ความหลากหลายทางชีวภาพของ fluorescent Pseudomonas · PDF file490 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย

การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด อําเภอเมือง จังหวัดอุบลราชธานี

ความหลากหลายทางชีวภาพของ fluorescent Pseudomonas สาเหตุโรคพืช Biodiversity of Phytopathogenic Fluorescent Pseudomonas

วิยะดา ขันอาสา1 และ เพชรรัตน ธรรมเบญจพล2 Viyada Kanasa1 and Petcharat Thummabenjapone2

1สาขาโรคพืชวิทยา ภาควิชาพืชศาสตรและทรัพยากรการเกษตร คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน ขอนแกน 40002

1Plant Pathology Section, Department of Plant Science and Agriculture resources, Faculty of Agriculture, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002

2ศูนยวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตรเพื่อเศรษฐกิจที่ยั่งยืน และศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร (มหาวิทยาลัยขอนแกน) สํานักงานพัฒนาบัณฑิตศึกษาและวิจัยสาขาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี

2Research Center of Agricultural Biotechnology for Sustainable Economy (Khon kaen University) and Center of Excellence on Agricultural Biotechnology,

Postgraduate Education and Research Development Office

ABSTRACT Eighty one isolates of a plant pathogenic fluorescent Pseudomonas were isolated from

infected cotyledon of tomato seedlings obtained from blotter test and leaf spot / leaf blight symptoms of watermelon, gourd, pepper, tomato, coriander, celery and orchid. All isolates produced disease on particular tested plants. Bacterial identification was done based on morphology, fluorescent pigment production, biochemical property, LOPAT test, whole cell protein profile by SDS-PAGE and serological relationship with AR-TS003 antiserum by indirect ELISA. This resulted in 6 groups with major group consist in of 70 isolates isolated from melon, squash, watermelon, cucumber, guard, pepper, tomato and corn. The candidates of this cluster were Me FS 001 and Me FS 009 were further identified by BiologTM system. The species ID as Pseudomonas aeruginosa was archived found to be as same as the AR-TS 003 isolate. This identification was supported by other characteristics as in reported for Pseudomonas aeruginosa. Three isolates in group II included Sq FS 005(ID species Pseudomonas nitroreducens / azalaica), unknown#22(Pe) and CeFL001 (no ID species) isolated from squash, pepper and celery respectively. Member in cluster III were unknown#19(Me) (ID species Pseudomona putida), unknown#21(Me) isolated from melon and unknown#29(Pe) isolated from pepper. Three isolates from group IV e.g. CorFB001(from coriander), ToFS001(from tomato) and unknown#20(Pe) from pepper (no ID species). One isolate in group V was unknown#25(Pe) isolated from pepper (no ID species) and one isolate in group VI e.g. OrFL001 (no ID species)

490 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย แกรนด จังหวัดอุบลราชธานี

isolated from orchid leaf spot disease. The results showed evidence of biodiversity in phytopathogenic fluorescent Pseudomonas. The unexpected result in this study was most fluorescent Pseudomonas isolates from various host plants showed properties as P. aeruginosa. Therefore, further confirmation on species identification by molecular techniques might be necessary.

Keywords: fluorescent Pseudomonas, cucumber disease, tomato disease, pepper disease

บทคัดยอ นําเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas ที่แยกไดจากอาการใบจุด ใบไหมบนใบ

เลี้ยงของตนกลาแตงกวา เมลอน สคว็อซ ขาวโพด พริกและมะเขือเทศที่ตรวจหาเชื้อที่ติดมากับเมล็ดพันธุโดยเทคนิค blotter test และแยกไดจากอาการใบจุด ใบไหมจากตัวอยางใบแตงโม นํ้าเตา พริก มะเขือเทศ คื่นชาย ผักชีและกลวยไม จํานวน 81 ไอโซเลตซ่ึงสามารถทําใหเกดิโรคกบัพืชทดสอบทีเ่ปนพืชชนิดเดียวกันได มาศึกษาคุณสมบัติดานตางๆ ทั้งดานสัณฐานวิทยา การสราง fluorescent pigment คุณสมบัติทางชีวเคมีบางประการ LOPAT test รูปแบบของแถบโปรตีนจากเซลลเม่ือตรวจดวยเทคนิค SDS-PAGE และความสัมพันธทางเซรุมวิทยากับเชื้อที่จําแนกเบื้องตนเปน Pseudomonas aeruginosa AR-TS003 ดวยเทคนิค indirect ELISA พบวาแบงออกไดเปน 6 กลุม โดยกลุมใหญที่สุดมี 70 ไอโซเลต แยกไดจาก เมลอน สคว็อช แตงโม แตงกวา นํ้าเตา พริก มะเขือเทศ และขาวโพด โดยมีตัวแทนไอโซเลตคือ MeFS001 และ MeFS009 เม่ือตรวจสอบการใชแหลงคารโบไฮเดรต 95 ชนิดโดย BiologTM ระบุ ID species เปน Pseudomonas aeruginosa เชนเดียวกับ AR-TS003 และมีคุณสมบัติอ่ืนๆ ตรงกับการจําแนกเชื้อเปน Pseudomonas aeruginosa สวนกลุมที่สองมี 3 ไอโซเลต คือ SqFS005 (ID species Pseudomonas nitroreducens / azalaica), unknown#22(Pe) และ CeFL001 (no ID species) ซ่ึงแยกไดจากสคว็อช พริกและคึ่นชายตามลําดับ กลุมที่ 3 คือ ไอโซเลต unknown#19(Me) ID species Pseudomonas putida), unknown#21(Me) แยกไดจากเมลอน และ unknown #29(Pe) (no ID species) ซ่ึงแยกไดจากพริก กลุมที่ 4 ไดแก CorFB001(จากผักชี) ToFS001 (จากมะเขือเทศ) และ unknown#20(Pe) จากพริก (no ID species) กลุมที่ 5 ไดแก unknown#25(Pe) จากพริก (no ID species) และ กลุมที่ 6 ไดแก OrFL001 (no ID species) แยกไดจากตัวอยางใบกลวยไมเปนโรคใบจุด จากผลการทดลองชี้ใหเห็นวามีความหลากหลายทางชีวภาพของ fluorescent Pseudomonas ที่กอใหเกิดโรคกับพืช และมีสิ่งที่ไมคาดคิดคือเชื้อไอโซเลตสวนใหญซ่ึงแยกไดจากพืชหลากชนิดจําแนกไดเปน P. aeruginosa จึงมีความจําเปนที่จะตองศึกษาตอไปในดานชีวโมเลกุลเพ่ือยืนยันการระบุ species ดังกลาว

คําหลัก : fluorescent Pseudomonas, โรคแตง, โรคพริก, โรคมะเขือเทศ

การประชุมวิชาการอารักขาพืชแหงชาติ ครั้งที่ 9 491

บทนํา เชื้อแบคทเีรียที่อยูในสกุล (genus) Pseudomonas และสรางสารเรอืงแสงบนอาหาร King’s

medium B (KB) จัดเปนกลุม fluorescent Pseudomonas มีหลายชนิด (species) เชน P. syringae, P. cichorii, P. viridiflava, P. fluorescence, P. putida, P. aeruginosa, P. agarici, P. talaasii, P. asplenii โดย Pseudomonas syringae pathovars เปนแบคทีเรียสาเหตุโรคพืชที่มีรายงานความหลากหลายมากกวา 50 pathovars (Goszczynska et al., 2000) เน่ืองจากมีพืชอาศัยที่หลากหลายตางกันไป เชน Pseudomonas syringae pv. tomato สาเหตุโรคใบจุดเล็ก (bacterial speck) ของมะเขือเทศ Pseudomonas sygingae pv. lachrymans สาเหตุโรคใบจุดเหลี่ยมแตง (angular leaf spot), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola สาเหตุโรคใบไหมถั่ว (bacterial leaf blight), Pseudomonas syringae pv. syringae สาเหตุโรคใบจุดใบไหม (leaf spot/leaf blight) ของพืชเศรษฐกิจหลายชนิดทั้งที่เปนพืชใบเลี้ยงเด่ียวและใบเลี้ยงคู เชื้อทีมี่การรายงานการถายทอดผานทางเมล็ดพันธุไดมีหลายชนิดเชน P. syringae pv. tomato ในมะเขือเทศ และ P. syringae pv. lachrymans ในพืชวงศแตง เน่ืองจากในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยเปนแหลงผลิตเมลด็พันธุลูกผสมที่สําคัญ มีการนําเขาเมล็ดพันธุที่ใชเปนสายพันธุพอแมจากแหลงตางๆ ทั่วโลก ซ่ึงยังไมไดมีการศึกษาขอมูลอยางจริงจังถึงชนิดเชื้อ fluorescent Pseudomonas ที่อาจติดมากับเมล็ดพันธุทีนํ่าเขามาปลูก และการตรวจสอบสถานการณของเชื้อแบคทเีรียในกลุมน้ีในแปลงผลิตหรือในเมล็ดพันธุที่ผลิตได ตลอดจนในพืชผักหรือไมดอกเศรษฐกิจอ่ืนๆ การวิจัยครั้งนีจึ้งมีวัตถุประสงคในการศึกษาคือรวบรวมไอโซเลตของเชือ้ fluorescent Pseudomonas และจําแนกระบุชนิดของเชื้อ เพ่ือเปนขอมูลพ้ืนฐานทีส่ําคัญในการนาํไปใชจัดการโรคและการพัฒนาวิธกีารตรวจวินิจฉัยโรคที่แมนยําและรวดเรว็ตอไป

อุปกรณและวิธีการ

1. การเก็บรวบรวมเชื้อแบคทีเรียและการตรวจสอบการสรางสารเรืองแสง แยกเชื้อแบคทีเรียจากตนกลาแตงกวา เมลอน สคว็อช พริกและมะเขือเทศ ที่แสดงอาการ

เปนโรคในสวนของใบเลี้ยงเมื่อนําเมล็ดพันธุมาตรวจหาเชื้อโดยเทคนิค blotter test และตัวอยางอาการของโรคจากพืชตาง ๆ ในกลุมอาการใบจุด ใบไหม ที่มีอาการช้ําน้ํา ที่คาดวาจะเกิดจากการเขาทําลายของเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas มาแยกเชื้อบริสุทธิ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ NA และอาหาร KB ตรวจสอบการสรางสารเรืองแสงภายใตแสง UV ที่ความยาวคลื่นแสง 366 nm

2. การทดสอบความสามารถในการทําใหเกิดโรค เลี้ยงเช้ือแบคทีเรียที่สรางสารเรืองแสงที่รวบรวมไดบนอาหาร NA นาน 48 ชม. แลวนํามา

เตรียมเปนสารแขวนลอยเซลลแบคทีเรีย วัดคาการดูดซับแสงที่ 600 nm เทากับ 0.1 สําหรับนําไปปลูกเชื้อบนพืชทดสอบคือ ตนกลาแตงกวา เมลอน สคว็อซ และแตงโม โดยใช syringe ปลอดเชื้อดูดสารแขวนลอยแบคทีเรียแตละไอโซเลตแลวฉีดเขาใตใบเลี้ยงทั้งสองใบ เปรียบเทียบกับนํ้ากลั่นน่ึงฆาเชื้อแลว สวนใน


พริกและมะเขือเทศใชวิธีอัด (infiltration) สารแขวนลอยเชื้อแบคทีเรียลงบนใบจริงที่แผขยายเต็มที่แลว นําพืชทดสอบที่ไดรับการปลูกเชื้อใสในกลองพลาสติกที่ทําความสะอาดอยางดี ฉีดสเปรยนํ้าใหความชื้นใหทั่วทั้งฝาขางในและฝากลองพลาสติกโดยไมใหสัมผัสกับตนพืชทดสอบแลวปดฝากลอง นําไปไวในหองอุณหภูมิประมาณ 28ºซ เปนเวลา 48 ชม. จึงเปดฝากลองและดูแลตนพืชตามปกติ สังเกตและบันทึกผล นําตัวอยางที่แสดงอาการโรคมาแยกเชื้อกลับบนอาหาร NA และตรวจสอบการเรืองแสงบนอาหาร KB เก็บรักษาเชื้อที่ผานการพิสูจนความสามารถในการเกิดโรคแลวในรูปแบบ glycerol stock ที่ -20ºซ

3. การจัดจําแนกเชื้อสาเหตุของโรค 3.1 การตรวจสอบเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas ดวยเทคนิค indirect ELISA นําเชื้อแบคทีเรียที่ผานการทดสอบความสามารถในการกอโรคแลวเลี้ยงเชื้อบนอาหาร NA บม

ที่อุณหภูมิ 28ºซ นาน 24-48 ชม. นําไปตรวจสอบแกรมดวย 3% KOH จัดเตรยีมเปนสารแขวนลอยเซลลเชื้อแบคทีเรียใน coating buffer และปรับความเขมขนของสารละลายเซลลแบคทีเรียใหเทากันคือมีคาการดูดซับแสงที่ 600 nm เทากับ 0.1 ใสลงในหลุมของ ELISA plate 200 µl/หลุม ทํา 2 ซํ้าตอหน่ึงตัวอยาง บมขามคืนที่ 4ºซ แลวนํามาตรวจสอบตามขั้นตอนของ indirect ELISA (เพชรรัตนและประภาษ, 2544) โดยใชแอนติซีร่ัมตอเชื้อแบคทีเรีย P. aeruginosa AR-TS003 ในอัตราสวน 1:1,000 โดยปริมาตร และความเขมขนของ goat antirabbit IgG-alkaline phosphatase conjugate อัตราสวน 1:40,000 โดยปริมาตร ความเขมขนของ substrate p-nitrophenyl 1 มก./มล. รายงานผลการตรวจสอบดวยเครื่อง ELISA reader (Bio Rad Model 550) ที่ความยาวคลื่นแสง 405 nm.

3.2 การตรวจสอบรูปแบบของแถบโปรตีนดวยเทคนิค SDS-PAGE นําเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas ที่ใหผลบวกจากการตรวจสอบ indirect

ELISA มาเลี้ยงในอาหาร Nutrient broth (NB) เขยาขามคืนนาน 18 ชม. ปนเก็บตะกอนเซลลแบคทีเรียที่ 10,000 rpm นาน 2 นาที ลางตะกอนเซลลดวยน้ํากลั่น 2 ครั้ง ละลายตะกอนเซลลแบคทีเรียในน้ํากลั่นน่ึงฆาเชื้อ 300 µl ผสมตะกอนเซลลแบคทีเรีย 20 µl กับ protein sample buffer 40 µl นําไปตมในน้ําเดือดนาน 5 นาที จากนั้นนําไปวางในน้ําแข็งทันที กอนนําไปแยกบนตัวกลางเจลตามระบบ discontinuous SDS-PAGE (Sambrook et al., 1989) ใช 12% resolving gel กระแสไฟฟา 18 mA เปนเวลา 3 ชม. ยอมเจลดวย Coomassie brilliant blue R-250 ใน staining solution นานขามคืน แลวลางสีสวนเกินออกดวย destaining solution บันทึกภาพ

3.3 การทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีและการเกิด HR คุณสมบัติทางชีวเคมีที่คัดเลือกมาตรวจสอบ ไดแก การสรางเอนไซมคะตะเลส (catalase

activity) และ LOPAT ซ่ึงประกอบดวยการสราง levan (levan production) ปฏิกิริยาออกซิเดส (oxidase reaction) ทดสอบการสรางเอนไซมยอย pectin (ทดสอบการทําใหมันฝรั่งเนา (pectolytic activity) การไฮโดรไลส arginine (arginine hydrolase activity) และการเกิด hypersensitive reaction (HR) บนยาสูบตามวิธีการที่แนะนําไวใน Schaad et al. (2001)


3.4 การใชแหลงคารบอนเปนอาหารโดยวิธีกึ่งอัตโนมัติ (BioloqTM) เชื้อแบคทีเรียที่ผานการจําแนกตามขอ 3.1, 3.2 และ 3.3 แลว ทําการเลือกไอโซเลตที่คาดวา

จะเปนเชื้อ P. aeruginosa ไดแก ไอโซเลต Me FS 001 และไอโซเลตที่แตกตางออกไป ไดแก ไอโซเลต To FS 001, Sq FS 005, unknown #22 (Pe), unknown #25 (Pe), unknown 29 (Pe), unknown #19 (Me), unknown #20 (Me), unknown #21 (Me), Cor FB 001, Ce FL 001, Or FL 001 เลี้ยงเชื้อบนอาหาร NA เปนเวลา 48 ชม. ทําการทดสอบแกรมดวย 3% KOH เพ่ือเลือก Biolog plate สําหรับแบคทีเรียแกรมลบใช GN2 จากนั้นเตรียมสารแขวนลอยแบคทีเรียใหไดความขุนเหมาะสมกับประเภทของเชื้อ จากการทดสอบปฏิกิริยาออกซิเดส โดยใชสําลีพันกานปลอดเชื้อขูดโคโลนีเชื้อแบคทีเรียมาละลายใน GN/GP inoculation Fluid for BiologTM (ปริมาตร 600 มล.: Sodium cloride 2.4 ก., Pluronic-F68 0.18 ก., Gellan gum 0.12 ก.) เชื้อแบคทีเรียที่ใหผลการทดสอบออกซิเดสเปน บวก จัดเปนกลุม non-enteric จะตองเตรียมสารละลายแบคทีเรียใหไดความขุนที่ 52 %T ถาผลการทดสอบออกซิเดสเปนลบ จัดเปนกลุม enteric จะตองเตรียมสารละลายแบคทีเรียใหไดความขุนที่ 61%T แลวทําการปเปตสารละลายแขวนลอยแบคทีเรียหยอดลงใน Biolog plate หลุมละ 150 µl นําไปบมที่อุณหภูมิ 320ซ เปนเวลา 16-24 ชม. จากนั้นนํามาอานคาดวยเครื่อง microstation reader

ผลและวิจารณ

1. การเก็บรวบรวมเชื้อแบคทีเรียและการทดสอบการสรางสารเรืองแสง เชื้อแบคทีเรียกลุมใหญ จํานวน 70 ไอโซเลต สามารถเจริญไดบนอาหาร NA และเจริญไดดี

บนอาหาร KB ในระยะแรกโคโลนีมีลักษณะกลม ขอบเรียบ สีครีม ขุน มีกลิ่นเหม็น เม่ือเชื้อเร่ิมแกลักษณะโคโลนีมีลักษณะคลายรูปตา มักเปลี่ยนสีอาหาร NA เปนสีนํ้าตาลหรือสีเขียว สวนกลุมที่มีลักษณะโคโลนีแตกตางออกไป ไมเปลี่ยนสีอาหาร NA และไมมีกลิ่นเหม็นเฉพาะตัวเหมือนกลุมดังกลาว จํานวน 11 ไอโซเลต ทุกไอโซเลตสามารถสรางสารเรืองแสงสีเหลืองปนเขียวบนอาหาร KB อยางไรก็ตามพบวามีความผันแปรในสีและความเขมของสารเรืองแสงเกิดขึ้นในบางไอโซเลต

2. การทดสอบความสามารถในการทําใหเกิดโรค จากการทดสอบความสามารถในการทําใหเกิดโรคของเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent

Pseudomonas จํานวน 81 ไอโซเลต กับตนแตงกวา เมลอน สคว็อซ แตงโม นํ้าเตา ขาวโพด พริก มะเขือเทศ คึ่นชาย ผักชีและกลวยไม พบวา ที่ 2 วัน หลังปลูกเชื้อพบวา เชื้อแบคทีเรียทุกไอโซเลต มีความสามารถในการทําใหเกิดโรคกับพืชทดสอบ โดยสังเกตไดอาการเนื้อเยื่อตาย มีจุดช้ําน้ํา แตไมเดนชัดมากและที่ 4 วัน หลังปลูกเชื้อพบวาทุกไอโซเลตทําใหใบพืชทดสอบ แสดงอาการเหลืองซีดและเห่ียว และอาการเริ่มลุกลาม ซ่ึงแตกตางจากการเกิด HR พืชจะแสดงอาการเหมือนเปนโรคในชวง 2 วันแรก หลังจากนั้นจะไมลุกลาม จนในที่สุดพืชทดสอบกลับมาเปนปกติ และเม่ือเปรียบเทียบกับ control ที่ไมแสดงอาการผิดปกติ เม่ือทําการแยกเชื้อจากสวนที่แสดงอาการเปนโรค พบวาไดเชื้อเหมือนเดิม


3, การจัดจําแนกเชื้อสาเหตุของโรค 3.1 การตรวจสอบเชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas ดวยเทคนิค indirect ELISA เม่ือใชแอนติซีร่ัม P. aeruginosa AR-TS003 สามารถแบงกลุมเชื้อ fluorescent

Pseudomonas ทั้ง 81 ไอโซเลต ออกเปน 2 กลุม คือ กลุมเชื้อจํานวน 70 ไอโซเลต ที่ใหสัญญาณในระดับสูงใกลชิดกับเชื้อ P. aeruginosa AR-TS003 ซ่ึงแตกตางจากไอโซเลตของเชื้อที่มีคา ELISA ต่ําลงมาในระดับความสัมพันธทางเซรุมวิทยาปานกลางหรือต่ํา (Table 1.)

Table 1. ELISA value of fluorescent Pseudomonas isolates after detection with antiserum of P. aeruginosa AR-TS003 antiserum by indirect ELISA.

Gram Gram No. Cultures reaction

ELISA value

No. Cultures reaction

ELISA value

1 Me FS 001 - 1.858 42 Sq FS 008 - 1.478 2 Me FS 002 - 1.555 43 Sq FS 009 - 1.776 3 Me FS 003 - 1.694 44 Sq FS 010 - 1.815 4 Me FS 004 - 1.861 45 Sq FS 011 - 1.935 5 Me FS 005 - 1.661 46 Sq FS 012 - 1.447 6 Me FS 006 - 1.766 47 WM FB 001 - 1.551 7 Me FS 007 - 1.626 48 WM FL 001 - 1.455 8 Me FS 008 - 1.915 49 Cu FS 001 - 1.803 9 Me FS 009 - 1.594 50 Gu FS 001 - 1.830 10 Me FS 010 - 1.813 51 Pe FS 001 - 0.426 11 Me FS 011 - 1.647 52 Pe FS 002 - 1.380 12 Me FS 012 - 1.769 53 Pe FS 003 - 1.441 13 Me FS 013 - 1.708 54 Pe FS 004 - 1.380 14 Me FS 014 - 1.665 55 Pe FS 005 - 1.512 15 Me FS 015 - 1.555 56 Pe FS 006 - 1.498 16 Me FS 016 - 1.810 57 Pe FS 007 - 1.458 17 Me FS 017 - 1.391 58 Pe FP 001 - 0.501 18 Me FS 018 - 1.770 59 Pe (flu.) KKU1 - 0.545 19 Me FS 019 - 1.723 60 Pe (flu.) KKU2 - 1.402 20 Me FS 020 - 1.789 61 AR-TS 001 - 1.815 21 Me FS 021 - 1.700 62 AR-TS 002 - 1.496 22 Me FS 022 - 0.847 63 AR-TS 004 - 1.776 23 Me FS 023 - 1.408 64 To FF 001 - 1.450 24 Me FS 024 - 1.713 65 To FF 002 - 1.427 25 Me FS 025 - 1.589 66 To FF 003 - 1.411


Gram Gram No. Cultures reaction

ELISA value

No. Cultures reaction

ELISA value

26 Me FS 026 - 1.559 67 To FF 004 - 1.437 27 Me FS 027 - 1.747 68 To (flu.) KKU1 - 0.645 28 Me FS 028 - 1.560 69 Corn FS 001 - 1.682 29 Me FS 029 - 0.983 70 Sq FS 005 - 1.500 30 Me FS 030 - 1.784 71 To FS 001 - 1.102 31 Me FS 031 - 1.107 72 Unknown#29 (Pe) - 1.018 32 Me FS 032 - 1.120 73 Unknown#22 (Pe) - 0.925 33 Me FS 033 - 1.945 74 Unknown#20 (Pe) - 0.895 34 Me FS 034 - 1.523 75 Unknown#25 (Pe) - 0.525 35 Me FS 035 - 0.812 76 Ce FL 001 - 0.413 36 Sq FS 001 - 1.821 77 Cor FB 001 - 0.255 37 Sq FS 002 - 1.808 78 Or FL 001 - 0.214 38 Sq FS 003 - 1.851 79 Unknown#19 (Me) - 0.113 39 Sq FS 004 - 1.151 80 Unknown#21 (Me) - 0.115 40 Sq FS 006 - 1.773 81 Positive control - 1.711 41 Sq FS 007 - 1.739 82 Negative control - -0.011

3.2 รูปแบบของแถบโปรตีนจากเซลลดวยเทคนิค SDS-PAGE เชื้อแบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas ที่จัดกลุมตามลักษณะสีและความสวางของ

สารเรืองแสง พบวามีรูปแบบของโปรตีนจากเซลลเม่ือตรวจดวยเทคนิค SDS-PAGE แตกตางกัน เม่ือเปรียบเทียบกับความสัมพันธทางเซรุมวิทยากับแอนติซีร่ัมตอเชื้อ P. aeruginosa AR-TS003 พบวามีความสอดคลองกัน โดยเชื้อ 70 ไอโซเลต ที่ใหสัญญาณในระดับสูงใกลชิดกับเชื้อ P. aeruginosa AR-TS003 มากตางก็มีรูปแบบของโปรตีนจากเซลลเหมือนกัน (Fig. 1.) ซ่ึงแตกตางจากไอโซเลตของเชือ้ทีมี่คา ELISA ต่ําลงมาในระดับความสัมพันธทางเซรุมวิทยาปานกลางหรือต่ํา (Fig. 2.)


Fig. 1. Protein profiles of tentative fluorescent Pseudomonas when perform on 12% polyacrylamide gel M : protein marker sizes lane 1: Sq FS 001 lane 2 : Sq FS 011 lane 3 : Me FS 001

lane 4 : Me FS 022 lane 5 : Me FS 034 lane 6 : Me FS 035 lane 7 : WM FB 001 lane 8 : WM FL 001 lane 9 : Cu FS 001 lane 10 : Cu FS 002 lane 11 : AR-TS 003 ane 12 : Gu FS 001 lane 13 : AR-TS 001 lane 14:To(flu.)KKU1 lane 15 : To FF 001

lane 16 : Pe (flu.) KKU1 lane 17 : Pe FS 001 lane 18 : Pe FS 002 lane 19 : Pe FP 001 lane 20 : Pe (flu.) KKU2 lane 21 : Pe FP 002 lane 22 : AR-TS 003

Fig. 2. Protein profiles of fluorescent Pseudomonas when perform on 12% polyacrylamide gel

M:protein marker sizes lane 1 : To FS 001 lane 2 : Cor FB 001 lane 3 : Ce FL 001 lane 4 : Or FL 001 lane 5 : unknown #20 (Pe) lane 6 : unknown #22 (Pe)

lane 7 : unknown # 25 (Pe) lane 8 : unknown # 29 (Pe) lane 9 : unknown # 19 (Me) lane 10 : unknown # 20 (Me) lane 11 : AR-TS 003

3.3 การทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี จากการทดสอบ LOPAT ซ่ึงเปนการทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีที่ใชในการจําแนกเชื้อ

แบคทีเรียในกลุม fluorescent Pseudomonas จากคุณสมบัติดังกลาว สามารถแบงเชื้อแบคทีเรีย ทั้ง 81 ไอโซเลต ออกเปน 6 กลุม ดังนี้

35 kDa

25 kDa

18.8 kDa

45 kDa

14 kDa

66 kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

66 kDa45 kDa

35 kDa

25 kDa

18.8 kDa

14 kDa


กลุม 1) เชื้อแบคทีเรียจํานวน 70 ไอโซเลต ที่คาดวาจะเปนเชื้อ P. aeruginosa (LOPAT - + + + -) กลุม 2) เชื้อแบคทีเรียโอโซเลต unknown #19 (Me), unknown #21 (Me) และ unknown #29 (Pe) (LOPAT - + + + -) ตางจากกลุม 1 ตรงรูปแบบของแถบโปรตีนจากเซลลและความสัมพันธ ทางเซรุมวิทยากับเชื้อ P. aeruginosa AR-TS003 กลุม 3) เชื้อแบคทีเรียไอโซเลต Sq FS 005 และ unknown #22 (Pe) (LOPAT - + - - -) กลุม 4) เชื้อแบคทีเรียไอโซเลต Cor FB 001, To FS 001 และ unknown #20 (Pe) (LOPAT- + - + -) กลุม 5) เชื้อแบคทีเรียไอโซเลต unknown #25 (Pe) (LOPAT + + + + -) กลุม 6) เชื้อแบคทีเรียไอโซเลต Or FL 001 (LOPAT + - - - -)

Table 3. Biochemical test of phytopathogenic fluorescent Pseudomonas 81 isolates LOPAT test

No. code Fluorescent Pectolytic Arginine Tobacco pigments

Catalase Levan Oxidase Activity dihydrolase HR

1 Me FS 001 blue + - + + + - 2 Me FS 002 blue + - + + + - 3 Me FS 003 blue + - + + + - 4 Me FS 004 blue + - + + + - 5 Me FS 005 blue + - + + + - 6 Me FS 006 blue + - + + + - 7 Me FS 007 blue + - + + + - 8 Me FS 008 blue + - + + + - 9 Me FS 009 blue + - + + + - 10 Me FS 010 blue + - + + + - 11 Me FS 011 blue + - + + + - 12 Me FS 012 blue + - + + + - 13 Me FS 013 blue + - + + + - 14 Me FS 014 blue + - + + + - 15 Me FS 015 blue + - + + + - 16 Me FS 016 blue + - + + + - 17 Me FS 017 blue + - + + + - 18 Me FS 018 blue + - + + + - 19 Me FS 019 blue + - + + + - 20 Me FS 020 blue + - + + + - 21 Me FS 021 blue + - + + + - 22 Me FS 022 blue + - + + + - 23 Me FS 023 blue + - + + + - 24 Me FS 024 blue + - + + + - 25 Me FS 025 blue + - + + + -


LOPAT test No. code Fluorescent Pectolytic Arginine Tobacco

pigments Catalase Levan Oxidase

Activity dihydrolase HR 26 Me FS 026 blue + - + + + - 27 Me FS 027 blue + - + + + - 28 Me FS 028 blue + - + + + - 29 Me FS 029 blue + - + + + - 30 Me FS 030 blue + - + + + - 31 Me FS 031 blue + - + + + - 32 Me FS 032 blue + - + + + - 33 Me FS 033 blue + - + + + - 34 Me FS 034 blue + - + + + - 35 Me FS 035 blue + - + + + - 36 Sq FS 001 blue + - + + + - 37 Sq FS 002 blue + - + + + - 38 Sq FS 003 blue + - + + + - 39 Sq FS 004 blue + - + + + - 40 Sq FS 006 blue + - + + + - 41 Sq FS 007 blue + - + + + - 42 Sq FS 008 blue + - + + + - 43 Sq FS 009 blue + - + + + - 44 Sq FS 010 blue + - + + + - 45 Sq FS 011 blue + - + + + - 46 Sq FS 012 blue + - + + + - 47 WM FB 001 blue + - + + + - 48 WM FL 001 blue + - + + + - 49 Cu FS 001 blue + - + + + - 50 Gu FF 001 blue + - + + + - 51 Pe FP 001 blue + - + + + - 52 Pe FS 001 blue + - + + + - 53 Pe FS 002 blue + - + + + - 54 Pe FS 003 blue + - + + + - 55 Pe FS 004 blue + - + + + - 56 Pe FS 005 blue + - + + + - 57 Pe FS 006 blue + - + + + - 58 Pe FS 007 blue + - + + + - 59 Pe (flu.) KKU1 blue + - + + + -


LOPAT test No. code Fluorescent Pectolytic Arginine Tobacco

pigments Catalase Levan Oxidase

Activity dihydrolase HR 60 Pe (flu.) KKU2 blue + - + + + - 61 AR-TS 001 blue + - + + + - 62 AR-TS 002 blue + - + + + - 63 AR-TS 003 blue + - + + + - 64 AR-TS 004 blue + - + + + - 65 To FF 001 blue + - + + + - 66 To FF 002 blue + - + + + - 67 To FF 003 blue + - + + + - 68 To FF 004 blue + - + + + - 69 To (flu.) KKU1 blue + - + + + - 70 Corn FS 001 blue + - + + + - 71 Sq FS 005 blue + - + - - - 72 unknown #22 (Pe) blue + - + - - - 73 Ce FL 001 blue + - + - - - 74 unknown #19 (Me) blue + - + + + - 75 unknown #21 (Me) blue + - + + + - 76 unknown #29 (Pe) blue + - + + + - 77 Cor FB 001 blue + - + - + - 78 To FS 001 blue + - + - + - 79 unknown #20 (Pe) blue + - + - + - 80 unknown #25 (Pe) blue + + + + + - 81 Or FL 001 blue + + - - - -

3.4 การใชแหลงคารบอนเปนอาหารโดยวิธีกึ่งอัตโนมัติ(BioloqTM) เม่ือนําแบคทีเรียที่เปนไอโซเลตตัวแทนของแตละกลุมที่จําแนกโดยใชคุณสมบัติทั้ง สัณฐาน

วิทยา, คุณสมบัติทางชีวเคมี, LOPAT และ SDS-PAGE มาตรวจสอบความสามารถในการใช คารโบไฮเตรท ทั้ง 95 ชนิด บน Biolog GN2 Microplate พบวาเชื้อแบคทีเรียไอโซเลต Me FS 001 ซ่ึงเปนไอโซเลตตัวแทนกลุมที่คาดวาจะเปนเชื้อ P. aeruginosa สามารถระบุ ID ไดเปน Pseudomonas aeruginosa (Prob 98%) เชนเดียวกับไอโซเลต AR-TS003 สวนไอโซเลตที่เปนตัวแทนในกลุม unknown ไดแก ไอโซเลต Sq FS 005 ระบุ ID ไดเปน Pseudomonas nitroreducens/azelaica (Prob 99%), ไอโซเลต unknown #19 (Me) ระบุ ID ไดเปน Pseudomonas putida (Prob 98%), unknown #22 (Pe), unknown #25 (Pe), unknown #29 (Pe), unknow #20 (Me), unknown #21 (Me) รวมถึงเชื้อที่เปนตัวแทนกลุมที่คาดวาจะเปนเชื้อ P. syringae pv. syringae ไดแก ไอโซเลต Cor FB 001, Ce FL 001 และ Or FL 001 ที่ไมสามารถระบุ ID ได


สรุปผลการทดลอง เชื้อ fluorescent Pseudomonas สาเหตุโรคพืชมีความหลากหลายทางชีวภาพ โดยที่เปนกลุม

ใหญ (70 ไอโซเลต) ระบุชื่อเปน P. aeruginosa มีคุณสมบัติประจําตัวคือ คือ (1) ไมสราง levan เม่ือเลี้ยงบนอาหาร nutrient sucrose agar (2) ใหผลบวกในการศึกษาปฏิกิริยาออกซิเดส (3) ใหผลบวกกับการทดสอบ pectolytic activity (4) สามารถไฮโดรไลส arginine ใหเปนแอมโมเนียในสภาพที่ปราศจากออกซิเจนได (5) ใหผลลบกับการทดสอบ HR บนใบยาสูบ (LOPAT - + + + -) กลุมที่ 2 ระบุชื่อเปน P. putida ไดแก unknown #19 (Me), unknown #21 (Me) และ unknown #29 (Pe) (LOPAT - + + + -) กลุมที่ 3 ระบุชื่อเปน Pseudomonas nitroreducens/azelaica ไดแก Sq FS 005 และ unknown #22 (Pe) (LOPAT – + - - -) สวนกลุมที่ 4 Cor FB 001, To FS 001 และ unknown #20 (Pe) (LOPAT -+-+-), กลุมที่ 5 unknown #25 (Pe) (LOPAT + + + + -) และกลุมที่ 6 Or FL 001 (LOPAT + - - - -) ยังไมสามารถระบุชื่อชนิดได จําเปนตองศึกษาขอมูลเพ่ิมเติมในสวนของลําดับนิวคลีโอไทดในสวน 16S rDNA เพ่ีอนํามายืนยันหรือประกอบการจําแนกระบุชื่อชนิด

เอกสารอางอิง เพชรรัตน ศิริวงศ และประภาษ กาวิชา. 2544. การตรวจหาเชื้อ Acidovorax avenae subsp. citrulli

ดวยเทคนิค ELISA. รายงานสัมมนาวิชาการเกษตรประจําป 2544. คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน.

Goszczynska, T., J. J. Serfontein and S. Serfontein. 2000. Introduction to practical phytopathology. Plant Protection Research Institute. Protoria, South Africa.

Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning a laboratory manual second edition. Cold spring harbor laboratory press. United stated of America.

Schaad, N.W., Jones, J.B. and W. Chun. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria third edition. The American phytopathological society, St. Paul, Minnesota, USA.

Documents

ความหลากหลายทางชีวภาพของ fluorescent Pseudomonas · PDF file490 24-26 พฤศจิกายน 2552 โรงแรมสุนีย