肿瘤遗传标记肿瘤遗传标记 -DNA-DNA 修复与修复与

肿瘤发病风险的研究肿瘤发病风险的研究

魏庆义 , M.D., Ph.D.

流行病系

肿瘤遗传标记肿瘤遗传标记 -DNA-DNA 修复与修复与

肿瘤发病风险的研究肿瘤发病风险的研究

魏庆义 , M.D., Ph.D.

流行病系

美国休斯顿德州医学中心MD Anderson Cancer Center

肿瘤死亡病因

电离辐射 3%

Tobacco 30%

酗酒 5%成年人膳食和肥胖症 30%

其他 7%免疫因素 5%

缺乏运动 5%

遗传因素 5%

病毒感染 5%

产前因素和生长因素产前因素和生长因素 5%5%

Harvard School of Public Health, 1998Harvard School of Public Health, 1998

基本数据基本数据 :: 百万百万

美国人口美国人口 : : 300.0300.0 吸烟者吸烟者 :: 46.546.5 每年癌症患者每年癌症患者 1.31.3 每年肺癌患者每年肺癌患者 0.50.5 每年头颈部癌患者每年头颈部癌患者

0.040.04

吸烟与肿瘤

ACS, 2009

遗传因素一定在起作用遗传因素一定在起作用 !!

Peto J, Nature, 2001

吸烟在不同人群中有不同危害

Heart disease

9%Strok9%

TB5%

Stomach cancer

9%

Liver cancer11%

Other respiratory

27%

Esophageal cancer

8%

Lung cancer18%

Other cancer

4%Heart disease36%

Strok5%

Stomach +liver+TB

1%Other respiratory

12%

Esophageal cancer

2%

Lung cancer39%

Other cancer

5%

中国 美国

Cell CycleArrest

DNA Repair

Cancer

Apoptosis

Transcription Dependent Apoptosis

Transcription IndependentApoptosis

DNADNA 损伤损伤 -- 修复与肿瘤发生的机制修复与肿瘤发生的机制 DNADNA 损伤损伤 -- 修复与肿瘤发生的机制修复与肿瘤发生的机制

p53 Proteinp53 ProteinAccumulationAccumulation

DNA

DAMAGEAltered ExpressionAltered ExpressionBAX, Fas, Bcl2PIG3

Binding to Transcription Binding to Transcription

Replication-Repair FactorsReplication-Repair Factors

• TFIIH (XPB, XPD) and p62

binds to p53

• PCNA (p21WAF1 and GADD45)

Increased ExpressionIncreased Expression p21WAF1, MDM2, cyclin G, and GADD45

Modified from Harris, 1994

DNA 修复基因和肿瘤发生 基因 肿瘤 基因 肿瘤

XP(A) 皮肤癌 XP(B) 皮肤癌XP(C) 皮肤癌XP(D) 皮肤癌XP(E-G) 皮肤癌

hMLH1 结肠癌hPSM1/2 结肠癌hMSH2 结肠癌hMSH3 结肠癌hMSH6 结肠癌

pRB 视网膜母细胞瘤P53, hCHK2 Li-Fraumeni 综合症P16 黑色素瘤ATM 乳腺癌

BRCA1/2 乳腺癌…

正常修复功能 修复功能缺陷

DNADNA 修复的特定通路修复的特定通路

DNA断裂

重组（重组（ HRHR ）和）和 非重组修复 （非重组修复 （ NHEJNHEJ ） ） 重组（重组（ HRHR ）和）和 非重组修复 （非重组修复 （ NHEJNHEJ ） ）

氧化损伤

多碱基剪切修复多碱基剪切修复(BER) (BER)

多碱基剪切修复多碱基剪切修复(BER) (BER)

DNA加成物多碱基剪切修复多碱基剪切修复

(NER)(NER)多碱基剪切修复多碱基剪切修复

(NER)(NER)

铰链物

NER, HR & NHEJNER, HR & NHEJ的综合修复的综合修复

NER, HR & NHEJNER, HR & NHEJ的综合修复的综合修复

人类 DNA 修复通路人类 DNA 修复通路 修复类型 基因种类 损伤种类 修复类型 基因种类 损伤种类 单碱基剪切修复单碱基剪切修复 DNA ligase (LIG3), 单碱基损伤

DNA glycosylase (MBD4, MPG, MYH, NTH1, OGG1, SMUG1,TDG, UNG), APE1, APE2, XRCC1,ADPRT, ADPRTL2, ADPRTL3 ...

多碱基剪切修复多碱基剪切修复 XPA, XPC, XPE, XPF/ERCC4, 多碱基损伤 XPG/ERCC5, ERCC1, LIG1, （紫外线、吸烟）

CSB/ERCC6,CSA/CKN1, XAB2, TFIIH (XPB/ERCC3 XPD/ERCC2, GTF2H1, GTF2H2\1, GTF2H3,GTF2H4, CDK7, CCNH, MNAT), DDB1, DDB2, MMS19, CENN2, AD23A, RAD23B, RPA1, RPA2, RPA3 ...

碱基错配修复 MSH2, MHS3, MSH6, MSH4, 碱基错配MSH5, MLH1, MLH3, PMS1, PMS2, PMS2L3, PMS2L4 ...

Wood et al, Science, 2001

重组修复 RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, DNA 双链断裂 RAD51D, RAD54L, RAD54B, V(D)J 重组

RAD52, DMC1, MRE11A, NBS1, ERCC1, XPF/ERCC4, XRCC2 XRCC3, XRCC4, XRCC5, XRCC6 XRCC7, XRCC8, BRCA1, BRCA2 ...

XP 病人和正常人中皮肤癌发生的年龄分布

Kraemer, PNAS, 1997

Skin cancers in normal population

Skin cancers in XP population

XP = xeroderma pigmentosum

变量 病例 对照 OR (95% CI) P value

No. (%) No. (%)

总数 895 898

年龄 0.493 ≤ 55 439 (49.1) 455 (50.7) > 55 456 (50.9) 443 (49.3)性别 0.231 男 674 (75.3) 654 (72.8) 女 221 (24.7) 244 (27.2)种族 0.859 白人 767 (85.7) 763 (85.0) 西裔 69 (7.7) 70 (7.8) 非裔 59 (6.6) 65 (7.2)吸烟 <0.0001 从 无 291 (32.5) 310 (34.5) 1.39 (1.09–1.78) 曾经 239 (26.7) 441 (49.1) 1.00 未间断 365 (40.8) 147 (16.4) 3.97 (3.08–5.13)喝酒 <0.0001 从无 235 (26.3) 398 (44.3) 1.00 曾经 206 (23.0) 149 (16.6) 2.12 (1.60–2.81) 未间断 454 (50.7) 351 (39.1) 2.10 (1.68–2.63)家族史 0.748 有 516 (57.7) 511 (56.9) 1.00 无‡ 379 (42.3) 387 (43.1) 1.01 (0.83-1.23)

头颈部肿瘤病例 - 对照研究中部分变量的频数分布2000-2006

*Differences between cases and controls were analyzed by two-sided 2 and Student’s t tests

实验室血样处理流程

PHAPHA

PH

AP

HA

Spin

SpinWhole blood Whole blood

short-term cultureshort-term culture

1ml1ml 1ml1ml 1ml1ml

Mutagen Mutagen sensitivitysensitivity

assayassay

BP

DE

BP

DE

Co

ntr

ol

Co

ntr

ol

BP

DE

BP

DE

Gam

ma

Gam

ma

1ml1ml

BPDE-BPDE-Induce DNAInduce DNA

adducts adducts assayassay

DNADNAextractionextraction

1ml1ml

RT- PCR forRT- PCR forgene expressiongene expression

Long-termLong-termstoragestorage

cDNAcDNA DNADNA

1ml1ml

RNARNAextractionextraction

GenotypingGenotyping

Lymphocyte isolationLymphocyte isolation(frozen)(frozen)

CAT/LucCAT/Lucassaysassays

DNA repairDNA repaircapacitycapacity

2 ml2 mleacheach

TransfectionTransfection

Heparinized, 10-30 mlHeparinized, 10-30 ml Sample collectionSample collection(cases and controls)(cases and controls)

1ml1ml

PlasmaPlasmaSerum Serum

烟草致癌物诱导的 DNA 损伤与修复机制烟草致癌物诱导的 DNA 损伤与修复机制

OH

BPDE O

HO

过氧化酶

DNA 加成物

DNA 恢复正常

Benzo[a]pyrene

吸烟

修复复合体

连接

POL/, ligasePCNA, RFC RPA

NER Core Proteins

ERCC1XPAXPB/ERCC3XPCXPD/ERCC2XPE/DDB1/2XPE/ERCC4XPG/ERCC5

Neumann et al., Mol Carcino, 2005

Li et al., Int J Cancer. 2001

BPDE- 诱导 DNA 加成物的检测

头颈部肿瘤研究

Cancer Res 2007; 67: (12). June 15, 2007

变量 病例 (n = 803) 对照 (n = 839) P or OR (95% CI)* n (%) n (%)

总数加成物中位数 <0.0001≤ 29.22 / 107 295 (36.7) 420 (50.0) 1.00> 29.22 / 107 508 (63.3) 419 (50.0) 1.71 (1.39–2.10)

白人加成物中位数 <0.0001≤ 29.22 / 107 235 (35.3) 355 (48.8) 1.00> 29.22 / 107 431 (64.7) 338 (51.2) 1.81 (1.45–2.27)

*Adjusted for the matching variables: age (in years), sex, ethnicity, smoking and alcohol use.

染色体对 DNA 损伤剂的敏感性测定

变量 病例 (n = 895) 对照 (n = 898) P or OR (95% CI)* n (%) n (%)

总数中位数 <0.0001≤ 0.43 347 (38.8) 441 (49.1) 1.00> 0.43 548 (61.2) 457 (50.9) 1.57 (1.29–1.90)

白人中位数 <0.0001≤ 0.43 302 (39.4) 382 (50.1) 1.00> 0.43 465 (60.6) 381 (49.9) 1.56 (1.27–1.91)

*Adjusted for the matching variables: age (in years), sex, ethnicity, smoking and alcohol use.

Cancer Res 2008; 68: (11). June 1, 2008

宿主报告基因的 DNA 损伤修复测定

4863 bp

Ap

Enh

PLuc

Bgl II

Xbal I

Pvu I

BamH I

Nar I

Bgl II

pCMVlucpCMVcat

5000 bp

Ap

Enh

P

cat

Hind III

Xbal I

EcoR I

EcoR I BPDEBPDE BPDEBPDE

Qiao et al., Mutat Res, 2002

0

1

2

3

Ist 2nd 3rd 4th

Cases = 803Controls = 839

趋势检验 : P < 0.001

调整

相对

比数

DRC (%) 四分位数

个体 DNA 修复功能与头颈部肿瘤发病分险

High Low

Li et al., Can Res, 2007

0

1

2

3

Ist 2nd 3rd 4th

0

1

2

3

Ist 2nd 3rd 4th

病例 = 721对照 = 721

趋势检验 : P < 0.0001 修复功能

Cases = 767Controls = 763

趋势检验 : P = 0.0001 染色体敏感性

DNA 加成物

Wang et al.,CCR, 2009

Wang et al., Cancer Res, 2007

反式蛋白质芯片测定修复蛋白水平

Wei et al., CEBP, 2005

57 病例， 63 对照

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

相对比数

相对表达水平 :

ERCC1

XPA

XPC

XPD/ERCC2

XPF/ERCC4

XPG/ERCC5

(compared to beta-actin)

NER 修复蛋白水平与头颈部肿瘤发病风险NER 修复蛋白水平与头颈部肿瘤发病风险

病例 = 57对照 = 63

Wei et al., CEBP, 2005

Gene rs no. Allele 1 Allele 2 Codon Wt Variant Var fre

ERCC1 None ERCC2 1799793 G A 312 ASP(D) ASN(N) 0.24

1052559 A C 751 LYS(K) GLN(Q) 0.22ERCC3 NoneERCC4 2020955 T C 662 SER(S) PRO(P) 0.06ERCC5 17655 G C 1104 ASP(D) HIS(H) 0.38ERCC6 2228528 G A 399 GLY(G) ASP(D) 0.22

2228526 A G 1097 MET(M) VAL(V) 0.18 2228527 A G 1213 ARG(R) GLY(G) 0.19 4253211 G C 1230 ARG(R) PRO(P) 0.08 2228529 A G 1413 GLN(Q) ARG(R) 0.19

XPA NoneXPC 2228000 C T 499 ALA(A) VAL(V) 0.24

2228001 A C 939 LYS(K) GLN(Q) 0.34

多碱基剪切修复基因多态位点及对其功能的影响(nsSNPs in NER genes)

多碱基剪切修复基因多态位点与头颈部肿瘤发病风险多碱基剪切修复基因多态位点与头颈部肿瘤发病风险

NER - SNPsNER - SNPs 829 / 854 829 / 854 OR (95% CI)OR (95% CI)ERCC1ERCC1

C8092A AA vs CC+CAAA vs CC+CA 0.9 (0.6-1.4) 0.9 (0.6-1.4)XPAXPA

G23A AA vs AA vs GG+AG 0.9 (0.7-1.2) 0.9 (0.7-1.2)XPCXPC

Ala499Val Val/Val vs Ala/Ala+Ala/Val 1.7 1.7 (1.2-2.4)(1.2-2.4)

Lys939Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Lys/Gln 1.1 (0.8-1.4) 1.1 (0.8-1.4)ERCC2/XPDERCC2/XPD

Asp312Asn Asn/Asn vs Asp/Asp+Asp/Asn 1.2 (0.9-1.7) 1.2 (0.9-1.7)Lys751Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Gln/Gln 1.1 (0.8-1.4) 1.1 (0.8-1.4)

XPG/ERCC5XPG/ERCC5His1104Asp Asp/Asp vs His/His+His/Asp 0.8 (0.5-1.3) 0.8 (0.5-1.3)

All SNPs combined asAll SNPs combined asNo. of variant homozygotesNo. of variant homozygotes no. (%) no. (%) no. (%) OR (95% CI) no. (%) OR (95% CI)

0-2 0-2 114 (13.8) 114 (13.8) 140 (16.3) 1.0140 (16.3) 1.03 3 453 (54.6) 453 (54.6) 477 (55.9) 1.2 (0.9-1.6)477 (55.9) 1.2 (0.9-1.6)4 4 194 (23.4) 194 (23.4) 177 (20.7) 177 (20.7) 1.4 (1.0-1.9)1.4 (1.0-1.9)5 5 53 (6.4) 53 (6.4) 55 (6.4) 1.2 (0.8-2.0) 55 (6.4) 1.2 (0.8-2.0)6 6 15 (1.8) 15 (1.8) 5 (0.6) 5 (0.6) 4.1 (1.4-12.0)4.1 (1.4-12.0)P for trend P for trend 0.0170.017

NER - SNPsNER - SNPs 829 / 854 829 / 854 OR (95% CI)OR (95% CI)ERCC1ERCC1

C8092A AA vs CC+CAAA vs CC+CA 0.9 (0.6-1.4) 0.9 (0.6-1.4)XPAXPA

G23A AA vs AA vs GG+AG 0.9 (0.7-1.2) 0.9 (0.7-1.2)XPCXPC

Ala499Val Val/Val vs Ala/Ala+Ala/Val 1.7 1.7 (1.2-2.4)(1.2-2.4)

Lys939Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Lys/Gln 1.1 (0.8-1.4) 1.1 (0.8-1.4)ERCC2/XPDERCC2/XPD

Asp312Asn Asn/Asn vs Asp/Asp+Asp/Asn 1.2 (0.9-1.7) 1.2 (0.9-1.7)Lys751Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Gln/Gln 1.1 (0.8-1.4) 1.1 (0.8-1.4)

XPG/ERCC5XPG/ERCC5His1104Asp Asp/Asp vs His/His+His/Asp 0.8 (0.5-1.3) 0.8 (0.5-1.3)

All SNPs combined asAll SNPs combined asNo. of variant homozygotesNo. of variant homozygotes no. (%) no. (%) no. (%) OR (95% CI) no. (%) OR (95% CI)

0-2 0-2 114 (13.8) 114 (13.8) 140 (16.3) 1.0140 (16.3) 1.03 3 453 (54.6) 453 (54.6) 477 (55.9) 1.2 (0.9-1.6)477 (55.9) 1.2 (0.9-1.6)4 4 194 (23.4) 194 (23.4) 177 (20.7) 177 (20.7) 1.4 (1.0-1.9)1.4 (1.0-1.9)5 5 53 (6.4) 53 (6.4) 55 (6.4) 1.2 (0.8-2.0) 55 (6.4) 1.2 (0.8-2.0)6 6 15 (1.8) 15 (1.8) 5 (0.6) 5 (0.6) 4.1 (1.4-12.0)4.1 (1.4-12.0)P for trend P for trend 0.0170.017

Gene Gene Comparison Cases/Controls Risk* Comparison Cases/Controls Risk*Gene Gene Comparison Cases/Controls Risk* Comparison Cases/Controls Risk*

* Adjusted for age, sex, smoking and alcohol use (An et al., CEBP, 2007)

结论结论

需要有高通量基因型检测的平台，乃至个体全基因遗传变异的测定和建立多元回归预警数学模型

需要有高通量基因型检测的平台，乃至个体全基因遗传变异的测定和建立多元回归预警数学模型

个体 DNA 修复功能低下增加头颈部肿瘤的发病风险 个体 DNA 修复功能低下增加头颈部肿瘤的发病风险

个体 DNA 修复功能低下可能有遗传因素决定 个体 DNA 修复功能低下可能有遗传因素决定

需要有大规模的病例 - 对照研究来揭示基因 - 基因和基因 - 环境的交互影响

需要有大规模的病例 - 对照研究来揭示基因 - 基因和基因 - 环境的交互影响

鸣谢鸣谢 Recruitment of subjectsRecruitment of subjects Administering questionnairesAdministering questionnaires Processing of blood samplesProcessing of blood samples Extraction of DNAExtraction of DNA Cell cultureCell culture Phenotyping/DRCPhenotyping/DRC GenotypingGenotyping Data entryData entry Data analysisData analysis ManuscriptsManuscripts