На правах рукописи

ДЖУМАЕВ ШУХРАТ НУРМУРОДОВИЧ

Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, член-корреспондент ТАСХН,

М. Аноятбеков доктор биологических наук,

член-корреспондент РАСХН, профессор

Д.А. Девришов

МОСКВА - 2011

- 2 -

ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………..….…… ВВЕДЕНИЕ.…………………………………………………………..……......... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………… 1.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ ………………………………………….. 1.2. Лабораторные методы диагностики ЧМЖЖ……………………………… 1.3. Конкурентные методы ИФА………………………………………..……. 1.3.1. Неконкурентные методы ИФА……………………………………..……. 1.3.2. Твердофазный носитель для ИФА………………………………………. 1.3.3. Иммуноферментные коньюгаты…………………………………….…… 1.3.4. Принципы получения диагностических сывороток……………………. 1.3.5. Принципы приготовления антигенов…………………………………… 1.4. Заключение по обзору литературы…………………………………..……. ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………………….. 2. Материалы и методы ……………………………….……………………….. 2.1.1. Материалы………………………………………………………………… 2.1.1.1. Вирусы……………………………………………………………..…….. 2.1.1.2. Животные………………………………………………………………... 2.1.1.3. Диагностические антигены и сыворотки……………………….…….. 2.1.1.4. Контрольно-испытуемые пробы……………………………………….. 2.1.1.5. Культуры клеток……………………………………………………… 2.1.1.6. Химические реактивы и биопрепараты……………………………….. 2.1.1.7. Растворы и их приготовление.…………………………………………. 2.1.1.8. Аппараты и лабораторное оборудование…………………………… 2.1.2. Методы…………………………………………………………………….. 2.1.2.1. Приготовление вируссодержащего органо-тканевого материала…… 2.1.2.2. Инфицирование культур клеток и получение вируссодержащего культурального материала…………………………………………… 2.1.2.3. Электронная микроскопия штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ… 2.1.2.4. Постановка и учет результатов серологических реакций……………. 2.1.2.5. Концентрирование биологических препаратов и определение концентрации белка…………………………………………………….. 2.1.2.6. Лиофильная сушка препаратов………………………………………… 2.1.2.7. Статистическая обработка результатов……………………………….. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ……………………………. 3.1. Выделение эпизоотического штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ для приготовления диагностических препаратов……………………………... 3.2. Приготовление культурального антигена для ИФА при ЧМЖЖ и гипериммунизации животных……………………………………………… 3.2.1. Изучение оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ в культуре клеток (температура, сроки культивирования, заражающая доза)………………………………………………………………………... 3.3. Приготовление специфических и нормальных антигенов при ЧМЖЖ…

стр. 4 5 10 10 14 16 17 20 23 28 29 31 34 34 34 34 34 35 35 36 36 37 38 38 38 39 39 40 41 41 42 43 43 49 49 52

- 3 -

3.4. Получение специфических сывороток при ЧМЖЖ…………………….. 3.5. Получение видоспецифических сывороток………………………………. 3.6. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА при ЧМЖЖ………………………………………………………. 3.7. Проверка активности диагностических препаратов после хранения в нативном и лиофилизированном состояниях при температуре от плюс 3 до плюс 4°С...................................................................................................... 3.8. Отработка оптимальных условий постановки метода ИФА для выявления антигена вируса ЧМЖЖ……………………………………….. 3.8.1. Отработка процесса сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином……………………... 3.8.2. Отработка температурно-временных условий сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином……………………………………………………….. 3.8.3. Подбор раствора для сенсибилизации лунок полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином……. 3.8.4. Отработка температурно-временных условий контакта сенсибилизированных плашек с БСА…………………………………… 3.8.5. Отработка температурно-временных условий контакта антигена с сенсибилизированными вирусспецифическим иммуноглобулином полистироловыми плоскодонными плашками………………………… 3.8.6. Отработка условий постановки метода ИФА для определения антител в сыворотках крови животных…………………………………………… 3.8.7. Эффективность применения метода твердофазного ИФА для выявления и идентификации специфического антигена вируса ЧМЖЖ……………………………………………………………. 3.8.8. Оценка специфичности, чувствительности и эффективности непрямого варианта ИФА………………………………………………… 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………. 5. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… 6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ…………………………………….. 7. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ ………..……………………… ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………………………….

56 59 60 68 71 71 71 73 74 75 77 77 81 83 92 93 94 110

- 4 -

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АБТС - 2,2-азинобисэтилбензтиазолин сульфоновая кислота БСА - бычий сывороточный альбумин ИФА - иммуноферментный анализ Иг - иммуноглобулин КРС - крупный рогатый скот МДВК - перевиваемые линий культуры клеток почки коровы МФА - метод флуоресцирующих антител МРС - мелкий рогатый скот ОП - оптическая плотность ПО - перевиваемые линий культуры клеток почки овцы ПЯ - первично-трипсинизированнaя культурa клеток почки ягненка ПЭГ - полиэтиленгликоль ПСП - пристеночная питательная среда ПЦР - полимеразная цепная реакция РДП - реакция диффузионной преципитации РНК - рибонуклеиновая кислота РИА - радиоиммуноанализ РН - реакция нейтрализация РСК - реакция связывания комплемента РТ - Республика Таджикистан ТЯ - тестикул ягненка ТЦД - титр цитопатического действия ЧМЖЖ - чума мелких жвачных животных ЦПД - цитопатическое действие ЦПЭ - цитипатический эффект Rz - чистота коньюгата

- 5 -

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Чума мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) – la

peste des petits ruminants – вирусное заболевание, характеризующееся

некротическим стоматитом, диареей и бронхопневмонией. Возбудитель –

РНК-содержащий вирус, относится к семейству Парамиксовирусов, роду

Морбилливирус. Впервые она была зарегистрирована в Кот Дивуаре в

Западной Африке в 1942 году.

Вирусная этиология болезни была подтверждена в 1972 году во время

всестороннего исследования вспышки болезни среди овец и коз клинически

похожей на чуму крупного рогатого скота.

Согласно данным МЭБ чума овец и коз в настоящее время распространена

по всей территории Центральной Африки, Турции (1994), Ирана,

Аравийского полуострова, Индии, Пакистана (1991), Бангладеш, Непала

(1993) и Афганистана (1995).

Экономический ущерб, причиняемый ЧМЖЖ козоводству и овцеводству,

велик, особенно в странах, где преимущественно разводят мелких жвачных

животных, так как заболеваемость в первичных очагах болезни может

достигать 100%, при высоком уровне летальности. Кроме того, ЧМЖЖ

обуславливает возникновение сопутствующих болезней у животных, что

определяет высокий уровень экономических потерь.

Для борьбы с этой болезнью необходим точный диагноз, но не всегда это

удаётся из-за схожести с другими болезнями. Своевременная диагностика

ЧМЖЖ является важным условием купирования инфекции в первичном

очаге.

В настоящее время для диагностики ЧМЖЖ применяют различные

серологические методы такие как: реакция диффузионной преципитации

(РДП), реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН)

и иммуноферментный анализ (ИФА).

Наиболее простыми в исполнении и легко воспроизводимыми являются

реакции диффузионной преципитации и связывания комплемента, но они

- 6 -

малочувствительны, реакция нейтрализации является длительной, трудоемкой

и требует для постановки культуру клеток.

Известно, что разработанный для диагностики болезни ЧМЖЖ метод

ИФА применяют во многих странах. Однако в разных странах методы ИФА

отличаются между собой по многим параметрам и имеют специфические

особенности.

Принимая вышеуказанное во внимание можно сделать заключение о

необходимости разработки ИФА для выявления антигена и антител при

ЧМЖЖ. Для широкого применения ИФА для диагностики и серомониторинга

требуется разработка и создание универсальных отечественных

высокоспецифических диагностикумов.

Цель и задачи исследований.

Разработать тест-систему для лабораторной диагностики и идентификации

антигена вируса ЧМЖЖ и антител к нему.

Для достижения указанной цели необходимо было:

- провести эпизоотологические и вирусологические исследования в очагах

инфекции и выделить эпизоотический изолят вирулентной культуры

вируса ЧМЖЖ, пригодный для приготовления диагностических

препаратов;

- отработать методы приготовления комплексных культуральных

специфических и нормальных (контрольных) антигенов для

серологических тестов;

- получить активную вирусоспецифическую и антивидовую сыворотку

пригодную для постановки ИФА;

- подобрать оптимальные методы выделения иммуноглобулинов и

аффинноочищенных антител, и на их основе получения

иммунопероксидазных конъюгатов;

- отработать оптимальные условия постановки твердофазного варианта

ИФА для обнаружения специфического антигена вируса ЧМЖЖ;

- 7 -

- разработать оптимальные условия постановки непрямого твердофазного

варианта ИФА для обнаружения антител к вирусу ЧМЖЖ.

Научная новизна. Научная новизна проведенных исследований состоит в

том, что:

- впервые выделен эпизоотический вирус ЧМЖЖ из очага болезни мелкого

рогатого скота в Республике Таджикистан. Выделенный вирус ЧМЖЖ

паспортизован и депонирован в коллекции микроорганизмов ДГП

Научно-исследовательском институте проблем биологической

безопасности Республики Казахстан штамм вируса ЧМЖЖ

«Темурмалик» для биотехнологических целей.

- впервые в Республике Таджикистан разработана методика приготовления

комплексных культуральных специфических (на основе штамма

«Темурмалик» ЧМЖЖ) и нормального антигенов;

- разработана схема гипериммунизации получения высокоактивных

вирусоспецифических (на основе штаммов «G-45» и «Темурмалик») и

антивидовых сывороток для серологических реакций;

- отработаны оптимальные условия постановки прямого «Сэндвич» -

варианта ИФА для обнаружения антигена вируса ЧМЖЖ;

- отработаны оптимальные условия постановки непрямого варианта ИФА

для выявления вирусспецифических антител к вирусу ЧМЖЖ;

Практическая значимость. Предложен способ изготовления

культурального антигена на основе эпизоотического штамма «Темурмалик»

вируса ЧМЖЖ для постановки серологических реакций и гипериммунизации

животных.

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на

культуральный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы

выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочищенных

антител переданы для использования в НПП «Биологические препараты»

Таджикской Академии сельскохозяйственных наук для налаживания их

производства.

- 8 -

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-

техническая документация: Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни

чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменти (Наставление по

лабораторной диагностике ЧМЖЖ методом ИФА) и Тавсияхо оид ба

гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни

чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических

мероприятий при чуме мелких жвачных животных), утвержденные

начальником и зам. начальником Службы государственного ветеринарного

надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15

марта 2011г.) - приложение.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы

изложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НПП «Биологические

препараты» (Среднеазиатского ящурного института) - 2003-2010гг., на научно

– теоретических конференциях в Бишкеке и Москве.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных

работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на

119 страницах компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора

литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических

предложений и списка литературы. Список используемой литературы

включает 151 источников, из которых 79 иностранных. Диссертация

иллюстрирована 9 рисунками, 25 таблицами. Приложение на 10 страницах.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты выделения вирулентного изолята вируса ЧМЖЖ из очага

эпизоотии от больных и павших животных;

- результаты изучения выделенного вируса, его паспортизации и

депонирования в коллекции микроорганизмов для создания

иммунобиологических препаратов (диагностикумов, вакцин);

- 9 -

- результаты получения компонентов диагностических препаратов

пригодных для постановки ИФА на обнаружения антигена и антител

вируса ЧМЖЖ на основе полученного штамма;

- разработки ИФА тест-системы для выявления антигена вируса ЧМЖЖ и

наставления по использованию в лабораторной практике;

- разработки ИФА тест-системы для выявления антител из сывороток

крови больных и иммунизированных животных вирусом ЧМЖЖ.

- 10 -

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ

Чума мелких жвачных животных (la peste des petits ruminants) –

высококонтагиозное вирусное заболевание овец и коз, протекающее в острой

или подострой форме, характеризующееся лихорадкой, язвенными

поражениями слизистой оболочки ротовой полости, геморрагическим

гастроэнтеритом, поражением лимфоидной системы и развитием пневмонии

[4, 52, 83, 98, 114, 121, 133].

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относится к роду

морбилливирусов, семейства парамиксовирусов. Болезнь впервые

идентифицирована и описана в 1942г в Западной Африке. (Jvory Coast

Largadennec and Lalanne, 1942). С тех пор данное заболевание описано

разными исследователями под разными названиями, включая «Ката»

(Whitney, Scott and Hill 1967; Rowland, Scott and Hill, 1969), «псевдочума

КРС», «стоматитопневмоэнтеритный синдром» и «энтеритно-пневмонийный

комплекс». Заболевание было названо чумой мелких животных из-за его

клинического, патологического и иммунологического сходства с чумой КРС.

Возбудитель вызывает одноименное тяжелое заболевание у домашных и

диких мелких жвачных с высоким уровнем летальности в первичных очагах.

У крупного рогатого скота и свиней при инфицировании наблюдается

сероконверсия, на фоне отсутствия клинических признаков и

вирусовыделения [73,74,78,88,124]. Инфекция, однажды возникнув,

характеризуется устойчивой стационарностью.

В естественных условиях к вирусу чувствительны овцы, козы, антилопы,

горные овцы и козы. Крупный рогатый скот, буйволы и яки также заражаются

вирусом, что подтверждается обнаружением антител в сыворотке их крови в

реакции нейтрализации. Однако клиническое появление болезни этих видов

животных проявляется исключительно редко [78, 88, 90, 103, 108, 118, 119].

Есть значительные различия в эпизоотологическом образце болезни в

различных экологических системах и географических областях. Во влажной

- 11 -

Гвинейской зоне, где ЧМЖЖ проходит в форме эпизоотии, это может иметь

драматические последствия с заболеваемостью животных до 80% - 90%,

сопровождаемых смертностью до 50 и 80% (Lefеvre и Diallo, 1990). В

засушливых и полузасушливых областях ЧМЖЖ обычно проходит как

подклиническая или хроническая инфекция, открывающая дверь для других

инфекций, типа Pasteurellosis (Lefеvre и Diallo, 1990). Хотя вспышки в

Западной Африке совпадают с влажным дождливым сезоном, Opasina и др.

(1985) наблюдали вспышки в течение сухого сезона в двух различных

экологических зонах. Тэйлор и др. (1990) в Омане болезнь наблюдали

круглый год. О высокой заболеваемости 90%, сопровождаемой с 70%-ой

летальностью сообщали из Саудовской Аравии (Abu Elzein и др., 1990).

Серологические исследования, проведенные в Нигерии (Тэйлор, 1979b)

показали, что антитела обнаруживаются во всех возрастных группах с 4 до 24

месяцев [74, 89, 91, 128].

При исследовании филогенетических линий вируса методом

секвенирования гена было выявлено, что вирусы ЧМЖЖ, циркулирующие в

Африке и Омане, относятся к трем разным линиям, обозначенных как I, II, III.

В 1987 году при вспышке болезни в Индии была найдена IV-я линия вируса.

Есть предложение, что IV-я линия вируса, открытая в Индии в 1987 году,

существовала на субконтиненте, по крайне мере, с 1940 года. Существует

предположение, что эта линия вируса была завезена в Индию с Африканского

континента и имеет свой самостоятельный путь развити [82, 133, 146, 147].

В 1991 году вирус IV-ой линии подвергся мутации и превратился из

эндемической в эпизоотическую форму. Это произошло в Файсалабаде

Пакистана. Эпизоотический штамм вируса начал распространяться на юг и

запад. В 1993 году он достиг Северной Индии, затем Бангладеш и Непала. На

западе этот штамм в 1994 году достиг Турции, а в 1995 году Афганистана. В

эти же годы он достиг Ирака и Ирана.

- 12 -

Клинические признаки ЧМЖЖ хорошо изучены (Hamdy и др., 1976; Obi,

1984; Lefеvre, 1987; Тэйлор, 1984; Bundza и др., 1988; Roeder и др., 1994;

Roeder и Obi, 1999).

Вирус ЧМЖЖ в большинстве случаев вызывает клиническое заболевание

со смертельным исходом, которое протекает в острой и подострой форме.

Инкубационный период составляет 4-6 дней, иногда длится до 16 дней.

Первым признаком инфекции при остром течении чумы у овец и коз

является лихорадка с температурой тела 40-420С на шестой день после

первоначального контакта с вирусом. После краткого периода возбуждения

наступает депрессия, потеря аппетита и общие признаки сильного

заболевания. Носовое зеркальце сухое, горячее. На слизистой оболочке рта и

носа вначале появляются зоны гиперемии, затем очаги некроза и язвы.

Наблюдаются также серозные, а затем серозно-гнойные выделения из

носа, глаз, затрудненное дыхание и язвенно-некротический стоматит (Mornet

et al. 1956). Летальность при остром течении болезни через 8-10 суток

достигает 20-40%.

При подостром течении заболевание развивается медленнее, лихорадка

перемежающего типа. На 15-18 сутки появляются признаки пневмонии

вторичного характера и профузной диареи, обезвоживание организма. При

подострой форме поражения также включают застойный стоматит с

пятнистым изъязвлением и некроз языка, десен и глотки, отек

лимфатических узлов. У животных наблюдается истощение организма. При

благоприятном исходе болезни животные постепенно выздоравливают, а в

тяжелых случаях через 2-3 недели до 20% животных погибает. У самок

наблюдаются аборты.

При подострой форме заболевания можно отметить иногда ложный

«парез» конечностей и сгорбливание спины. На основе этих признаков

ЧМЖЖ принимали за «заболевание костей».

- 13 -

Прогноз при ЧМЖЖ неблагоприятный, для коз уровень смертности

достигает 95%. Наблюдалось выздоровление заболевших коз старшего

возраста, поэтому с возрастом прогноз становится благоприятным.

При патологоанатомическом вскрытии трупов животных слизистая

оболочка рта покрыта кровоизлияниями, эрозиями и язвами. Наиболее

характерные изменения находят в двенадцатиперстной, подвздошной и

слепой кишках, слизистая оболочка которых пронизана точечно-пятнистыми

и полосчатыми кровоизлияниями, местами с изъязвлениями. В кардиальных

и апикальных долях легкого наблюдают уплотнения, в сердце петихиальные

кровоизлияния по ходу коронарных сосудов. Заглоточные, мезентериальные

и портальные лимфатические узлы отечны, с кровоизлияниями и очагами

некроза. Селезенка иногда увеличена, дряблая, полнокровна, с

многочисленными кровоизлияниями.

Также у павших животных обнаруживают катаральное воспаление

дыхательных путей, продольные складки большой кишки, закупорку

протоков кишечных желез. Образование налета на губах является

характерным признаком хронической формы ЧМЖЖ и должен учитываться

при постановке дифференциального диагноза на инфекционную эктиму овец

и коз (Obi и Gibbs 1978). Isoun и Mann (1972) провели бактериологическое

исследование овец, погибших от ЧМЖЖ, и в образце легкого обнаружили

Pastertella spp, Esherichia colli и Streptococcus spp, в то время как в образцах

фекалий от овец с признаками диареи обнаружена Salmonella spp.

Для выделения вируса используют образцы крови, истечения из глаз и

носа (от живых животных), миндалины, брыжеечных лимфоузлов и легкого,

которые должны быть отобраны в течение гипертермической фазы (Lefevre,

1987) и представлены во льду в лабораторию для испытания.

Из данных литературы известно, что вирус ЧМЖЖ репродуцируется в

различных клеточных системах, в том числе в первично-

трипсинизированных-почек ягненка (ПЯ), тестикул ягненка (ТЯ), почек

козленка (ПК), тестикул козленка (ТК), эмбриональных клетках почек

- 14 -

мелких жвачных, клеток кожи эмбриона овцы, клеток почек обезьян, а также

перевиваемых - почек эмбриона КРС (MDBK), почек сайги (ПС), почек овцы

(ПО), почек эмбриона свиньи (СПЭВ), почек свиньи (IB-RS-2), почек

сирийского хомячка (ВНК-21), почек африканской зеленой мартышки

(VERO) и др. По разным данным наиболее чувствительными является

СПЭВ, VERO, ПС [47].

По данным Гильберт и Monnier (1962); Лорент (1968), Тэйлор и Abegune

(1979), Hamdy и др. (1976) наиболее чувствительными системами являются

клеточные культуры почек ягненка и Vero [99, 112]. Цитопатический эффект

(ЦПЭ) проявляется на 8-10 день. Цитопатическое действие на этих клетках

выглядело в виде крупного циферблатоподобного синцития, ядра которого

иногда содержали включения. Цитопатическое действие обычно развивалось

между 6-15 днями после инокуляции, начало его завысило от

множественности заражения.

Наиболее приемлемыми для изучения биологических свойств возбудителя

оказались культуры клеток тканей ягненка. Причем культура клеток

тестикулярной ткани ягненка наиболее перспективна как по

чувствительности, так и по степени доступности исходной ткани [51].

1.2. Лабораторные методы диагностики ЧМЖЖ

В настоящее время существует несколько методических подходов в

диагностике ЧМЖЖ. В практических лабораториях наиболее часто

используются методы обнаружения антигена ЧМЖЖ основанные на

серологических тестах диффузионной преципитации, флуоресцирующих

антител и иммуноферментного анализа на основе моно- и поликлональных

антител [93, 94]. Данные диагностические методы получили широкое

распространение в практике в связи с простотой их исполнения и

доступностью, однако, каждый из них имеет ряд недостатков и не является

- 15 -

оптимальным по сумме таких критериев как чувствительность,

специфичность и быстрота получения окончательного результата.

Из перечисленных методов диагностики ЧМЖЖ применяется РДП для

выявления вирусспецифических антител у переболевших и

иммунизированных животных (Obi, 1984; Абрахам и Berhan, 2001).

Реакцию нейтрализации (РН) при ЧМЖЖ применяют для обнаружения

вируснейтрализующих антител в сыворотках крови переболевших и

вакцинированных животных, а также для идентификации возбудителя

болезни в патологическом материале и инфицированной культуре клеток

(Тэйлор и Abegunde, 1979; Rossitter, 1994).

В настоящее время в основном для выявления антиген и антител при

ЧМЖЖ применяют метод иммуноферментного анализа (Selvakumar,

Padmanaban и Balaprakasam, 1981; Saliki и др., 1993; Wohlsein и др., 1993;

Андерсон и Mckay, 1994; Singh и др., 2004). ИФА обладает высокой

чувствительностью и специфичностью, позволяет анализировать

одновременно большое число проб, использовать полностью или частично

автоматизированные системы или проводить анализ практически без

оборудования; метод не требует очистки для обогащения проб, прост в

выполнении.

В последние годы с развитием иммунологии и молекулярной биологии,

лабораторная диагностика пополнилась новыми тестами. К таким тестам

относится полимеразная цепная реакция (ПЦР, the polmerase chain reaction,

PCR). B мире ПЦР нашла широкое применение в медицинской и

ветеринарной практике [57, 87, 96].

Метод ПЦР, основанный на выявлении специфических фрагментов

нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) возбудителя [55, 87, 96].

- 16 -

1.3. Конкурентные методы ИФА

В начале 1970-х гг. E.Engvall и P.Perlmann [95] и независимо от них B.K.

Van Weeman и A.H.W.M.Schuurs [148] предложили для выявления и

количественного определения антигенов и антител без применения

агглютинации частиц или радиоактивных меток более чувствительных и

универсальных меток для иммуноанализа – ферменты.

E.Engvall и P.Perlmann предложили сокращенно называть этот анализ

«enzyme-linked immunosorbent assay» (ELISA) [95], что означает

«ферментзависимый иммуносорбционный анализ». Суть метода ELISA

состоит в том, что сначала отделяют меченые и немеченые антигены,

связавшиеся с антителами, от свободных антигенов и только потом измеряют

активность метки в одной из двух фракций. Такие методы относят к

иммуноанализу с разделением компонентов. Поскольку фракционирование

анализируемой смеси неизбежно предполагает использование гетерогенных

фаз, иммуноанализ с разделением компонентов часто называют гетерогенным

иммуноанализом.

Конкурентные методы ИФА основаны на принципе конкуренции

известного количества меченого антигена или антитела с неизвестным

количеством того же самого антигена или антитела, но уже не меченного

ферментом, за третий компонент реакционной смеси, адсорбированным на

твердом носителе. В этих методах о наличии в пробе анализа судят по

степени подавления специфического окрашивания.

Конкурентный метод с иммобилизованным антигеном (для

обнаружения антигена)

Данный метод анализа проводят, используя меченые антитела, за центры,

связывания которых конкурируют иммобилизованный антиген и антиген,

находящийся в анализируемой пробе. Степень ингибирования процесса

связывания меченых антител с иммуносорбентом возрастает с увеличением

концентрации определяемого антигена. Измерения ферментативной

- 17 -

активности, в данном случае, можно проводить в растворе или на носителе

[23,24].

Конкурентный метод с иммобилизованным антителом

К иммобилизованным антителам добавляют определяемый антиген и

антиген, меченный ферментом, которые конкурируют за центры связывания

антител. Концентрация ферментной метки, определяемая в растворе или на

носителе, пропорциональна концентрации исследуемого раствора.

Метод конкуренции антител

Этот метод ИФА - наиболее применяемый из всех конкурентных методов

из-за простоты, высокой чувствительности и экспрессности [22, 23, 54].

Принцип метода состоит в следующем: меченые антитела и исследуемая

сыворотка добавляются к фиксированному количеству иммобилизованного

антигена. После установления в системе равновесия, содержание ферментной

метки в растворе или на носителе пропорционально концентрации антител в

сыворотке. Основное преимущество конкурентных методов в том, что они

требуют минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и

легко могут быть автоматизированы. Но эти методы не нашли пока широкого

распространения в вирусологической практике, так как для их постановки

требуется приготовление высокоочищенных препаратов антигенов, а также

отдельных иммуноферментных диагностикумов на каждый серотип вируса

[23,24].

1.3.1. Неконкурентные методы твердофазного ИФА Эти методы наиболее давно испытаны для диагностики вирусных

инфекций [67, 92]. В отличие от конкурентных методов, концентрация

антигенов или антител, определяемая данными методами, прямо

пропорциональна интенсивности окрашивания реакций.

- 18 -

«Сэндвич» - метод определения антигенов

Данный метод ИФА является наиболее простым и широко

распространенным и неконкурентным методом для количественного

определения поливалентных антигенов. Метод введен в вирусологическую

практику в 1975г. [150]. Сущность его состоит в следующем: определяемый

антиген реагирует с избытком иммобилизованных вирусоспецифических

антител. После промывания, в систему добавляют такие же антитела, но уже

меченые ферментом. Количество ферментной метки, связанной с носителем,

пропорционально концентрации определяемого антигена. Метод требует

больше времени и числа операций, чем конкурентный анализ, но обладает

рядом существенных преимуществ, основными из которых является высокая

специфичность и чувствительность, превосходящая возможности других

вариантов твердофазного ИФА. Б.Б. Дзантиев [23] связывает это с высоким

родством вирусоспецифических антител, меченных ферментом, к

определяемому антигену. В настоящее время этот метод разработан для

диагностики многих вирусных инфекций животных [34, 42].

Непрямой «Сэндвич» - вариант для определения антигенов является

производным от предыдущего метода и отличается от него использованием

не вирусспецифических, а видоспецифических антител, меченных ферментом

и направленных против используемых вторичных антител. Метод

предложили M.F.Clark и A.N.Adams в 1977г. Чувствительность непрямого

«Сэндвич» - метода ИФА, как отмечают многие авторы, идентично

чувствительности прямого метода [23], а в некоторых случаях превосходит

его в 2-4 раза. Но метод является более трудоемким и требует получения

вирусспецифических антител на разных видах животных, чтобы избежать

неспецифического фонового окрашивания.

Метод с прямой адсорбцией антигена заимствован из РИА [68,

85].Определяемый антиген в условиях щелочной среды (рН 9,5-9,6)

сорбируется на стенки носителя, затем его выявляют методами прямого или

непрямого «Сэндвич» - варианта ИФА.

- 19 -

Прямой метод ИФА (по принципу ингибирования) для выявления антител

разработан D.E.Vorde et al. [149] по принципу ингибирования специфической

реакции между антигеном и вирусспецифическим конъюгатом в случае

наличия между ними специфических антител. Метод обладает следующими

преимуществами: во-первых, он позволяет использовать одни и те же

конъюгаты, как для определения антител, так и для обнаружения антигенов,

во-вторых, этот метод, как и все методы по принципу «Сэндвич»,

высокоспецифичен и достаточно чувствителен [23, 24].

Непрямой «Сэндвич» - метод определения антител разработан ранее всех

описанных методов ИФА [95]. Принцип его состоит в том, что определяемые

антитела соединяют с гомологичным иммобилизованным антигеном,

полученный комплекс выявляют антивидовыми антителами, меченными

ферментом и направленными против исследуемой сыворотки. Данный метод

позволяет выявить уровень антител при различных заболеваниях, используя

один и тот же антивидовой конъюгат [20]. Чувствительность методов в

отношении специфических антител составляет 0,03-1 мкг/мл [27], что в 100-

1000 раз чувствительнее РСК и сравнимо или превосходит в 2-10 раз

чувствительность РН [20]. В настоящее время при постановке непрямого

ИФА вместо антивидовых конъюгатов могут применятся конъюгаты белка А

золотистого стафилококка, который имеет высокое сродство с Fc -

субъединицами большинства иммуноглобулинов G, которым принадлежит

подавляющая часть антител [120, 131]. Тем более это перспективно, так как в

зарубежных странах налажено промышленное производство белка А и его

конъюгатов с пероксидазой хрена.

Определенное влияние на выбор конкурентной методики проведения

гетерогенного анализа, а также на успех постановки реакций оказывает тип и

форма твердофазного носителя и способы его сенсибилизации.

- 20 -

1.3.2. Твердофазный носитель для ИФА

Наибольшее применение в диагностике целого ряда вирусных заболеваний

человека и животных нашли методы твердофазного ИФА [95, 143].

Твердофазный (гетерогенный) метод ИФА основан на использовании антител

и антигенов, иммобилизованных на твердом носителе. Этот комплекс,

названный иммуноадсорбирующим, позволяет уловить антиген или антитела

в исследуемом растворе. Полученный таким образом иммунный комплекс

выявляют путем введения вторичного антитела или антигена, но уже

меченого ферментом. Впервые твердофазный ИФА был описан в 1972г. [95],

и в настоящее время он широко известен под названием метод «ELISA» -

энзимсвязанный иммуноадсорбирующий анализ. В зависимости от того,

исследуют антиген или антитело и применяют различные модификации этого

метода.

Гетерогенный (или твердофазный) ИФА основан на принципе

иммобилизации антигенов или антител на твердой фазе, что обеспечивает

быстрое или эффективное разделение компонентов после реакций. В качестве

твердой фазы используют целый ряд различных полимеров, но не зависимо от

того, какой используют материал, конечной целью является получение

максимальной и специфической фиксации для других реагентов.

Иммобилизацию проводят либо ковалентным связыванием, либо физической

адсорбцией белка на носителе. Для приготовления иммуносорбентов путем

ковалентного связывания нашли применение такие носители, как целлюлоза,

сефароза, агароза, сефадекс [32, 69], биогель [24], пористое стекло [1],

силихром [1, 24], бумажные диски [69], нитроцеллюлозные мембраны [36,

144]. Сшивающими реагентами в этом случае являются азиды,

водорастворимые карбодиамиды, бромциан, изоцианаты, глютаровый

альдегид [35, 106, 115].

Последние время большое внимание уделяется автоматизации методов

ИФА. В связи с этим, представляет интерес применение носителей на основе

- 21 -

окислов железа и феррита бария, обладающих магнитными свойствами [23,

100].

В качестве твердой фазы тест-систем, основанных на принципах

иммуноферментного анализа, используют синтетические полимеры, такие как

полистирол, поливинил, дакрил и другие в виде пробирок [28, 71, 110], 96-

луночных планшет [49, 60], магнитных частиц, магнитных бус. Наиболее

широко применяются 96–луночные планшеты из полистирола, так как этот

полимер доступен и химически инертен. В работе авторов [49] отмечено, что

поверхность любых планшетов характеризуется неравномерностью

распределения гидрофобных участков. Так, на равных участках полистирола

может находиться различное остаточное количество химического

компонента, используемого в процессе получения полимера. Нестандартность

адсорбционной поверхности полистироловых планшетов приводит к

непрочному связыванию антител и их десорбции на этапах ИФА. В связи с

этим необходимы исследования по оптимизации способов получения твердых

носителей, обеспечивающих прочную иммобилизацию лигандов (Ат и Аг)

при сохранении их биологической активности.

Согласно данным литературы [62], связывание антител с твердым

носителем проводят путем физической адсорбции или методом ковалентной

иммобилизации. В случае физической адсорбции носитель в течение

нескольких часов обрабатывают раствором соответствующих антител, при

этом связывание антител с поверхностью полистиролового носителя

обеспечивается, в основном, за счет гидрофобных взаимодействий. Затем

избыток антител отмывают, а носитель помещают в раствор альбумина для

предотвращения неспецифической адсорбции конъюгата. Связывание белка с

носителем зависит от концентрации, причем совместное влияние рН и ионной

силы особенно проявляется при более высоких концентрациях белка в

растворе. Связывание белков с полистироловым носителем зависит от

времени и температуры обработки. Так, при 37 0С связывание белка вдвое

- 22 -

больше, чем при 40С. Кроме того, при 3–х часовой иммобилизации уровень

адсорбции белка достигает 80%, после 36–ти часовой – 100% [49].

Способы иммобилизации антигенов или антител очень разнообразны, но

наиболее распространенным является способ K.J.Catt, G.W.Treager (1967),

впервые примененный в ИФА в 1972г. [85] . Для этого антигены или антитела

растворяют в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) и наслаивают на

поверхность носителя, адсорбция длится 1-3 часа при плюс 37ºС или 18-24

часа при плюс 4ºС [106, 107, 115].

Применение метода иммобилизации, как показывает анализ

многочисленных обзорных публикаций и монографий, способствует

повышению эффективности биотехнологических процессов, и при этом

следует остановиться на многих составляющих, которые обосновывают

преимущества иммобилизованных систем [9, 10, 19, 84].

По-видимому, это связано с увеличением скорости биоконверсии

субстрата в целевой продукт, увеличение скорости потребления субстрата

ферментативной реакции.

Таким образом, многократность применения иммобилизованных

биокатализаторов позволяет перейти от периодических к более

технологичным непрерывным процессам [18], значительны при этом

экономические преимущества.

Важной технологической особенностью применения иммобилизованных

систем является то, что значительно упрощаются стадии выделения,

концентрирования и очистки целевого продукта. При иммобилизации

микробных клеток, например, в альгинате кальция возможно проведение

прямой экстракции антибиотика циклогексимидина из культуральной

жидкости, и при этом из технологической схемы исключаются стадии

промывки, экстракции растворителями, ионообменной хроматографии,

степень очистки указанного антибиотика достигает 95% [18].

Использование носителей с магнитными свойствами для иммобилизации

биообъектов открывает новые перспективы интенсификации процессов

- 23 -

биотехнологии. Применение магнитных носителей позволяет повысить

массопередачу в биореакторах, особенно при аэробных процессах, где

массопередача является лимитирующим фактором.

Использование ферментеров с генераторами магнитного поля для

непрерывных процессов позволит отказаться от перемешивания с помощью

обычных мешалок. Носители биообъектов с магнитными свойствами

приобретают повышенную стабильность и могут быть использованы в

реакторах с большими скоростями потоков и более высокими давлениями.

Магнитные свойства носителей биокатализаторов (ферментов и клеток)

позволяют с помощью магнитного поля удалять их после использования в

биотехнологическом процессе.

Таким образом, метод ИФА находиться в постоянном развитии. С одной

стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и

совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что

упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается

расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых ферментов,

используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА

оказывает химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная

инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов

для ИФА.

1.3.3.Иммуноферментные конъюгаты Важным звеном при отработке иммуноферментных методов является

приготовление и контроль иммуноферментных конъюгатов. Само же качество

конъюгатов определяется свойствами фермента и антитела или антигена,

входящими в его состав, а также способом изготовления конъюгата.

Чувствительность и воспроизводимость ИФА находится в прямой

зависимости от качества фермента, взятого для метки. Ферменты-маркеры,

- 24 -

используемые в ИФА, должны удовлетворять следующим требованиям,

вытекающим из специфики метода:

- высокая специфичность и удельная каталическая активность фермента,

позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;

- стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с

антителом;

- простота, доступность, чувствительность методов определения

ферментативной активности;

- сохранение активности и стабильности при модификации в конъюгате с

антителами (антигенами);

- отсутствие используемого фермента или его субстрата в исследуемых

пробах;

Для метки в ИФА применяют следующие ферменты: пероксидазу хрена,

щелочную и кислую фосфотазу, β-Д-галактозидазу, глюкозооксидазу, β-

лактамазу, каталазу, лизоцим, малатдегидрогеназу, люциферазу [17, 22, 27,

63, 66, 70, 75, 97, 101, 104, 113, 123, 127, 130]. Но наиболее применяемым

ферментом в ИФА является пероксидаза хрена. Его молекулярный вес (около

40 000) значительно ниже молекулярного веса фосфатазы (около 100 000) и

глюкозо – оксидазы (около 150 000), что способствует лучшему

проникновению через клеточную мембрану комплекса пероксидаза-антитело.

Кроме того, пероксидаза из хрена устойчива при цитихимической методе

обработке (Kurstak, 1971). Применению имммунопрероксидазного метода в

вирусологии предшествовала разработка методов конъюгации фермента с

невирусными антителами (Avrameas et all., 1966, 1967, 1968, 1969, 1971).

Это связано с доступностью сырья для ее выделения, относительной

легкостью очистки, достаточно высокой стабильностью, большим

количеством хромогенных субстратов и отсутствием ее во многих

исследуемых биологических жидкостях [27, 37, 72]. Она содержит легко

окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может,

осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав

- 25 -

субстратной системы для измерения активности пероксидазы

фотометрическом способом входят хромогены, дающие при окислении

перекисью окрашенные соединения.

Впервые Nakane и Pierce (1966-1971) разработали способ соеденения

антикроличьного овечьего гамма-глобулина с равным количеством

пероксидазы с помощью бифункционального реагента пара,

парадилуородинит-родфенилсульфона. Этим способом были конъюгированы

антитела к антигенам вируса лимфоцитарного хореоменингита (Adelson et all.,

1969), реовирусов (Ubertini et all., 1971), вирусов простого герпеса и SV-40

(Shabo et all., 1972), вакцины (Siverd et all., 1969).

Важным условием получения специфического конъюгата для выявления

вирусных антигенов является конъюгация фермента не с гамма-глобулиновой

фракцией антисывороток, а с очищенными антителами (Dobardzic et all., 1973,

Wicker, 1971, и др.).

Некоторые исследователи отмечают неспецифическое, фоновое

окрашивание при использовании конъюгата, не очищенного от несвязавшейся

пероксидазы (Storch, Sandov, 1973). Разделение обычно ведут или

преципитацией насищенным раствором сульфата аммония (Avrameas,

Ternynsk, 1971; Miller et all., 1974), гель-фильтрацией на сефадексе G-75-200

(Abelson et all., 1969; Kurstak, 1970; Ciampor et all., 1974), или фильтрацией на

био-геле Р-300 (Hoshino, 1972).

Nakane, Kawaoi (1974) для активации пероксидазы использовали периодат

натрия. Образование альдегида пероксидазы происходило без значительного

снижения активности фермента. При этом связывалось около 99% IgG и 70%

пероксидазы вместо 2% при обычном способе (Avrameas, 1969). Полученный

альдегид пероксидазы можно было хранить около месяца.

В настоящее время известны две группы методов введения ферментной

метки: ковалентное связывание молекул антител с ферментом и

нековалентные методы, в которых связь между ферментом и антителом

осуществляется иммунологически, через взаимодействие антигена с

- 26 -

антителом. Наиболее применимы ковалентные методы приготовления

конъюгатов. Из большого числа бифункциональных реагентов наибольшее

применение нашли глютаровый альдегид и периодат натрия [37, 97]. Первым

использованным для синтеза конъюгатов антител с ферментами, был

глютаровый альдегид - бифункциональный реагент, взаимодействующий с Е-

аминогруппами белка. Существует две модификации этого метода: одно - и

двуступенчатый [56, 70, 79, 80].

Одноступенчатый метод заключается в добавлении бифункционального

реагента к смеси иммуноглобулинов и фермента. Методически метод прост и

в результате реакций образуются высоко реактивные конъюгаты, но они часто

являются гетерогенными, так как содержат значительное количество

высокомолекулярных реагентов и олигомеров исходных компонентов. Этот

метод в настоящее время используется редко, так как качество конъюгатов в

значительной степени определяет характеристики анализа.

Двуступенчатый метод заключается в следующем: на первом этапе

конъюгации фермент обрабатывают глютаровым альдегидом (активируют), а

на втором этапе соединяют активированный фермент с антителами [56].

Данный метод получения иммуноферментных конъюгатов позволяет

уменьшить полимеризацию антител и получить конъюгаты однородного

состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на одну молекулу

иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и

иммунологическую активность. Двуступенчатый метод конъюгации широко

используется различными исследователями [22, 23, 72]. Кроме глютарового

альдегида, для конъюгации с успехом испытаны диизоцианаты и бензохинон

[23, 125]. Эти реагенты более стабильны в водной среде и применяются как

для одно-, так и для двуэтапного синтеза иммуноферментных конъюгатов.

Наибольшее практическое применение нашел метод приготовления

конъюгатов, базирующийся на окислении углеводного компонента фермента

периодатом натрия [27, 105, 125]. Первый периодатный метод разработан в

1974г. P.K.Nakane и A.Kawaoi [122], а в 1978г. модифицирован M.B.Wilson и

- 27 -

P.K.Nakane [151]. Эффективность связывания пероксидазы с глобулинами в

данной методике достигает 70-90%, при сохранении ее активности на 20%

[23, 27]. Приготовленные с помощью перйодатного метода конъюгаты имеют

полудисперсионный состав и содержат от 0,5 до 3 молекул фермента на одну

молекулу иммуноглобулина. Метод имеет высокую воспроизводимость и

эффективность по сравнению с глютаральдегидным, по этому более широко

применяется [14, 30, 102].

K. Kato et al. в 1975г. был разработан эффективный метод конъюгации с

помощью дималеида [109]. Авторы предложили с помощью этого метода

конъюгировать иммуноглобулины с ферментами, устойчивыми к химическим

воздействиям (в частности с β-Д галактозидазой). Установлено, что

полученные конъюгаты сохраняли до 80% исходного фермента и 90% его

каталитической активности [23, 27].

Перспективным направлением является использование для метки не целой

молекулы фермента, а его пептида обладающего каталитической

активностью, что исключает возможность стерического экранирования

активных центров антител. Возможность такого синтеза показана при

ковалентном связывании Fab- фрагмента антител с гемактапептидом,

обладающим пероксидазной активностью [8].

В настоящее время разрабатываются методы мечения антител,

иммобилизированных на иммуносорбенте [38].В процессе конъюгации

активный центр антител экранируется антигенным иммуносорбентом.

Полученные этим способом конъюгаты сохраняют исходную активность

антител и обладают исключительной специфичностью и сродством к

антигену. В отдельную группу выделились иммунологические методы

введения ферментной метки, основанные на образовании связи антиген-

антитело.

Идет процесс дальнейшего совершенствования методов ИФА в плане

повышения их чувствительности, специфичности и экспрессности. Исходя из

этого, главное направление в развитии ИФА на ближайшие годы будет

- 28 -

заключаться в совершенствовании методов очистки и контроля компонентов

ИФА, использовании в качестве антигенов отдельных вирусных белков,

аффинно-очищенных или моноклональных антител [8, 11, 105]. Будут также

совершенствоваться методы получения более активных и чистых конъюгатов

- путем введения ферментной метки, либо с помощью «мостиковых», либо с

помощью так называемых, гибридных антител [7, 8]. Перспективным в этом

направлении является применение белка А золотистого стафилококка,

который образует прочный комплекс с Fс-фрагментами молекул IgG

различных видов животных [120, 125, 131].

Важнейшее преимущество ИФА с включением авидин-биотина

заключается в том, что любое вещество, конъюгированное с биотином, можно

обнаружить по взаимодействию с авидином. Это обуславливается

чрезвычайно высоким сродством авидина к молекулам биотина[129, 137].

1.3.4. Принципы получения диагностических сывороток

Анализ доступной литературы по использованию различных

серологических реакций в диагностических целях свидетельствует, что

важнейшим компонентом, определяющим их специфичность, является

диагностическая сыворотка, так как при прямой диагностике именно она

выполняют роль «индикатора» наличия в пробе искомого агента и «мерила»

его антигенного и иммунохимического спектров.

Для получения диагностических сывороток, содержащих высокие титры

антител, домашних и лабораторных животных подвергают иммунизации по

определенным схемам, либо заражению вирулентным материалом.

Общепринятых схем с целью получения активных и специфичных сывороток

не существует. Диагностические сыворотки при различных инфекциях

получают самыми разнообразными способами [44], но при этом

придерживаются некоторых общих правил:

1. Антигены для иммунизации должны быть предельно чистыми, т.е. не

содержать клеточные компоненты или другие неадекватные компоненты.

- 29 -

2. Схема иммунизации должна быть, как можно проще и легко

воспроизводима.

3. При выборе донора необходимо учитывать вид животного, так как это

играет определенную роль для избежания неспецифической реакции с

антигенами против видоспецифических клеток.

Для получения высокоэффективных антител были подобраны

оптимальные дозы антигена и сроки иммунизации животных. Известно, что

сыворотки, полученные на ранних этапах иммунизации, обычно имеют более

низкую аффинность, чем полученные позднее (T.P. Werblin, Tai Kim Young,

G. W. Siskind, 1973). На аффинность антител влияет также величина дозы

антигена, используемого для иммунизации. Иммунизация высокими дозами

антигена не только вызывает продукцию низкоаффинных антител, но и

приводит к образованию антител против посторонних примесей. Чтобы

уменьшить нежелательный ответ на посторонние антигены, предпринята

попытка вызвать к ним толерантность путем введения животным

гомологичных антител (P. Qold, S.O. Freedmmam, 1965) в период основного

цикла иммунизации.

Титр антител в сыворотках определяли через 7 дней после последней

иммунизации [21]. Иммунологическую активность сыворотки определяли в

реакции радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (O. Ouchterlony, 1949)

или в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

Если титр антител исследуемых сывороток в реакции преципитации

составлял – 1:16–1:32, то проводили полное обескровливание животного. При

низких значениях титра животных-продуцентов после месячного перерыва

подвергали процедуре реиммунизации.

1.3.5. Принципы приготовления антигенов Антигены в диагностических исследованиях выполняют двоякую роль. С

одной стороны они служат «эталоном сравнения» при идентификации

выделенного антигена, а с другой - самостоятельным диагностическим

- 30 -

компонентом при выявлении антител. В практических условиях нередко

антигены применяют еще в одной сфере, а именно при получении

диагностических сывороток и антительных препаратов. В соответствии с

этими аспектами использования антигены универсального назначения

должны быть высокоактивными в серологических реакциях и

иммуногенными для доноров диагностических сывороток, максимально

очищенными от балластных веществ и чужеродных антигенов, обладать

высокими потребительскими качествами.

При ЧМЖЖ, как и при других вирусных болезнях животных,

технологическая схема изготовления диагностических антигенов включает

ряд стадий, в том числе наработку вируссодержащего материала, его очистку,

концентрирование и стабилизацию. Как следует из данных литературы, для

наработки вируссодержащего сырья можно использовать культуру клеток

[40].

Как было отмечено выше, в антигенных препаратах всегда содержится

много балластных веществ из клеток культуры ткани. Это требует при

постановке серологических реакций ставить контрольную пробу с

использованием препарата антигена, полученного из аналогичной

незараженной ткани тем же методом, которым получали вирусный тест-

антиген. Таким образом, определяют, имеется ли в препарате тест - антигена

материал клетки хозяина, способный реагировать с антителами, содер-

жащимися в тест - сыворотке. Центрифугирование в градиенте плотности,

колоночная хроматография или обработка фторуглеродными соединениями

помогают очистить антигенные препараты от примесей.

Научно-практические аспекты концентрирования разных вирусов

подробно рассмотрены в работах Васильева А.В. [13].

- 31 -

1.4. Заключение по обзору литературы

ЧМЖЖ широко распространен во многих странах и на территории СНГ,

особенно в приграничных районах Республики Таджикистан. В Афганистане

эта болезнь регистрировалась в 1995г. При анализе литературных данных

установлено, что болезнь имеет инфекционную природу и относится к

категории серьезных вследствие массового охвата, тяжелого течения, с

высоким уровнем летальности в первичных очагах. Поэтому своевременный

диагноз на ЧМЖЖ позволит снизить вышеизложенные последствия.

Описанные авторами эпизоотологические данные, клиническая картина и

результаты патологоанатомического вскрытия не дают оснований для полной

постановки диагноза, так как сходные признаки могут быть у других

вирусных болезней мелкого рогатого скота. На основании этих признаков

можно поставить только предварительный диагноз. Достоверная диагностика

осуществляется лабораторными методами исследования, основанными на

выделении вируса в культуре клеток и его идентификации постановкой

серологических реакций.

В настоящее время для диагностики и идентификации ЧМЖЖ

разработаны РСК, РДП, МФА, РН с использованием специфических

сывороток и антигенов, отдельных для каждой реакции [58, 59, 125, 142, 145].

Они имеют ряд недостатков: использование дорогостоящих культур клеток,

малочувствительность, большая затрата времени и др.

В последние годы для серологической диагностики многих вирусных

болезней широкое применение находит иммуноферментный метод. Его

преимущество по сравнению с другими серологическими методами состоит в

более высокой чувствительности и высокой производительности в результате

полной автоматизации.

В зависимости от того, исследуют антиген или антитело и применяют

различные модификации этого метода, которые объединены в две группы -

- 32 -

конкурентные и неконкурентные. Каждая из этих групп имеет свои

особенности и преимущества при постановке ИФА.

При разработке метода ИФА для диагностики ЧМЖЖ некоторыми

авторами были выбраны из неконкурентных методов ИФА - прямой метод

для обнаружения антигена и непрямой метод для обнаружения антител в

исследуемых пробах. Они отличаются от других большей чувствительностью,

специфичностью и простотой постановки [136]. С помощью этих методов

можно обнаружить антигены и антитела в более низких титрах, а также для

постановки реакции можно использовать поливалентные антигены.

Важным звеном при отработке иммуноферментных методов является

приготовление и контроль иммуноферментных конъюгатов.

По данным литературных источников для метки белков рекомендуется

использовать фермент пероксидазу хрена. Это связано с доступностью сырья

для его выделения, относительной легкостью очистки, достаточно высокой

стабильностью, большей безопасностью хромогенных субстратов и

отсутствием фермента во многих исследуемых биологических жидкостях [27,

37,72].

Известно, что метод ИФА для диагностики болезни ЧМЖЖ разрабатывали

и применяют во многих странах. Однако разработанные в разных странах

методы ИФА между собой отличаются по многим параметрам и имеют

специфические особенности [43, 76, 77, 86, 116, 117, 134, 135, 139, 140].

Однако в отношении такой вирусной болезни, как ЧМЖЖ, которая

наносит огромный экономический ущерб животноводству Республики

Таджикистан до настоящего времени не разработан метод ИФА для

выявления антигена и антител при ЧМЖЖ.

Для борьбы с ЧМЖЖ необходим точный диагноз, но не всегда это удаётся

из-за схожести с другими болезнями. Своевременная диагностика ЧМЖЖ,

является важным условием купирования инфекции в первичном очаге.

- 33 -

Поэтому, указанные выше обстоятельства послужили основной

предпосылкой разработки иммуноферментного анализа для лабораторной

диагностики ЧМЖЖ.

Для ее решения было запланировано:

- подобрать наиболее оптимальные условия приготовления

специфического комплексного культурального антигена, его концентрация и

очистка;

- разработать наиболее приемлемую схему гипериммунизации животных с

целью получения активных, вирусспецифических и антивидовых сывороток;

- на основе полученных вирусспецифических и антивидовых сывороток

подобрать наиболее оптимальные методы выделения вирусспецифических и

антивидовых иммуноглобулинов;

- подобрать наиболее оптимальные условия приготовления

вирусспецифических и антивидовых конъюгатов;

- отработать условия постановки иммуноферментного анализа для

диагностики болезни ЧМЖЖ.

- 34 -

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа была проведена в НПП «Биологические препараты» ТАСХН,

ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины

и биотехнологии имени К.И. Скрябина», экспериментальное изучение вируса

ЧМЖЖ проведено на базе ДГП Научно- исследовательского института

проблем биологической безопасности Республики Казахстан,

производственные опыты проведены на базе республиканской и областных

ветеринарных лабораторий и в овцеводческих и козоводческих хозяйствах

Республики Таджикистан.

В работе использовали клинико-эпизоотологические, вирусологические,

серологические и иммунологические методы исследования.

В экспериментах по изучению вируса ЧМЖЖ принимали участие

сотрудники лаборатории «Диагностика и индикация вирусных инфекций»

ДГП НИИПББ МОН Республики Казахстан, которому автор выражает

искреннюю признательность за оказанную помощь и сотрудничество.

2.1.1. Материалы

2.1.1.1. Вирусы

В опытах использованы выделенный и депонированный нами штамм

ЧМЖЖ «Темурмалик» с биологической активностью 5,25 lgТЦД50/см3;

вакцинный штамм ЧМЖЖ «G-45» с биологической активностью 4,5

lgТЦД50/см3.

2.1.1.2. Животные

Для получения вируссодержащего материала, вирусспецифических и

видоспецифических сывороток в опытах использовали овец и коз в возрасте

от 1,5 до 3 лет, массой от 45 до 50кг; кроликов местной породы, массой от 2

до 3кг.

Для опытов брали только клинически здоровых животных, перед

использованием их выдерживали на карантине не менее 16 сут.

- 35 -

2.1.1.3. Диагностические антигены и сыворотки - специфические антигены, полученные путем инфицирования первично-

трипсинизированной культуры клеток ТЯ эпизоотическим штаммом

«Темурмалик» и вакцинным штаммом вируса ЧМЖЖ;

- нормальные антигены, полученные из незараженных культур клеток ТЯ;

- специфические сыворотки от овец и коз получали путем

гипериммунизации животных вируссодержащим материалом ЧМЖЖ;

- нормальная сыворотка от здоровых овец и коз;

- антивидовые сыворотки получали путем гипериммунизации кроликов

нормальным глобулином овец и коз;

- гаммаглобулины выделяли из вирусспецифических сывороток

спиртовым методом по Кону [53];

- аффинно-очищенные антивидовые антитела выделяли по методике

S.Avrameas и T.Ternynck [65];

- антивидовой и вирусспецифический иммунопероксидазные конъюгаты

готовили методами P.K.Nakane, A.Kawaoi и M.B.Wilson, P.K.Nakane [122,

151];

- в качестве гетерологичных антигенов и сывороток использовали

диагностические антигены и сыворотки к вирусам оспы овец, контагиозной

эктимы овец и катаральной лихорадки овец.

2.1.1.4. Контрольно-испытуемые пробы

- культуральные вируссодержащие материалы вируса ЧМЖЖ;

- 10 и 20% суспензии органов (селезенка, легкие, почки, печень, сердце,

губы, лимфатические узлы, смывы из носовой полости) взятые в период

виремии или гибели животных;

- культуральные вируссодержащие материалы, зараженные 10 и 20%

органо-тканевыми суспензиями, взятыми от больных животных

экспериментально зараженных эпизоотическими вирусами ЧМЖЖ;

- 10-20%-ые нормальные органо-тканевые суспензии.

- 36 -

2.1.1.5. Культуры клеток Для выделения, культивирования, титрования вирусов ЧМЖЖ и

постановки реакции нейтрализации использовали первично-

трипсинизированную культуру клеток ПЯ, ТЯ и перевиваемую линию

культуры клеток МДВК, выращенные в лаборатории «Культивирования

клеток и тканей» НИИПББ.

2.1.1.6. Химические реактивы и биопрепараты

- пероксидаза хрена «Биохимреактив» г. Олайне с чистотой (Rz)- 2,7 и

выше, ТУ-6-09-10-172-76;

- АБТС (2,2-азинобисэтилбензтиазолин сульфоновая кислота), «Serva»;

- Гаммаглобулин бычий, «Serva»;

- Бычий сывороточный альбумин, «Биохимреактив» ТУ 6-09-10-342-75;

- Натрий метапериодат, ТУ 6-09-02-54-74, «Реахим»;

- Перекись водорода, ГОСТ 10929-76 «Реахим»;

- Сефадекс G-200, «Pharmacia»;

- Твин-80, «Serva»;

- 25 % глютаровый альдегид, «Merck»;

- Полиэтиленгликоль (Мм=6000, 40000), «Serva»;

- Этиленгликоль «Реахим», ГОСТ 10164-75;

- Сахароза «Биохимреактив», ГОСТ 5833-54;

- Полный и неполный адъюванты Фрейнда, «Difco»;

- Натрий фосфат 1-замещенный, ГОСТ 245-76;

- Натрий фосфат 2-замещенный, 2-водный, ГОСТ 4172-76;

- Натрий боргидрит, «Merck»;

- Натрий двууглекислый, ГОСТ 4201-79;

- Натрий углекислый, ГОСТ 4283-79;

- Натрий хлорид, ГОСТ 42-33-77;

- Натрий ацетат трехводный, ГОСТ 199-88;

- Глицин, «Serva»;

- 37 -

- Бактоагар, «Difco»;

- Бензилпенициллина натриевая соль;

- Глицерин, «Реахим», ГОСТ 6259-75;

- Сернокислый аммоний, «Реахим».

2.1.1.7. Растворы и их приготовление При проведении исследований применяли следующие растворы:

0,15М раствор хлористого натрия (физиологический раствор): в мерную

колбу вносят 8,7г хлористого натрия, и объем доводят дистиллированной

водой до 1дм3.

Раствор для ИФА: к 1дм3 физиологического раствора добавляют 1см3

твина-80. Раствор применяют для разбавления компонентов и промывания

плашек при постановке ИФА.

Наполнитель для ИФА: к раствору для ИФА добавляют БСА до концент-

рации 1%.

0,1М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ), рН 9,6: для приготовления

0,1М КББ смешивают 10см3 1М натрия двууглекислого (Nа2СО3) и 90см3 1М

гидрокарбоната натрия (NаНСО3) и объем раствора доводят до 1дм3

дистиллированной водой.

1М натрий двууглекислый (Nа2СО3): 105,8г Nа2СО3 растворяют в 1дм3

дистиллированной воды.

1М гидрокарбонат натрия (NаНСО3): 83,9г NaHCO3 растворяют в 1дм3

дистиллированной воды.

1%-ый раствор перекиси водорода (Н2О2) готовят: в мерную колбу вносят

3см3 30%-ой Н2О2 и общий объем доводят до 30см3 дистиллированной водой.

0,01М раствор уксуснокислого натрия, рН 4,3-4,4: 1,36мг

СН3СООNа3Н2О растворяют в 1дм3 дистиллированной воды, рН раствора

доводят до 4,3-4,4 с помощью уксусной кислоты.

- 38 -

Раствор субстрата для ИФА: в 10см3 0,01М раствора уксуснокислого

натрия, рН 4,3-4,4, растворяют 2,2мг АБТС и 0,1см3 1%-ой перекиси

водорода.

2.1.1.8. Аппараты и лабораторное оборудование - низкотемпературный холодильник «Кельвинатор» (режим хранения

биоматериалов от минус 30 до минус 400С);

- бытовой холодильник «ЗиЛ», для хранения образцов

вируссодержащего материала;

- Торсионные весы марки «ВТ»;

- Фотометр марки «Мультискан» фирмы «Флау лаборатория»;

- Спектрофотометр марки СФ-18 «Ломо»;

- Препаративные центрифуги до 12 тыс. об/мин;

- Термостат с водяной рубашкой (120Вт - 220В);

- Ротационная мешалка;

- Хроматографические колонки размером 2,5х85см, фирмы «Фармация»;

- Магнитная мешалка Мм 3М 220В, 50Гц;

- Микротитровальные планшеты 96-луночные, плоскодонные из

полистирола любой фирмы;

- Пипетки с регулируемым объемом от 0 до 250мкл, фирмы «Флау

лаборатория», «Эппендорф», «Кентаур Хемикалс»;

- Ультратермостат УТ-15, 220В, 50Гц.

2.1.2. Методы

2.1.2.1. Приготовление вируссодержащего органно - тканевого

материала

Навеску органа измельчали с помощью ножниц и растирали в ступке с

кварцевым песком или битым стеклом. Готовили 10-20 % суспензию органов

на стерильном физиологическом растворе. Полученный гомогенат

однократно замораживали при минус 400С в течение 3 часов оттаивали при

- 39 -

комнатной температуре и центрифугировали при 4000-5000 об/мин в течение

30минут. Надосадок использовали в качестве испытуемого антигена.

2.1.2.2. Инфицирование культур клеток и получение

вируссодержащего культурального материала

Заражение первично-трипсинизированной линий культур клеток вирусом

ЧМЖЖ осуществляли следующим способом. Культуру клеток в пробирках

со сформировавшимся монослоем заражали 10-20% органо-тканевой

вируссодержащей суспензией с 1000 ед/мл пенициллина и стрептомицина в

объеме 0,2 см3 на каждую пробирку. Контакт вируссодержащего материала с

монослоем осуществляли в течение 1-1,5 час при 37-380С, после чего

клеточный монослой отмывали трехкратно поддерживающей средой ПСП и

заливали по 1мл питательной среды. В ходе культивирования смену среды

проводили питательной средой с 5% инактивированной нормальной

сыворотки крови эмбриона коровы через каждые 2-3 суток. В ИФА такие

вируссодержащие пробы исследовали после появления ЦПД.

2.1.2.3. Электронная микроскопия штамма «Темурмалик» вируса

ЧМЖЖ

Очистку и концентрирование вируса проводили с использованием

низкоскоростного центрифугирования и ультроцентрифугирования.

На первом этапе вируссодержащую жидкость центрифугировали при 3000

обмин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отделяли, осадок клеток

гомогенизировали в 0,05М фосфатном буфере и гомогенат

центрифугировали при тех же условиях. Надосадочные жидкости

объединяли и центрифугировали при 30000 обмин в течение 40 минут.

Надосадок отбрасывали, осадок суспендировали в небольшом объеме 0,05М

фосфатного буфера и использовали для электронно-микроскопического

исследования.

Препараты готовили методом негативного контрастирования с

использованием 2%-ого водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты

(рН 6,9), исследовали в электронном микроскопе JЕМ-100СХ «JEOL»,

- 40 -

Япония при ускоряющем напряжении 80 kV и увеличении 20-40 тысяч.

Замеры вирусных частиц и их структурных компонентов проводили

непосредственно на фотопластике после проявления.

2.1.2.4. Постановка и учет результатов серологических реакций

РДП в агаровом геле применяют для диагностики ЧМЖЖ путем

обнаружения антигена в пробах от больных и павших животных и

специфических антител в сыворотках крови переболевших животных. С этой

целью готовят 0,8% агар «Дифко» на 0,01М фосфатно-буферном солевом

растворе рН 7,2-7,4 по трафарету с помощью металлической трубки делают

лунки диаметром 0,5см3 на расстоянии 0,3-0,4см друг от друга. Лунки

располагают таким образом, чтобы одна из них находилась в центре и 6

лунок вокруг нее.

Для обнаружения антигена или антител в испытуемых пробах РДП ставят

одновременно с двумя стандартными (специфическим и нормальным)

компонентами реакции. При исследовании антигена в одну из центральных

лунок вносят стандартную специфическую, в другую стандартную

нормальную сыворотки в рабочем разведении в объеме по 0,1см3. В

периферические лунки разливают испытуемые антигены в цельном виде

(20%-ая суспензия) в объеме по 0,1см3. При исследовании сывороток в

центральные лунки вносят стандартные специфический и нормальный

антигены в рабочем разведении, а в периферические - испытуемые

сыворотки в цельном виде. При титровании испытуемых антигенов и

сывороток в РДП в периферические лунки вносят испытуемые пробы в

разведении от 1:2 до 1:32. Параллельно ставят контроли (специфическая и

нормальная сыворотки с нормальным и специфическим антигенами). После

постановки реакции чашки Петри закрывают крышками, ставят под

стеклянный колпак и выдерживают 24 час при 37-38С в термостате, а затем

в течение 24 час при комнатной температуре.

- 41 -

Результаты реакции начинают учитывать с контролей, в которых

обязательно должны быть линии преципитации между стандартным

специфическим антигеном и стандартной специфической сывороткой при

отсутствии их между нормальной сывороткой и специфическим антигеном и

специфической сывороткой и нормальным антигеном.

Реакцию считают положительной, если между лунками с испытуемыми

сыворотками и специфическим антигеном через указанное выше время

имеются линии преципитации по характеру идентичные линиям в контроле.

При отсутствии линий преципитации между указанными компонентами

реакцию считают отрицательной.

2.1.2.5. Концентрирование биологических препаратов и определение

концентрации белка

Концентрирование препаратов белка (антигенов вируса ЧМЖЖ и

аффинно-очищенных антител) проводили диализом против сухого

полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000-40000.

Концентрацию белка (специфических и нормальных иммунноглобулинов

и аффинно-очищенных антител) в препарате определяли на

спектрофотометре по методу Лоури или при Д=280 нм и дальнейшего

пересчета по формуле Бэра.

2.1.2.6. Лиофильная сушка препаратов Вирусспецифические и антивидовые сыворотки, гаммаглобулины,

иммунопероксидазные конъюгаты, специфические культуральные и

нормальные (контрольные) антигены лиофилизировали в объеме 0,5-1,0 см3.

Перед высушиванием в иммунопероксидазные конъюгаты, культуральные

специфические и нормальные (контрольные) антигены добавляли

стабилизатор, предложенный О.Г. Башкировым в соотношении 1:1 (7,5%

сахарозы, 1,5% желатина, 0,2% агара, 90,8% дистиллированной воды). Сушку

проводили в вакуум-сушильном аппарате «Юзифруа» или других

аналогичных приборах.

- 42 -

2.1.2.7. Статистическая обработка результатов Все исследования проводили с числом повторностей, обеспечивающих

получение достоверных результатов. Инфекционный титр вирусных

препаратов рассчитывали по методу Рида и Менча [61]. Цифровые данные

подвергали статистическому анализу с определением средних величин и их

ошибок непосредственным и разностным методом по Стьюденту [2, 61].

- 43 -

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выделение вируса ЧМЖЖ в эпизоотических неблагополучных

очагах и получение штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ для

приготовления диагностических препаратов

В Cреднеазиатском ящурном институт Республики Таджикистан

совместно с сотрудниками Научно-исследовательского института проблем

биологической безопасности Республики Казахстан в феврале 2005г.

проведены экспертиза по установлению причины заболевания и гибели овец

и коз в хозяйствах Республики Таджикистан.

Было проведено клиническое обследование овец и коз в хозяйствах РТ.

Наши наблюдения показали, что болезнь протекает в острой и подострой

форме. Инкубационный период продолжается от 6 до 16 дней. Температура

тела инфицированного животного повышается до 41-41,5ºС, после краткого

периода возбуждения наступает депрессия, снижается аппетит. Носовое

зеркальце сухое, горячее. На слизистой оболочки рта и носа вначеле

появляются зоны гиперемии. Затем очаги некроза и язв. Выделяются

серозные, а затем серозно-гнойные истечения со зловонным запахом [рис.1 и

2]. Дыхание затрудняется, появляются признаки пневмонии. Смерть

наступает на 8-10-й день после повышения температуры тела, летальность

достигает до 20%, среди молодняка до 70%. На 15-18-е сутки наблюдаются

признаки пневмонии и обезвоживания организма, диарея.

Рисунок 1 - Истечение

- 44 -

Рисунок 2 - Гнойные истечения, эрозия кожи губ.

На слизистой оболочке ротовой полости павших или вынужденно забитых

животных наблюдаются кровоизлияния, эрозии и язвы. Наиболее

характерные изменения наблюдаются в двенадцатиперстной, подвздошной и

слепой кишках, их слизистая оболочка пронизана пятнистыми и

полосчатыми кровоизлияниями, местами с изъязвлениями. Заглоточные,

средостенные, мезентеральные и портальные лимфоузлы отечны, с

кровоизлияниями и очагами некроза [рис.3]. Селезенка иногда увеличена,

дряблой консистенции, полнокровна с многочисленными кровоизлияниями

под капсулой. Очень часто наблюдается воспаление кардиального и

апикального долей легкого.

Рисунок 3 - Лимфоузлы отечны.

- 45 -

Для лабораторной экспертизы от больных и павших животных были взяты

сыворотки крови от больных и переболевших животных, смывы из носовых

полостей и пробы органов (легкие, трахея, средостенные, подчелюстные,

предлопаточные и брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, печень,

кишечник, почки, сердце) и приготовлены суспензии для вирусологического

и серологического исследования.

Из проб патологического материала приготовлены 20%-ые суспензии на

физиологическом растворе. Полученные пробы двукратно замораживали при

температуре минус 30-40С, оттаивали при температуре 37-38С и

обрабатывали антибиотиками из расчета 200-300 ЕД/см3 суспензии. Носовые

смывы исследовали в цельном виде после однократного замораживания при

температуре минус 30-40С, оттаивания при температуре 37-38С и

обрабатывали антибиотиками.

В результате исследований установлено, что материалы, предоставленные

для экспертизы (лимфоузел, селезенка, легкие) дали положительные

результаты на ЧМЖЖ с титром в ИФА.

Для выделения возбудителя болезни полученными пробами заражали

первично-трипсинизированные культуры клеток ТЯ, ПЯ и перевиваемую

линию культуры клеток МДВК.

На культурах клеток проведены по пять последовательных пассажа. В

процессе выделения возбудителя из проб патологического материала в

монослое культуры клеток ТЯ испытана следующая методика: к пробам

патологического материала добавляли антибиотики по 200-300 ЕД/см3 и

использовали для выделения вируса в культуре клеток ТЯ. Затем монослой

культуры клеток заражали по 0,1-0,2 см3 пробами патологических

материалов, и ставили на контакт при 370С в течение 1,5 часа. Затем

монослой пробирочной культуры клеток трижды отмывали 0,15М

стерильным физиологическим раствором, после чего в каждую пробирку

вносили по 1 см3 пристеночной питательной среды (ПСП) с 5%

инактивированной нормальной сыворотки крови эмбриона коровы и

- 46 -

пробирки оставляли в термостате при температуре 37-38С для размножения

вируса. Каждый день вели наблюдение под световым микроскопом за

изменениями в монослое культуры клеток.

Через 2 суток в монослое были отмечены цитопатические изменения

(ЦПД), при этом в контрольных пробирках подобные поражения не

отмечались. ЦПД в пробирках было сходно с ЦПД вируса ЧМЖЖ:

характеризуется появлением округлившихся клеток, возникновением

многоядерных синцитиев и распадом слоя культуры. Незараженный

монослой культуры клеток ТЯ и проявление ЦПД в монослое культуры

клеток ТЯ показано на рис. №4.

Рисунок 4 - Незараженный монослой культуры клеток ТЯ и проявление

ЦПД в монослое культуры клеток ТЯ, зараженным патологическим

материалом, взятым от больного ягненка.

Идентификацию выделенного возбудителя проводили в ИФА и

электронной микроскопией.

Исследование культуральной суспензии в ИФА позволило выявить

антиген вируса чумы мелких жвачных животных. Активность культуральных

суспензий составила 1:320.

Элетронномикроскопические исследования методом негативного

контрастирования с использованием 2%-ого водного раствора фосфорно-

вольфрамовой кислоты показало, что исследованный штамм имеет

морфологическую характеристику и структуру характерную для группы

- 47 -

морбилливирусов. На рис. 5 Представлена электронно-микроскопическая

картина выделенного возбудителя.

Рисунок 5 - Электронная микроскопия очищенных препаратов вируса

ЧМЖЖ;

Негативное контрастирование 2 % ФВК. Ув. 100000.

Выделенный культуральный вирус прошел еще пять пассажей на

культуре клеток. С каждым пассажем проявление ЦПД усиливалось. После

каждого пассажа проводили титрование вируса с целью определения

биологической активности. Результаты исследований представлены в табл.1.

Таблица 1 - Биологическая активность штамма «Темурмалик»

№ пассажа

Сроки культивирования,

сут.

Биологическая активность, lg/ТЦД50/см3

1 7 1,750,25

2 7 3,500,25

3 7 5,120,25

4 7 5,250,25

5 7 5,250,25

Из данных представленных в таблице видно, что активность вируса с

каждым пассажем увеличивается и на 3 пассажном уровне достигла 5,12

lg/ТЦД50/см3, а на 4-5 пассажном уровне активность составила 5,250,25

lg/ТЦД50/см3.

- 48 -

В дальнейшем для сравнения накопления вируса ЧМЖЖ, были проведены

исследования в разных культурах клеток (ПО, Vero, МДВК, ТЯ и ПТ).

Результаты этих опытов представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Активность специфического антигена вируса ЧМЖЖ

Культура клеток Параметры

ПЯ ПО Vero МДВК ТЯ ПТ Сроки наступления ЦПД, сут

8 9 11 10 8 11

Биологическая активность, lgТЦД50/см3

5,250,25 4,750,25 4,250,25 5,00 0,25 5,250,25 4,250,25

Из данных таблицы 2 следует, что наибольшая биологическая активность

и накопление специфического антигена наблюдается при использовании

культур клеток ТЯ, МДВК и ПЯ.

Таким образом, в результате проведенных исследований был выделен

эпизоотический штамм вируса ЧМЖЖ, который в дальнейшем был

использован для получения специфических антигенов для постановки

серологических реакций и гипериммунизации животных при получении

вирусспецифических сывороток.

Выделенный штамм ЧМЖЖ «Темурмалик» депонирован в коллекции

штаммов микроорганизмов ДГП НИИПББ МОН Республики Казахстан.

Выделенный штамм характеризуется следующими свойствами:

- выделенный от МРС эпизоотический штамм вируса ЧМЖЖ

размножается на 3-9 суточной культуре клеток ТЯ при температуре 37-38С в

течение 4-11 сут;

- биологическая активность штамма при оптимальной температуре

инкубации 37-38С достигает 5,25 lgТЦД50/см3 и выше;

- активность вируссодержащей суспензии в ИФА составляет 1:320;

- штамм «Темурмалик» обладает патогенностью для мелкого рогатого

скота любого возраста. При подкожном и внутривенном методах заражения

- 49 -

мелкого рогатого скота культуральным вирусом ЧМЖЖ у животных

отмечается характерная клиническая картина.

3.2. Приготовление культурального антигена для ИФА при ЧМЖЖ и

гипериммунизации животных

3.2.1. Изучение оптимальных условий культивирования вируса

ЧМЖЖ в культуре клеток (температура, сроки культивирования,

заражающая доза)

Объектами исследований являлись штаммы «G-45» и «Темурмалик»

вируса ЧМЖЖ. С этой целью проводили изучение оптимальных условий

культивирования штаммов «G-45», «Темурмалик» и сравнительную оценку

культуральных свойств данных штаммов. Для выращивания штаммов «G-45»

и «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ использовали первично-

трипсинизированную культуру клеток ТЯ.

В опыте изучали оптимальные условия температуры, сроки

культивирования и заражающие дозы штаммов «G-45» и «Темурмалик»

вируса ЧМЖЖ. Каждый опыт исследования проводили в трех повторностях.

Для изучения условий температуры культивирования и сроков

культивирования вируса ЧМЖЖ, использовали пробирочную культуру

клеток ТЯ. Монослой культуры клеток ТЯ заражали штаммами «G-45» и

«Темурмалик» и выдерживали при температуре 37°С в течение 1ч, для

контакта монослоя с вирусом. После контакта монослоя с вирусом в

культуру клеток добавляли поддерживающую среду по 1,0 см3 и

культивировали в течение 1-14 суток, с ежедневным просмотром под

микроскопом до проявления ЦПД. Каждые трое суток меняли

поддерживающую среду (ПСП) с 5% инактивированной нормальной

сыворотки крови эмбриона коровы. Результаты исследований представлены в

табл. 3.

- 50 -

Таблица 3 - Сроки наступления ЦПД

Сутки Температурные режимы

Штаммы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

G-45 - - - - + + + + + + + о/о о/о о/о 370С+10С Темурмалик - - - + + + + + + о/о о/о о/о о/о о/о

Примечания: 1 «-» - отсутствие ЦПД вируса 2 «+» - наличие ЦПД вируса 3 «о/о» - опыт окончен

Из данных таблицы 3 видно, что при температуре культивирования 37°С

штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ цитопатическое действие (ЦПД)

развивалось между 4-9 днями после заражения культуры клеток. Первые

признаки ЦПД в монослое культуры клеток ТЯ, под действием штамма

«Темурмалик» появились на четвертые сутки при температуре 37°С, а на 5

сутки поражение монослоя культуры клеток достигло 80-85%.

Полученные данные свидетельствует о том, что оптимальная температура

накопления вируса ЧМЖЖ в культуре клеток является (37+ 1)°С.

У всех вариантов вируссодержащих суспензий, полученных при разных

температурно-временных режимах, определяли биологическую активность

вируса ЧМЖЖ в культуре клеток ТЯ и антигенную активность методом

иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты исследований представлены

в табл. №4.

Таблица 4 - Биологическая и антигенная активность

вируссодержащих суспензий ЧМЖЖ

№ пп

Температурные режимы

Штаммы Биологическая активность

вируссодержащих суспензий, lg/ТЦД50/см3

Антигенная активность

вируссодержащих суспензий в ИФА

Темурмалик 5,250,25 1: 320 1 370С

G-45 4,500,25 1: 80

Примечание - «-» - отрицательная реакция

По данным таблицы 4 видно, что биологическая активность штамма

«Темурмалик» вируса ЧМЖЖ при температуре 37°С составила - 5,25

- 51 -

lg/ТЦД50/см3, биологическая активность штаммы «G-45» при 370С составила

- 4,5 lg/ТЦД50/см3. Антигенная активность вируссодержащей суспензии

вируса ЧМЖЖ штаммы «G-45» при 37 °С - 1:80, а штамма «Темурмалик» в

ИФА составила: при 37°С - 1:320.

После определения антигенной и биологической активности

вируссодержащих суспензий вируса ЧМЖЖ можно сделать вывод, что

вируссодержащие суспензии штамма «Темурмалик» были более активные,

по сравнению со штаммами «G-45» .

Для определения оптимальных сроков культивирования вируса ЧМЖЖ

штаммы «Темурмалик» и «G-45» культивировали 3, 5, 7, 9 и 11 суток. У

полученных в разные сроки культивирования вируссодержащих суспензий

определяли биологическую и антигенную активность. Результаты этих

исследований представлены в табл. 5.

Таблица 5 - Сроки культивирования штаммов вируса ЧМЖЖ

№ п/п

Штаммы вируса

Сроки культивирования,

сут.

Биологическая активность, lg/ТЦД50/см3

Антигенная активность

вируссодержащих суспензии в ИФА

Темурмалик 1,750,25 1:20 1 G-45

3 - -

Темурмалик 3,500,25 1:40

2 G-45

5 2,500,25 1:20

Темурмалик 5,250,25 1:160 3 G-45

7 4,500,25 1:40

Темурмалик 5,250,25 1:320

4 G-45

9 4,500,25 1:80

Темурмалик 5,120,25 1:320 5 G-45

11 4,500,25 1:80

Примечание - «-» - отрицательная реакция

Из данных таблицы 5 видно, что при культивировании штамма

«Темурмалик» вируса ЧМЖЖ в течение 7 суток биологическая активность

- 52 -

составила – 5,250,25 lg/ТЦД50/см3, а биологическая активность штамма «G-

45» составила – 4,500,25 lg/ТЦД50/см3.

После определения температуры, сроков культивирования и

биологической активности вируса ЧМЖЖ, определяли заражающую дозу.

Для определения заражающей дозы штаммов «Темурмалик» и «G-45»

вируса ЧМЖЖ, мы использовали пробирочную первично -

трипсинизированную культуру клеток ТЯ. Заражающую дозу определяли в

трех повторностях.

Монослой культуры клеток ТЯ заражали разными дозами штамма

«Темурмалик» вируса ЧМЖЖ (по 0,01, 0,05, и 0,5 ТЦД) и культивировали

при 37ºC в течение 1-14 суток, с ежедневным просмотром под микроскопом

до проявления цитопатического действия (ЦПД). Результаты исследований

щпредставлены в табл. 6.

Таблица 6 - Определение заражающей дозы вируса ЧМЖЖ

СУТКИ Испытуемые заражающие дозы ТЦД50/кл

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Биологическая активность lgТЦД50/см3

0,01 - - - - - - - - + + + 3,5

0,05 - + + + + + + + + + + 4,5

0,1 - - + + + + + + + + + 5,25

0,5 + + + + + + + + + + + 5,25

Примечания: 1 «-» - ЦПД не наблюдалось 2 «+» - ЦПД

Из данных таблицы 6 видно, что заражающая доза вируса ЧМЖЖ штамма

«Темурмалик» составила от 0,05 до 0,1 ТЦД50/кл.

3.3. Приготовление специфических и нормальных антигенов при

ЧМЖЖ

В экспериментах по изучению антигенных свойств штаммов «G-45» и

«Темурмалик» вируса ЧМЖЖ применяли РДП, РСК и ИФА, которые

- 53 -

ставили согласно принятым в НИИПББ МОН РК наставлениям по

постановке и применению указанных тестов.

Отработка условий приготовления специфического антигена при ЧМЖЖ.

Для отработки условий приготовления специфического антигена при

ЧМЖЖ использовали штаммы «G-45 и «Темурмалик» и первично-

трипсинизированную культуру клеток ТЯ, выращенную в матрасах при

температуре 37°C, со сроком инкубации вируса 1-11 суток.

Оптимизацию условий приготовления культурального специфического

антигена проводили по трем методам, которые представлены в табл. 7.

Таблица 7 - Методы приготовления нормальных и специфических

антигенов при ЧМЖЖ

Номер метода

Описание методов

1 Снятие монослоя шпателем, осаждение клеточной фракции центрифугированием при 2000об/мин в течение 30 мин, и концентрирование в 100 раз.

2 Снятие монослоя шпателем, осаждение клеточной фракции центрифугированием при 2000об/мин в течение 30 мин, и концентрирование в 100 раз, с последующим 3 кратным замораживанием при 40ºС и оттаиванием при комнатной температуре и вновь центрифугированием при 4000-4500об/мин в течение 20-30 мин, надосадок использовали в качестве антигена.

3 Трехкратное замораживание при минус 40ºС и оттаивание пораженного вирусом монослоя клеток на 80-90% с последующим центрифугированием при 2000об/мин в течение 20 мин, и осаждением антигена из надосадочной суспензии добавлением ПЭГ-6000 до концентрации 7% и NaCl до концентрации 3%, оставляли на 16-18 ч при (24)С для формирования осадка и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливали, осадок ресуспендировали в дистиллированной воде, в 100 раз меньшем объеме от первоначального объема суспензии (концентрирование в 100 раз). После этого диализовали против физиологического раствора в течение суток, и использовали в качестве антигена.

После получения нормальных и специфических антигенов вируса ЧМЖЖ,

приготовленных разными методами, проверяли активность и специфичность

в реакции диффузионной преципитации с разными специфическими и

нормальными сыворотками против вируса ЧМЖЖ. Результаты РДП

представлены в табл. 8.

- 54 -

Таблица 8 - Активность и специфичность специфических антигенов вируса ЧМЖЖ в РДП

Антиген специфический

приготовленный по методу

Контрольные сыворотки

Штаммы

1 2 3

Антигены нормальные

приготовленные по методам

№ 1, 2, 3 Темурмалик 1:2 1:32 1:32 - Сыворотка специфическая

при ЧМЖЖ козья №1 G-45 ц 1:4 1:4 - Темурмалик 1:2 1:32 1:32 - Сыворотка специфическая

при ЧМЖЖ козья №2 G-45 ц 1:4 1:2 - Темурмалик 1:4 1:32 1:32 - Сыворотка специфическая

при ЧМЖЖ овечья №1 G-45 ц 1:4 1:4 - Темурмалик 1:2 1:16 1:16 - Сыворотка специфическая

при ЧМЖЖ овечья №2 G-45 - 1:2 ц - Темурмалик - - - - Сыворотка нормальная

козья G-45 - - - - Темурмалик - - - - Сыворотка нормальная

овечья G-45 - - - - Примечания: 1 «-» - отрицательная реакция

2 «ц» - в цельном виде

Из данных таблицы 8 видно, что в РДП специфические антигены вируса

ЧМЖЖ, полученные по методам №2 и №3, оказались наиболее активными и

специфичными в сравнении с антигенами, полученными по методу №1. В

ходе исследования в РДП активность антигенов, полученных по методам №2

и №3 из штамма «G-45» составила 1:4, а из штамма «Темурмалик» 1:32.

Полученные разными методами специфические антигены вируса ЧМЖЖ

из штаммов «Темурмалик» и «G-45» для сравнения активности и

специфичности проверяли в других лабораторных тест-системах: реакция

связывания комплемента и иммуноферментный анализ. Результаты

представлены в табл. 9.

- 55 -

Таблица 9 - Сравнительная оценка активности и специфичности

специфических антигенов вируса ЧМЖЖ, полученных разными

методами в лабораторных тест - системах

Сравнительная активность и специфичность антигенов в:

РСК

Номер метода

Штаммы

СС СН

ИФА

Темурмалик 1:36 - 1:320 1 G-45 1:20 - 1:80 Темурмалик 1:80 - 1:3200 2 G-45 1:40 - 1:512 Темурмалик 1:60 - 1:1600 3 G-45 1:36 - 1:256

Антиген нормальный - - - Примечания: 1 «-» - отрицательная реакция 2 «СС» - сыворотка специфическая

3 «СН» - сыворотка нормальная

Из данных таблицы 9 видно, что более активные и специфичные антигены

вируса ЧМЖЖ проверенные во всех лабораторных тест-системах

приготовлены по методу №2, после трехкратного термолизиса.

Сравнение специфических антигенов штаммов вируса ЧМЖЖ по

антигенной активности во всех лабораторных тест-системах показало, что

штамм «G-45» проявил низкую активность, по сравнению со штаммом

«Темурмалик».

В полученные разными методами специфические антигены добавляли

стабилизатор 0,5% желатин и лиофильно высушили. После сушки активность

и специфичность антигенов вируса ЧМЖЖ проверяли в лабораторных тест-

системах, таких как РДП, РСК и ИФА. Результаты этих опытов

представлены в табл. 10.

- 56 -

Таблица 10 - Активность и специфичность антигенов вируса ЧМЖЖ

после лиофилизации со стабилизатором 0,5 % желатин в тест - системах

Активность и специфичность антигенов в: РДП РСК

Номер метода

Штаммы

СС СН СС СН

ИФА

Темурмалик 1:8 - 1:36 - 1:320 1 G-45 ц - 1:20 - 1:80 Темурмалик 1:32 - 1:80 - 1:3200 2 G-45 1: 4 - 1:40 - 1:512 Темурмалик 1:32 - 1:60 - 1:1600 3 G-45 1:4 - 1:36 - 1:256

Антиген нормальный - - - - - Примечания: 1 «-» - отрицательная реакция 2 «СС» - сыворотка специфическая 3 «СН» - сыворотка нормальная

4 «ц» - в цельном виде Как видно из результатов таблицы 10, активность и специфичность

специфического антигена вируса ЧМЖЖ после сушки не снижалась во всех

тест-системах.

3. 4. Получение специфических сывороток при ЧМЖЖ

Для изготовления активных и специфичных иммунопероксидазных

конъюгатов необходимы активные и специфичные сыворотки против

ЧМЖЖ.

При получении сывороток использовали коз и овец местной породы 1-3

летнего возраста и кроликов. В качестве антигена для гипериммунизации

применяли культуральный концентрированный антиген вируса чумы мелких

жвачных животных из штамма «Темурмалик», 20%-ную органо-тканевую

вируссодержащую суспензию из органов больных чумой МРС,

культуральную вируссодержащую суспензию вируса ЧМЖЖ.

Для гипериммунизации кроликов использовали вируссодержащую

суспензию (ВСС) и специфический антиген (AgS) ЧМЖЖ полученный на

основе штамма «Темурмалик», которые вводили внутривенно (в/в) и

подкожно (п/к). Гипериммунизации подвергали 3-х кроликов:

- 57 -

Первая схема:

1-е введение - по 1см3 в/в и 3 см3 п/к ВСС ЧМЖЖ, перерыв 2 сут; 2-е введение - по 1 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС, перерыв 1сут; 3-е введение - по 1 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС, перерыв 7сут; 4-е введение - по 2 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС, перерыв 7сут; 5-е введение - по 3 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС. Вторая схема: 1-е введение - по 2 см3 в/в, 3 см3 п/к ВСС ЧМЖЖ, перерыв 7 сут; 2-е введение - по 2 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС, перерыв 7сут; 3-е введение - по 3 см3 в/в, 5 см3 п/к ВСС. Третая схема: 1-е введение - по 3 см3 в/в, 4 см3 п/к ВСС ЧМЖЖ, перерыв 7 сут; 2-е введение - по 2 см3 в/в ВСС и 0,5 см3 п/к AgS , перерыв 7сут; 3-е введение - по 2 см3 в/в, 5 см3 п/к ВСС. По окончании гипериммунизации у животных отбирали кровь для

исследования в РДП. Результаты исследований приведены в табл. 11.

Таблица 11 - Активность и специфичность сывороток в РДП,

полученных на кроликах

Активность сывороток в РДП с № животного AgS AgN

1 1:16-1:32 1:16-1:32 2 1:8 1:4 3 1:32 1:32

Примечания: 1 AgS - антиген специфический при ЧМЖЖ 2 AgN - антиген нормальный

Как видно из таблицы 11, все сыворотки, полученные на кроликах,

проявили неспецифичность, что связано с присутствием большого

количества клеточных и других белков во вводимом материале.

В дальнейших опытах по получению специфической сыворотки на

естественно восприимчивых животных использовали специфический

антиген, очищенный на 30%-ой сахарозной подушке. Для этого на 30%-ый

раствор сахарозы наслаивали антиген и центрифугировали при 25000 об/мин

в течение 60 мин. После этого отбирали для исследования в РДП следующие

фракции: осадок, полосу над сахарозой и надосадок. Антиген был обнаружен

- 58 -

в надосадке в титре 1:16-1:32, который использовали для гипериммунизации

козы и барана по следующим схемам, которые представлены в табл. 12.

Таблица 12 - Схемы гипериммунизации коз и овец очищенным вирусом ЧМЖЖ Животное № введения AgS очищенный Интервал, сут

1 1,5 см3 в/в, 0,5 см3 п/к 7 2 1,5 см3 в/в, 2 см3 п/к 7 3 5 см3 в/в 10 4 5 см3 в/в, 3 см3 п/к с сапонином 7

Коза

5 5 см3 в/в, 5 см3 п/к с сапонином 1 2см3 в/в, 2 см3 п/к с сапонином 10 2 4 см3 в/в, 4 см3 п/к с сапонином 10

Баран

3 5 см3 в/в, 5 см3 п/к с сапонином

В ходе гипериммунизации перед каждым введением отбирали кровь для

исследования с целью определения динамики накопления антител в

сыворотке крови у животных. Полученные результаты приведены в табл. 13.

Таблица 13 - Динамика накопления уровня антител в сыворотках козы

и барана в ходе гипериммунизации

Титр в РДП Животное Интервал, сут AgS AgN

0 - - 7 - - 14 Ц - 24 1:2 - 31 1:8 -

Коза

38 1:32 - 0 - - 10 1:2 -

Баран

20 1:32 - Примечание: AgS – антиген специфический;

AgN – антиген нормальный;

«ц» - цельный;

«-» - отрицательно.

В результате активность полученных сывороток в РДП составила 1:32,

причем отрицательный результат получен с антигеном нормальным. Это

показывает их ни высокую специфичность.

- 59 -

Анализируя вышеизложенное можно заключить, что оптимальной схемой

для иммунизации коз является 5-кратное введение козам спицифического

антигена в возрастающей дозе 1; 3; 5; 10; 10 см3 в комплексе с равным

объемом полного адъюванта Фрейнда с недельным интервалом.

3.5. Получение видоспецифических сывороток

Для титрования в ИФА сывороток от переболевших и вакцинированных

против ЧМЖЖ животных необходим антивидовой - против глобулинов МРС

- иммунопероксидазный конъюгат. Целью настоящих исследований была

отработка оптимальных схем гипериммунизации доноров

видоспецифических антител (кроликов) препаратами сывороточного гамма-

глобулина МРС.

В качестве антигена для иммунизации кроликов использовали

иммуноглобулин МРС, выделенный нами по методу Кона.

Гипериммунизацию 30 кроликов гамма-глобулином МРС проводили по

трем схемам.

За неделю до начала цикла гипериммунизации подколенные

лимфатические узлы кроликов сенсибилизировали неполным адъювантом

Фрейнда в дозе 1 см3 на каждого кролика.

Первая схема гипериммунизации включала 5 введений гамма-глобулина

МРС с недельным интервалом в область подколенных лимфатических узлов.

Глобулин вводили в возрастающей дозе (1; 1,5; 2; 2,5; 3 мг) на одного

кролика в комплексе с равным объемом полного адъюванта Фрейнда.

Вторая схема гипериммунизации соответствовала первой и отличалась

тем, что для введения использовали гамма-глобулин в дозе 2; 2; 3; 3; 3,5 мг

на одного кролика в комплексе с равным объемом полного адъюванта

Фрейнда.

По третьей схеме гипериммунизации глобулин вводили во всех 5

введениях по 3 мг на одного кролика в комплексе с равным объемом полного

адъюванта Фрейнда.

- 60 -

Динамику накопления титра антител в полученных сыворотках

контролировали в РДП.

Результаты проведенных опытов по получению антивидовых сывороток

на кроликах обобщены в табл. 14.

Таблица 14 - Серологическая активность антивидовых сывороток,

полученных по разным схемам в РДП

Титры антител в РДП Схема иммунизации

Количество животных,

гол.

Объем полученных

сывороток, см минимальные,

log2 максимальные,

log2 №1 10 100 2,200,08 2,820,09 №2 10 105 1,210,05 1,820,02 №3 10 110 3,630,12 4,620,13 Примечание - Величины титров антивидовых сывороток обозначены в обратных

величинах

Приведенные данные показывают, что антивидовые сыворотки,

полученные по 3 схеме, обладали высокой преципитирующей активностью

от 3,630,12…до 4,620,13 log2. Первая и вторая схемы гипериммунизации

оказались малоэффективными, титры антител в сыворотках не превышали их

разведения 1:3. В связи с этим третья схема была рекомендована для

получения антивидовых сывороток.

3.6. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов

для ИФА при ЧМЖЖ

Как известно, наиболее важным фактором, влияющим на

чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, является

качество используемых конъюгатов. В свою очередь качество конъюгатов

находится в прямой зависимости от качества (чистоты, активности и

специфичности) используемых для конъюгации иммуноглобулинов и

антител. В связи с этим, первым этапом исследований в этом направлении

была отработка условий выделения и очистки активных и специфичных

иммуноглобулинов и антител из специфических и антивидовых сывороток.

Гамма-глобулиновые фракции из вирусспецифических сывороток МРС

выделяли различными методами:

- 61 -

1. Ступенчатым осаждением альбумина и иммунных глобулинов,

различными концентрациями этилового спирта по методу Кона;

2. Трехкратным осаждением общей глобулиновой фракции насыщенным

раствором сульфата аммония при 40%, 35 % и 33% степени насыщения

раствора по общепринятой методике;

3. Осаждением гамма-глобулина из сыворотки крови спиртово-

хлороформным методом.

Для оценки качества полученных иммуноглобулинов последние

параллельно с исходными сыворотками исследовали на активность и

специфичность в РДП и ИФА. Результаты исследований представлены в

табл. 15.

Таблица 15 - Сравнительная оценка специфической активности

выделенных разными методами иммуноглобулинов в РДП и ИФА

Активность в РДП, log2

Активность в ИФА, log2

№№ п/п

Метод выделения иммуноглобулин

А

Серии выделен

ных иммуногло

булинов исходных

сывороток иммуногло

булинов исходных

сывороток иммуногло

булинов 2 3,660,17 4,930,19 13,540,42 18,240,48 1 Осаждение

насыщенным раствором (NH4)2SO4

3 3,660,17 3,310,12 13,540,42 12,250,33

1 3,660,17 5,140,21 13,540,42 19,020,41

2 3,660,17 5,000,20 13,540,42 18,500,46

3 3,660,17 4,980,20 13,540,42 18,430,51

2 Спиртовое осаждение по Кону

4 3,660,17 5,320,21 13,540,42 19,680,51

1 3,660,17 4,810,17 13,540,42 17,800,48

2 3,660,17 3,730,09 13,540,42 13,080,38

3 Осаждение спиртово-хлороформным методом

3 3,660,17 3,030,11 13,540,42 11,210,24

Примечание - титры антител выражены в обратных величинах.

Представленные в таблице 15 данные свидетельствуют о том, что

наиболее активные и специфичные иммуноглобулины были получены с

помощью спиртового осаждения по Кону. Осаждение гамма-глобулинов

- 62 -

спиртово-хлороформным методом и трехкратное переосаждение общей

фракции глобулинов с помощью насыщенного раствора (NH4)2SO4 позволяли

получить иммуноглобулины с достаточно высокой активностью в РДП и

ИФА, но приготовленные в дальнейшем на их основе конъюгаты давали

значительное неспецифическое фоновое окрашивание, в то время как

конъюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов, выделенных по

методу Кона были достаточно специфичными в ИФА.

Следующим этапом исследований для выделения и очистки антивидовых

антител были испытаны методы:

- спиртовое осаждение гамма-глобулина по Кону;

- аффинная очистка антител по методу S.Avrameas и T.Ternynck.

Методом Кона было выделено 5 серии антивидового гамма-глобулина,

преципитирующая активность приготовленных гамма-глобулинов была от

1:8 до 1:16. Иммунопероксидазные конъюгаты, приготовленные на их

основе, имели предельные титры в ИФА от 1:800 до 1:1600 и соответственно

рабочие от 1:200 до 1:400, однако были неспецифичны до разведения 1:100-

1:200, да и в своем рабочем разведении вызывали неспецифическое фоновое

окрашивание при исследовании нормальных сывороток. Поэтому с целью

повышения специфичности ИФА в дальнейших наших исследованиях был

испытан метод аффинного выделения антивидовых антител на белково-

глутаральдегидном иммуносорбенте. Сущность метода состоит в том, что

иммуноглобулин переводится в нерастворимое (сетевое) состояние за счет

взаимодействия альдегидных групп глутаральдегида и свободных

аминогрупп белка (основание Шиффа). Образованный таким образом

белково-глутаральдегидовый иммуносорбент связывает добавленные к нему

антивидовые антитела. Элюцию связавшихся антител с иммуносорбентом

проводят с помощью кислых буферных растворов (0,1 М глицин-HCI-буфер

рН-2,8 или 3М KSCN) с последующим диализом полученных препаратов

антител против забуферного раствора и концентрированием белка с

помощью ПЭГ с Мм = 6000 - 40000 до содержания белка в препарате от 5 до

- 63 -

10 мг/мл. С применением данного метода было очищено 4 серий

антивидовых антител. Наряду с исходными сыворотками их исследовали на

активность и специфичность в РДП. Результаты исследования активности

выделенных антивидовых антител приведены в табл. 16.

Таблица 16 - Сравнительная оценка преципитирующей активности

антивидовых сывороток и аффинно-очищенных антител

Активность в РДП, log2 № сывороток и антител сывороток аффинно-очищенных

антител 1 3,530,12 3,750,05 2 4,310,17 5,610,13 3 4,800,15 4,930,14 4 3,440,09 3,670,08

Примечание: титры антител выражены в обратных величинах

Представленные в таблице 16 данные показывают, что аффинно-

очищенные антитела, выделенные по вышеуказанной методике, имеют

сравнительно высокую активность в РДП, сравнимую с исходными

сыворотками. В дальнейшем на основе препаратов аффинно-очищенных

антивидовых антител были приготовлены иммунопероксидазные конъюгаты

для ИФА.

Конъюгаты обладали достаточной специфичностью и позволили выявлять

антитела к вирусу ЧМЖЖ, с цельной сывороткой и в ее двукратных

разведениях.

Таким образом, в результате проведенных исследований были подобраны

оптимальные условия выделения и очистки активных и специфичных

препаратов вирусспецифических и антивидовых антител. Это позволило

перейти к отработке методов конъюгации приготовленных глобулинов и

антител с пероксидазой хрена.

По данным литературы наиболее эффективными методами конъюгации

антител с пероксидазой хрена признаны перийодатные. Исходя из этого, они

были испытаны для приготовления вирусспецифических и антивидовых

конъюгатов, пригодных для ИФА при ЧМЖЖ. С применением метода

- 64 -

P.K.Nakane, A.Kawaoi было приготовлено 4 микросерии

вирусспецифического и 3 микросерии антивидового конъюгата, методом

M.B.Wilson, P.K.Nakane - 6 микросерии вирусспецифического и 4

микросерии антивидового конъюгата. Для конъюгации использовали в

основном пероксидазу хрена производства завода «Биохимреактив» г.

Олайне Латвийской Республики различных партий с Rz = от 2,6 до 3,4 и

активностью по белку от 650 до 1400 ЕД/мг. Приготовленные конъюгаты

очищали от несвязавшихся реагентов методом гельфильтрации через

сефадекс G-200. Характерные профили элюции специфического и

антивидового конъюгатов, приготовленных по методу P.K.Nakane и

A.Kawaoi, представлены на рисунках 6 и 7.

Профили элюции вирусспецифических и антивидовых конъюгатов,

приготовленных по методу M.B.Wilson и P.K.Nakane, представлены на

рисунках 8 и 9.

Очищенные конъюгаты собирали фракциями от 4 до 5 см3 и определяли

ОП каждой фракции при Д280 и Д403. Коэффициент связывания (К) конъюгата

рассчитывали по следующей формуле:

Д403 К = ______________ Д280 Фракции имеющие К = от 0,3 до 0,6 и вышедшие первым основным

пиком, объединяли и стабилизировали 1:1стабилизатором, предложенным

Башкировым, содержащим 7,5% сахарозы, 1,5% желатина, 0,2% агара и

90,8% воды. Конъюгаты хорошо сохранялись от 4 до 6 мес. при минус 40°С в

нативном виде и от 12 до 18 мес. в лиофилизированном

состоянии.

- 65 -

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12опти

ческ

ая п

лотн

ость

Д =

280

нм

, Д =

403

нм

фракции конъюгатаРисунок 6- Профиль элюции вирусспецифического иммунопероксидазного

конъюгата, полученного на штамм "Темурмалик" вируса ЧМЖЖ, на спектрофотометре Philips

Д-280 нм

Д-403 нм

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

опти

ческ

ая п

лотн

ость

, Д =

280

нм,

Д

= 40

3 нм

фракции конъюгатаРисунок 7- Профиль элюции антивидового конъюгата, полученного на нормальный

иммуноглобулин овцы, на спектрофотометре Philips

Д-280 нм

Д-403 нм

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

опти

ческ

ая п

лотн

ость

, Д =

280

нм,

Д =

403

нм

фракции конъюгата

Рисунок 8. Профиль элюции вирусспецифического конъюгата, полученного на штамм "Темурмалик" вируса ЧМЖЖ, на спектрофотометре Philips

Д-280 нм

Д-403 нм

- 66 -

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12опти

ческ

ая пл

отно

сть,

Д =

28

0 нм

, Д =

403 н

м

фракции конъюгатаРисунок 9- Профиль элюции антивидового конъюгата, полученного на нормальный иммуноглобулин овца, на спектрофотометре Philips

Д-280 нм

Д-403 нм

Активность и специфичность приготовленных серий

вирусспецифического и антивидового конъюгатов проверяли методом их

шахматного титрования в прямом и непрямом вариантах ИФА

соответственно.

Титрование вирусспецифических конъюгатов проводили против

специфического и нормального антигенов, а антивидовых - против

нормальных и специфических сывороток МРС.

Результаты этих исследований представлены в табл. 17 и 18.

Таблица 17 - Сравнительное шахматное титрование в ИФА

вирусспецифических конъюгатов, полученных на штамм «Темурмалик»

вируса ЧМЖЖ, приготовленных разными методами

Разведения специфического культурального антигена Метод

получения конъюгата

Разведения конъюгата

10 100 1000 2000 4000 8000

Нормальный антиген в

разведении 1:10

50 + + + + - - - 100 + + + + - - - 200 + + + - - - - 400 - - - - - - - 800 - - - - - - -

P.K.Nakane, A.Kawaoi

1600 - - - - - - - 50 + + + + + - -

100 + + + + + - - 200 + + + + + - - 400 + + + + - - - 800 + + - - - - -

M.B.Wilson, P.K.Nakane

1600 - - - - - - - Примечания: 1 Разведения конъюгатов и антигенов выражены в обратных величинах 2 «»-положительный результат в ИФА

3 «-»-отрицательный результат

- 67 -

Из результатов таблиц 17 и 18 видно, что более активными являются

препараты, приготовленные методом M.B.Wilson, P.K.Nakane. Так, например,

специфический культуральный антиген выявляется вирусспецифическим

конъюгатом, приготовленным по методу M.B.Wilson, P.K.Nakane, до

разведения 1:4000 при разведении конъюгата 1:100 и при разведении

антигена 1:100 до разведения конъюгата 1:800. В то же время у конъюгата,

полученного по методу P.K.Nakane, A.Kawaoi, эти показатели были

соответственно равны 2000 при разведении конъюгата 1:100, при разведении

антигена 1:100 до разведения конъюгата 1:200. Титрование в непрямом

варианте ИФА антивидовых конъюгатов показало, что препараты,

приготовленные по методу P.K.Nakane, A.Kawaoi имели предельные титры в

ИФА с разведения от 1:200 до 1:400, а по методу M.B.Wilson, P.K.Nakane - от

1:800 до 1:1600.

Таблица 18 - Сравнительная оценка активности и специфичности

антивидовых конъюгатов, полученных на нормальный иммуноглобулин

овец и коз, приготовленных разными методами

Разведения специфического культурального антигена

Разведения нормальной сыворотки

Метод получения конъюгата

Разведения конъюгата

100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 10 20 40 50 + + + + + + + - - - - -

100 + + + + + + + - - - - - 200 + + + + + + - - - - - - 400 + + + - - - - - - - - - 800 - - - - - - - - - - - -

P.K.Nakane, A.Kawaoi

1600 - - - - - - - - - - - - 50 + + + + + + + + - - - -

100 + + + + + + + + - - - - 200 + + + + + + + + - - - - 400 + + + + + + + + - - - - 800 + + + + + - - - - - - - 1600 + + + + - - - - - - - -

M.B.Wilson, P.K.Nakane

3200 - - - - - - - - - - - - Примечания: 1 Разведения конъюгатов и антигенов выражены в обратных величинах

2 «+» - положительный результат в ИФА 3 «-» - отрицательный результат

- 68 -

Таким образом, в результате проведенных исследований по

приготовлению активных и специфичных иммунопероксидазных конъюгатов

было установлено, что из испытанных нами двух перийодатных способов

конъюгации антител с пероксидазой хрена лучшим оказался метод

M.B.Wilson, P.K.Nakane. Данный метод конъюгации позволил получить

активные и специфичные иммунопероксидазные конъюгаты с титром в ИФА

от 1:400 до 1:1600, которые были активнее в 4 раза.

3.7. Проверка активности диагностических препаратов после

хранения в нативном и лиофилизированном состояниях при

температуре от + 3 до + 4°С

Диагностические препараты кроме конъюгатов в нативном состоянии при

температуре от плюс 3 до плюс 4°С сохраняют свою активность в течение 6

месяцев и лиофильно высушенном состоянии при том же температурном

режиме более 3 года, конъюгаты свою активность сохраняет в течение 6

месяцев и 18 месяцев соответственно. В дальнейшем активность препаратов

медленно снижается (срок наблюдения - 3 года).

Диагностические препараты проверяли на активность от 2 до 8 месяцев в

нативном состоянии и от 1,5 до 3 лет в лиофильно высушенном виде при

режиме хранения от +3°С до +4°С. Препараты высушивали в

сублимационных аппаратах. Для стабилизации антигенов и конъюгатов

перед высушиванием добавляли стабилизатор, предложенный Башкировым

1:1 (7,5% сахарозы, 1,5% желатина, 0,2% агара, 90,8% воды).

Ампулы с сухим препаратом запаивали под вакуумом. По такому же

методу готовили нормальные (контрольные) диагностические препараты.

Результаты исследований представлены в табл. 19 и 20.

- 69 -

Таблица 19 - Активность лиофильно высушенных диагностических препаратов при ЧМЖЖ, хранившихся в течение 1,5-5 лет при температуре от 3°С до 4°С

Исходная активность в Активность Активность

№ № п/п

Номер серии

диагностикума РДП РСК ИФА

Срок хранения,

мес РДП РСК ИФА

Срок хранения,

мес РДП РСК ИФА 1 АС 1 7,330,67 40,310,89 12800 12 7,280,6 40,310,89 12800 60 7,280,6 7,680,52 12800 2 АС 2 7,210,58 29,010,53 12800 24 7,140,57 29,010,53 12800 45 7,140,57 29,010,53 12800 3 Ан 1 - - - 12 - - - 60 - - - 4 СС 1-04 5,590,31 32,010,45 12800 32 5,240,28 32,010,45 12800 60 5,240,28 32,010,45 12800 5 СС 2-04 7,640,82 36,110,68 25600 24 7,320,61 35,910,58 25600 50 7,320,61 35,910,58 25600 6 СН 1 - - - 18 - - - 60 - - - 7 ВИГ 1 7,430,58 ни 16000 24 7,360,49 ни 16000 54 7,360,49 ни 16000 8 ВИГ 2 7,920,48 ни 32000 30 7,680,52 ни 32000 60 7,680,52 ни 32000 9 ВИПК 1 ни ни 800 12 ни ни 800 24 ни ни 200 10 ВИПК 2 ни ни 400 18 ни ни 200 24 ни ни 100 11 АИПК 1 ни ни 800 12 ни ни 800 24 ни ни 400 12 АИПК 2 ни ни 800 18 ни ни 400 24 ни ни 200

Примечания: 1. Величины титров обозначены в обратных величинах; 6. ВИГ – вирусспецифический иммуноглобулин; 2. АС – антиген специфический; 7. ВИПК – вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат; 3. АН - антиген нормальный; 8. АИПК – антивидовой иммунопероксидазный конъюгат; 4. СС – сыворотка специфическая; 9. «-» – отрицательный результат;

5. СН – сыворотка нормальная; 10. ни – не исследовано.

- 70 -

Таблица 20 - Результаты исследований по определению срока хранения нативных диагностических препаратов при температуре от 3°С до 4°С

Сроки хранения, мес Исходная активность в через 60 дней через 120 дней через 180 дней через 240 дней

№№ п/п

Номер серии

диагностикума РДП РСК ИФА РДП РСК ИФА РДП РСК ИФА РДП РСК ИФА РДП РСК ИФА

1 АС 1 6,23 1,32

30,51 5,09

6400 6,20 1,60

30,16 4,98

6400 6,21 1,47

30,23 5,00

6400 6,17 1,51

29,95 4,39

6400 4,23 1,18

18,83 3,24

1600

2 АС 2 11,34 2,03

46,52 5,73

12800 11,28 2,84

45,98 5,94

12800 11,30 2,60

46,31 5,60

12800 11,27 2,49

46,02 5,49

12800 7,18 1,97

33,65 4,70

3200

3 Ан 1 - - - - - - - - - - - - - - - 4 СС 1-04 5,86

1,69 28,94 4,01

3200 5,38 1,48

29,05 4,37

3200 5,72 1,85

29,10 5,20

3200 5,61 1,91

28,99 5,19

3200 2,51 0,94

14,63 1,17

800

5 СС 2-04 7,27 3,98

35,72 6,38

25600 7,23 3,57

35,84 6,20

25600 7,60 3,06

35,79 6,90

25600 7,73 2,99

34,99 6,38

25600 3,49 2,85

23,84 4,80

6400

6 СН 1 - - - - - - - - - - - - - - - 7 ВИГ 1 18,52

2,87 ни 32000 18,56

2,10 ни 32000 18,82

2,83 ни 32000 18,09

2,78 ни 32000 10,62

2,01 ни 8000

8 ВИГ 2 22,04 3,90

ни 32000 22,73 4,04

ни 32000 22,47 4,17

ни 32000 21,98 4,10

ни 32000 12,74 2,95

ни 16000

9 ВИПК 1 ни ни 400 ни ни 400 ни ни 400 ни ни 400 ни ни 100 10 ВИПК 2 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 200 11 АИПК 1 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни Ни 400 12 АИПК 2 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 800 ни ни 400

Примечания: 1.Величины титров обозначены в обратных величинах; 6.ВИГ – вирусспецифический иммуноглобулин; 2.АС – антиген специфический; 7.ВИПК – вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат; 3.АН - антиген нормальный; 8.АИПК – антивидовой иммунопероксидазный конъюгат; 4.СС – сыворотка специфическая; 9.ц – цельный; 5.СН – сыворотка нормальная; 10. «-» – отрицательный результат; 11. ни – не исследовано

- 71 -

Как видно из таблицы 19, хранение лиофилизированных диагностикумов

в холодильнике при температуре от плюс 3…до плюс 4°С в течение 3 лет не

снижает их титра, кроме конъюгатов. Конъюгаты свою активность

сохраняют в течение 1,5 лет, после чего начинают снижать свою активность.

Из данных таблицы 20 следует, что препараты в нативном виде сохраняют

свою исходную активность в течение 6 мес. при условии хранения при

температуре от плюс 3…до плюс 4°С. По истечении 8 мес. и более титры

препаратов снижаются. Также можно сказать, что у сыворотки в процессе

хранения в нативном виде повышается неспецифическая фоновая реакция,

которая нежелательна при постановке ИФА.

3.8. Отработка оптимальных условий постановки метода ИФА для

выявления антигена вируса ЧМЖЖ

С целью оптимизации условий постановки прямого «Сэндвич»-варианта

ИФА были проведены исследования по определению оптимальной (для

сенсибилизации твердой фазы) концентрации вирусспецифического

гаммаглобулина и рабочей дозы иммунопероксидазного конъюгата, а также

влияние различных условий постановки ИФА на его чувствительность.

3.8.1. Отработка процесса сенсибилизации полистироловых

плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином

3.8.2. Отработка температурно-временных условий сенсибилизации

полистироловых плоскодонных плашек вирусспецифическим

иммуноглобулином

Для отработки температурно-временных условий процесса

сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ исследовали следующие

режимы:

1 ч при 37°С;

2 ч при 37°С;

3 ч при 37°С;

4 ч при 37°С;

- 72 -

2 ч при комнатной температуре;

3 ч при комнатной температуре;

4 ч при комнатной температуре;

16-18 ч при 4°С.

Полистироловые плоскодонные плашки сенсибилизировали

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ в разведениях от 1:100 до

1:12800 на КББ (рН 9,6) по вертикали по 0,2 см3. После контакта при

вышеуказанных режимах лунки плашки отмывали трижды отмывочным

раствором и обрабатывали 1%-м раствором БСА на отмывочном растворе

при температуре 37°С в течение 1 ч.

После контакта с БСА плашки снова трижды промывали отмывочным

раствором и вносили в лунки разведения антигена по горизонтали по 0,1 см3

в следующем порядке: 1 ряд - отмывочный раствор, 2-4 ряды - разведения

нормального антигена 1:10, 1:50 и 1:100, ряды 5-12 - разведения

специфического антигена от 1:100 до 1:12800. Контакт антигенов с

сенсибилизированными плашками составил 16-18 ч при 4°С. После контакта

с антигеном лунки плашек трижды отмывали и вносили рабочее разведение

вирусспецифического конъюгата по 0,1 см3. Контакт - 1 ч при 37°С. По

истечении указанного времени плашки отмывали 5-6 раз и вносили рабочий

раствор субстрата. Результаты реакции учитывали через 1 ч на

спектрофотометре Multiskan Plus.

Результаты исследований показали, что наиболее оптимальными

режимами сенсибилизации полистироловых плоскодонных плашек

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ являются:

4 ч при 37°С;

16-18 ч при 4°С.

- 73 -

3.8.3. Подбор раствора для сенсибилизации лунок полистироловых

плоскодонных плашек вирусспецифическим иммуноглобулином

Для подбора раствора для сенсибилизации плоскодонных полистироловых

плашек готовили следующие растворы:

0,1 М фосфатный буферный раствор (ФБР) рН 7,2-7,4 - 9,32 см3 1М

раствора двузамещенного фосфорно-кислого натрия смешивали с

0,68 см3 1 М раствора однозамещенного фосфорно-кислого натрия и

объем доводили до 100 мл дистиллированной водой.

0,01М ФБР - готовили из 0,1 М ФБР разведением в 10 раз.

0,1М фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС) - готовили из 0,1М

ФБР добавлением хлористого натрия из расчета 8,7 г на 1 л.

0,01М ФБС готовили из 0,01М ФБР добавлением хлористого натрия

из расчета 8,7 г на 1 л.

0,1М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) рН 9,6 – готовили

растворением 0,795 г карбоната натрия, 1,475 г гидрокарбоната

натрия и 0,1 г азотистокислого натрия в 50 см3 дистиллированной

воды.

0,01М КББ готовили разведением 0,1 М КББ в 10 раз.

0,1М боратный буфер рН 8,0-8,2 – готовили растворением 0,6183 г

борной кислоты в 100 см3 дистиллированной воды с добавлением

2,875 см3 раствора буры (1,9 г на 50 см3 дистиллированной воды).

0,01М боратный буфер готовили разведением 0,1М боратного

буфера в 10 раз.

0,1М ТрисHCl-буфер рН 8,0-8,2 – готовили растворением 1,21 г Трис

в 100 см3 дистиллированной воде с доведением уровня рН до 8,0-8,2

5М соляной кислотой.

0,01М ТрисHCl-буфер готовили разведением 0,1М ТрисHCl-буфера в

10 раз.

0,15М физиологический раствор.

- 74 -

Полистироловые плоскодонные плашки сенсибилизировали

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ по 0,2 см3 на указанных

растворах в разведениях от 1:100 до 1:12800 по вертикали. Контакт – 16-18 ч

при комнатной температуре. После контакта плашки трижды отмыли

отмывочным раствором и внесли по 0,2 см3 1%-ый раствор БСА. Контакт – 1

ч при температуре 37°С. Затем плашки снова трижды отмыли и внесли по 0,1

см3 разведения антигенов: ряды 1 и 7 – отмывочный раствор, ряды 2 и 8 –

нормальный антиген 1:50, ряды 3-6 и 9-12 – специфический антиген от 1:100

до 1:800. Контакт – 16-18 ч при температуре 4°С. По истечении указанного

времени плашки трижды отмыли, внесли рабочее разведение

вирусспецифического конъюгата и поставили на контакт при температуре

37°С на 1ч. Затем плашки отмыли 5-6 раз и внесли рабочий раствор

субстрата. Результаты учитывали через 1 ч.

Результаты исследований показали, что наиболее оптимальными

растворами для сенсибилизации плашек иммуноглобулином ЧМЖЖ

являются:

0,01М ФБС;

0,01М КББ;

0,01М ТрисHCl-буфер;

3.8.4. Отработка температурно-временных условий контакта

сенсибилизированных плашек с БСА

Для отработки температурно-временных условий контакта

сенсибилизированных плашек с БСА использовали следующие режимы:

30 мин при 37°С;

1 ч при 37°С;

1,5 ч при 37°С;

30 мин при комнатной температуре;

1 ч при комнатной температуре;

1,5 ч при комнатной температуре.

- 75 -

Полистироловые плоскодонные плашки сенсибилизировали

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ в разведении 1:500 на КББ

(рН 9,6) по 0,2 см3. После контакта при температуре 37°С в течение 16-18 ч

лунки плашки отмывали трижды отмывочным раствором и обрабатывали

1%-м раствором БСА на отмывочном растворе при указанных режимах.

После плашки снова трижды отмыли и внесли разведения антигенов в

следующем порядке: 1 ряд – отмывочный раствор, 2-4 ряды – разведения

нормального антигена от 1:50 до 1:200, ряды 5-12 – разведения

специфического антигена от 1:100 до 1:12800. Контакт антигенов с

сенсибилизированными плашками составил 16-18 ч при 4°С. После контакта

с антигеном, лунки плашек трижды отмывали и вносили рабочее разведение

вирусспецифического конъюгата по 0,1 см3. Контакт – 1 ч при 37°С. По

истечении указанного времени плашки отмывали 5-6 раз и вносили рабочий

раствор субстрата. Результаты реакции учитывали через 1 ч на

спектрофотометре Multiskan Plus.

Результаты исследований показали, что обработка лунок плашек БСА в

концентрации 1% в течение 30 мин при температуре 37°С полностью

снимает неспецифический фон.

3.8.5. Отработка температурно-временных условий контакта антигена

с сенсибилизированными вирусспецифическим иммуноглобулином

полистироловыми плоскодонными плашками

Для отработки температурно-временных условий контакта антигена с

сенсибилизированными вирусспецифическим иммуноглобулином

полистироловыми плоскодонными плашками исследовались следующие

режимы:

1 ч при 37°С;

2 ч при 37°С;

3 ч при 37°С;

4 ч при 37°С;

2 ч при комнатной температуре;

- 76 -

3 ч при комнатной температуре;

4 ч при комнатной температуре;

16-18 ч при 4°С.

Полистироловые плоскодонные плашки сенсибилизировали

вирусспецифическим иммуноглобулином ЧМЖЖ в разведении 1:500 на КББ

(рН 9,6) по 0,2 см3. После контакта при температуре 37°С в течение 16-18 ч

лунки плашки отмывали трижды отмывочным раствором и обрабатывали

1%-м раствором БСА при температуре 37°С в течение 1 ч. После плашки

снова трижды отмыли и внесли разведения антигенов в следующем порядке:

1 ряд – отмывочный раствор, 2-4 ряды – разведения нормального антигена от

1:50 до 1:200, ряды 5-12 – разведения специфического антигена от 1:100 до

1:12800. Контакт антигенов с сенсибилизированными плашками проводили

при вышеуказанных режимах. После контакта с антигеном лунки плашек

трижды отмывали и вносили рабочее разведение вирусспецифического

конъюгата по 0,1 см3. Контакт – 1 ч при 37°С. По истечении указанного

времени плашки отмывали 5-6 раз и вносили рабочий раствор субстрата.

Результаты реакции учитывали через 1 ч на спектрофотометре Multiskan Plus.

Результаты исследований показали, что наиболее оптимальными

режимами контакта антигена с сенсибилизированными вирусспецифическим

иммуноглобулином полистироловыми плоскодонными плашками являются:

4 ч при 37°С;

16-18 ч при 4°С.

В ходе исследований установлено, что при контакте вирусспецифического

конъюгата наиболее оптимальным является инкубирования плашек при 37°С

в течение 1 ч.

Результаты постановки ИФА при ЧМЖЖ на обнаружение антигена

следует учитывать через 30-60 мин после внесения субстрата в лунки

плашки.

- 77 -

3.8.6. Отработка условий постановки метода ИФА для определения

антител в сыворотках крови животных

По результатам постановок ИФА на обнаружение антител в сыворотках

крови можно сделать выводы:

Сенсибилизацию полистироловых плоскодонных плашек следует

проводить при 37°С в течение 4 ч или при 4°С в течение 16-18 ч.

После сенсибилизации плашки обрабатывают 1%-м раствором БСА

при 37°С в течение 1ч. Эта процедура не обязательна.

Далее в лунки плашки вносят разведения исследуемых и

контрольных сывороток, начиная с разведения 1:25. Контакт при

37°С в течение 4 ч или при 4°С в течение 16-18 ч.

После контакта с антигеном в плашки вносят рабочий раствор

антивидового конъюгата. Контакт – при 37°С в течение 1ч.

После контакта с конъюгатом вносят рабочий раствор субстрата.

Учет результатов реакции следует проводить через 30-60 мин.

В процессе постановки метода после контакта с каждым компонентом

реакции плашки трижды промывают отмывочным раствором, а перед

внесением субстрата промывают 5-6 раз.

3.8.7. Эффективность применения метода твердофазного ИФА для

выявления и идентификации специфического антигена вируса ЧМЖЖ

При изучении эффективности применения ИФА для обнаружения

антигена вируса ЧМЖЖ пробами служили смывы из носовой полости, а

также сердце, селезенка, легкие, печень, лимфатические узлы от зараженных

животных и суспензии зараженных культур клеток выше названными

органами. Из тканевых материалов готовили 10-20% суспензию на

физиологическом растворе. Затем ее однократно замораживали-оттаивали и

осветляли центрифугированием при 3000-4000 об/мин в течение 30 мин.;

смывы из носовой полости исследовали после ресуспендирования их в

- 78 -

минимальном объеме физиологического раствора и последующего

центрифугирования при 3000-4000 об/мин 30 мин.

«Сэндвич»-вариант ИФА осуществляли в полистироловых плоскодонных

планшетах с 96 лунками по отработанной нами ранее методике. Испытуемые

образцы слабых в антигенном отношении 10-20% суспензий из тканевых

материалов, смывов из носовой полости и суспензий зараженных культур

клеток исследовали в ИФА в цельном виде и в последовательных двукратных

разведениях до 1:2048. Контролями реакции служили: буферный раствор для

ИФА, 10-20%-ые суспензии органов и тканей, смывы из носовой полости,

взятые от клинически здоровых животных, суспензии неинфицированных

культур клеток, а также стандартные специфические и нормальные

культуральные антигены при ЧМЖЖ. Для оценки специфичности ИФА

исследовали параллельно гетерологичные культуральные антигены вирусов

контагиозной эктими овец, оспы овец и катаральная лихорадка овец.

Результаты оценки чувствительности ИФА при исследовании антигенов

представлены в табл. 21.

Таблица 21 - Результаты оценки чувствительности ИФА при

исследовании антигенов

№№ п/п Антиген

Количество исследованных

проб

Результаты исследований в

ИФА, log2 1 Нормальный, сер. 1 197 - 2 Специфический, сер. 1 197 13,720,38 3 Специфический, сер. 2 65 12,360,23 4 Специфический, сер. 3 68 12,150,22 5 Нормальная суспензия культуры клеток 393 - 6 Вируссодержащая суспензия культуры клеток 393 3,400,08 7 20%-ая суспензия органо-тканевого материала

МРС, инфицированных вирусом ЧМЖЖ взятых из разных регионов Республики Таджикистан

49 6,800,16

8 20%-ая суспензия органо-тканевого материала от здорового МРС 73 -

Примечание: титры антигенов выражены в обратных величинах;

«- »– отрицательная реакция.

- 79 -

Из данных таблицы 21 видно, что «Сэндвич»-вариант ИФА позволяет

выявлять антиген вируса ЧМЖЖ практически во всех исследованных

пробах. Титрование в ИФА специфических культуральных антигенов при

ЧМЖЖ показало, что их активность составила от 12,150,22…до 13,720,38

log2. Испытанные пробы органов и тканей от здоровых животных,

нормальные культуральные антигены показали отрицательные результаты в

ИФА, что свидетельствует о высокой чувствительности данного метода.

В дальнейшем были проведены исследования по проверке специфичности

ИФА с набором гомологичных и гетерологичных препаратов, результаты

которых отражены в табл. 22.

Таблица 22 - Результаты проверки специфичности ИФА при ЧМЖЖ

№№ п/п

Характеристика испытуемых проб Количество проб

Результаты в ИФА, log2

1 Вируссодержащие культуральные суспензии ЧМЖЖ 355 3,120,07

2 Неинфицированные культуральные суспензии (ТЯ) 355 -

3 Специфические культуральные антигены: Оспы овец 94 -

4 Контагиозной эктимы овец 23 - 5 Катаральной лихорадки овец 23 - 6 Чумы мелких жвачных животных 169 13,99 0,29 7 Антигены нормальные с культуры клеток ТЯ 169 -

Обозначения: «–» – отрицательно;

Титры антигенов обозначены в обратных величинах.

Как видно из таблицы 22, ИФА обладает высокой специфичностью. Все

испытанные пробы неинфицированные культуральные суспензии в цельном

виде, концентрированные нормальные культуральные антигены, а также

гетерологичные антигены при оспы овец, КЭО и КЛО показали

отрицательный результат в ИФА, начиная с разведения 1:10. При этом

культуральные вирусспецифические и концентрированные антигены ЧМЖЖ

давали положительные результаты в ИФА. Активность концентрированных

антигенов вируса ЧМЖЖ составляла в ИФА-13,99 0,29 log2.

- 80 -

В следующей серии опытов была определена чувствительность ИФА при

ЧМЖЖ. В качестве специфических антигенов в этой серии опытов

использовали 20% суспензию органо-тканевых проб от овец,

экспериментально зараженных вирусом ЧМЖЖ (штамм «Темурмалик») и

лиофилизированные специфические культуральные антигены.

Контрольными антигенами служили суспензии лимфоузлов здоровых

животных и нормальные культуральные антигены. Результаты проведенных

исследований представлены в табл. 23.

Таблица 23 - Сравнительная оценка чувствительности ИФА

№№ п/п Исследуемые материалы

Количество исследованных

проб

Средние арифметические титры

антигена ИФА, log2

1 Специфические культуральные антигены ЧМЖЖ 267 13,340,33

2 Нормальные культуральные антигены (ТЯ) 267 -

3 20%-ые суспензии органо-тканевых материалов от МРС больного ЧМЖЖ

49 6,180,12

4 20%-ые суспензии органо-тканевых материалов от здоровой МРС 60 -

Примечание: «-» - отрицательный результат.

Титры антигенов вируса ЧМЖЖ выражены в обратных величинах.

Данные, представленные в таблицы 23, свидетельствуют о более высокой

чувствительности ИФА. Во всех пробах специфические антигены вируса

ЧМЖЖ положительно реагировали в ИФА. В то же время контрольные

(нормальные) антигены показывали отрицательные результаты.

С целью определения чувствительности «Сэндвич» - варианта ИФА при

обнаружении вируса ЧМЖЖ в культуральных пробах (в инфекционных

единицах) культуральный вирус ЧМЖЖ (штаммы «G-45» и «Темурмалик»)

параллельно титровали в культуре клеток ТЯ и в ИФА. Результаты этих

исследований представлены в табл. 24.

- 81 -

Таблица 24 - Чувствительность «Сендвич» - варианта ИФА при культурального вируса ЧМЖЖ

№№ п/п

Штаммы культурального

вируса ЧМЖЖ

Количество исследованных

проб

Инфекционная активность в

культуре клеток ТЯ

(lgТЦД50/см3)

Активность вируса в ИФА

(log2)

Доза вируса, выявляемая в

ИФА (ТЦД50/см3)

1 «Темурмалик» 110 4,940,78 3,610,11 9772,0 2 «G-45» 100 4,830,56 2,590,09 912,0

Согласно приведенным результатам в таблице 24 можно сделать

заключение, что чувствительность «Сэндвич»-варианта ИФА при титровании

культуральной вируссодержащей суспензии находится в пределах от 912,0 до

9772,0 ТЦД50/см3.

3.8.8. Оценка специфичности, чувствительности и эффективности

непрямого варианта ИФА

Специфичность тестов оценивали параллельным исследованием в ИФА

сывороток от иммунных и здоровых, невакцинированных овец и коз и

гетерологичных сывороток мелкого рогатого скота к вирусам оспы овец,

контагиозной эктимы овец и катаральной лихорадки овец.

Результаты определения чувствительности и специфичности непрямого

варианта ИФА представлены в табл. 25.

Таблица 25 - Чувствительность и специфичность непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток

Непрямой вариант ИФА №№ п/п

Характеристика сывороток количество

исследованных проб разведения, log2

1 Гипериммунные сыворотки ЧМЖЖ 9 13,540,34 2 Сыворотки от вакцинированных МРС

(21 суток ПВ) против ЧМЖЖ 717 6,610,19

3 Сыворотки от переболевших ЧМЖЖ 3560 8,990,21 4 Сыворотки от здоровых и

невакцинированных МРС 197 н/o

5 Гетерологичные сыворотки против: Оспы овец 110 но

6 Контагиозной эктимы овец 167 но 7 Катаральной лихорадки овец 73 но

Примечание: титры выражены в обратных величинах; ПВ – после вакцинации; «но» – отрицательный результат.

- 82 -

Таким образом, из данных таблицы видно, что непрямой вариант ИФА

позволяет обнаруживать вирусспецифические антитела в гипериммунных

сыворотках в разведениях 13,540,34 log2, в сыворотках переболевших

животных 8,990,21 log2, а в сыворотках крови от вакцинированных

животных с разведения 6,610,19 log2. Исследованные пробы сывороток от

здоровых овец и коз и гетерологичные сыворотки к вирусам оспы овец,

контагиозной эктимы овец, катаральной лихорадки овец в непрямом ИФА

дали отрицательные результаты.

Приведенные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и

специфичности непрямого варианта ИФА при исследовании полевых проб

сывороток от вакцинированных животных и о возможности их применения

для диагностики ЧМЖЖ и оценки напряженности поствакцинального

иммунитета.

- 83 -

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для лабораторной диагностики и идентификации вируса ЧМЖЖ к

настоящему времени в мире применяются такие серологические тесты, как

РДП, РСК, РН, МФА и ПЦР, а также методы выделения и идентификации

возбудителя в чувствительных культурах клеток [25, 31, 50, 57, 81, 119]. Все

эти методы имеют различную диагностическую ценность – одни из них

требуют значительных затрат времени, другие имеют низкую

чувствительность. Поэтому разработка более чувствительных и

специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики и

идентификации вируса ЧМЖЖ остается актуальной проблемой и до

настоящего времени. Одним из таких методов является иммуноферментный

анализ, который обладает рядом существенных преимуществ – высокая

чувствительность, специфичность и экспрессность метода, возможность

автоматизации процессов реакции и универсальность иммуноферментных

конъюгатов [8, 14, 23]. ИФА широко применяется в ветеринарной практике

для специфической диагностики и идентификации многих вирусных

инфекций животных [26, 48].

В связи с этим, нами были проведены исследования по разработке

твердофазного ИФА при ЧМЖЖ. Изучена эффективность разработанных

вариантов ИФА для диагностики и идентификации возбудителя болезни.

Выбор оптимальных вариантов ИФА проводили на основании анализа

данных литературы, учитывая следующие критерии: время необходимое для

постановки реакции, ее воспроизводимость и простоту в исполнении [14, 22,

27, 32].

Основываясь на данных литературы, из большого числа известных

вариантов твердофазного ИФА мы выбрали как наиболее эффективные и

перспективные следующие методы: прямой «Сэндвич» - метод выявления

поливалентных антигенов и непрямой метод определения антител.

- 84 -

В качестве источника иммуноглобулинов при отработке прямого

«Сэндвич» - варианта служили иммунные сыворотки коз, которые широко

применяются в других серологических реакциях [45, 48, 141]. При получении

вирусспецифических сывороток было испытано схем гипериммунизации коз

культуральный концентрированный антиген вируса чумы мелких жвачных

животных из штамма «Темурмалик», 20%-ную органо-тканевую

вируссодержащую суспензию из органов больных ЧМЖЖ, культуральную

вируссодержащую суспензию вируса ЧМЖЖ. В основу испытанных схем

гипериммунизации коз была положена схема получения специфической

сыворотки для РСК и РДП разработанная в лаборатории [44, 45, 46].

В результате активность полученных сывороток в РДП составила 1:32,

причем отрицательный результат получен с антигеном нормальным. Это

показывает их ни высокую специфичность.

Разработка для ретроспективной диагностики ЧМЖЖ непрямого варианта

ИФА вызвало необходимость получения антивидового конъюгата. По

литературным данным в качестве доноров антивидовых антител служат

кролики и морские свинки [3, 64, 65, 132]. В качестве доноров антивидовых

антител в наших экспериментах служили кролики. Испытанные схемы

гипериммунизации кроликов глобулином МРС позволили получить более

активные сыворотки, титры их в РДП составили от 3,630,12 до 4,620,13

log2. Из испытанных трех схем гипериммунизации кроликов лучшими

оказались схемы, предусматривающие 5-кратное введение гамма-глобулина

овца в комплексе с адъювантом Фрейнда в область подколенных

лимфатических узлов.

Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов, которые

получили высокоактивные антивидовые сыворотки на кроликах к

глобулинам многих видов животных [3, 29, 39]. Немаловажным этапом при

отработке метода ИФА является выделение из сывороток

иммуноглобулиновой фракции. Анализ зарубежной литературы по данному

вопросу свидетельствует, что в настоящее время для выделения и очистки

- 85 -

иммуноглобулинов из вирусспецифических и антивидовых сывороток

наиболее широко применяют: осаждение сульфатом аммония,

полиэтиленгликолем, спиртовое осаждение, хроматографию на сефадексах

или целлюлозе, аффинную очистку антител на различных сорбентах [12, 39,

72, 105].

Однако, глобулины, выделяемые вышеперечисленными методами, по

данным различных авторов имели неодинаковую активность, специфичность

и чистоту.

Так, например, Лайко С.В. и др. [39] было испытано 4 метода выделения

иммуноглобулинов: хроматография на колонке с сефадексом G-200,

фракционирование на белок А сефарозе, бесколоночная хроматография на

ДЭАЭ-сефадексе А-50, осаждение сульфатом аммония. Конъюгаты,

полученные на основе иммуноглобулинов, выделенных на сефадексе G-200 и

осаждением сульфатом аммония, имели более высокий уровень Rz (0,53-

0,56) и специфическую активность в ИФА (1:400), а конъюгаты с

иммуноглобулином, выделенным на белок А сефарозе, имели низкое

значение Rz (0,15) и невысокую специфическую активность в ИФА.

По данным ряда других авторов [12, 105] наиболее эффективным

способом фракционирования сывороток является метод аффинной

хроматографии, позволяющий выделить серологически высокоактивные и

специфичные иммуноглобулины. Наглядным подтверждением этих данных

являются исследования по выделению антивидовых иммуноглобулинов

Янкиной Н.Ф. с сотр. [72]. Сравнивая три способа выделения

антииммуноглобулинов (осаждение сульфатом аммония,

полиэтиленгликолем и с помощью иммуносорбента), они установили, что

антитела, выделенные с помощью иммуносорбента, по серологической

активности на 1,5 порядка превышали таковые, выделенные другими

способами.

Анализ этих данных свидетельствует о том, что в процессе разработки

ИФА при той или иной инфекции методы выделения иммуноглобулинов

- 86 -

требуют индивидуального подхода и в каждом конкретном случае

определяются опытным путем.

В наших экспериментах для выделения и очистки вирусспецифических

иммуноглобулинов были испытаны: трехкратное осаждение общей

глобулиновой фракции насыщенным раствором сульфата аммония,

спиртовое осаждение по Кону и спиртово-хлороформным методом. Для

выделения и очистки антивидовых антител были испытаны: спиртовое

осаждение по Кону и аффинная очистка антител на белково-

глютаральдегидном иммуносорбенте. Результаты проведенных исследований

показали, что наиболее активные и специфичные иммуноглобулины были

выделены из вирусспецифических сывороток при спиртовом осаждении по

Кону (титры в РДП от 4,980,20…до 5,320,21 log2) и менее активные

методом спиртово-хлороформным. Иммуноглобулин, выделенный

сульфатом аммония, имел активность в серологических реакциях, сравнимую

с серологической активностью спиртового гамма-глобулина. Но

иммунопероксидазные конъюгаты, приготовленные на его основе, вызывали

значительное неспецифическое фоновое окрашивание в контрольных рядах.

Это, по-видимому, связано с тем, что иммуноглобулины, осажденные

сульфатом аммония, содержали значительное количество примесей других

белков сыворотки крови. Эти результаты согласуются с данными Василенко

Н.Ф. [15] о том, что специфичность ИФА находится в полной зависимости от

степени очистки антител, применяемых для сенсибилизации полистирола и

приготовления конъюгата.

Антивидовые иммуноглобулины, выделенные методом Кона, имели

активность в РДП от 1:8 до 1:16, иммунопероксидазные конъюгаты,

приготовленные на их основе имели высокие предельные титры в ИФА (от

1:800 до 1:1600), но обладали значительным неспецифическим фоновым

уровнем до разведения 1:100-1:200 и даже в рабочем разведении (от 1:200 до

1:400) вызывали неспецифическое фоновое окрашивание в рядах с

- 87 -

нормальной сывороткой, что затрудняло тестирование в ИФА

слабоположительных сывороток.

Аффинно-очищенные на иммуносорбенте антивидовые антитела

сохраняли иммунологическую активность исходной сыворотки и позволяли

получать достаточно специфичные и активные иммунопероксидазные

конъюгаты, с помощью которых возможно было тестирование

слабоположительных сывороток, начиная с их разведения 1:10.

Анализируя данные литературы по получению иммунопероксидазных

конъюгатов, мы пришли к заключению, что наиболее эффективными и

широко применяемыми способами конъюгации антител с пероксидазой

хрена являются перйодатные методы: P.K.Nakane, A.Kawaoi, M.B.Wilson,

P.K.Nakane [122, 151]. Поэтому в наших исследованиях основное внимание

было уделено этим методам. С помощью данных способов было

приготовлено антивидовых и вирусспецифических конъюгатов. Для

конъюгации в основном использовали пероксидазу хрена зарубежного

производства с Rz=2,6-3,4 и удельной активностью по белку от 698 до 1476

ед/мг. Исследование активности и специфичности, приготовленных

конъюгатов в ИФА показало, что оба способа обеспечивают получение

достаточно специфичных конъюгатов, но активность конъюгатов

(предельный титр), приготовленных по методу M.B.Wilson, P.K.Nakane, была

выше в 2-4 раза. К таким же результатам пришли Звонарев А.Н. [29] и

Halliday M. [215] при получении антивидовых и вирусспецифических

иммунопероксидазных конъюгатов различными методами. Приготовленные

иммунопероксидазные конъюгаты хранили как в замороженном, так и в

лиофильно-высушенном состоянии. Для стабилизации конъюгатов

использовали стабилизатор, предложенный Башкировым О.Г. [5].

Результаты проведенных экспериментов показали, что

иммунопероксидазные конъюгаты сохраняли свои свойства в течение от 4 до

6 месяцев при хранении их в замороженном состоянии (- 40°С) и от 12 до 18

месяцев в лиофильно-высушенном при добавлении стабилизатора [5].

- 88 -

Лучшие результаты (в плане сохранения иммуноферментной активности)

показали конъюгаты, хранившиеся с добавлением стабилизатора,

содержащего сахарозу, агар и желатин.

При определении оптимальных условий постановки прямого варианта

твердофазного ИФА по принципу «Сэндвич» для обнаружения антигена

вируса ЧМЖЖ были проведены исследования по подбору оптимальной

сенсибилизирующей дозы вирусспецифического гамма-глобулина и рабочей

дозы конъюгата, а также изучено влияние на ход реакции таких факторов,

как рН используемых буферных растворов, время и температура

инкубирования компонентов реакции с твердофазным носителем. В

результате проведенных исследований было установлено, что оптимальная

сенсибилизирующая доза иммуноглобулинов зависит от их активности в

РДП и составляет от 1:16000 до 1:32000. Для сенсибилизации планшетов

использовали стократный оптимальный титр иммуноглобулинов, то есть их

разведения от 1:160 до 1:320, что соответствует концентрации белка от 0,1 до

0,3 мг/мл. Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов [16,

26], которые применяли такие же концентрации иммуноглобулинов для

оптимальной сенсибилизации полистирола при постановке «Сэндвич»-

варианта ИФА при ящуре, гриппе и многих других вирусных инфекциях

животных и человека.

Опытным путем было установлено, что оптимальные рабочие дозы

приготовленных вирусспецифических конъюгатов составляют их разведения

от 1:50 до 1:100, что соответствует их восьмикратному предельному титру.

При отработке оптимальных условий постановки прямого твердофазного

ИФА было установлено, что оптимальным режимом сенсибилизации

планшетов вирусспецифическим иммуноглобулином, а затем антигеном

является 4 час при температуре 37°С. Такие же результаты получены при

инкубировании вышеуказанных компонентов реакции в течение 18 час при

температуре 4°С. Эти результаты согласуются с многочисленными данными

- 89 -

литературы по отработке оптимальных условий постановки «Сэндвич» -

варианта ИФА при ящуре, коронавирусной инфекции КРС и гриппе [16, 33].

Наивысшее значение оптической плотности специфического антигена

достигается при взаимодействии конъюгата со связавшимся антигеном в

течение 50-60 мин при температуре 37°С [23, 111]. Опытным путем было

установлено, что оптимальным режимом инкубации субстратов пероксидазы

хрена с конъюгатом является от 30 до 60 мин при комнатной температуре в

затемненном месте.

При изучении возможности применения метода твердофазного ИФА для

обнаружения специфического антигена, в качестве испытуемых материалов

исследовали смывов из носовой полости, органов (лимфатические узлы,

селезенка, легкие, печень), взятые от больных и павших МРС. Контролями

служили пробы от здоровых овец и коз, стандартные культуральные

антигены и гетерологичные антигены вирусов оспы овец, контагиозная

эктима овец и катаральная лихорадка овец. В результате проведенных

исследований было установлено, что «Сэндвич» - вариант ИФА позволяет

выявлять антиген вируса ЧМЖЖ в пробах селезенки, легких, печени,

лимфатических узлов, смывах из носовой полости в титрах 6,800,16 log2.

При этом специфические культуральные антигены показали положительный

результат в ИФА от 12,150,22…до 13,720,38 log2, а контрольные

нормальные и гетерологичные антигены были отрицательны в ИФА, начиная

с 1:10. Для более объективной оценки эффективности прямого «Сэндвич»-

варианта ИФА были проведены исследования по сравнению

чувствительности этого метода с уже существующими серологическим

тестами (РСК и РДП). С целью определения чувствительности ИФА в

инфекционных единицах, культуральный вирус ЧМЖЖ (штаммы «G-45» и

«Темурмалик») параллельно титровали в культуре клеток ТЯ и в ИФА.

Результаты проведенных исследований показали, что чувствительность

«Сэндвич» - варианта ИФА в культуральной вируссодержащей суспензии

находится в пределах от 851,1…до 9772,0 ТЦД50/мл при исходной

- 90 -

инфекционной активности ее в культуре клеток ТЯ, равной от 4,750,43…до

6,240,78 lg ТЦД50/мл[41].

Для ретроспективной диагностики ЧМЖЖ были проведены исследования

по разработке непрямого варианта ИФА для количественного титрования

антител в сыворотках крови вакцинированных, переболевших и

гипериммунизированных МРС. Отработку оптимальных условий постановки

вышеуказанного варианта ИФА проводили по следующим параметрам –

подбор оптимальных концентраций компонентов реакции, времени и

температурного режима их инкубирования с твердой фазой.

В результате проведенных опытов по отработке оптимальных условий

постановки непрямого твердофазного ИФА были установлены следующие

оптимальные параметры этого теста, при которых достигается наивысшая

чувствительность: сенсибилизация полистироловых планшетов

специфическим комплексным культуральным антигеном (в рабочей дозе)

при рН 9,5 в течение 2 часов при температуре 37°С или 18 час при

температуре 4°С, инкубация испытуемых и контрольных сывороток с

закрепленным на полистироле антигеном не менее 1 час при температуре

37°С, взаимодействие антивидового конъюгата с сыворотками в течение 1

час при температуре 37°С, а затем рабочего раствора субстрата с конъюгатом

в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Чувствительность

отработанного варианта ИФА при выявлении вирусспецифических антител

определяли по максимальному титру антител в испытуемых пробах

сывороток и по отсутствию положительных реакций в (контрольных)

нормальных и гетерологичных сыворотках мелкого рогатого скота.

В результате проведенных исследований было установлено, что с

помощью непрямого варианта ИФА вирусспецифические антитела в

сыворотках гипериммунизированных животных были выявлены в титрах до

13,540,34 log2, в сыворотках от переболевших животных 8,990,21 log2, в

пробах сывороток от вакцинированных 6,610,19 log2.

- 91 -

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать

заключение, что разработанные и предлагаемые в ветеринарную практику

твердофазные варианты ИФА являются простыми, высокочувствительными,

специфичными и воспроизводимыми методами анализа, что позволяет

применять их для экспресс-диагностики ЧМЖЖ и идентификации

возбудителя болезни ЧМЖЖ в нашей стране.

- 92 -

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые в Республики Таджикистан получен штамм вируса ЧМЖЖ

(«Темурмалик») из эпизоотического очага от больной овцы. Проведена его

адаптация на культуре клеток ТЯ. Биологическая активность штамма

«Темурмалик» в культуре клеток ТЯ составляет 5,25 lgТЦД50/см3, штамм

характеризуется высокой иммуногенной активностью и может быть

использовании при создании иммунобиологических препаратов.

2. Разработана технология приготовления специфического антигена

вируса ЧМЖЖ на основе штамма «Темурмалик».

3. Разработаны схемы получения диагностических вирусспецифических и

антивидовых сывороток, для ИФА метода диагностики ЧМЖЖ.

4. Отработаны оптимальные режимы выделения вирусспецифических

иммуноглобулинов из сывороток иммунизированных вирусом ЧМЖЖ

животных (спиртовое осаждение по Кону), а из антивидовых – методом

аффинной очистки антител на белково-глютаральдегидном иммуносорбенте.

Получены специфически активные и антивидовые иммуноглобулины и

вирусспецифические иммунопероксидазные конъюгаты. Предельные

разведения приготовленных конъюгатов в ИФА составили от 1:400 до 1:1600,

а рабочие разведения от 1:50 до 1:200.

5. Определены оптимальные параметры постановки ИФА при ЧМЖЖ,

позволяющие обнаруживать специфический антиген в органо-тканевых и

культуральных материалах и вирусспецифические антитела в сыворотках

крови от больных, переболевших и гипериммунизированных овец и коз в

течение 4-6 часов после поступления проб на анализ. Отработаны

методические параметры контроля ИФА-теста на специфичность,

чувствительность и интерпретации результатов.

- 93 -

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на

культуральный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы

выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочищенных

антител переданы для использования в НПП «Биологические препараты»

Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и ООО «Агровет» для

налаживания их производства.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-

техническая документация: Наставление по лабораторной диагностике

ЧМЖЖ методом ИФА (Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои

хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменти) и Рекомендации по

проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных

животных (Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва

пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор), утвержденные

начальником и зам. начальником Службы государственного ветеринарного

надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15

марта 2011г.)

Разработанные мероприятия по эпизоотологическому анализу и

диагностике ЧМЖЖ внедрены в практику ветеринарной службы

Таджикистана.

- 94 -

7. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ

1. Алексеева В.Н. Характеристика некоторых иммуносорбен-

тов//Препараты для экспресс диагн.. –Ленинград, 1981. -С. 43

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. //Статистические методы в микробиол.

исследованиях. –Ленинград, 1962.-С. 180.

3. Бабикова Н.В., Шустова Н.Д., Васерин Ю.И. Иммуноферментный

анализ, условия количественного определения антител к вирусу гриппа

//Мед. химия. -1984.- С. 4.

4. Бакулова И.А.Чума мелких жвачных. // Карантинные и малоизвестные

болезни животных. «Колос» -1983. С. 106.

5. Башкиров О.Г. Лиофилизация конъюгатов для ИФА //Бюл. ВИЭВ.-

Москва, 1986. -Выпуск 57.- С. 35-36.

6. Белозеров А.П., Навольнев С.О. Сравнительная характеристика

некоторых методов ИФА для определения суммарных

иммуноглобулинов //МЭИ.- 1985. -№1. -С. 59.

7. Беляев Н.Н. Применение иммунных комплексов фермента-антитело в

серологическом анализе //МЭИ. -Москва, 1988. -№4. -С. 50-53.

8. Березин И.В., Егоров А.М. Новые направления развития ИФА //Вест.

АМН СССР.- 1987. -12. -С. 72-78.

9. Брыкалов, А.В. Новые композиционные носители для иммобилизации

ферментов / А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева // Современные

достижения биотехнологии: Материалы Всерос. конф. -Ставрополь.

1996.- С.279.

10. Брыкалов, А.В. Получение биопрепаратов на основе методов -

аффинной сорбции и иммобилизации // Дис. ... д-ра хим. наук / А.В.

Брыкалов. -1993,СПб. - 330с.

11. Ванеева Л.И., Янкина Н.Ф. Разработка методов получения

моноспецифических ингредиентов для ИФА //ЖМЭИ. -1989. -№5. -С.

50-55.

- 95 -

12. Ванеева Л.И. Изучение сорбционной способности полистирольных

планшетов, используемых в иммуноферментном анализе /, И.Ю.

Гридина, О.Н. Пантелеева и др., // ЖМЭИ.- №9.- 1989.-С. 86-89.

13. Васильев А. В. // Пробл. молекул. биол. и патол. с/х животных. –Сб.

науч. трудов.- Москва, 1998.- Том 113. -С. 71.

14. Васильев А.В., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в

диагностике вирусных инфекций //Вет. –1982.- №8. -С. 63-65.

15. Василенко Н.Ф., Заревина Л.И. О применении твердофазного ИФМ для

определения туляремийного антигена //Акт. вопр. иммунодиагн. особо

опасных инфекц. Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. 26-27 мая 1986

г. -С. 53.

16. Веселов М.Е., Синяков И.Г. Разработка иммуноферментной тест-

системы для количественной индикации гемагглютинина вируса

гриппа в биологических образцах //Вопр. вирусол. -1985. -№ 6.- С. 672.

17. Виха И.В., Воробьев А.А., Желудева С.И. Получение, свойства и

применение β-галактозидазы B. Subtitles в ИФА //ВНИИ биологическая

приборостроения. –Москва, 1985.- С.12-15.

18. Вудворд, Д. Иммобилизованные клетки и ферменты / Д. Вудворд М.:

Мир, 1988.- 161с.

19. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров А.М. Иммуноферментный

анализ: Тез.докл.3-го Всес.науч.симпоз. "Получение

иммобилизованных ферментов в научных исследованиях,

промышленности и медицине"-Л., 1980. - С.37-38.

20. Георгиу Х. Сравнительная оценка ИФА и РСК при анаплазмозе

рогатого скота // Бюл. ВИЭВ.–Москва, 1985. -Выпуск 58. -С. 52-54.

21. Граевская Н. А. Закономерности синтеза противовирусных антител.

Теоретические исследования в связи с проблемой получения

гипериммунных сывороток// Док. дисс. – Москва, 1968.

22. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов

ИФА //Итоги науки и техн. –Биотех. –Москва, 1987. -Т. 3. -С. 56-116.

- 96 -

23. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития

иммуноферментного анализа //Ж. Всесоюз. химического общества

имени Д.И.Менделеева.- 1982.- Т. XXIV.- №4.- с. 82-89.

24. Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы ИФА //Бюл. ВИЭВ. - 1985. -

Выпуск 58.- С. 10.

25. Диев В.И.., Соколов Л.Н., Мамкова Р.В., Евсеев А.М., Куляшбекова

Ш.К. Изучение чувствительных различных клеточных культур к

вирусу чумы мелких жвачных животных.// Вирусные болезни

сельскохозяйственных животных. - Владимир, 1995.-С.94.

26. Думанова Л., Текерлеков П. Дифференциация вируса ящура с

помощью ELISA //Вет.-медицинские науки. -1983.- 2.- С. 13-19.

27. Егоров А.М. //Современное состояние и перспективы развития ИФА:

школа-семинар. Совр. проб. биотех. -Астрахань, 1985. -С. 2-24.

28. Егоров, Н.С. Биотехнология /Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д.

Самуилов // Проблемы и перспективы биотехнологии.- М:.Высшая

школа.- 1987.- 115 с.

29. Звонарев Л.Ю., Мальцева Н.Н. Получение и оценка антивидовых и

антивирусных пероксидазных конъюгатов //Acta Virol.- 1987.- Р.31-33

30. Иванов А.П., Башкирцев В.Н. Разработка и применение ИФМ для

диагностики аденовирусных инфекций //Вопр. вирусол. -1981. -№6. -С.

23-26.

31. Капускин Е.В. Изучение чувствительности клеточных культурах к

вакцинному вирусу чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ»,

Вестник Кыргызкого научно-исследовательского института

животноводства, ветеринарии и пастбищ имени А. Дуйшева. Бишкек-

2007. - С.212-215).

32. Коромыслов Г.Ф., Авилов В.С. Иммуноферментный анализ и

применение его в ветеринарии //Бюл. ВИЭВ.– Москва, 1985. -Выпуск

58.

- 97 -

33. Коромыслов И.Г., Шарабрин О.И., Гуленков В.В. Иммуноферментный

метод в диагностике коронавирусной инфекции у КРС //Бюл. ВИЭВ.–

Москва, 1985. -№58. -С. 48-51.

34. Кошеметов Ж.К. Разработка иммуноферментного анализа для

диагностики и индикации вирусов чумы крупного рогатого скота и

оспы овец. //Итоги выполнения РНТП Ц0252 «Научно-техническое

обеспечение и организация производства биотехнологической

продукции в Республике Казахстан» на 2001-2005 гг. Материалы

республиканского научно-практического семинара. Астана, 2005.

С.146-151.

35. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителя на свойства катализатора /

С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский // Кинетика и катализ. -

1973.- Т.14, №5.-С.1300-1303.

36. Корогодин Д.В. Перспективные области применения ИФА на

нитроцеллюлозном носителе в биотехнологии и медицине

//Механизмы иммунорегуляции и иммун. –Биотех.- Москва, 1989. -С.

87-89.

37. Курманова Л.В., Ермолин Г.А., Эткин А.Ф. Получение специфических

иммуноферментных конъюгатов против класса иммуноглобулинов

человека// Лаб. дело. -1984. -№2. -С. 80.

38. Кэтти Д. Получение меченых антител посредством связывания

антигена с носителем, связывания антител с антигеном и метки

ферментом или флуоресцентной краской с последующим

освобождением антител. //В кн.: Антитела 2. Москва «Мир», 1991.-

С.210-212.

39. Лайко С.В., Блинова Т.В. Приготовление конъюгатов для ИФМ

диагностики вирусного гепатита //Вопр. вирусол. - №4. -1986. -С. 473.

40. Мамадалиев С.М., Кошеметов Ж.К., Троицкий Е. Н., Нурабаев С. Ш.

Отработка условий приготовления специфического антигена чумы

крупного рогатого скота// Вторая международная научная конференция

- 98 -

«Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных

болезней животных». Сборник материалов конференции Самарканд-

2004г. С. 125-127.

41. Мамадалиев С.М., Матвеева В.М., Троицкий Е.Н., Кошеметов Ж.К.

Сравнительная оценка эффективности иммуноферментного анализа

для выявления антител против вируса чумы крупного рогатого

скота.//Международная научно-практическая конференция на тему

«Биотехнология основа повышения продуктивности

сельскохозяйственных животных и растений». г. Бишкек 15-16

сентября 2005г.

42. Мамадалиев С.М., Матвеева В.М., Кошеметов Ж.К. Применение

метода ИФА для обнаружения антигена вируса чумы крупного

рогатого скота.//Международная научно-практическая конференция на

тему «Биотехнология основа повышения продуктивности

сельскохозяйственных животных и растений». г. Бишкек 15-16

сентября 2005г.

43. Мамадалиев С.М., Кошеметов Ж.К., Керембекова У.Ж., Нурабаев

С.Ш., Хайруллин Б.М., Касенов М.М., Ажибаев А.Ж.. Применение

иммуноферментного метода для ретроспективной диагностики чумы

мелких жвачных животных. Актуальные вопросы диагностики

болезней животных. Специальный выпуск материалы второй

международной конференции. С. 256-261. г. Алматы.

44. Матвеева В.М., С.М. Мамадалиев, Ж.К. Кошеметов, А.М. Русанова.

Получение диагностических сывороток против вируса чумы КРС,

пригодных для постановки в ИФА. Актуальные вопросы диагностики

болезней животных. Специальный выпуск материалы второй

международной конференции. С. 265-268. г. Алматы. 2005г.

45. Матвеева В.М., С.М. Мамадалиев, Ж.К. Кошеметов, А.Ж. Ажибаев.

Разработка методов выделения и очистки иммуноглобулиновых

препаратов для ИФА при чуме КРС. Актуальные вопросы диагностики

- 99 -

болезней животных. Специальный выпуск материалы второй

международной конференции. С. 269-272. г. Алматы. 2005г. С. 269-

272.

46. Матвеева В.М., Кошеметов Ж.К. Мамадалиев С.М.Способы выделения

и очистки иммуноглобулиновых препаратов для ИФА при оспе овец.

//Биотехнология. Теория и практика. 2006г. №1 С.87-90.

47. Михалкин И.П. Чума мелких жвачных животных.// Сибирская язва и

другие опасные инфекционные болезни животных. – Покров, 2005.-

С.159-163.

48. Мникова Л. А. Разработка средств и методов иммуноферментного

анализа для диагностики оспы овец //Дисс. канд. биол. наук. -

Гвардейский, 1977.- 131С-Д46.

49. Нго Г.Т, Ленхофор Г.М. Иммуноферментный анализ –М:. 1988.–С.25–

167

50. Неверовская Н.С., С.Г. Юрков, В.Ю. Луговец, А.В. Степанов.

Чувствительность серийных культур клеток тестикулярной ткани

ягненка (ТЯ) к вирусам пограничной болезни (ПБО) овец и чумы

мелких жвачных (ЧМЖ). //Диагностика, профилактика и меры борьбы

с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезниями

животных. г. Покров-2000.-С.190-192.

51. Неверовская Н.С., А.В. Степанов, С.Г. Юрков. Изучение

чувствительности первичнотрипсинизированных культур клеток к

вакцинному «45g35» и эпизоотическому штаммам вируса чумы мелких

жвачных животных (ЧМЖ). //Диагностика, профилактика и меры

борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными

болезниями животных. г. Покров-2000.-С.192-194.

52. Осидзе Д.Ф. Чума мелких жвачных. // Инфекционные болезни

животных. Справочник под ред. Д.Ф. Осидзе - М.Агропромиздат- 1987.

С.73.

- 100 -

53. Пономарева Н.А., Нечаева А.С. //Гамма-глобулин. –Москва, 1965. -С.

3-20.

54. Покровский, В.И. Иммуноферментный анализ: современное состояние

и тенденции развития / В.И. Покровский // Медицинская генетика и

иммунология.- М:. 1986.- С. 4-5.

55. Пшеничная Л. А., Хабижанов А. Б. Полимеразная цепная реакция //

Эскулап. – Алматы, 2000.- №9. - С. 8.

56. Рукосуев В.С., Капинус Л.Н. Иммуноморфологический метод

исследования с меткой антител пероксидазой //Архив патол. -1979. -

№5. -С. 64-67.

57. Степанов А.В., Я.С. Цыбанов, А.А. Стрижаков, С.Ж. Цыбанов.

Молекулярно-генетической метод диагностики чумы мелких

жвачных.//Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо

опасными, экзотическими и зооантропонозными болезниями

животных. г. Покров-2000.-С.163-164).

58. Сухоруков А.В., Кошеметов Ж.К., Иванов Н.П., Кусаинов А.К.

Отработка условий постановки реакции связывания комплемента для

диагностики чумы мелких жвачных животных у коз. С. 324-326, Третья

Международная конференция//Состояние и перспективы развития

производства ветеринарных биопрепаратов, Алматы-2006.

59. Сухоруков А.В., Кошеметов Ж.К., Иванов Н.П., Сиденко А.С.

Отработка условий постановки реакции связывания комплемента для

диагностики чумы мелких жвачных животных с использованием

сывороток, полученных от овец. С. 327-329, Третья Международная

конференция//Состояние и перспективы развития производства

ветеринарных биопрепаратов, Алматы-2006.

60. Сухоруков, А.М. Изучение сорбционных свойств полистироловых

планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / А.М.

Сухоруков, А.М.Пономарева // ЖМЭИ.- 1987.- №9.- С. 18-22.

- 101 -

61. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. // Диагностика вирусных

болезней животных. -Москва ВО "Агропромиздат", 1991. – С. 157.

62. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. – М:. Мир,

1983.– с.23.

63. Умнова, Н.С. Приготовление иммунопероксидазных препаратов для

диагностики особо опасных инфекций / Н.С. Умнова, И.П. Павлова,

Г.В. Михеева // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо

опасных инфекций: Тез. Докл. Всесоюзной конф.– Ставрополь,1986.–

4.2.–С.95–98.

64. Федоров Ю.Н. Принципы получения моноспецифических

антисывороток к Иг Г овец //Труды Всесоюз. института

экспериментальной вет. -1980. -51. -С. 106-112.

65. Фримель Г. //Иммунологические методы. –Медицина.- Москва, 1987.-

С.472.

66. Харитоненков И.Г., Христова М.М. Использование ИФА в

вирусологии// МГМиВ. -1985.- №6.-С.17-21.

67. Хлюстов С.В., Коломнец Н.Д., Коломнец А.Г. Применение ИФА в

целях диагностирования ретровирусной инфекции при лейкозе КРС

//Теор. и практ. вопр. вет.- Тарту.- 1981. - Т.2.- С. 25-31.

68. Чард Г. //Радиоиммунологические методы.- Москва, 1981.- С. 246.

69. Шажко Ж.А., Мищенко Н.Н. Оптимизация ИФМ на фильтровальных

мембранах для выявления ящура и противоящурных антител //Бюл.

ВИЭВ.–Москва, 1985.- Выпуск 58. -С. 62-64.

70. Шамардин В.А., Кузьмин Ю.А., Каральник Б.В. Использование

каталазы в иммуноферментных реакциях //Лаб. дело. -1988. -№4. -С.

69-73.

71. Шаханина, К.Л. Выбор критериев пригодности твердофазных

носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного

анализа / К.Л. Шаханина, А.А. Соколенко, И.П. Павлова // ЖМЭИ.-

№9.- 1987.-С. 8-11.

- 102 -

72. Янкина Н.Ф., Ванеева А.И. Разработка метода получения конъюгатов

пероксидазы с антиглобулином для ИФА //МЭИ. -1985.- №1. -С. 35

73. Abraham G, Sintayehu A, Libeau G, Albina E, Roger F, Laekemariam Y,

Abayneh D and Awoke KM . Antibody seroprevalences against peste des

petits ruminants (PPR) virus in camels, cattle, goats and sheep in Ethiopia//

Preventative Veterinary Medicine.-2005.- 70(1–2):51–57.

74. Abu-Elzein E.M.E., Hassanien M.M., Al-Afaleq A.I., Abd-Elhadi M.A. &

Housawi F.M.I. Isolation of peste des petits ruminants from goats in Saudi

Arabia// Vet. Rec.-1990- 127 (12), 309-310

75. Anaokar,.S.Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferreting / S.

Anaokar, P.J. Sorry, J.C. Standefer // Clin. Chem..-1979.- V.25.-P.1426-

1431.

76. Anderson J, McKay JA and Butcher RN. The use of monoclonal antibodies

in competitive ELISA for the detection of antibodies to rinderpest and peste

des petits ruminants viruses// In: The Sero-monitoring of Rinderpest

throughout Africa, International Atomic Energy Agency, Vienna.-1991.

77. Anderson J., Rowe L.W., Taylor W.P. An enzyme-linked immunosorbent

assay for the detection of Ig G, Ig M, Ig A antibodies to rinderpest virus in

experimentally infected cattle //Res. vet. sci.- 1982.- V. 32.- №2.-Р.98-100.

78. Anderson J. & McKay J.A. The detection of antibodies against peste des

petits ruminants virus in cattle, sheep and goats and the possible implication

to rinderpest control programmes// Epidemiol. Infect.-1994- 112, 225-234.

79. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of

the conjugates for the detection of antigens and antibody

//Immunochemistry.- 1969.- №6.- Р. 43-52.

80. Avrameas S., Wiel A. Methode de marquage d'antigens et d'anticorps avec

des enzymes et su application immunodiffusion //C.R. acad. sci.- 1966.- V.

26.- №2.- Р. 25-43.

81. Balamurugan V, Sen A, Saravanan P, Rasool TJ, Yadav MP,

Bandyopadhyay SK, Singh RK.Development and characterization of a stable

- 103 -

vero cell line constitutively expressing Peste des petits ruminants virus

(PPRV) hemagglutinin protein and its potential use as antigen in enzyme-

linked immunosorbent assay for serosurveillance of PPRV. Clin Vaccine

Immunol. -2006- Dec;13(12):1367-72.

82. Bazarghani TT, Charkhkar S, Doroudi J, Bani Hassan E. A Review on Peste

des Petits Ruminants (PPR) with Special Reference to PPR in Iran// J Vet

Med B Infect Dis Vet Public Health.- 2006- Dec;53 Suppl 1:17-8.

83. Braide VP. Peste des petits ruminants, a review.//FAO World Animal

Review.-1981- 39:25–28.

84. Cantorero L.A., Butler J.E., Oslorne J.W. The adsorptive characteristics of

protein for polystyrene and their significance in solid phase immunoassay

//Anal. biochem.- 1980.- V. 105.- Р. 375-382.

85. Catt R., Treagear G.W. Solid-phase radioimmunoassay in antibody coated

tubes //Science.- 1967.- №158.- Р. 1570.

86. Choi, K. S., J. J. Nah, C. U. Choi, Y. J. Ko, H. J. Sohn, G. Libeau, S. Y.

Kang, and Y. S. Joo. Monoclonal antibody-based competitive ELISA for

simultaneous detection of rinderpest virus and peste des petits ruminants

virus antibodies// Vet. Microbiol.-2003. 96:1-16

87. Couacy-Hymann R.F., Hurard C., Guillou J.P., Libeau G. & Diallo A. Rapid

and sensitive detection of peste des petits ruminants virus by a polymerase

chain reaction assay//J. Virol. Methods.-2002.-100, 17-25.

88. Dardiri AH, DeBoer CJ and Hamby FM . Response of American goats and

cattle to peste des petits ruminants virus// In: Proceedings of the 19th Annual

Meeting of the American Association of Veterinary Laboratory

Diagnosticians, Miami Beach, Florida.-1976.-337–344.

89. Dhar, P., B. P. Sreenivasa, T. Barrett, M. Corteyn, R. P. Singh, and S. K.

Bandyopadhyay. Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus

(PPRV)//Vet. Microbiol.-2002.- 88:153–159. 32.

- 104 -

90. Diop M, Sarr J, Libeau G. Evaluation of novel diagnostic tools for peste des

petits ruminants virus in naturally infected goat herds// Epidemiol Infect.

2005 Aug;133(4):711-7.

91. Diallo A, Minet C, Le Goff C, Berhe G, Albina E, Libeau G and Barrett T.

The threat of peste de petits ruminants: progress in vaccine development for

disease control // Vaccine.-2007.- 25(30):5591–5597.

92. Dugimont J.C. Essais d'automatisation de l' ELISA //"Enzyme linked

immunosorbent assay". Orig. lab. interpret.- 1976.- Р. 627-629.

93. Durojaiye O.A., Obi T.U. & Ojo O. Virological and serological diagnosis of

peste des petits ruminants//Trop. Vet.-1983.- 1, 13–17.

94. El-Hakim OA .An Outbreak of Peste de Petit Ruminants (PPR) At Aswan

Province, Eygpt - Evaluation of Some Novel Tools for Diagnosis Of PPR

//Assiut Veterinary Medical Journal.-2006.- 52(110):132–145.

95. Engvall E., Perlmann P. Enzyme linked immunosorbent assay. III.

Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled antiimmunoglobulin

antigen-coated tubes //J.Immunol.- 1972.- V. 109.- №1.- Р. 129-135.

96. Forsyth, M. and Barrett, T. Evaluation of polymerase chain reaction for the

detection of rinderpest and peste des petits ruminants viruses for

epidemiological studies// Virus Research.-1995.- 39, 151–163.

97. Ford D., Radin R., Pesce A. Characterization of glutaraldehyde coupled

alcaline phosphatase-antibody and lactoperoxidase-antibody

conjugates//Immunochemistry.-1978.- V. 15.-Р. 237-243.

98. Gargadennec L. & Lalanne A. La peste des petits ruminants// Bull. Serv.

Zoo. A.O.F.-1942.- 5, 15– 21.

99. Gilbert L., Monnier A., Adaptation olu virus de la des petits ruminants

aux cultures cellulaires. Note prelimimaire -Rev. Elev. Med. Vet. Pays

trop., 1962, v.15 4, p. 321-325.

100.Guesdon J.L., Avrameas S. Magnetic solid phase enzyme

immunoassay//Immunochemistry.- 1977.- V. 17.- Р. 443-447.

- 105 -

101.Guesdon J.-L. La methde enzyme-immunologique. Aspects theoriques et

practiques //Techn. et biol.- 1987.- V. 13.- Р. 97-107.

102.Hamblin C.C., Barnett J.T.R. A new enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) for the detection of antibodies against food-and-mouth disease

virus //J.Immunol. methods.- 1986.- V. 93.-№1.- Р. 115-129.

103.Hamdy F.M. & Dardiri A.H. Response of white-tailed deer to infection

with peste des petits ruminants virus// J. Wildl. Dis.-1976.-12, 516– 522.

104. Halliday M.J., Wisdom G.B. A comparison of three methods for the

preparation of enzyme-antibody conjugates //Biochem. soc. trans.- 1986- №

14.- Р. 473-474.

105. Hawanitz J.H. Immunoassay. Innovations in label technology //Arch.

pathol. and Med. Lab.- 1988.- V. 112.- №8.- Р. 775-779.

106. Hendry R.M., Hermann J.E. Immobilization of antibodies on nylon for use

in enzyme-linked immunoassay //J.Immunol. methods.- 1980.- № 35.- Р.

285-286.

107. Hendry R.M., Hermann J.E. Coupling of antibodies and enteroviruses to

plastics enzyme linked immunoassay //Abstr. annu. meet. amer. microbiol. -

Los Angeles, Calif. 1979. Washington D.C.- 1979.- Р. 3330.

108. Ismail IM and House J. Evidence and identification of peste des petits

ruminants from goats in Egypt// Archiv fur Experimentelle

Veterinarmedizin.-1990.- 44(3):471–474.

109. Kato K.W., Hamaguchi V., Fukui M. Coupling fab-fragment of rabbits anti-

human Ig G antibody to galactosidase and highly sensitive immunoassay of

human Ig G //FEBS lett.- 1975.- №56.- Р. 370.

110. Kricka L.J., Carter T.J., Burt S.N. Variability in the adsorption properties of

microtitre plates used as solid supports in enzyme immunoassay //Clin.

chem.- 1980.- №6.- Р. 741-744.

111. Kyrein H.J. Der Enzyme-Immunoassay (EIA) //Arztl. lab.- 1978.- V. 21.-

№3.- Р. 57-65.

- 106 -

112. Laurent A., Aspects biologigues de la multiplication au virus de la peste des

petits ruminants on PPR sur les cultures cellulaires ,- Rev. Elev. Med. Vet.

Pays trop, 1968, v.21, 3, p.297-308

113. Laurent C. Detection d'antigens viruses de la maladie de Marek a

l'immunoserums conyuquest a la peroxidase //C.R. acad. sc. -Paris, 1973.- V.

277.-№19.- Р. 2093-2096.

114. Lefevre P.C. & Diallo A. Peste des petits ruminants// Rev. sci. tech. Off. int.

Epiz.-1990.- 9, 951-965.

115. Lehtonen O.P., Vileganun M.K. Antigen attachment in ELISA //J.Immunol.

methods.- 1980.- №34.- Р. 61-70.

116. Libeau G., Diallo A., Colas F. & Guerre L. Rapid differential diagnosis of

rinderpest and peste des petits ruminants using an immunocapture ELISA//

Vet. Rec.-1994.- 134, 300-304

117. Libeau, G., C. Préhaud, R. Lancelot, F. Colas, L. Guerre, D. H. L. Bishop,

and A. Diallo. Development of a competitive ELISA for detecting antibodies

to the peste des petits ruminants virus using a recombinant

nucleoprotein//Res. Vet. Sci.-1995.- 58:50-55

118. Libeau, G. & Lefevre, P.C. Comparison of rinderpest and peste des petits

ruminants viruses using anti-nucleoprotein monoclonal antibodies. Vet.

Microbiol.-1990.- 25: 1-16.

119. Mitra-Kaushik, S., R. Nayak, and M. S. Shaila. Identification of a cytotoxic

T-cell epitope on the recombinant nucleocapsid proteins of rinderpest and

peste des petits ruminants viruses presented as assembled nucleocapsids//

Virology.-2001.- 279:210–220

120. Mohanty P.K., Verme P.C. Detection of swine pox and buffalo pox viruses

in cell culture using protein A – horseradisch peroxidase conjugate //Acta.

virol.- 1989.- V. 33.- №3.- Р. 290-296.

121. P. Mornet, J.Orue, Y. Gilbert, G. Thiery and S. Mamadou. La peste des

petits ruminants en Afrique occidentale francaise: ses rapports avec la peste

bovine//Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop. -1956.-9, 4, p.313-356.

- 107 -

122. Nakane P.K., Kawoi A.A. New method of conjugation //J.Histochem.

Cytochem.- 1974.- V. 22.- Р. 1084-1091.

123. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody – a new method of conjugation

/P.K. Nakane, A. Kawaoi // J.Histochem. Cytochem.-1974.- V.22. №4-

P.506-506.

124. Nawathe D.R., Taylor W.P.// Trop. Anim. Рдер Prod. 1979. V. 11. P. 120-

123

125. Nygren H., Hansson H.A. Conjugation of horseradish peroxidase

staphylococcus protein A with benzoquinone, gluteraldehyde or periodate as

cross-linking reagents. A comparative study //Histochem. cytochem.- 1981.-

V. 29. №2.- Р. 266-270.

126. Obi, T. U. The detection of PPR virus antigen by agar gel precipitation test

and counter-immunoelectrophoresis//J.Hyg. – 1984.-93: 579-586.

127. O'Sullivan M.J., Marks V. Method of preparation of enzymatibody

conjugates for use in enzyme immunoassay // Meth. In Enzymol.-

New.York, 1981. - V. 73. -P.147- 166.

128. Obi T. U., M. O. Ojo, O. A. Durojaiye, O. B. Kasali, S. Akpavie, and D. B.

Opasina. 1983. Peste des petits ruminants (PPR) in goats in Nigeria: clinical,

microbiological and pathological features. Zentralbl. Veterinaermed. Reihe

B 30:751-761.

129. Pfahler W.H.E., Reimann M. Abiotin-avidin amplified enzyme

immunoassay for detection and quantitation of orthopox virus camel

antibodies in dromedaries //J. Vet. med. b. 1986.- V. 33.- № 7.- Р. 477-484.

130. Piroird R., Lambard M. Les methods immuno-enzymatiques et leurs

applications serologiques //Rev. med. vet. pays trop.-1980.- V. 131.- P. 25-

42.

131. Potgieter L.N.D., Rouse B.T., Webb-Martin T.A. Enzyme-linked

immunosorbent assay using staphylococcal protein A for detecting virus

antibodies //Amer. J. Vet. res.- 1980- V. 41.- №6- Р. 978-980.

- 108 -

132. Rossister P.B., Iessett D.M., Holmes P. MicroELISA test for detecting

antibodies to rinderpest virus antigens //Trop. anim. hlth. prod.- 1981.-

№13.- Р. 113-116.

133. Rossiter PB. Peste des petits ruminants. In: Infectious Diseases of Livestock,

vol 2, 2nd edition, Coetzer JAW and Tustin RC (eds), Oxford University

Press, UK.-2005.

134. Saliki, J.T., House, J. A., Mebus, C.A., and Dubovi, E.J. Comparison of

peste des petits ruminants monoconal antibody-based sandwich tecnique

ELISA and virus isolation for detection of peste des petits ruminants virus in

goat tissues and secretions//J. Clin. Microbiol.-1994.- 32:1349-1356-3

135. Saliki J.T., Libeau G., House J.A., Mebus C.A. & Dubovi E.J. Monoclonal

antibody based blocking ELISA for specific detection and titration of peste

des petits ruminants antibody in caprine and ovine sera.//J. clin. Microbiol.-

1993- 31 (5), 1075-1082.

136. Sanders G.S., Clinard E.N., Bartelett M.L. Application of the indirect

enzyme-labelled antibody microtest to the detection and surveillance of

animal diseases //J.Infect. dis..- 1977-№136- Р.258-266.

137. Schilow W.E., Meyer V. Durchführung und Awendungsmöglichkeiten des

ELISA in der veterinärmedizinischen Virusdiagnostik //Mh. vet.-med.-

1985.- № 40.- Р. 186-189.

138. Shaila, M. S., D. Shamaki, M. A. Forsyth, D. Diallo, L. Goatley, R. P.

Kitching, and T. Barrett. Geographic distribution and epidemiology of peste

des petits ruminants viruses//Virus Res.-1996.- 43:149–153.

139. Singh R.P., Sreenivasa B.P., Dhar P., Shah L.C. & Bandyopadhyay S.K.

Development of monoclonal antibody based competitive ELISA for

detection and titration of antibodies to peste des petits ruminants (PPR)

virus// Vet. Microbiol.-2004.- 98 (1), 3-15

140. Singh R.P., Sreenivasa B.P., Dhar P. & Bandyopadhyay S.K. (2004). – A

sandwich ELISA for the diagnosis of peste des petits ruminants (PPR)

- 109 -

infection in small ruminants using anti-nucleocapsid protein monoclonal

antibody.//Arch. Virol.-2004.- 149 (11), 2155-2170.

141. Steck F., Huggler Chr. Inheritance and interaction of immune traits in beef

calves //"Off. int. epiz", 43 sess. general C. I. E..- Paris, 1975.- P.13-15.

142. Sumption K.J., Aradom G., Libeau G. & Wilsmore A.J. (1998). Detection of

peste des petits ruminants antigen in conjunctival smears of goats by indirect

immunofluorescence. Vet. Rec., 142, 421-424.

143. Sundquist V.-A., Wahren B. An interchangeable ELISA for cytomegalovirus

antigen and antibody //J.Virol. methods.- 1981.- №2.- Р. 301-302.

144. Taketa K., Ichikawa E. A tetrasolium method for staining peroxidase labels

in blottings assays //J.Immunol. methods.- 1986.- V. 95.- №1.- Р. 71-77.

145. Taylor W.P. Serological studies with the virus of peste des petits ruminants

in Nigeria//Res. Vet. Sci., 26.- 1979.-236-242.

146. Taylor W.P., Albusaidy S. & Barrett T. The epidemiology of peste des petits

ruminants in the Sultanate of Oman//Vet. Microbiol 22.- 1990. 341-352.

147. Taylor WP. The distribution and epidemiology of peste des petits

ruminants//Preventive Veterinary Medicine -1984.-2:157–166.

148. Van Weemann B.K. ELISA. Highlights of the present state of the art

//J.Virol. methods.- 1985.- V. 10, №4.- Р. 371-378.

149. Vorde D.E., Sasse E.A., Hursa R. Competitive enzyme-linked immunoassay

with use of soluble enzyme antibody immunocomplexes for labelling. I.

measurement of human choriogonadotropin //Clin. chem.- 1976.- V. 22.-

№8.- Р. 1372-1377.

150. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. The use of microplatelets test of ELISA

in some infection diseases //Proc. int. symp. immuno-enz. techniques.- Paris,

2-4 Apr.- 1975.-№4. 1975.

151. Wilson M.B., Nakane P.K. Recent development in the periodate method of

conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies //Biomedical

Press.- 1978.- Р. 215-244.