 10 хв, поміщають у камеру з рухомою фазою: кислота мурашина

безводна Р - вода Р – етилацетат Р (10:10:80) і хроматографують висхідним

методом. Коли фронт розчинників пройде 15 см, її виймають з камери,

сушать при температурі 100 ºС. Гарячу пластинку обприскують розчином 10

г/л аміноетилового ефіру дифенілборної кислоти Р у метанолі Р, потім

розчином 50 г/л макроголу 400 Р у метанолі Р та висушують на повітрі

впродовж 30 хв та переглядають в УФ-світлі при 365 нм.

Результат А. На хроматограмі розчину порівняння (а) мають

виявлятися зони (у порядку зростання Rf) гіперозид, апігенін-7-глікозид,

мірцетин, кофейна кислота, кверцитину, апігенін.

На хроматограмі розчину порівняння (в) мають виявлятися зони (у

порядку зростання Rf) рутин, хлорогенова кислота, гіперозид, лютеоліну-7-

глюкозид, розмаринова кислота, цикорієва кислота, лютеолін.

На хроматограмі випробовуваного розчину ((a), (в), (с), (d) (е) (є))

ідентифікують зони на рівні зон на хроматограмах розчину порівняння (а) та

(в).

223

Додаток Б

Методика ідентифікації флавоноїдів та гідроксикоричних кислот в в

звіробою траві, глоду плодах, м’яти листі, хмелю шишках, валеріани коренях

та КГЕ Седавіту методом ВЕРХ.

Випробовуваний розчин (а). 0,5 г подрібненої сировини трави звіробою,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 400С протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують. в звіробою траві, глоду плодах, м’яти листі,

хмелю шишках, валеріани коренях та КГЕ Седавіту

Випробуваний розчин (b). 1,000 г подрібненої сировини плодів глоду,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 650С протягом 5 хв при

енергійному струшуванні, охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат

доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (с). 2,000 г подрібненої сировини листя м’яти ,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані при температурі 650С протягом 5 хв при

енергійному струшуванні, охолоджують і фільтрують. Одержаний фільтрат

доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (d). 2,000 г подрібненої сировини хмелю шишок,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

кип’ятять на водяній бані протягом 5 хв при охолоджують і фільтрують.

Одержаний фільтрат доводять до об’єму близько 10 мл метанолом Р.

Випробуваний розчин (е). 2,000 г подрібненої сировини валеріани

коренів, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл

метанолу Р і кип’ятять на водяній бані протягом 5 хв при охолоджують і

фільтрують. Одержаний фільтрат доводять до об’єму близько 10 мл

метанолом Р.

224

Продовження додатку Б

Розчин порівняння. 2 мг кислоти кавової Р, 5 мг рутину, 2 мг

хлорогенова кислоти, 5 мг гіперозиду, 5 мг кверцитину 2 мг лютеоліну, 5 мг

апігеніну, 5 мг розмаринова кислоти, 5 мг ферулової кислоти, 5 мг

лютеоліну, 5 мг кверцитрину , розчинять в метанолі і доводять об’єм розчину

тим самим розчинником до 20 мл.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250 мм,

заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: 0,6 г натрію дигідрофосфату моногідрату Р розчиняють у

1000 мл води для хроматографії, доводять рН розчину кислотою фосфорною

Р до 2,5 (потенціометрично; ДФУ, 2.2.3).

- рухома фаза В: ацетонітрил;

- швидкість рухомої фази – 1,0 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 220 нм, 370, 260 нм;

- температура колонки 25 0С;

- час хроматографування 45 хв.

Використовують таку програму градієнту:

Стадія Час,хв Рухома фаза А

(% об/об )

Рухома фаза В

(% об/об )

1 0-5 90 10

2 5-30 90 → 70 10 → 30

3 30-40 70 → 60 30 → 40

4 40-45 60 40

5 45-50 60 → 90 40 → 10

6 50-60 90 10

Хроматографують 50 мкл розчину порівняння .

225

Продовження додатку Б

Хроматографічна система вважається придатною, якщо:

Коефіцієнт розділення для піків флавоноїдів на хроматограмі розчину

порівняння становить не менше 1,0.

Хроматографують 50 мкл випробовуваного розчину.

На хроматограмі випробуваного розчину відзначають піки, які

співпадають за часами утримування з піками на хроматограмі розчину

порівняння.

226

Додаток В

Методика ідентифікації ефірних олій м’яти листя та валеріани коренів в КГЕ

Седавіту.

Випробуваний зразок. 1,0 г густого екстракту розчиняють у 10 мл

суміші 96 % спирт Р - вода Р (70:30)

Розчин порівняння: 2 мг цинеолу, 2 мг лімонену, 2,5 мг ментону, 1 мг

ментофурану, 2 мг ментилацетату, 2 мг ментолу, 5 мг пулегону, 25 мг

кислоти ізовалеріанової, 5мг карвону розчиняють в етанолі і доводять тим же

розчинником об’єм до 100,0 мл. 1,0 мл отриманого розчину доводять

етанолом до 10,0 мл.

Контрольний розчин Етанол Р.

Хроматографують по 1 мкл контрольногь розчину, випробовуваного

розчину та розчину порівняння на газовому хроматографі з полум’яно-

іонізаційним детектором у таких умовах:

- колонка капілярна, розміром 60 м 0,53 мм, покрита шаром макроголу

20000 Р з товщиною шару 1 мкм або аналогічна;

- температуру колонки програмують: початкова температура 100 °С протягом

5 хв, далі підвищують температуру з швидкістю 10 °С/хв до 230°С і

витримують 22 хв;

- швидкість газу-носія (гелій Р для хроматографії) – 35 см/с (5 мл/хв);

- ділення потоку газу-носія – 1 : 1;

- температура випарника – 200 °С;

- температура детектора – 300 °С;

На хроматограмі розчину порівняння порядок виходу піків: етанол,

порядок виходу піків співпадає з порядком зважування компонентів,

вказаним у приготуванні розчину порівняння.

На хроматограмі випробуваного розчину відзначають піки, які

співпадають за часами утримування з піками на хроматограмі розчину

порівняння.

227

Додаток Г

Методика ідентифікації флавоноїдів та гідроксикоричних кислот у зразках

КГЕ Седавіту, виготовлених за різними технологіями методом ТШХ.

Випробовуваний розчин. По 1,000 г екстракту вміщують у склянку

місткістю 50 мл розчиняють у 15 мл 30 % спирту P, переносять за

допомогою 10 мл води P у ділильну лійку місткістю 100 мл, додають 40 мл

етилацетату P і струшують протягом 10 хв. Після розділення шарів, водний

(нижній) шар зливають, етилацетатний шар фільтрують через паперовий

фільтр з 2 г натрію сульфату безводного Р, попередньо змочений

етилацетатом Р. 10 мл фільтрату відганяють на водяній бані при

температурі 60˚С під вакуумом до сухого. Сухий залишок розчиняють у 0,5

мл метанолу Р.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 розміром

20 х 20 см зі скляною підложкою з товщиною шару 0,25 мм наносять у

вигляді смуги довжиною 10 мм по 15 мкл випробовуваних розчинів (1 група

– екстракти, отримані за технологією настоювання 1Н-5Н, 2-га група –

екстракти, отримані за технологією реперколяції 1Р-5Р, помічають олівцем

доріжки відповідних зразків). Пластинку сушать у струмені теплого повітря

протягом 30 хв, потім поміщають у камеру з сумішшю розчинників:

етилацетат Р - мурашина кислота безводна Р – вода Р (5:1:1) і

хроматографують висхідним способом. Коли фронт розчинників пройде 17

см від лінії старту, пластинку виймають з камери, сушать на повітрі

протягом 15 хв., потім протягом 10 хв. при температурі від 100 °С до 105

°С і обприскують гарячу пластинку розчином 10 г/л дифеніл борної кислоти

аміно етиловим ефіром Р в метанолі Р. Сушать на повітрі протягом 10 хв. і

обприскують пластинку розчином 50 г/л макроголу 400 Р в метанолі P.

Сушать на повітрі протягом 30 хв. і переглядають в УФ-світлі за довжини

хвилі 366 нм.

Відзначають на хроматограмах положення плям для всіх зразків

228

Додаток Д

Методика ідентифікації флавоноїдів та гідроксикоричних кислот у зразках

КГЕСедавіту, виготовлених за різними технологіями методом ВЕРХ.

Випробуваний розчин. 1,000 г ектракту поміщають у склянку місткістю

50 мл розчиняють у 10 мл розчинника, переносять за допомогою 20 мл води

P у ділильну лійку місткістю 100 мл, додають 15 мл етилацетату Р і

струшують протягом 5 хв. Після розділення шарів, нижній (водний) шар

зливають у конічну колбу місткістю 50 мл, а верхній (етилацетатний)

збирають у конічну колбу місткістю 100 мл. Водну фракцію поміщають знов

у ділильну лійку і екстракцію повторюють ще два рази з 15 мл етилацетату

Р, струшуючи по 5 хв. Об’єднані етилацетатні витягнення кількісно, за

допомогою 25 мл води Р, переносять назад у ділильну лійку і струшують 2

рази з водою Р, по 25 мл і 50 мл, відповідно, протягом 2 хв. Фільтрують

через фільтр «біла стрічка» з 5 г натрію сульфату безводного Р у мірну

колбу місткістю 50 мл (фільтр з натрію сульфатом безводним Р попередньо

змочують етилацетатом Р), ділильну лійку і фільтр промивають 5 мл

етилацетату Р і доводять об’єм фільтрату етилацетатом Р до мітки.

10 мл фільтрату відганяють на водяній бані при температурі 60˚С під

вакуумом до сухого. Сухий залишок розчиняють у 10 мл метанолу Р.

Розчин порівняння. 5,0 мг рутину (Sigma-Aldrich, №R5143), 5,0 мг

кверцетину (каталог Fluka 2003/2004, №83370 ), 5,0мг кавової кислоти

(каталог Fluka 2003/2004, №60020), 5,0 мг хлорогенової кислоти (каталог

Fluka 2003/2004, №25700), 5,0 мг апігеніну, 5,0 мг лютеоліну та 5,0 мг

лютеолін-7-глікозиду, 5 мг гіперозиду розчиняють у розчиннику, доводять до

25 мл тим самим розчинником. 5,0 мл одержаного розчину доводять до 100

мл рухомою фазою А.

Розчинник. Суміш 96% спирт- вода Р (70:30).

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

229

Продовження додатку Д

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250 мм,

заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: 0,6 г натрію дигідрофосфату моногідрату Р розчиняють у

1000 мл води для хроматографії, доводять рН розчину кислотою фосфорною

Р до 2,5 (потенціометрично; ДФУ, 2.2.3).

- рухома фаза В: ацетонітрил;

- швидкість рухомої фази – 1,0 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 220 нм, 370, 260 нм;

- температура колонки 25 0С;

- час хроматографування 45 хв.

Використовують таку програму градієнту:

Стадія Час,хв Рухома фаза А

(% об/об )

Рухома фаза В

(% об/об )

1 0-5 90 10

2 5-30 90 → 70 10 → 30

3 30-40 70 → 60 30 → 40

4 40-45 60 40

5 45-50 60 → 90 40 → 10

6 50-60 90 10

Хроматографують 50 мкл розчину порівняння .

Хроматографічна система вважається придатною, якщо:

- коефіцієнт розділення для піків флавоноїдів на хроматограмі розчину

порівняння становить не менше 1,0.

Хроматографують 50 мкл випробовуваного розчину .

На хроматограмі випробуваного розчину мають бути присутніми піки, які

співпадають за часом утримування з піками, що відповідають пікам рутину,

гіперозиду, лютеоліну, кверцитину та апігеніну на хроматограмі розчину

порівняння.

230

Додаток Е

Методика ідентифікації летких компонентів валеріани коренів та листя м’яти

у зразках КГЕ Седавіту, виготовлених за різними технологіями методом ГХ.

Випробуваний зразок. По 2,0 г густого екстракту вміщують у флакон

ємністю 20 мл, розчиняють у 6 мл води Р, та герметично укупорюють.

Пробу для проведення парофазної газової хроматографії витримують в

наступних умовах:

- рівноважна температура 90 о С;

- температура петлі 100 о С;

- температура лінії подачі газової проби 110 о С;

- час витримки проби 30 хв;

По 1 мл парової фази над зразком хроматографують на газовому

хроматографі з полум’яно-іонізаційним детектором у таких умовах:

- колонка капілярна, розміром 30 м 0,53 мм, покрита сорбентом HP-

INNOWax (Crosslinked Polyethylene Glycol) з товщиною шару 1 мкм або

аналогічна;

- температуру колонки програмують: початкова температура 100 °С протягом

5 хв, далі підвищують температуру з швидкістю 15 °С/хв до 230°С і

витримують 22 хв;

- швидкість газу-носія (гелій Р для хроматографії) – 35 см/с (5 мл/хв);

- ділення потоку газу-носія – 1 : 1;

- температура випарника – 200 °С;

- температура детектора – 300 °С;

231

Додаток Ж

Методика кількісного визначення вмісту суми флавоноїдів у зразках КГЕ

Седавіту, виготовлених за різними технологіями.

Вихідний розчин. 0,5 г екстракту поміщають у круглодонну колбу

місткістю 100 мл, додають і 7,0 мл хлористоводневої кислоти Р1, 25 мл

ацетону Р та кип’ятять зі зворотнім холодильником протягом 30 хв.

Кількісно, за допомогою двох порцій по 5 мл ацетону Р, переносять у мірну

колбу місткістю 50 мл, фільтруючи через фільтр «синя стрічка» і доводять

об’єм ацетоном Р до мітки.

20,0 мл одержаного розчину поміщають у ділильну лійку місткістю 100

мл, додають 20 мл води Р, 15 мл етилацетату Р і струшують протягом 5 хв.

Після розділення шарів, нижній (водний) шар зливають у конічну колбу

місткістю 50 мл, а верхній (етилацетатний) шар збирають у конічну колбу

місткістю 100 мл. Водну фракцію поміщають знов у ділильну лійку і

екстракцію повторюють ще два рази з 15 мл етилацетату Р, струшуючи по

5 хв. Об’єднані етилацетатні витягнення кількісно, за допомогою 25 мл води

Р, переносять назад у ділильну лійку і струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл

і 50 мл, відповідно, протягом 2 хв. Фільтрують через фільтр «біла стрічка» з

5 г натрію сульфату безводного Р у мірну колбу місткістю 50 мл (фільтр з

натрію сульфатом безводним Р попередньо змочують етилацетатом Р),

ділильну лійку і фільтр промивають 5 мл етилацетату Р і доводять об’єм

фільтрату етилацетатом Р до мітки.

Випробовуваний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають, ретельно перемішуючи, 5 мл розчину

гексаметилентетраміну Р, 5 мл розчину алюмінію хлориду Р, нагрівають на

водяній бані при температурі 70 0С протягом 5 хв., охолоджують і доводять

об’єм розчину метанолом Р до мітки.

Компенсаційний розчин. 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають, ретельно перемішуючи, 5 мл розчину

гексаметилентетраміну Р, нагрівають на водяній бані при температурі 70 0С

232

Продовження додатку Ж

протягом 5 хв., охолоджують і об’єм розчину доводять метанолом Р до

мітки.

Через 25 хв. після приготування записують спектр випробовуваного

розчину на спектрофотометрі в інтервалі довжин хвиль 300-500 нм у кюветі з

товщиною шару 10 мм, у порівнянні з компенсаційним розчином.

Записують довжини хвиль у максимумах поглинання та розраховують

питомі показники поглинання у максимумах поглинання на спектрах зразків

густих екстрактів, отриманих за різними технологіями

233

Додаток И

Таблиця 1

Вихідні дані для розрахунку валідаційних характеристик методики

кількісного визначення флавоноїдів у КГЕ Седавіту.

Теор.

вміст, %

А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

20 0,154 20,05 20,12 99,62

40 0,312 40,62 40.81 99.54

60 0,458 59.63 59.58 100.07

80 0,630 82,03 83,62 98.10

100 0,768 100.0 100.0 100.0

120 0,915 119,14 117.60 101.31

140 1,101 143,36 144.34 99.22

160 1,255 163.41 160.42 101.86

180 1,394 181.51 183.27 99.04

Таблиця 2

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми флавоноїдів у КГЕ Седавіту

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0121845

Sb 0.0076053388

a | 0.35294889 | ≤ | 1.6446689 |

≤ | 1.995817 |

витримується по

першому критерію

Sa 0.81621287

RSD0 0.96154434

RSD0 /b | 0.94996945 | ≤ | 2.4813896 | витримується

RSDy 53.712245

r | 0.99983975 | > | 0.99893231 витримується

234

Продовження додатку И

Таблиця 3

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у КГЕ Седавіту

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність d 2.5913693 5 Витримується

Правильність |d cp -

100| | 1.427728 | 0.979445 1.58

Витримується

по першому

критерію

S d,r (%) = 0.8387 (95, 1,9) = 1.833

Таблиця 4

Вихідні дані для розрахунку валідаційних характеристик методики

кількісного визначення гідроксикоричних кислот у КГЕ Седавіту

Теор.

вміст, %

А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

50 0,266 49,53 49,35 100,36

60 0,325 60,52 60,18 100,57

70 0,376 70,02 69,41 100,87

80 0,435 81,00 80,24 100,96

90 0,486 90,50 89,97 100,59

100 0,537 100 100 100

110 0,597 111,17 110,03 101,04

120 0,644 119,93 119,36 100,47

130 0,705 131,28 129,99 100,99

140 0,751 139,85 138,53 100,95

235

Продовження додатку И

Таблиця 5

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

гідроксикорричних кислот у КГЕ Седавіту

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0105451

Sb 0.0038584341

a | -0.32399147 | 0.70972461 |

| 3.2994219 |

витримується по

першому критерію

Sa 0.38167497

RSD0 0.34847294

RSD0 /b | 0.34483662 | | 2.6888949 | витримується

RSDy 31.787356

r | 0.99993991 | > | 0.99641584 | витримується

Таблиця 6

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення гідроксикоричних кислот у КГЕ Седавіту

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність d 0.650465 5 Витримується

Правильність |d cp -

100| | 0.585837| 0.205697 1.58

Витримується

по другому

критерію

S d,r (%) = 0.3547 (95, 1,9) = 1.8331

236

Додаток К

Методика ідентифікації флавоноїдів і фенольних сполук у нагідках квітках та

настойці, цмину піщаного квітках та сухому екстракті, моркви дикої плодах

та рідкому екстракті, моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

методом ТШХ.

Випробовуваний розчин (а).2,00 г подрібненої сировини нагідок квіток,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р і

нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують.

Випробуваний розчин (b). 1,000 г подрібненої сировини цмину піщаного

квіток, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу

Р і нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують.

Випробуваний розчин (с). 2,000 г подрібненої сировини моркви дикої

плодів, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу

Р і нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом 10 хв.

Випробовуваний розчин (d). 0,20 г моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракту густого розчиняють в 5 мл води Р та 10 мл метанолу Р за

допомогою ультразвукової бані протягом 10 хв, переносять у ділильну лійку

додають 10 мл хлороформу Р і фільтрують над натрію сульфатом

безводним Р.

Випробуваний розчин (e). 0,05 г цмину піщаного квіток екстракту

сухого розчиняють в 10 мл метанолу Р.

Випробуваний розчин (f). 0,20 г моркви дикої плодів екстракту рідкого

розчиняють в 10 мл метанолу Р за допомогою магнітної мішалки і

фільтрують через фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Випробуваний розчин (j). 0,20 г нагідок квіток настойки розчиняють в

10 мл метанолу Р за допомогою магнітної мішалки і фільтрують через фільтр

з діаметром пор не більше 0,45 мкм.

237

Продовження додатку К

Розчин порівняння(а). 5 мг рутину, 2,5 мг хлорогенової кислоти, 5,0 мг

гіперозиду, 5,0 мг апігеніну-7-глюкозиду, 2,5 мг ізосаліпурпузиду, 5,0 мг

цикорієвої кислоти, 2,0 мг лютеоліну, 2,5 мг апігеніну розчинять в метанолі і

доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

Розчин порівняння(в). 5,0 мг лютеолін-7-глюкозид, 2,5 мг кофейна

кислота, 5,0 мг кверцетин розчинять в метанолі і доводять об’єм розчину тим

самим розчинником до 20 мл.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 наносять у

вигляді смуги, завдовжки 10 мм, 10 мкл випробовуваного розчину ((a), (в), (с)

(d), (e), (f), (j)) та 20 мкл розчину порівняння (а) та (в). Пластинку сушать на

повітрі протягом 10 хв, поміщають у камеру з рухомою фазою: кислота

мурашина безводна Р - вода Р – етилацетат Р (10:10:80) і хроматографують

висхідним методом. Коли фронт розчинників пройде 15 см, її виймають з

камери, сушать при температурі 100 ºС. Гарячу пластинку обприскують

розчином 10 г/л аміноетилового ефіру дифенілборної кислоти Р у метанолі Р,

потім розчином 50 г/л макроголу 400 Р у метанолі Р та висушують на повітрі

впродовж 30 хв та переглядають в УФ-світлі при 365 нм.

Результат А. На хроматограмі розчину порівняння (а) мають

виявлятися зони (у порядку зростання Rf) рутин, хлорогенова кислота,

гіперозид, апігеніну-7-глюкозид, ізосаліпурпузид, цикорієва кислота,

лютеолін, апігенін.

Результат В. На хроматограмі розчину порівняння (в) мають

виявлятися зони (у порядку зростання Rf) лютеолін-7-глюкозид, кофейна

кислота, кверцетин.

На хроматограмі випробовуваного розчину (а) повинні проявлятися

зони, що відповідають зонам рутину хлорогенової і цикорієвій кислотам,

апігенін-7-глюкозиду, лютеоліну, апігеніну на хроматограмах розчинів

порівняння (а) та/або (в).

238

Продовження додатку К

На хроматограмі випробовуваного розчину (в) повинні проявлятися

зони, що відповідають зонам хлорогенової і кофейної кислотам, апігенін-7-

глюкозиду, ізосаліпурпузиду, лютеоліну на хроматограмах розчинів

порівняння (а) та/або (в).

На хроматограмі випробовуваного розчину (с) повинні проявлятися

зони, що відповідають зонам хлорогенової, кофейної та ферулової кислотам,

лютеолін-7-глікозиду, апігенін-7-глюкозиду, лютеоліну, апігеніну, кепферолу

на хроматограмах розчинів порівняння (а) та/або (в).

На хроматограмі випробовуваного розчину (d) повинні проявлятися

зони, що відповідають зонам рутину, хлорогенової та цикорієвої кислотам,

лютеолін-7-глікозиду, апігенін-7-глюкозидуи на хроматограмах розчинів

порівняння (а) та/або (в).

239

Додаток Л

Методика ідентифікації флавоноїдів, фенольних сполук та календулозидів у

нагідках квітках та настойці, цмину піщаного квітах та сухому екстракті,

моркви дикої плодах та рідкому екстракті, моркви дикої плодів та нагідок

квіток екстракті густому методом ВЕРХ.

Випробовуваний розчин (а).1,00 г подрібненої сировини квіток нагідок,

поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу Р

нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують. 3,0 мл одержаного розчину доводять до 10 мл

рухомою фазою А і фільтрують через фільтр із діаметром пор не більше

0,45 мкм.

Випробуваний розчин (b). 1,000 г подрібненої сировини цмину

піщаного, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 20 мл

метанолу Р нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом

10 хв, охолоджують і фільтрують. 2,0 мл одержаного розчину доводять до

10 мл рухомою фазою А і фільтрують через фільтр із діаметром пор не

більше 0,45 мкм.

Випробуваний розчин (с). 2,000 г подрібненої сировини моркви дикої

плодів, поміщають у конічну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл метанолу

Р нагрівають на водяній бані зі зворотнім холодильником протягом 10 хв,

охолоджують і фільтрують. 3,0 мл одержаного розчину доводять до 10 мл

рухомою фазою А і фільтрують через фільтр із діаметром пор не більше

0,45 мкм.

Випробовуваний розчин (d). 3,0 мл рідкого екстракту моркви дикої

плодів доводять до 10,0 мл рухомою фазою А і фільтрують через фільтр з

діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Випробуваний розчин (e). 3,0 мл рідкого екстракту нагідок квітів

доводять до 10,0 мл рухомою фазою А і фільтрують через фільтр з діаметром

пор не більше 0,45 мкм.

240

Продовження додатку Л

Випробуваний розчин (f). 0,05 г сухого екстракту цмину піщного

розчиняють в метанолі Р і доводять до 10,0 мл. 3,0 мл одержаного розчину

доводять до 10,0 мл рухомою фазою А і фільтрують через фільтр з

діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Випробовуваний розчин (j). 0,5 мг густого екстракту моркви дикої

плодів та нагідок квітів розчиняють в 10,0 мл метанолу, нагрівають зі

зворотнім холодильником протягом 10 хв охолоджують і фільтрують. 3,0 мл

одержаного розчину доводять до 10,0 мл рухомою фазою А і фільтрують

через фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Розчин порівняння (1). 2 мг кислоти кавової Р, 5 мг рутину, 2 мг

хлорогенова кислоти, 5 мг гіперозиду, 5 мг кверцитину, 2,0 мг лютеолін-7-

глюкозиду, 2 мг лютеоліну, 5 мг апігеніну, 5 мг розмаринова кислоти, 5,0 мг

цикорієвої кислоти, 5 мг ферулової кислоти, 5 мг лютеоліну, 5 мг

кверцитрину 5,0 мг ізокверцетрину, 5 мг апігенін-7-глюкозиду, 2,0 мг

ізосаліпурпузиду, 2,5 мг мірецетину, 5,0 мг нарінгеніну, 2,5 мг кемферолу

розчинять в метанолі і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до

20 мл.

Розчин порівняння (2). До 5,0 мг ФСЗ ДФУ календулозидів додають

5 мл метанолу Р, перемішують, витримують і використовують надосадову

рідину.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250 мм,

заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: 0,6 г натрію дигідрофосфату моногідрату Р розчиняють у

1000 мл води для хроматографії, доводять рН розчину кислотою фосфорною

Р до 2,5 (потенціометрично; ДФУ, 2.2.3).

241

Продовження додатку Л

- рухома фаза В: ацетонітрил;

- швидкість рухомої фази – 1,0 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 220 нм, 370, 260 нм;

- температура колонки 25 0С;

- час хроматографування 45 хв.

Використовують таку програму градієнту:

Стадія Час,хв Рухома фаза А

(% об/об )

Рухома фаза В

(% об/об )

1 0-5 90 10

2 5-30 90 → 70 10 → 30

3 30-40 70 → 60 30 → 40

4 40-45 60 40

5 45-50 60 → 90 40 → 10

6 50-60 90 10

Хроматографують 50 мкл розчину порівняння .

Хроматографічна система вважається придатною, якщо:

- коефіцієнт розділення для піків флавоноїдів на хроматограмі розчину

порівняння становить не менше 1,0.

Хроматографують 50 мкл випробовуваного розчину .

Порядок виходу піків на хроматограмі розчин порівняння (1)

ескулін, хлорогенова кислота, кофейна кислота, скополетин, 7-

гідроксикумарин, фурулова кислота, лютеолін-7-глікозид, рутин, гіперозид,

ізокверцетин, апігені-7-глікозид, цикорієва кислота, розмаринова кислота,

кверцетин, ізосаліпурпузид, мірецетин, лютеолін, кверцетин, нарінгенін,

кемпферол.

На хроматограмі випробуваного розчину (а), (б), (с) (d) (e) (f) (j)

відзначають піки, які співпадають за часом утримування з піками, що

відповідають компонентам розчину порівняння.(1).

На хроматограмі випробуваного розчину (а) (e) (j) відзначають піки, які

співпадають за часом утримування з піками, що відповідають компонентам

розчину порівняння.(2).

242

Додаток М

Методика кількісного визначення вмісту суми флавоноїдів в цмину піщаного

квітках.

Вихідний розчин 1. 0,500 г здрібненої на порошок сировини (500)

(2.9.12), поміщають у конічну колбу місткістю 250 мл, додають 50 мл спирту

(50 % об/об) Р і нагрівають на водяній бані при 60 С протягом 15 хв.

Отриманий розчин фільтрують через вату в мірну колбу місткістю 250 мл.

Вату поміщають в колбу для екстрагування, екстрагування проводять ще

чотири рази за вказаних вище умов, витягнення фільтрують у ту ж мірну

колбу та доводять об’єм розчину спиртом (50 % об/об) Р до 250,0 мл.

Отриманий розчин фільтрують через фільтр «біла стрічка», відкидаючи 10 мл

фільтрату.

Випробовуваний розчин. До 5,0 мл вихідного розчину 1 додають 5,0 мл

розчину 50 г/л алюмінію хлориду Р в 96 % спирті Р, доводять об’єм розчину

96 % спиртом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 1. 5,0 мл вихідного розчину 1 доводять 96 %

спиртом Р до 25,0 мл.

Вихідний розчин 2. 0,020 г СЗ ізосаліпурпозиду (ФСЗ ДФУ або РСЗ) ,

висушеного до постійної маси при температурі 100-105 °С, розчиняють в 96

% спирті Р, доводять об’єм розчину тим самим розчинником до 200,0 мл.

Розчин порівняння. До 2,0 мл вихідного розчину 2 додають 5,0 мл розчину

50 г/л алюмінію хлориду Р в 96 % спирті Р, доводять об’єм розчину 96 %

спиртом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 2. 2,0 мл вихідного розчину 2 доводять 96 %

спиртом Р до 25,0 мл.

Через 30 хв після приготування знімають спектр випробовуваного

розчину відносно компенсаційного розчину 1 в області від 350 нм до 500 нм

(ДФУ, 2.2.25) і вимірюють оптичну густину випробовуваного розчину в

максимумі спектра (максимум має знаходитись в діапазоні (418±5) нм).

243

Продовження додатку М

Паралельно знімають спектр розчину порівняння відносно

компенсаційного розчину 2 і вимірюють оптичну густину в максимумі

спектру.

Вміст суми флавоноїдів (Х) у відсотках, в перерахуванні на

ізосаліпурпозид і суху речовину, обчислюють за формулою:

WmA

PmAX

100

50

0

0 , де:

А - оптична густина випробовуваного розчину у максимумі спектру;

А0 - оптична густина розчину порівняння у максимумі спектру;

Р - вміст ізосаліпурпозиду, в СЗ, вказаний у сертифікаті, у відсотках.

т - маса наважки ЛРС, у грамах;

m0 - маса наважки СЗ ізосаліпурпозиду, у грамах;

W - втрата в масі при висушуванні, у відсотках.

244

Додаток Н

Методика ідентифікації календулозидів у нагідок квітках, нагідок настойці та

моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому методом ТШХ.

Випробовуваний розчин (а). До 1,00 г здрібненої на порошок сировини

нагідок квіток, додають 20 мл 50 % етанолу Р, нагрівають на водяній бані зі

зворотнім холодильником протягом 30 хв, охолоджують і фільтрують.

Фільтрат випарюють на водяній бані до об’єму близько 5 мл, охолоджують і

фільтрують крізь паперовий фільтр. Осад на фільтрі промивають 5.0 мл води

Р та змивають 5,0 мл метанолу Р. Використовують одержаний метанольний

фільтрат.

Випробовуваний розчин (в). 25 мл настойки випарюють на водяній бані

до об’єму близько 5 мл, охолоджують і фільтрують крізь паперовий фільтр.

Осад на фільтрі промивають 5.0 мл води Р та змивають 5,0 мл метанолу Р.

Використовують одержаний метанольний фільтрат.

Випробовуваний розчин (с). 0,5 г густого екстракту розчиняють 5.0 мл

води Р, фільтрують крізь паперовий фільтр. Осад на фільтрі промивають

5,0 мл метанолу Р. Використовують одержаний метанольний фільтрат.

Розчин порівняння. До 5,0 мг ФСЗ ДФУ календулозидів додають 5 мл

метанолу Р, перемішують, витримують і використовують надосадову рідину.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 наносять у

вигляді смуги, завдовжки 10 мм, 20 мкл випробовуваного розчину ((a), (в),

(с)) та 20 мкл розчину порівняння. Пластинку сушать на повітрі протягом 10

хв, поміщають у камеру з рухомою фазою: хлороформ Р – кислота оцтова

льодяна Р – метанол Р – вода Р (35:16:6:4) і хроматографують висхідним

методом. Коли фронт розчинників пройде 10 см, висушують на повітрі

впродовж 10 хв, обприскують розчином анісового альдегіду Р, витримують

протягом 10 хв у сушильній шафі при температурі від 100 0С до 105

0С і

переглядають при денному світлі.

245

Продовження додатку Н

На хроматограмі розчину порівняння мають виявлятися дві основні чітко

розділені зони синьо-фіолетового кольору. На хроматограмі

випробовуваного розчину ((a), (в), (с)) має виявлятися не менше двох чітко

розділених зон синьо-фіолетового кольору на рівні відповідних зон на

хроматограмі розчину порівняння (календулозиди).

246

Додаток П

Методика ідентифікації кумаринів у моркви дикої плодах, екстракті рідкому

моркви дикої плодів, моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

методом ТШХ.

Випробовуваний розчин (а). До 2,00 г здрібненої на порошок сировини

нагідок квітів, додають 10 мл метанолу Р, нагрівають на водяній бані при

600С протягом 10 хв, охолоджують і фільтрують.

Випробовуваний розчин (в).рідкий екстракт моркви дикої плодів.

Випробовуваний розчин (с). 2,0 г густого екстракту розчиняють 5.0 мл

води Р, додають 10,0 мл метанолу Р. витримують на ультразвуковій бані,

переносять у ділильну лійку, додають 10 мл хлороформу Р і фільтрують над

натрію сульфатом безводним Р.

Розчин порівняння (1). 0,5 мг 7-гідроксикумарину, 0,5 мг скополетину,

2,0 мг ескуліну, 2,5 мг 7-метоксикумарину, 3,0 мг 5,7-дигідрокси-4-

метоксикуркуміну розчиняють в 10 мл метанолу Р і доводять до 20,0 мл

метанолом Р.

Розчин порівняння (2). 2,0 мг епікатехіну, 3,0 мг кумарину розчиняють

в 5 мл метанолу Р і доводять до 10,0 мл метанолом Р.

перемішують, витримують і використовують надосадову рідину.

На лінію старту хроматографічної пластинки Silica gel F254 наносять у

вигляді смуги, завдовжки 10 мм, 60 мкл випробовуваного розчину (a), 25 мкл

випробовуваного розчину (в), (с)) та 5 мкл розчину порівняння (1) та 10 мкл

розчину порівняння (2). Пластинку сушать на повітрі протягом 10 хв,

поміщають у камеру з рухомою фазою: кислота оцтова льодяна Р – метанол Р

– ефір Р – толуол Р (10:10:50:50) і хроматографують висхідним методом

двічі. Коли фронт розчинників пройде 18 см, висушують на повітрі впродовж

10 хв, поміщають в камеру з сумішшю розчинників вода Р – метанол Р –

етилацетат Р (10:14:76) обприскують 2 М розчином калію гідрооксиду Р, і

переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 365 нм.

На хроматограмі розчину порівняння (1) мають виявлятися зони (у

247

Продовження додатку П

порядку зростання Rf) ескуліну, 5,7-дигідрокси-4-метоксикумарину,

скополетину, умбеліферону, 7-метоксикумарину .

На хроматограмі розчину порівняння (2) мають виявлятися зони (у

порядку зростання Rf) епікатехіну, кумарину.

На хроматограмі випробовуваного розчину ((a), (в), (с)) має виявлятися

зони на рівні відповідних зон на хроматограмі розчину порівняння (1) та (2).

248

Додаток Р

Методика ідентифікації кумаринів у моркви дикої плодах, екстракті рідкому

моркви дикої плодів, моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті густому

методом ВЕРХ.

Випробовуваний розчин (а). До 2,00 г здрібненої на порошок сировини

нагідок квітів, додають 10 мл метанолу Р, нагрівають на водяній бані при

600С протягом 10 хв, охолоджують і фільтрують через фільтр з діаметром

пор не більше 0,45 мкм..

Випробовуваний розчин (в).рідкий екстракт моркви дикої плодів.

Випробовуваний розчин (с). 1,00 г густого екстракту розчиняють 5.0 мл

води Р, додають 10,0 мл метанолу Р. витримують на ультразвуковій бані,

переносять у ділильну лійку, додають 10 мл хлороформу Р і фільтрують над

натрію сульфатом безводним Р. Фільтрат випарюють до сухого залишку,

сухий залишок розчиняють у 7 мл метанолу Р.

Розчин порівняння. 3,0 мг епікатехіну, 3,0 мг умкаліну, 3,0 мг кумарину,

3,0 мг 7-гідроксикумарину, 1,5 мг скополетину, 2,0 мг ескуліну, 3,0 мг

пірогалолу, 3,0 мг 7-метоксикумарину, 3,0 мг 5,7-дигідрокси-4-

метоксикуркуміну розчиняють в 5 мл метанолу Р і доводять до 10,0 мл

метанолом Р.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором, за таких умов:

- колонка “XTerra C 18” (фірми “Waters”, Ірландія), розміром 4,6 х 250

мм, заповнена сорбентом з розміром частинок 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту “Перевірка придатності хроматографічної

системи”.

- рухома фаза А: ацетонітрил Р – 5 г/л розчин кислоти фосфорної Р.

- швидкість рухомої фази – 1,7 мл/хв.;

- детектування за довжини хвилі 275 нм;

- температура колонки 30 0С;

- час хроматографування 30 хв.

249

Продовження додатку Р

Хроматографують по 20 мкл розчину порівняння та випробовуваного

розчину.

Порядок виходу піків на хроматограмі розчин порівняння ескулін,

пірогалол, епікатехін, скополетин, 7-гідроксикумарин, 5,7-дигідрокси-4-

метоксикуркумін, умкалін, 7-метоксикумарин

На хроматограмі випробуваного розчину (а), (б), (с) відзначають піки,

які співпадають за часом утримування з піками, що відповідають

компонентам розчину порівняння.

250

Додаток С

Методика кількісного визначення вмісту суми флавоноїдів у моркви дикої

плодах та моркви дикої плодів екстракті рідкому.

Вихідний розчин (1). 2,000 г подрібненої сировини поміщають в

круглодонну колбу місткістю 100 мл, додають 1 мл розчину 5 г/л

гексаметилентетраміну Р, 25 мл ацетону Р і 2 мл кислоти хлористоводневої

Р1. Одержану суміш кип’ятять зі зворотним холодильником протягом 30 хв,

фільтрують крізь тампон із вати у плоскодонну колбу місткістю 100 мл.

Додають тампон з вати до залишку в круглодонну колбу та екстрагують

двома порціями, по 25 мл кожна, ацетону Р, кожного разу проводячи

кип’ятіння зі зворотним холодильником протягом 10 хв, охолоджують та

фільтрують через тампон із вати. Об’єднані ацетонові вилучення фільтрують

через паперовий фільтр у мірну колбу місткістю 100 мл та доводять об’єм

вилучення ацетоном Р до позначки та перемішують.

Вихідний розчин (2). 10,0 мл екстракту поміщають у круглодонну колбу

місткістю 100 мл, додають 1,0 мл розчину 5 г/л гексаметилентетраміну Р,

35 мл ацетону Р і 7,0 мл хлористоводневої кислоти Р1. Кип’ятять зі

зворотнім холодильником протягом 30 хв, охолоджують, кількісно, за

допомогою двох порцій по 10 мл ацетону Р, переносять в мірну колбу,

місткістю 100 мл і доводять ацетоном Р до мітки.

20 мл вихідного розчину (1), (2) поміщають у ділильну лійку місткістю 250

мл, додають 20 мл води Р і струшують з однією порцією 15 мл, потім з двома

порціями, по 10 мл кожна, етилацетату Р протягом 15 хв щоразу.

Етилацетатні витяги збирають разом в іншу ділильну лійку місткістю 250 мл.

Одержане етилацетатне вилучення промивають двома порціями, по 50 мл

кожна, води Р, відкидаючи кожного разу водну фазу. Органічний шар

фільтрують через паперовий фільтр з 10 г натрій сульфату безводного Р,

попередньо змоченого етилацетатом Р, у мірну колбу місткістю 50 мл і

доводять об’єм фільтрату етилацетатом Р до позначки і перемішують.

251

Продовження додатку С

Випробуваний розчин. 10 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають 1 мл реактиву алюмінію хлориду Р і доводять

розчином 5 % (об/об) кислоти оцтової льодяної Р у метанолі Р до позначки

та перемішують.

Компенсаційний розчин. 10 мл вихідного розчину (1), (2) поміщають у

мірну колбу місткістю 25 мл і доводять розчином 5 % (об/об) кислоти

оцтової льодяної Р у метанолі Р до позначки та перемішують.

Розчин стандартного зразка лютеоліну . 0,03 г стандартного зразка

лютеоліну (Fluka) поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, додають 70 мл

95 % етанолу, розчиняють та доводять об’єм розчину 95 % етанолом до

позначки і перемішують.

Розчин порівняння. 10 мл розчину стандартного зразка лютеоліну

поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл, додають 1 мл реактиву алюмінію

хлориду Р і доводять розчином 5 % (об/об) кислоти оцтової льодяної Р у

метанолі Р до позначки та перемішують.

Компенсаційний розчин. 10 мл розчину стандартного зразка лютеоліну

поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл і доводять розчином 5 % (об/об)

кислоти оцтової льодяної Р у метанолі Р до позначки та перемішують.

Оптичну густину випробуваного розчину та розчину порівняння

вимірюють через 30 хв після приготування при довжині хвилі 390 нм

відносно компенсаційних розчинів для кожного з розчинів відповідно.

Вміст суми флавоноїдів (Х), у відсотках та в перерахунку на лютеолін,

розраховують за формулою:

0

0 нав

m 100

10 m

де Ах – оптична густина випробуваного розчину;

m0 – маса стандартного зразка лютеоліну, в г;

А0 – оптична густина розчину порівняння;

mнав – маса наважки сировини, в г;

252

Додаток Т

Методика кількісного визначення вмісту суми флавоноїдів у нагідок квітках

та настойці нагідок.

Вихідний розчин (1) У круглодонну колбу місткістю 100 мл, відважують

1,000 г сировини, подрібненої і просіяної через сито діаметром 2 мм, додають

1,0 мл розчину 5 г/л гексаметилентетраміну Р, 25 мл ацетону Р і 7,0 мл

хлористоводневої кислоти Р1. Кип’ятять зі зворотним холодильником

протягом 30 хв, охолоджують і фільтрують рідину через фільтр “синя

стрічка” у мірну колбу місткістю 100 мл. Витягнення повторюють ще два

рази по 25 мл ацетону Р, кожного разу прокип’ятивши зі зворотним

холодильником 10 хв, промивають колбу і фільтр ацетоном Р і доводять

ацетоном Р до мітки.

Вихідний розчин (2) 5,00 г настойки поміщають в колбу місткістю

100 мл, випарюють майже до сухого залишку. До залишку додають 1,0 мл

розчину 5 г/л гексаметилентетраміну Р, 15 мл ацетону Р і 7,0 мл

хлористоводневої кислоти Р1. Кип’ятять зі зворотним холодильником

протягом 30 хв, охолоджують і фільтрують рідину через фільтр “синя

стрічка” у мірну колбу місткістю 50 мл. Колбу і фільтр промивають 15 мл

ацетону Р і доводять ацетоном Р до мітки.

20,0 мл вихідного розчину (1), (2) поміщають у ділильну лійку

місткістю 100 мл, додають 20 мл води Р і 15 мл етилацетату Р, струшують

протягом 15 хв. після розділення шарів, нижній (водний) шар зливають у

конічну колбу, місткістю 50 мл, а верхній (органічний) зливають у конічну

колбу 100 мл і закривають корком. Екстракцію водного шару повторюють 2

рази по 15 мл етилацетату Р за вказаних вище умов. Об’єднані етилацетатні

витягнення кількісно, за допомогою 25 мл води Р, переносять назад у

ділильну лійку і струшують 2 рази з водою Р, по 25 мл і 50 мл, відповідно,

протягом 5 хв. Етилацетатні витягнення фільтрують через фільтр “біла

стрічка” з 5 г натрію сульфату безводного Р у мірну колбу місткістю 50 мл

(фільтр з натрію сульфатом безводним Р попередньо змочують

253

Продовження додатку Т

етилацетатом Р). Лійку промивають 10 мл етилацетату Р і доводять вміст в

мірній колбі до мітки тим самим розчинником.

Випробуваний розчин: 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, додають 1,0 мл реактиву алюмінію хлориду Р і

доводять до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової кислоти льодяної Р в

метанолі Р.

Компенсаційний розчин: 10,0 мл вихідного розчину поміщають у мірну

колбу місткістю 25 мл, доводять до мітки 5 % (об/об) розчином оцтової

кислоти льодяної Р в метанолі Р.

Оптичну густину випробуваного розчину вимірюють через 30 хв після

приготування при довжині хвилі 425 ± 2 нм відносно компенсаційного

розчину.

Вміст суми флавоноїдів (Х) у сировині, у відсотках та в перерахунку на

гіперозид, розраховують із застосуванням питомого показника поглинання

комплексу гіперозиду з алюміній хлоридом – %1

1смА = 500 за формулою:

)100(m

125

нав W

де Ах – оптична густина випробуваного розчину;

mнав – маса наважки сировини, в г;

W – вміст вологи у сировині, у %.

Вміст суми флавоноїдів (Х) у екстракті, у відсотках та в перерахунку на

гіперозид, розраховують із застосуванням питомого показника поглинання

комплексу гіперозиду з алюміній хлоридом – %1

1смА = 500 за формулою:

нав

0,625

m

де Ах – оптична густина випробуваного розчину;

mнав – маса наважки настойки, в г.

254

Додаток У

Методика кількісного визначення суми куркуміноїдів у сухому

екстракті куркуми .

Випробовуваний розчин. 20 мг субстанції розчиняють в

тетрагідрофурані Р і доводять об’єм цим же розчинником до 50,0 мл. 5,0 мл

одерханого розчину доводять до об’єму 50,0 мл рухомою фазою і фільтрують

через фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм.

Вихідний розчин 1. 20 мг СЗ куркуміну (ФСЗ ДФУ або РСЗ)

розчиняють в тетрагідрофурані Р і доводять об’єм цим же розчинником до

50,0 мл.

Розчин порівняння. 5,0 мл вихідного розчину 1 доводять до

об’єму 50,0 мл рухомою фазою і фільтрують через фільтр з діаметром пор не

більше 0,45 мкм.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором в наступних умовах:

- колонка «XTerra С18» (фірми «Waters» США), розміром 4,6 х 250 мм,

заповнена сорбентом з розміром частин 5 мкм, або аналогічна, для якої

виконуються вимоги тесту «Придатність хроматографічної системи»;

- рухома фаза: суміш тетрагідрофурану Р і розчину 10 г/л лимонної

кислоти Р (40:60);

- швидкість рухомої фази: 1,0 мл/хв.;

- температура колонки: 400С;

- детектування при довжині хвилі 420 нм;

- об’єм проби що вводиться: 20 мкл.

Хроматографують розчин порівняння. Порядок виходу піків: куркумін,

диметоксикуркумін, бісдиметоксикуркумін.

Придатність хроматографічної системи: розчин порівняння:

- ефективність хроматографічної колонки, розрахована за

основними піками, складає не менше 2000 теоретичних тарілок;

255

Продовження додатку У

- коефіцієнт симетрії основних піків від 0,8 до 1,3;

- коефіцієнт розділення основних піків має бути не менше 2,0;

- відносне стандартне відхилення, розраховане для площ основних піків,

має відповідати вимогам ДФУ.

Вміст куркуміноїдів (Х) в відсоках, розраховують за формулою:

10

01

mS

PmSХ

S1 - середнє значення площ піків куркуміну, диметоксикуркуміну,

бісдиметоксикуркуміну, розраховане із хроматограм

випробовуваного розчину;

S0 - середнє значення площ піків куркуміну, розраховане з хроматограм

розчину порівняння;

m1 - маса наважки досліджуваного зразка , в міліграмах;

m0 - маса наважки СЗ куркуміну, у міліграмах;

Р - вміст куркуміну, вказаний у сертифікаті на СЗ куркуміну, у

відсотках;

256

Додаток Ф

Таблиця 1

Первинні дані для розрахунку валідаційних характеристик методики

кількісного визначення суми флавоноїдів в цмину піщаного квіток

екстракті сухому

Теор. вміст, % А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100/Сі

введено, %

20 0,096 18.68 18.82 98.86

40 0,208 39.9 7 40.16 99.54

60 0,309 59.32 59.88 99.07

80 0,413 77.78 79.28 98.10

100 0,531 100.0 100.0 100.0

120 0,639 120.34 119.97 100.31

140 0,737 138.79 140.59 98.72

160 0,868 163.53 160.23 102.06

180 0,954 179.60 179.53 101.04

Таблиця 2

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми флавоноїдів в цмину піщаного квіток екстракті сухому

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 0.9910

Sb 0.004557

a |0.6158| ≤ |1.0491926|

≤ |1.934307|

Витримується по

першому критерію

Sa 0.5642

RSD0 0.8250

RSD0 /b |0.8324| ≤ 2.6888949| Витримується

RSDy 54.97

r |0.99989| > |0.99880286| Витримується

257

Продовження додатку Ф

Таблиця 3

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми флавоноїдів в цмину піщаного квіток

екстракті сухому

Параметр Значення Критерій 1 Критерій

2 Висновок

Прецизійність d 1.537 ≤ 5 Витримується

Правильність |d cp -

100| |-0.1670| ≤ 0.486 ≤ 1.58

Витримується

по першому

критерію

S d,r (%) = 0.8387, (95, 1,9) = 1.833

258

Додаток Х

Таблиця 1

Первинні дані для розрахунку валідаційних характеристик кількісного

визначення суми флавоноїдів в моркви дикої плодів та нагідок квіток

екстракті густому.

Теор.

вміст, %

А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

20 0,154 20,05 20,12 99,62

40 0,312 40,62 40.81 99.54

60 0,458 59.63 59.58 100.07

80 0,630 82,03 83,62 98.10

100 0,768 100.0 100.0 100.0

120 0,915 119,14 117.60 101.31

140 1,101 143,36 144.34 99.22

160 1,255 163.41 160.42 101.86

180 1,394 181.51 183.27 99.04

Таблиця 2

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми флавоноїдів в моркви дикої плодів та нагідок квіток екстракті

густому.

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0121845

Sb 0.0076053388

a | 0.35294889 | ≤ | 1.6446689 |

≤ | 1.995817 |

витримується по першому

критерію

Sa 0.81621287

RSD0 0.96154434

RSD0 /b | 0.94996945 | ≤ | 2.4813896 | витримується

RSDy 53.712245

r | 0.99983975 | > | 0.99893231 витримується

259

Продовження додатку Х

Таблиця 3

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у моркви дикої плодів та

нагідок квіток екстракті густому.

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність Δ d 2.591369

3 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| |

1.427728 | 0.979445 1.58

Витримується

по першому

критерію

S d,r (%) = 0.8387 (95, 1,9) = 1.833

260

Додаток Ц

Таблиця 1

Вихідні дані для розрахунку валідаційних характеристик методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у «Седавіт» таблетках.

Теор.

вміст, %

А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

20 0,078 20,23 19,94 101,45

40 0,152 39,48 39,98 98.75

60 0,238 61,82 60,22 102.66

80 0,302 78,18 79,96 97,77

100 0,385 100.0 100.0 100.0

120 0,459 119,22 120,45 101.31

140 0,541 140,52 140,69 98,98

160 0,616 160.01 159,92 100.06

180 0,698 181.30 180,16 100.63

Таблиця 2

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми флавоноїдів «Седавіт» таблетках.

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0016864

Sb 0.0072180773

a | -0.2285102 | | 1.5414657 |

| 1.9727846 |

Витримується по

першому критерію

Sa 0.81361012

RSD0 1.1202118

RSD0 /b | 1.1183258 | | 2.6390795 | Витримується

RSDy 54.78973

r | 0.99979097 | > | 0.99883928 | Витримується

261

Продовження додатку Ц

Таблиця 3

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у«Седавіт» таблетках.

Параметр Значення Критерій 1 Критерій

2 Висновок

Прецизійність d 2.7569308 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| | -0.0334918 | 0.91897692 1.58

Витримується

по першому

критерію

S d,r (%) = 1.4826194 (95, 1,9) = 1.8595

Таблиця 4

Вихідні дані для розрахунку лінійності, правильності і прецизійності

нікотинаміду у «Седавіт» таблетках.

Теор. вміст,

%

Середня

площа

піку

Сі знайдено, % Сі введено, % Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 13442,7 100 100 100

80 10875,4 80,9 80 101,1

85 11464,5 85,3 85 100,3

90 12175,5 90,6 90 100,6

95 12745,8 94,8 95 99,8

100 12420,3 99,8 100 99,8

105 14068,1 104,7 105 99,7

110 14825,4 110,3 110 100,3

115 15460,5 115,0 115 100,0

120 16110,4 119,8 120 99,9

262

Продовження додатку Ц

Таблиця 5

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

нікотинаміду у «Седавіт» таблетках.

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 0,98070824

Sb 0.0086877753

a | 2.062747 | | 1.6596458|

| 2,528 |

Витримується по

другому критерію

Sa 0.87598743

RSD0 0,33647609

RSD0 /b | 0,343095 | | 0,84450544 | Витримується

RSDy 13,693064

r | 0.99969804| > | 0.99809635 | Витримується

Таблиця 6

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення нікотинаміду у «Седавіт» таблетках.

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність Δ d 1,4314225 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| | -0,10176 |

0.47714082 1.58

Витримується

по першому

критерію

263

Продовження додатку Ц

Таблиця 7

Вихідні дані для розрахунку лінійності, правильності і прецизійності

піридоксину гідрохлориду у «Седавіт» таблетках.

Теор. вміст,

%

Середня

площа

піку

Сі знайдено, % Сі введено, % Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 2902,8 100 100 100

80 2295,9 79,1 80 98,9

85 2458,1 84,7 85 99,6

90 2615,4 90,1 90 100,1

95 2740,2 94,4 95 99,4

100 2870,0 98,9 100 98,9

105 3072,1 105,8 105 100,8

110 3220,8 111,0 110 100,9

115 3357,8 115,7 115 100,6

120 3480,5 119,9 120 99,9

Таблиця 8

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

нікотинаміду у «Седавіт» таблетках.

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1,0312112

Sb 0,017333547

a | -3.1762436| | 1.6596458|

| 2,528 |

Витримується по

першому критерію

Sa 1.7477397

RSD0 0.67132541

RSD0 /b | 0.65100668| | 0,84450544 | Витримується

RSDy 13.693064

r | 0.99879747| > | 0.99809635 | Витримується

264

Продовження додатку Ц

Таблиця 9

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення нікотинаміду у «Седавіт» таблетках.

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність Δ d 1,4314225 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| | -0,10176375 | 0.47714082 1.58

Витримується

по першому

критерію

265

Додаток Ш

Методика кількісного визначення вмісту суми флавоноїдів з використанням

диференціальної спектрофотометрії у «Холелесан» капсулах.

Вихідний розчин 1: 300 мг (точна наважка) порошку розтертої капсульної

маси поміщали у центрифужну пробірку, додавали 20 мл води Р, інтенсивно

струшували протягом 5 хв, центрифугували 5 хв зі швидкістю 5000 об/хв;

надосадову рідину фільтрували через фільтр «біла стрічка» у мірну колбу

місткістю 100 мл. Вилучення водою повторювали ще 3 рази за тих же умов.

Фільтр промивали 10 мл води Р і доводили об’єм розчину водою Р до

100,0 мл.

Випробовуваний розчин. До 2,0 мл вихідного розчину 1 додавали 2,0 мл

розчину 50 г/л алюмінію хлориду Р в етанолі Р, нагрівали у водяній бані при

температурі (705) 0С протягом 5 хв, охолоджували до кімнатної

температури і доводили об’єм розчину етанолом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 1. 2,0 мл вихідного розчину 1, нагрівали у водяній

бані при температурі (705)0С протягом 5 хв, охолоджували до кімнатної

температури і доводили об’єм розчину етанолом Р до 25,0 мл.

Вихідний розчин 2. 10 мг ФСЗ ізосаліпурпозиду, висушеного до

постійної маси при температурі 100-105 °С, розчиняли в 50 мл етанолу

Р, доводили об’єм розчину тим самим розчинником до 100,0 мл.

Розчин порівняння. До 2,0 мл вихідного розчину 2 додавали 2,0 мл

розчину 50 г/л алюмінію хлориду Р в етанолі Р, нагрівали у водяній бані при

температурі (705) 0С протягом 5 хв, охолоджували до кімнатної

температури і доводили об’єм розчину етанолом Р до 25,0 мл.

Компенсаційний розчин 2: 2,0 мл вихідного розчину 2, нагрівали у

водяній бані при температурі (705)0С протягом 5 хв, охолоджували до

кімнатної температури і доводили об’єм розчину етанолом Р до 25,0 мл.

Оптичну густину (ДФУ, 2.2.25) випробовуваного розчину вимірювали в

максимумі спектра при довжині хвилі (420 ± 5) нм відносно компенсаційного

266

Продовження додатку Ш

розчину 1. Паралельно вимірювали оптичну густину розчину порівняння,

відносно компенсаційного розчину 2.

Вміст суми флавоноїдів (Х) (у мг), у перерахунку на ізосаліпурпозид,

розраховували за формулою:

mA

bmАX

0

0 , де

А - оптична густина випробовуваного розчину;

А0 - оптична густина розчину порівняння;

m - маса наважки, у міліграмах;

m0 - маса наважки ФСЗ ізосаліпурпозиду, у міліграмах;

b - середня маса вмісту однієї капсули, у міліграмах.

267

Додаток Ш 1

Специфікація якості «Холелесан», капсул

Найменування

показника Допустимі норми

Методи

контролю

Опис Тверді желатинові капсули, корпус і кришечка жовтого

кольору, порошок від жовтого до жовто-оранжевого кольору

з зеленувато-коричневим відтінком, з вкрапленнями та

специфічним запахом.

Візуально

Ідентифікація

Ментол

Турмерони

Куркуміноїди

Флавоноїди

А. На хроматограмі випробовуваного розчину, одержаній

при кількісному визначенні, повинен бути присутній пік, час

утримування якого має співпадати з часом утримування піку

ментолу на хроматограмі розчину порівняння

В. На хроматограмі випробовуваного розчину, одержаній

при кількісному визначенні, повинні бути присутні піки, час

утримування яких має співпадає з часом утримування піків

ar-турмерону, α-турмерону и β-турмерону на хроматограмі

розчину порівняння

С. На хроматограмі випробовуваного розчину, одержаній

при кількісному визначенні, повинні бути присутні піки, час

утримування яких має співпадає з часом утримування піків

куркуміну, диметоксикуркуміну, бісдиметоксикуркуміну на

хроматограмі розчину порівняння.

D. На хроматограмі випробуваного розчину повинні

виявлятися жовтувато-оранжева флуоресціююча зона на

рівні зони рутину на хроматограмі розчину порівняння;

жовтувато-зелена флуоресціююча зона на рівні зони

апігенін-7-глюкозиду на хроматограмі розчину порівняння;

вище неї - коричнева зона, відповідна зоні ізосаліпурпозиду

на хроматограмі розчину порівняння. Допускається

наявність інших зон

ДФУ, 2.2.28

ДФУ, 2.2.28

ДФУ, 2.2.29

ДФУ, 2.2.27

Розпадання Не більше 30 хв ДФУ, 2.9.1.

Середня маса Від 333 мг до 387 мг ДФУ, 2.9.5

Однорідність

маси

Не більше, ніж 2 з 20 визначених окремо, індивідуальних

мас вмісту капсули, можуть відхилятися від середньої маси

вмісту капсули більше, ніж на ± 7,5 %. При цьому жодна

індивідуальна маса не має відхилятися від середньої маси

більше, ніж на ± 15 %.

ДФУ, 2.9.5

Кількісне

визначення

Вміст ментолу в одній капсулі, має бути від 2,0 мг до 4,5 мг

в перерахуванні на середню масу.

Вміст суми турмеронів в одній капсулі, має бути від 2,0 мг

до 5,0 мг в перерахуванні на середню масу.

Вміст суми куркуміноїдів в одній капсулі, має бути від 16,0

мг до 24,0 мг в перерахуванні на куркумін і середню масу.

Вміст суми флавоноїдів в одній капсулі, має бути від 3,0 мг

до 10,0 мг в перерахуванні на ізосаліпурпузид і середню

масу.

ДФУ, 2.2.28

ДФУ, 2.2.28

ДФУ, 2.2.29

ДФУ, 2.2.25

268

Додаток Ш 2

Специфікація якості «Седавіт», таблеток

Найменування

показника

Допустимі межі Методи

контролю

Опис Таблетки від бежевого до коричневого кольору з

вкрапленнями, овальної форми, з двояковипуклою

поверхнею.

Візуально

Ідентифікація

Кислота

ізовалеріанова

Поліфенольні

сполуки

Нікотинамід

та піридоксину

гідрохлорид

А. На хроматограмі випробовууваного розчину має бути

присутній пік, який за часом утримування співпадає з

часом утримування піку ізовалеріанової кислоти на

хроматограмі розчину порівняння.

В. На хроматограмі випробовуваного розчину мають бути

присутні піки, які співпадають за часом утримування з

піками, що відповідають пікам хлорогенової, кофейна та

розмаринової кислот та кверцитину на хроматограмі

розчину порівняння.

С. На хроматограмі випробуваного розчину мають бути

присутні пік, які співпадають за часом утримування з

піками, що відповідають пікам нікотинаміду та

піридоксину гідрохлориду на хроматограмі розчину

порівняння.

ДФУ, 2.2.28

ДФУ, 2.2.29

ДФУ, 2.2.29

Розпадання Не більше 30 хв ДФУ, 2.9.1.

Середня маса Від 617,5 мг до 682,5 мг ДФУ, 2.9.5

Стиранність Не менше 1% ДФУ, 2.9.7

Однорідність

маси

відхилення маси кожної таблетки від середньої маси має

бути в межах ±5% і відповідати вимогам ДФУ.

ДФУ, 2.9.5

Кількісне

визначення

В одній таблетці

Вміст сума флавоноїдів має бути не менше 1,2 мг в

перерахунку на рутин та середню масу таблетки

Вміст нікотинаміду має бути від 13,9 до 16,1 мг в

перерахунку на середню масу таблетки

Вміст піридоксину гідрохлориду має бути від 2,7 до 3,3

мг в перерахунку на середню масу таблетки

ДФУ, 2.2.25

ДФУ, 2.2.29

ДФУ, 2.2.29

269

Додаток Щ

Таблиця 1

Вихідні дані для розрахунку валідаційних характеристик методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у «Холелесан» капсулах.

Теор.

вміст, %

А Сі знайдено, % Сі введено, %

Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 0,361 100 100 100

20 0,072 19,96 20,11 99,27

40 0,144 40,02 39,93 100,23

60 0,219 60,81 59,81 101,67

80 0,289 80,22 79,98 100,30

100 0,361 100 100 100

120 0,430 119,32 119,58 99,78

140 0,500 138,72 139,64 99,35

160 0,570 158,04 160,11 98,71

180 0,641 177,73 179,49 99,01

200 0,719 199,35 199,19 100,08

Таблиця 2

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми флавоноїдів у «Холелесан» капсулах

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 0.99106

Sb 0.004557

a | 0.61580 | | 1.04919|

| 1.93431|

Витримується по

першому критерію

Sa 0.56423

RSD0 0.82502

RSD0 /b | 0.83246 | |2.68889| Витримується

RSDy 54.96872

r | 0.99989 | > | 0.99880 | Витримується

270

Продовження додатку Щ

Таблиця 3

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми флавоноїдів у «Холелесан» капсулах

Параметр Значення Критерій

1

Критерій

2 Висновок

Прецизійність d 1.5375 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| | -0.16704 | 0.48619 1.58

Витримується

по першому

критерію

Таблиця 4

Вихідні дані для розрахунку лінійності, правильності і прецизійності

для кількісного визначення суми куркуміноїдів у «Холелесан» капсулах

Теор.

вміст, %

Сума площі піків

куркуміноїдів S Сі знайдено, % Сі введено, % Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 4911,7 100 100 100

50 2409,5 49,06 49,33 99,43

60 2940,0 59,86 59,89 99,95

70 3434,6 69,93 69,87 100,07

80 3917,6 79,76 79,17 100,74

90 4424,4 90,08 90,01 100,07

100 4911,7 100 100 100

110 5397,9 109,90 109,68 100,20

120 5885,9 119,83 119,87 99,97

130 6378,8 129,87 129,13 100,57

140 6871,3 139,86 139,45 100,32

150 7368,6 150,02 149,55 100,31

271

Продовження додатку Щ

Таблиця 5

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми куркуміноїдів у «Холелесан» капсулах.

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0059

Sb 0.00245

a | -0.39224| | 0,46986|

| 4,00612|

Витримується по

першому критерію

Sa 0.2563

RSD0 0.2567

RSD0 /b | 0.2553| | 3.4914 | Витримується

RSDy 33.2339

r | 0.99997| > | 0.99446 | Витримується

Таблиця 6

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми куркуміноїдів у «Холелесан» капсулах

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійність Δ d 0.63018 5 Витримується

Правильність |d cp – 100| | 0,12192| 0.19000 1.58

Витримується

по першому

критерію

272

Продовження додатку Щ

Таблиця 7

Вихідні дані для розрахунку лінійності, правильності і прецизійності

методики кількісного визначення ментолу в «Холелесан» капсулах

Теор.

вміст, %

Відношення

площ піків

ментолу до 1-

тридеканолу В

Сі знайдено, % Сі введено, % Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 1,227 100 100 100

40 0,464 38,75 39,79 97,38

50 0,595 48,48 49,81 97,32

60 0,722 58,81 59,87 98,23

70 0,844 68,77 69,57 98,86

80 0,972 79,27 79,71 99,45

90 1,102 89,81 90,23 99,50

100 1,227 100 100 100

110 1,354 110,38 110,22 100,14

120 1,483 120,85 120,44 100,34

130 1,601 130,48 129,87 100,47

140 1,732 141,14 139,82 100,94

150 1,852 150,97 149,55 100,95

Таблиця 8

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

ментолу в «Холелесан» капсулах«Холелесан» капсулах

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 1.0247303

Sb 0.0017610074

a | -2.4484193 | | 0,32239694|

| 2,7204852 |

Витримується по

другому критерію

Sa 0.17787417

RSD0 0.21082265

RSD0 /b | 0.20573477 | | 2.7586207 | Витримується

RSDy 38.031521

r | 0.99998464| > | 0.99736586 | Витримується

273

Продовження додатку Щ

Таблиця 9

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення ментолу в «Холелесан» капсулах

Параметр Значення Критерій

1

Критерій

2 Висновок

Прецизійність Δ d 2,2834321 5 Витримується

Правильність |d cp - 100| | -0,61447| 0.659170 1.58

Витримується

по першому

критерію

Таблиця 10

Вихідні дані для розрахунку лінійності, правильності і прецизійності

методики кількісного визначення суми турмеронів в «Холелесан»

капсулах

Теор.

вміст, %

Відношення

суми площ піків

турмеронів до 1-

тридеканолу В

Сі знайдено, % Сі введено, % Сі знайдено·100 /

Сі введено, %

100 0,97 100 100 100

40 0,38 38,65 39,79 97,13

50 0,47 48,83 49,81 98,03

60 0,57 58,94 59,87 98,45

70 0,66 68,83 69,57 98,95

80 0,77 79,26 79,71 99,43

90 0,87 89,70 90,27 99,38

100 0,97 100 100 100

110 1,06 110,34 110,23 100,10

120 1,13 117,20 120,44 97,31

130 1,21 125,81 129,88 96,87

140 1,31 135,61 139,82 96,98

150 1,40 144,96 149,55 96,93

274

Продовження додатку Щ

Таблиця 11

Результати дослідження лінійності методики кількісного визначення

суми турмеронів в «Холелесан» капсулах

Параметр

лінійності

Значення

параметра Критерій Висновок

b 0.965

Sb 0.011

a | 1.547 | | 1,989|

| 2,720 |

Витримується по

другому критерію

Sa 1.096

RSD0 1.299

RSD0 /b | 1.346 | | 2.759| Витримується

RSDy 38.032

r | 0.99941| > | 0.99737 | Витримується

Таблиця 12

Результати дослідження прецизійності та правильності методики

кількісного визначення суми турмеронів в «Холелесан» капсулах

Параметр Значення Критерій 1 Критерій 2 Висновок

Прецизійні

сть Δ d 2,289 5 Витримується

Правильніс

ть |d cp - 100| | - 1,447| 0.660 1.58

Витримується

по першому

критерію

275

Додаток Ю

276

Продовження додатку Ю

277

Продовження додатку Ю

278

Продовження додатку Ю

279

Додаток Я

280

Продовження додатку Я

281

Продовження додатку Я

282

Продовження додатку Я

283

Продовження додатку Я

284

Продовження додатку Я

285

Продовження додатку Я