대한내과학회지 : 제 60 권 제 1 호 2001

백서 심근에서 plasmid 벡터를 이용한 유전자 전달

및 VE GF 유전자 발현의 특성

성균관대학교 의과대학 내과학교실 순환기내과 , 삼성서울병원 심장혈관센터 * ,서울대학교 유전공학연구실† , 충남대학교 의과대학 내과학교실 순환기내과‡

정진옥*·박선진*·허정은*·정은아*·오주현*·권현철*

이영주†·김선영

†·박정의*·이원로*·전은석

‡·김덕경*

=A b s t r a c t =

Ch ar ac t e r i s t i c s o f g e n e t ra n s f e r an d V E GF e x p re s s i on

u s in g n ak e d p la s m i d v e c t or s in t h e rat h e art

J in - Ok J eong , M.D.*, Sun - Jin P ark , B.S .* , J eong - Eun Huh, M.S.* ,

Eun - Ah Jung , M.S .* , Ju Hyeon Oh, M.D.* , Hyeon - Cheol Gwon, M.D.*,

YoungJoo Lee, Ph.D.† , Sunyoung Kim, Ph.D.† , Jeong - Euy Park , M.D.* ,

Won Ro Lee, M.D.*, Eun - Seok Jeon , M.D.‡ and Duk - Kyung Kim , M.D.*

D epartm ent of M edicine, S ungkyunkwan University S chool of M edicine,

Cardiac and Vascular Center, Sam sung M edical Center*, Samsung B iom edical R esearch Institute

Institute of M olecular and Genetic B iology, S eoul N ational University †

D ivision of Cardiology, D epartm ent of M edicine, Chungnam N ational University ‡

B ackg round : T he purpose of this study was to compare gene expression among newly designedeukaryotic expression vectors, and to characterize the pattern of vascular endothelial growth

factor (VEGF ) expression using the most potent plasmids DNA vector .

Meth ods : After exposure of a beating rat heart (Sprague- Dawley, 250- 300g ), 5 different typesof plasmid DNA was injected directly into the myocardium . Reporter protein w as analyzed by ELISA

in the extracted heart .

Re s ult s : T he vector harboring cytomegalovirus (CMV) promoter and enhancer induced thestrongest expression of reporter gene (chloramphenicol acetyl transferase; CAT ) compared to those

of pC3.1, pEF 1a, RSV, pActin in the rat heart via direct injection of plasmid DNA into the apex

(p <0.001). Using pCN- CAT , gene expression showed a dose- dependent response over a range of0.3- 10 ㎍ . CAT expression could be detected up to 30 days after 10 ㎍ of pCN- CAT injection with

the maximal expression on day 5. In X- gal staining of injected pCN- lacZ gene, β- galactosidase w as

found only around the needle track in the apex. The expressed hVEGF 12 1 had biologic activity withvascular permeability assay (Miles assay ) in guinea pigs . After injection of pCN- hVEGF 12 1 into the

apex of the rat heart, the expression of VEGF protein w as dose- dependent over the range of 25 and

접 수 : 2000년 7월 25일

통 과 : 2000년 9월 6일

교신저자 : 김덕경, 서울특별시 강남구 일원동 50, 삼성서울병원 순환기내과, 심장혈관센터, 삼성생명과학연구소(135- 710)

E - m ail : dkkim @smc.samsung .co.kr

- 3 -

－ Korean Journal of Medicine : Vol. 60, No. 1, 2001 －

서 론

신혈관조성(新血管造成) 유전자 요법(angiogenic

gene therapy ) 은 혈관생성인자 (angiogenic factor )를

만드는 유전자를 허혈 부위에 투여하여 측부혈관의 형

성을 증진시킴으로서 허혈성 심질환을 치료하고자 하는

새로운 개념의 치료법이다. 이는 경피적 관동맥 성형술

이나 관동맥우회술 등의 관혈적 요법을 시행할 수 없고,

환자가 일반적인 약물요법에 반응하지 않을 때 시행할

수 있는 새로운 치료법으로 초기 연구에서 매우 희망적

인 연구 결과가 발표되고 있다1 - 4 ) . 유전자요법의 성패를

결정하는 가장 중요한 요인 중의 하나는 대상 질환에 적

합한 벡터의 선정이다 . 따라서 신혈관조성 유전자요법

의 성공을 위하여는 안전하면서도 심장에 유의한 수

준의 혈관생성인자 유전자 발현을 유도하는 벡터가

가장 중요하다 . 유전자 전달 plasmid의 유전자 발현

효율은 사용되는 프로모터 (prom oter )에 의하여 좌우

되는데 , 프로모터에는 바이러스 프로모터, 유핵세포 내

에 항상 유전자 발현을 유도하는 housekeeping 유전자

의 프로모터, 특정 조직에서의 유전자 발현을 결정하는

조직- 특이적 (tissue specific) 프로모터 등이 있다 . 또한

최근 intron 1에 enhancer 기능을 갖는 cis - acting

element들이 존재하여 프로모터의 기능을 강화시킨다는

보고들이 있다5 , 6 ) .

본 연구는 intron을 포함하는 다양한 프로모터를 갖는

서로 다른 plasmid를 이용하여 심근에서 프로모터에 따

른 유전자 발현 효율을 알아보고, 가장 높은 발현율을

보이는 벡터를 선정, 이를 이용하여 백서 심근에서의

reporter gene인 chloramphenicol acetyl transferase

(CAT )와 치료유전자인 hVEGF 12 1의 유전자 발현 양상

을 조사 비교하고자 하였다.

대 상 및 방 법

1. Plas mid 벡 터

pcDNA3.1- CAT , pCN- CAT , pCN- lacZ, pEF - CAT ,

pAct - CAT 벡터는 서울대 유전공학연구소 김선영 교수

로부터 공여 받았으며, pRSV- CAT은 Promega 회사로

부터 구입하였다 . pCN, pEF, pAct은 pcDNA3.1을

backbone으로 하여 프로모터 부위만 각각 다른 프로모

터로 치환한 벡터로서 pcDNA3.1은 587 bp CMV IE 프

로모터를 포함하며 Invitrogen 회사로부터 구입한 벡터

이다 . 이들 벡터의 프로모터 구조는 Figure 1과 같으며

제조 방법은 이전에 서술한 것과 같은 방법으로 제조되

었다7 ) . 간단히 요약하면 pcDNA3.1과 pCN은 바이러스

프로모터인 cytomegalovirus immediate early (CMV

IE) 유전자의 프로모터를 갖는 벡터이며, pRSV는 바이

러스 프로모터인 rous sarcome virus 유전자의 프로모

터를 갖는 벡터이고, pEF와 pAct은 housekeeping gene

인 elongation factor 1- alpha와 beta actin의 프로모터를

갖는 벡터이다. pCN은 pcDNA3.1에 비하여 CMV 프로

모터에 exon 1, intron 1, exon 2의 일부가 AT G 부위 직

전까지 삽입된 벡터이다. 또한 pEF와 pAct도 각각의

exon 1, intron 1, exon 2 일부를 포함하고 있다 .

2. 백 서 심 근 에 유 전 자 주 입

250- 300 gram의 생후 11- 14주 숫컷 Sprague-

Dawley rat을 사용하였다 . 에테르를 이용 유도 마취 후

Ketamine (유한양행 50 mg/ mL)과 Xylazine (바이엘코

리아 23.32 mg/ mL)을 3 : 17의 비율로 혼합한 용액을

0.5 mL 복강 내로 주입하였다. 기관지 삽관술 및 인공호

흡기 (Natume, Japan, model PT .2- 11622)를 유지한 상

태에서 흉골 좌측을 midline 절개 후 심첨부를 들어 올

500 ㎍. VEGF expression was detected up to 14 days with its peak on day 2 after injection of 250㎍ of pCN- hVEGF 12 1 . When plasmid was injected into the apex of the rat heart, the expression of

VEGF in the heart showed concentration gradient from the apex to the base. However, the

expression of CAT w as detected only in the apex.

Conclu s ion : Plasmids vector with hCMV IE promoter/ enhancer will provide clear advantages

over other previously developed plasmids and the information regarding the behaviors of VEGF

expression may be useful in angiogenic gene therapy of the heart .(Korean J Med 60:3- 15, 2001)

Key W ords : Gene therapy; Plasmids; Endothelial growth factors ; Promoter regions (Genetics)

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－ Jin- Ok Jeong, et al : Characteristics of gene transfer and VEGF expressionusing naked plasmid vectors in the rat heart －

린 상태에서 심첨부에 유전자를 주입하였다 . 유전자는

DNA purification kit (Qiagen 회사)을 이용하여 분리한

plasmid DNA가 총 용적이 50 μL가 되도록 생리식염수

로 희석하여 분주 후 29 gage 1 mL 인슐린 주사기를 이

용하여 needle 끝 부분 2 mm를 45° 각도로 굽힌 후 심

첨부에 서서히 주입하였다 . 유전자 주입 후 흉부 근육을

3- 0 black silk를 이용 연속봉합을 하여 흉곽을 닫았다.

시술 후 Cephalosporine sodium (Cefamezin, 동아제약

1.0 g/ vial) 0.1 g/ 1 mL normal saline을 우측 대퇴부에

근육 주사하였으며, 마취에서 깨어나면 인공호흡기와 기

관지 삽관을 제거 후 cage로 옮겨주었다 . 일정 시간 후

백서를 희생시키기 위하여 에테르 마취 후 복강을 절개

하고 하행대정맥을 짤라 실혈사 시킨 후 심장을 적출하

였다. 적출한 심장은 CAT ELISA, VEGF ELISA,

X- gal 염색 등에 사용되었다.

3 . CAT ELISA

적출한 심장을 ice- cold PBS로 씻은 후 전체 심장의

심첨부 1/ 3 부위를 잘라 2 mL의 CAT lysis buffer

(Boehringer Mannheim 회사제)에 넣은 후 얼음 위에서

homogenize한 후 4o C, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리

하여 조직부유액을 모았다 . 이 부유액을 1/ 100 희석 후

10 μL를 이용하여 Braford 용액 (Bio- Rad 회사제)으로

단백량을 정량하였고 CAT ELISA kit (Boehringer

Mannheim 회사제)을 이용하여 CAT의 양을 정량하였다.

4 . LacZ 유 전 자 발 현

적출한 심장을 ice- cold PBS로 씻은 후 전체 심장의

심첨부 1/ 3 부위를 잘라 tissue mold 에 넣은 후 O.C.T

용액 (Lipshow 회사제)을 mold 안에 기포가 생기지 않

도록 서서히 첨가시키고 - 70o C에서 냉동하였다 . 조직을

10 ㎛ 두께로 자른 후 ice- cold 4% paraformaldehyde 용

액 (pH 7.4, Sigma 회사제)에 5분간 고정하였다. 2 mM

MgCl2/ PBS 용액 (pH 7.4, Sigma 회사제)으로 세척한

후 X- gal 용액 (4 mM potassium ferricyanide, 4 mM

potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2 , 400 ㎍/ mL

X- Gal)으로 실온에서 4시간 동안 반응시켜 lacZ 유전자

가 발현되는 것을 확인한 후 eosin으로 대조염색하고

80% alcohol, 90% alcohol, 100% alcohol 탈수과정,

xylene으로 청명과정을 거쳐 cover glass로 봉합하였다 .

광학현미경 (Olymphus 회사제)으로 관찰한 후 40 배,

200 배에서 사진을 촬영하였다.

5. ACP-hVEGF12 1의 제 조

VEGF의 활성도와 신혈관조성능을 알아보기 위하여

adeno- associated virus의 IT R (inverted terminal

repeat)이 포함된 ACP 벡터의 EcoRI site에 PCR cloning

한 human VEGF 12 1 cDNA를 삽입하여 ACP- hVEGF 12 1

를 제조하였다.

6. Tra nsie nt tra nsfection과 세 포 배 양 액 의 VEGF

ELISA

293T 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)/ DMEM

(Gibco BRL 회사제) 배양액 하에서 6 well plate에 70%

가량 confluent하게 배양시켰다. T ransfection은 3 ㎍

ACP- hVEGF 12 1 DNA/ 200 μL serum free media

(OPTI- MEM, Gibco BRL 회사제)에 liposome인 FuGENE

6 (Roche 회사제) 9 μL를 한방울씩 떨어트려 혼합하고

10분간 반응시킨 후 세포의 배양액에 첨가하였다 . 6시간

후 세포를 10% FBS/ DMEM 배양액으로 교환 후 48시

간 후에 부유액을 모아 VEGF ELISA kit (R&D 회사제)

을 이용 발현량을 정량하였다.

7. Miles assay

Vascular permeability factor라고도 불리우는 VEGF

의 생물학적인 활성도는 Miles assay를 이용하여 조사

하였다. Male guinea pig (300- 450 g )의 등부위를 면도

후 제모 크림(니트, 일동제약)을 발라 털을 완전히 제거하

였다. Evans blue dye를 PBS로 0.5% (w/v)로 희석, 0.22

㎛ filter로 여과 후 1 mL을 대퇴정맥 (femoral vein)을 통

하여 주입하였다. 30분 후 ACP 및 ACP- hVEGF 12 1을

transfection 시킨 293T 세포주 배양액을 1 mL 인슐린

주사기를 이용 각기 100 μL씩 일정한 간격으로 피내

(intradermal) 주입하고 이어 주입부위에 evans blue

dye가 새어나와 형성되는 파란색 반점의 크기 및 진하

기를 비교하였다 .

8. 심 근 조 직 의 VEGF ELISA

CAT ELISA와 마찬가지 방법으로 심장을 적출하여

homogenize한 후 4o C, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리

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－ 대한내과학회지 : 제 60 권 제 1 호 통권 제 485 호 2001 －

하여 조직 부유액을 모았다. 이 부유액을 1/ 100 희석 후

10 μL를 이용하여 Braford 용액 (Bio- Rad 회사제)으로

단백량을 정량하였다. 200 μL의 조직 부유액 (calibrator

희석용액으로 1:1 희석)을 이용 VEGF의 양을 정량하였다.

10. 통 계 방 법

자료분석은 InStat program (version 2.02)을 이용하

여 명목척도는 Kruskal- Wallis test로 분석하였고, p값

이 0.05 이하인 경우 통계적 유의성을 인정하였고, 자료

는 평균 표준오차로 표시하였다.

결 과

1. 프 로 모 터 에 따 른 전 이 유 전 자 의 발 현 연 구

1) 백 서 심 근 에 서 프 로 모 터 에 따 른 CAT 유 전 자 발 현

비 교

각각의 프로모터에 따른 유전자 발현의 차이를 알기 위

해 총 56마리의 백서를 이용해 실험하였다. pcDNA3.1-

CAT , pCN- CAT은 15마리씩, pRSV- CAT , pEF - CAT

은 9마리씩, pAct - CAT은 8마리에서 plasmid DNA 30

㎍을 백서 심근에 주입하였다. 3일 후 심장을 적출하여

CAT 유전자를 ELISA 방법으로 정량하였다. 프로모터

의 종류에 따른 CAT 유전자의 발현은 pCN- CAT를 주

입한 심장에서의 CAT 발현이 1856.7 287.1 pg/ mg으로

가장 높았고, pcDNA3.1- CAT에서 256.0 28.1 pg/ mg,

pRSV- CAT에서 227.5 30.6 pg/ mg, pEF - CAT에서

328.6 72.4 pg/ mg, pAct - CAT에서 160.6 35.7 pg/ mg

의 CAT 단백질이 검출되었다 (Figure 2). pCN 벡터에

의한 CAT의 발현은 pcDNA3.1, pRSV, pAct와 비교하

였을 때 (p <0.001), pEF와 비교하였을 때 (p <0.01) 모두

유의한 차이를 보였다 . pcDNA3.1과 pRSV, pEF, pAct

네가지 프로모터 사이에서 CAT 유전자 발현의 유의한

차이는 없었다. CMV 프로모터에 추가적으로 intron 1

첨부된 pCN- CAT은 pcDNA3.1- CAT에 비해 7.3배 유

전자 발현이 증가되어 다른 어떤 프로모터보다 강력하

였다 .

2) pCN-CAT 유 전 자 발 현 의 dose, time-res ponse

curve

pCN- CAT DNA를 농도별로 각각 세 마리의 백서 심

첨부에 주입하였다. 3일 후 심장을 적출하여 총 단백질

을 추출하여 CAT에 대한 ELISA를 수행하였다 . pCN-

CAT은 0.3 ㎍에서 10 ㎍까지 농도에 비례하여 유전자

발현이 증가하였으나 10 ㎍에서 30 ㎍ 사이에는 약간 증

가하는 양상의 plateau를 보였고, 그 이상의 농도에서는

오히려 감소하였다 (Figure 3A).

Fig ure 1 . Structure of plasmid vectors . Arrow s indicatedirection of transcription . pcDNA3.1 contains hCMVpromoter (Invitrogen Inc.). pCN contains hCMV promoter,exon 1, intron 1 and partial exon 2. pRSV contains RSVpromoter . pEF contains elongation factor 1- α promoter,ex on 1, intron 1 and partial ex on 2. pAct contains betaactin prom oter, ex on 1, intron 1 and partial ex on 2.hCMV, hum an cytomeg alovirus ; RSV, rous sarcom avirus

Figure 2 . Comparison of chloroampenicol acetyltransferaseexpression level among different promoters of plasmidDNA in the rat heart . Each 30 ㎍ pDNA w as directlyinjected into the apex with pcDNA3.1 (n=15), pCN(n=15), pRSV (n=9), pEF (n=9) and pAct (n=8). CATassay was done by ELISA with extracted heart at 3 daysafter plasmid injection. The level of CAT geneexpression using pCN was significantly higher thanthose of other promoters (* p <0.001). Values are mean±S.E.M.

- 6 -

－ 정진옥 외 11인 : 백서 심근에서 plasmid 벡터를 이용한 유전자 전달 및 VEGF 유전자 발현의 특성 －

F ig ure 4 . Histochemical analysis of β- galactosidase expression in the rat heart, five days after directinjection of 10 ㎍ of pCN- lacZ DNA. Dark blue staining indicates active expression of β- galactosidase.A . Expression of pCN- lacZ: β- galactosidase could be detected around the needle track in the apex(original magnification ×40). B. Expression of pCN- lacZ and infiltration of inflammatory cells (originalmagnification ×200). C. Expression of pCN- lacZ purified with endotoxin- free column: β- galactosidasew as expressed and the degree of infiltration of inflammatory cells w as similar to the one with plasmidswithout purification of endotoxin (original magnification ×200).

pCN- CAT DNA 10 ㎍를 시간에 따라 세 마리의 백

서 심첨부에 주입한 뒤 같은 방법을 이용하여 유전자 발

현의 시간 과정을 살펴보았다. 백서 심근에서 CAT 유전

자 발현은 주입 5일 후에 최고치를 보였고 이후 서서히

감소하여 30일 후까지도 관찰되었다 (Figure 3B).

3) LacZ 유 전 자 발 현

pCN- lacZ DNA 10 ㎍을 심첨부에 주입하고, 5일 후

심장을 적출하여 냉동절편을 얻어 X- gal 염색을 하였다.

Cytoplasmic lacZ 유전자 발현에 의하여 심근세포가 푸

른색으로 염색됨을 관찰 할 수 있었으며, 유전자의 발현

은 주입한 부위 (needle injection)에서만 국소적으로 관

찰되었다 (Figure 4A). - galactosidase가 발현되는 심

근세포 주위로 염증세포의 침윤을 관찰되었다 (Figure

4B). 많은 양의 염증세포 침윤이 E- coli의 endotoxin이

contamination되어 생겼는지를 알기 위해, endotoxin-

free column을 이용하여 DNA를 정제 후 실험을 다시

시행하였다. Endotoxin- free column을 이용한 실험에서

도 마찬가지로 - galactosidase가 발현되는 심근세포 주

위로 비슷한 정도의 염증세포 침윤을 관찰되었다

Fig ure 3 . A. Dose- response of the injected pCN- CAT expression in the rat heart (3 rats for eachgroup). CAT assay w as done by ELISA with extracted heart in 3 days after direct injection ofpDNA into the rat heart . There was a dose- responsive relation from 0.3 to 10 ㎍, then plateaued,followed by decrease of gene expression in higher doses. Values are mean±S.E.M. B.Time- response of the injected pCN- CAT expression in the rat heart (3 rats for each group). CATassay w as done by ELISA with extracted heart after direct injection of 10 ㎍ of pCN- CAT . CATexpression w as detected at 1, 3, 5, 7, 14, 30 days after injection with maximal expression at 5th day.Values are mean±S.E .M.

- 7 -

－ Korean Journal of Medicine : Vol. 60, No. 1, 2001 －

(Figure 4C).

2. VEGF의 생 물 학 적 활 성 도 및 발 현 특 성

1) ACP-hVEGF1 2 1로 부 터 VEGF 생 산 확 인

ACP- hVEGF 12 1로부터 VEGF가 생성되는지의 여부

를 조사하기 위해 293T 세포주에 ACP- hVEGF 12 1를

FuGENE 6을 이용하여 transient transfection시키고, 세

포배양액으로 분비되는 VEGF의 양을 ELISA로 측정하

였다. Negative control (ACP transfection)에 비하여

ACP- hVEGF 12 1 transfection 후 많은 양의 VEGF가 생

산됨을 확인할 수 있었다(2.9±0.8 ng/ mL versus 62.7±

7.5 ng/ mL p <0.001).

2) 생 산 된 hVEGF1 2 1의 생 물 학 적 활 성 도 검 증 (Miles

permeability assay)

ACP- hVEGF 12 1로부터 얻어지는 VEGF가 실제로 생

물학적인 활성도를 지니는 지를 조사하기 위해 guinea

pig의 혈액 내로 evans blue dye를 주입시킨 뒤 위에서

얻은 세포배양액을 guinea pig의 등 부위에 피하 주사하

여 형성되는 파란색 반점을 관찰하였다 . 그 결과 주입한

VEGF 단백의 양에 비례하여 파란색 반점의 크기와 진

한 정도가 비례하였고, hVEGF 12 1 유전자를 transfection

시킨 세포 배양액에 의하여 permeability가 증가되어 파

란색 반점이 생김을 관찰할 수 있어 클로닝한 hVEGF 12 1

이 생물학적인 활성도가 있는 VEGF 단백을 생산함을

확인할 수 있었고, 같이 실험한 ACP- mVEGF 12 0도 생물

학적인 활성도가 있었다 (Figure 5).

3) pCN-hVEGF12 1을 이 용 한 백 서 심 근 에 서 dose,

time-res ponse curve

Fig ure 5 . Miles assay of VEGF . Biologic activity ofVEGF 12 1 w as demonstr ated w ith vascular permeabilityassay in guinea pig . Intr avenous injection of Evansblue dye via femoral vein follow ed by intr aderm alinjection of standard proteins or supernatant of A CP -hVEGF 12 1 t ansfected 293T cells . T here w ere blue dotsaround intraderm al injection site show ed extravas ationof evans blue dye due to increased vascular permeability ofVEGF . Left lane w as recombinant murine VEGFpeptide as standard (ST D). Dot size and intent sity ofdeep blue color w ere VEGF dose- dependent . Rightlanes show ed larger deep blue dot s around intraderm alinjection of ACP - hVEGF 12 1 and ACP - mVEGF 12 0

conditioned media than ACP conditioned media as anegative control.

Fig ure 6 . A. Dose- response of pCN- hVEGF 12 1 expression. Each pDNA w as directly injected inthe rat heart, where n=3 for each group. VEGF ELISA assay w as done 2 days after injection .Expression of VEGF w as dose- dependent from 25 to 500 ㎍ of pCN- hVEGF 12 1 DNA injection .Values are mean±S.E .M. B. Time- response of pCN- hVEGF 12 1 expression after injection of 250 ㎍pCN- hVEGF 12 1 in the rat heart, where n=3 for each group. VEGF expression could be detectedfrom 1 days upto 14 days after injection with maximal expression on day 2. Values are mean±S.E .M.

- 8 -

－ Jin- Ok Jeong, et al : Characteristics of gene transfer and VEGF expressionusing naked plasmid vectors in the rat heart －

ACP- hVEGF 12 1의 hVEGF 12 1 c DNA를 pCN벡터에

삽입하여 pCN- hVEGF 12 1를 제작한 후 농도별로 세 마

리씩 백서 심첨부에 주입하였다 . 2일 후에 심장을 적출

하고 총 단백질을 추출하여 VEGF의 양을 ELISA로 측

정하였다. VEGF 단백의 양은 주입한 DNA 농도에 비례

하여 증가하였다 (Figure 6A).

pCN- hVEGF 12 1 250 ㎍을 백서 심근에 주입 후 시간

에 따른 유전자 발현 과정을 살펴보았다. VEGF의 발현

은 주입 후 2일째에 최고치였으며 14일 후에도 VEGF

단백이 검출되었다 (Figure 6B).

4) pCN-hVEGF12 1을 이 용 한 백 서 심 근 에 서 부 위 에 따

른 VEGF 단 백 양 비 교

심장에서 측정한 VEGF의 양은 10 pg/ mg 이하로 같

은 프로모터를 가진 pCN의 CAT 단백질의 발현양 1,800

pg/ mg보다 현저히 낮았다. 이는 VEGF의 반감기가 약 1

분으로 매우 짧고, VEGF 12 1은 heparin- binding domain

이 없어 세포외기질에 부착되지 않고 자유롭게 확산되

기 때문에, 심장에서 발현된 VEGF가 빠른 시간 내에 확

산되어 적출한 심장에서는 낮게 측정되는 것으로 생각

되었다 . 따라서 심첨부에 주입한 plasmid DNA에 의한

VEGF와 CAT의 생산이 주입된 심첨부로부터 심장 내

에서 농도 경사가 있는지 알아보기 위하여, 백서 심첨부

에 pCN- hVEGF 12 1 250 ㎍ (n=6) 혹은 pCN- CAT 10 ㎍

(n=3)을 주입하였다 . VEGF는 2일 후, CAT은 3일 후 심

장을 적출하여 4부위로 나누고 각각의 VEGF, CAT 단

백양을 심첨부의 단백양과 비교하였다. 측정된 CAT 단

백은 심첨부에서 6264.2 1226.3 pg/ mg으로 가장 높았

고, 심첨부에서 멀어질수록 0.9 0.2 pg/ mg, 1.0 0.3

pg/ mg, 0.7 0.1 pg/ mg으로 plasmid DNA가 주입된 심첨

부에서만 검출되었다(Figure 7A). 측정된 VEGF 단백은

심첨부에서 26.3 5.2 pg/mg으로 가장 높았고, 심첨부에

서 멀어질수록 11.7 1.3 pg/ mg, 12.2 1.5 pg/ mg, 6.8

0.8 pg/mg으로서 VEGF 단백양이 감소하기는 하였으나

plasmid DNA가 주입된 심첨부 이외에도 기저부까지 심

장 전체에 VEGF가 확산되어 검출되었다 (Figure 7B).

고 찰

1. 심 근 내 유 전 자 전 달

심장에 유전자를 전달하는 방법은 크게 바이러스 벡

터와 비바이러스 벡터 두 가지 방법이 있다. 바이러스

벡터는 retrovirus, adenovirus, adenoassociated virus

등이 있는데, 이중 retrovirus는 조작이 매우 용이하여

만들기가 쉽고 숙주세포 유전자에 삽입되어 오랫동안

안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 장점이 있어, 현

재까지 인체 유전자요법에서 가장 널리 쓰이는 벡터이

다. 그러나 심근세포와 같이 최종 분화되어 분열하지 않

는 세포에서의 in vivo 유전자 전달은 1% 미만으로 유전

자 전달효율이 매우 낮으며8 - 10 ), 심근 손상 부위에 형성

되는 육아 조직 (granulation tissue)의 경우 섬유아세포

의 약 14%에만 유전자가 전달됨이 알려져 있다11 ) . Ade-

novirus는 비분열 세포에도 높은 유전자 전달효율을 보

이므로 심장을 대상으로한 유전자요법 시험에 가장 많이

이용된 벡터인데, adenovirus는 백서 심근에서 유전자 발

현이 plasmid DNA보다 6- 7배 더 높게 발현된다12 , 13 ) . 또

adenovirus를 토끼의 관동맥 내로 지속적으로 관류시키

면 거의 100%의 심근 세포에서 lacZ 유전자가 발현됨이

알려져 있고14 ), adenovirus 벡터를 rabbit의 관동맥으로

한 차례 정주하였을 때 유전자는 관동맥 외 주위 심근에

서도 발현되었고, 유전자 발현 정도는 plasmid DNA 벡

터보다 약 50배에 이른다15 ) . 이와 같이 adenovirus 벡터

F ig ure 7 . Spatial distribution of protein produced bygene injection . A. Spatial distribution of CAT proteinafter a single injection of pCN- CAT 10 ㎍ in the apex ofthe rat heart . T hree hearts at day 3 after injection wereanalyzed. CAT protein w as detected only in the apex .Values are mean±S.E .M. B. Spatial distribution of VEGFprotein after a single injection of pCN- hVEGF 12 1 250 ㎍in the apex of the rat heart . Six hearts at second dayafter injection were analyzed. Concentration gradient ofVEGF protein w as noted from the apex to the base.Values are mean±S.E .M.

- 9 -

－ 대한내과학회지 : 제 60 권 제 1 호 통권 제 485 호 2001 －

는 심근세포로 유전자를 전달하는데 효율성이 높지만

생성되는 adenovirus 단백에 의하여 immunogenicity가

있어 이로 인한 독성 반응 및 염증을 유발하고, 심근에

서의 유전자 발현이 2주 정도로 일시적이다13 ) . 최근 선

천성 대사질환인 ornithine transcarbamylase 결핍 환자

에게 높은 농도의 adenovirus를 간에 주입한 인체 유전

자요법에서 심한 간 손상으로 환자가 사망하여 아직까

지는 adenovirus의 안전성에 대한 더 많은 연구가 필요

하다. 또한 adenovirus가 염증반응을 일으킬 경우 염증

반응 자체가 신혈관조성을 촉진 시킬 수 있어 임상시험

과 같이 negative control 벡터를 사용할 수 없는 경우

그 치료효과가 신혈관조성인자의 형성에 의한 것인지,

adenovirus에 의한 염증반응에 의한 것인지 구별하기가

힘들다 . 따라서 adenovirus는 신혈관조성 유전자요법의

적절한 유전자 전달 벡터가 아닌 것으로 생각된다.

Adeno- associated virus는 심장과 같이 분열하지 않는

세포에도 감염이 가능하며 면역반응이 거의 없고, 물리

적 안정성, 비병원성, 장기간의 유전자 발현으로 심장으

로의 유전자 전달에 유용하게 쓰일 것으로 예측되나, 그

제조과정이 매우 까다로워 인체시험을 위한 다량의 바

이러스의 제조가 어렵다는 단점이 있다 .

2. 유 전 자 전 달 벡 터 로 서 na ked DNA의 장 단 점

위와 같이 바이러스 벡터가 심근으로 유전자를 전달

하는데 여러 가지 문제점들이 있어 최근 naked DNA가

심장의 유전자전달 벡터로 각광을 받고 있다 . Naked

DNA는 안전하며, 비분열 세포에 감염이 가능하고, 항원

성이 없고, 제작 및 제조가 간편하고, 생산 단가가 높지

않아 실제 임상시험에 적용하기 가장 용이한 벡터이지

만 그 발현 효율이 낮고 유전자 발현 기간이 짧다는 단

점이 있다. 그러나 허혈성 심질환의 유전자요법에 있어

서 naked DNA는 다른 장기의 다른 질환에 비하여 여러

가지 추가적인 장점이 있다. 첫째, 일반적으로 다른 장기

에서는 유전자 발현이 극도로 낮아 사용되지 않는

naked DNA가 횡문근(striated muscle)인 심장과 골격

근에서는 치료효과를 나타낼 수 있는 정도의 유의하게

높은 양과 장시간 유전자 발현이 가능하다 . Naked DNA

에 의한 생쥐의 골격근과 백서 심근에서의 유전자 발현

이 8주까지 지속됨이 보고되었고16 ), 유전자 발현율도 백

서의 경우 심근에서 골격근의 약 50배에 달함이 알려져

있다17 , 18 ) . 둘째, naked DNA는 골격근의 경우 허혈 상황

에서 오히려 유전자 발현이 증가됨이 보고되어 있다19 ) .

셋째, 허혈 상태에서는 혈관생성인자들의 수용체가 저산

소증 (hypoxia)에 의하여 upregulation 되어2 0 ) 낮은 양의

단백에 의하여도 그 효과가 증폭되므로 비록 유전자 전

달 효율이 낮아도 유의한 치료 효과를 이룰 수 있다. 넷

째, 백서를 이용한 동물 모델에서 retovirus를 이용 지속

적인 VEGF 유전자 발현이 국소적으로 혈관종

(angioma- like lesion)을 형성하므로2 1 ), 유전자 발현 안

정성의 측면에서 신혈관조성 치료법은 그 성격상 수년

간의 지속적인 혈관생성인자의 발현보다는 수주간의 발

현이 더 안전할 것이라는 점이다. 또한 신혈관조성에 의

하여 일단 생성된 측부혈관은 혈류가 흐르게 되면 w all

tension으로 인하여 더 이상 혈관생성인자가 존재하지

않더라도 퇴화되지 않을 것으로 추정되므로 naked

DNA의 단기간의 유전자 발현이 장점이 될 수 있다 .

Naked DNA의 이런 모든 특성은 naked DNA가 신혈관

조성 유전자요법에 가장 안전하면서도 이상적인 벡터임

을 반증한다. 이는 이미 동물실험과 인체시험에서 naked

DNA를 주입하여 낮은 레벨의 유전자 발현으로도 허혈

증상을 개선시킴으로 입증되어 있다1- 3 ) .

그러나 유전자요법이 성공하기 위하여는 낮은 유전자

전달 효율을 높일 수 있는 강력한 발현 벡터의 개발이

필요하다 . 강력한 벡터는 더 적은 용량의 plasmid로 높

은 발현율을 보이므로, 많은 양의 DNA를 생산하는데

드는 비용을 낮추고, 유전자 투여 간격을 늦출 수 있으

며, 한 번에 여러 군데 주입하지 않아도 치료단백 생산

효율을 높여 치료 효과를 극대화할 수 있다는 점에서 강

력한 발현 벡터의 개발은 신혈관조성 유전자요법에 필

수적이다 .

3 . Na ked DNA의 유 전 자 전 달 효 율 을 증 가 시 키 기

위 한 프 로 모 터 의 변 형

본 연구는 naked DNA의 유전자 발현 효율을 결정하

는 여러 가지 프로모터를 갖는 유핵세포 발현 벡터를 제

조하여 in vivo 심근에서 프로모터에 따른 유전자 발현

효율을 알아보고자 하였는데, reporter gene인 CAT을

이용한 유전자 발현 비교는 pCN > > pEF > pcDNA3.1

> pRSV > pAct의 순이었으며 통계적으로는 pCN이 다

른 벡터들에 비하여 CAT 단백의 생성이 유의하게 높았

다. pcDNA3.1 벡터는 Invitrogen 회사에서 시판하고 있

- 10 -

－ 정진옥 외 11인 : 백서 심근에서 plasmid 벡터를 이용한 유전자 전달 및 VEGF 유전자 발현의 특성 －

으며, 현재 구입이 가능한 벡터 중에는 유전자 전달효율

이 높아 가장 널리 쓰이는 벡터이고, Isner 등이 인체시

험에 사용한 것과 유사한 벡터이다. 본 연구에서 pCN은

pcDNA3.1에 비하여 7.3배의 강력한 유전자 발현 효율을

보였다 .

심근에서의 유핵 발현 벡터 프로모터의 세기를 비교

한 보고는 많지 않다. Buttrick 등2 2 )은 adult female

Wistar rats의 심첨부에 서로 다른 프로모터를 갖는 100

㎍의 naked DNA를 주입 후 luciferase reporter 유전자

의 발현 효율을 비교하였다 . 사용한 프로모터는 바이러

스 프로모터인 RSV, 심장 특이적 프로모터인 α

- myosin heavy chain (αMHC) 프로모터와 간 특이적

프로모터인 α1- antitrypsin 프로모터로서 발현율은

RSV >> αMHC > α1- antitrypsin 프로모터 순이었으

며, RSV가 αMHC에 비하여 20배 강력하였다. 따라서

기존의 실험 결과에 의하면 RSV 프로모터가 심근에서

사용된 프로모터로서는 가장 강력한 프로모터이다.

본 연구에 사용된 pCN, pcDNA3.1, pRSV, pEF, pAct

벡터 등이 심근에서의 유전자 발현에 대하여 비교 연구

된 바는 없다 . 그러나 일반적으로 CMV IE 프로모터는

다른 바이러스 프로모터보다 강력한 것으로 알려져 있

는데 Overell 등2 3 )은 primary B lympocytes에서

CMV- IE는 Moloney murine leukemia virus long

terminal repeat (MoMLV LT R)나 SV40 early region 프

로모터보다 reporter gene인 CAT의 발현이 높다고 보

고하였고, Hippenmeyer 등2 4 )도 quail cell에서 SV40

early, mouse metallothionein I, CMV- IE 프로모터중

CMV 프로모터가 가장 강력하다고 보고하였다. 본 연구

에서 pcDNA3.1과 pRSV는 CAT 단백 발현에 큰 차이가

없었다 . 따라서 심장에서 CMV 프로모터는 기존에 심장

에서 강력하다고 알려진 RSV 프로모터와 유전자 발현

세기가 유사한 것으로 생각된다.

EF - 1α 단백은 진핵세포의 가장 풍부한 단백의 하나

로서 human EF - 1α 유전자의 프로모터는 다양한 세포

에서 강한 프로모터 기능이 있음이 알려져 있다 . 또한

intron 1에 Sp1, Ap1 결합 부위가 있어 프로모터 활성을

증진시킴이 알려져 있다. 본 연구에 사용된 pEF 벡터의

프로모터도 intron 1을 포함한 구조를 갖고 있으며

Nagata 등이 보고한 강력한 발현 벡터인 pEF321과 유

사한 구조를 갖고 있다5 , 6 ) . 본 연구 결과에 의하면 pEF

프로모터는 심근에서는 CMV 프로모터와 유사한 정도

의 유전자 발현을 확인하였다.

Beta actin 단백은 housekeeping gene으로서 모든 진

핵세포에 거의 일정한 양의 단백이 존재한다. Beta actin

의 프로모터에 대하여는 자세히 연구된 바가 없으나, 본

연구 결과에 의하면 심근에서는 다른 바이러스 프로모

터보다 약한 유전자 발현을 보였다 .

본 연구에서 가장 강력한 프로모터 기능을 갖는 pCN

벡터는 CMV IE 프로모터에 추가로 exon 1, intron 1,

exon 2의 일부가 결합된 벡터이다 . CMV 프로모터 역시

EF 1- α 유전자와 같이 AT G site 앞의 5' - untranslated

region이 프로모터의 기능을 증진시키는 것으로 보고되

어 있다. Simari 등2 5 )은 혈관 평활근 세포에서 human

CMV IE 유전자의 프로모터에 CMV 유전자의

5' - untranslated sequence의 exon 1과 intron 1를 추가

할 경우 유전자 발현이 5.7배 증가하며, 같은 부위를

RSV 프로모터에 추가하였을 경우 유전자 발현이 10.3배

증가하여 이 부위에 인핸서 (enahncer) 기능이 있음을

보고하였다. 본 연구에서 pCN은 pcDNA3.1에 비하여 유

전자 발현이 7.3배 증가하여 평활근세포에서의 발현 증

가율과 유사하였다. 결론적으로 본 연구에서 다양한 프

로모터들을 심근에서 비교 연구한 바 심근에서도

CMV- IE 프로모터/ 인핸서(즉, exon 1, intron 1의 추가)

를 갖는 벡터가 유전자 발현율이 가장 강력함을 알 수

있었다.

4 . 심 근 에 서 na ked DNA 주 입 에 의 한 CAT 발 현 의

dose, time-response

본 실험에서 pCN- CAT의 유전자 발현은 0.3- 10 ㎍까

지는 농도에 비례하여 증가하였으나 10- 30 ㎍ 사이 농

도에서는 약간 증가하는 양상의 plateau를 보였고, 더 높

은 농도에서는 오히려 유전자 발현이 감소하는 소견을

보였다. 기존의 보고에 의하면 Li 등2 6 )은 CD1 생쥐에서

심장에 직접 RSV 혹은 rat α- MHC 프로모터를 갖는

naked plasmid DNA를 주입한 후 luciferase activity를

측정하여 유전자 발현의 정도를 보았는데, RSVluc가 0.3

㎍에서 3 ㎍까지 농도에 비례하여 증가하는 반응을 보였

고 그 이상의 농도에서는 plateau를 이룬다고 보고하였

다. 본 연구와 같이 높은 발현율을 갖는 고농도의 벡터

를 이용하여 백서의 심장에서의 CAT 유전자 발현에 대

한 보고는 아직 없다 . 본 연구에서 100 ㎍ 이상의 고 농

도에서 유전자 발현이 오히려 감소하였는데 이러한 현

- 11 -

－ Korean Journal of Medicine : Vol. 60, No. 1, 2001 －

상은 다른 실험에서도 관찰된 바 있다 . Heller 등2 7 )은 백

서 간에 electroporation에 의한 luciferase 혹은

- galactosidase 유전자를 주입 시 naked DNA의 농도

25 ㎍까지는 유전자 발현이 증가하였으나, 그 이상 50

㎍에서 500 ㎍사이의 농도에서는 유전자 발현이 감소함

을 보고하였으며, Harsdorf 등2 8 )은 개의 심근에 mouse

sarcoma virus- CAT 유전자를 주입 시 CAT 유전자 발

현이 10 ㎍에서 200 ㎍까지 비례하고 300 ㎍으로 갈수록

감소함을 보고하였는데, 이는 세포 내에 축적되는 고농

도의 reporter gene 단백이 유전자의 발현을 억제하기

때문일 것으로 생각된다 . 또한 본 연구에 사용한

pCN- hVEGF 12 1 벡터의 경우 VEGF 발현양이 500 ㎍까

지 농도에 비례하여 증가하므로, 생성되는 단백의 종류

와 축적되는 단백의 양에 의하여 유전자 발현이 영향을

받는 것으로 생각된다 .

본 연구에서 pCN- CAT 10 ㎍을 심첨부에 주입하였

을 때 5일에 최고치에 도달하였고, 이후 서서히 감소하

여 관찰 마지막인 30일까지도 발현되었다 . Li 등2 6 )은

CD1 생쥐에서 심장에 직접 RSV 혹은 rat α- MHC 프

로모터를 갖는 naked plasmid DNA를 주입한 후

luciferase activity를 측정한 결과 luciferase가 1주에 최

고치에 도달하였고, Lin 등18 )은 in vivo로 생후 6- 11주

Sprague- Dawley 백서 심근에 RSV프로모터를 이용한

100 ㎍의 - galactosidase plasmid DNA를 직접 주입하

여 유전자가 4주까지도 발현됨을 보고하였다. Buttrick

등2 2 )은 pRSV- CAT과 pRSV- Luc naked DNA 100 ㎍를

Wistar rat 심근에 주입한 결과 CAT 또는 luciferase 활

성도를 검출할 수 있는 경우가, 유전자 주입 후 1일에서

7일 사이에는 100%, 17일에서 23일 사이에는 60%, 38일

에서 60일 사이에는 30%이었으며, 최고 농도는 7- 10일

로 시간이 지나면서 감소하였다고 보고하였다. 따라서

본 연구에서 pCN- CAT의 시간- 반응 발현 양상은 기존

의 심근에서 naked DNA를 이용한 유전자전달 요법의

다른 결과와 유사하며 벡터가 강력하여 유전자 발현이

증가하여도 유전자 발현의 기간이 증가하지는 않음을

알 수 있었다 .

5. 유 전 자 발 현 범 위

본 연구에서 심근 내 유전자 주입 후 유전자의 발현

범위는 주입한 주위에 매우 국소적임을 관찰하였다. Li

등2 6 )은 naked DNA를 직접 심근에 주사바늘로 주입 시

유전자의 발현은 주입한 부위 1- 2 mm에 국한됨을 보고

한 바 있는데, 생쥐 심근에서 luciferase의 발현을 통해

유전자 발현은 좌심실에 국한되며 우심실 혹은 심방, 심

중격 (septum) 등에서는 유전자 발현을 관찰할 수 없었

고, c- myc 유전자 주입 후 myc- specific monoclonal

antibody를 이용한 면역조직학 검사에서 c- myc의 발현

은 좌심실중에서도 특히 바늘로 주입한 부위에 국한됨

을 관찰하였다. Buttrick 등2 2 )도 Wister rat 심첨부에

pRSVluc을 주입 5일 후 확인한 유전자 발현이 주입한

부위 1- 2 mm에 국한됨을 보고하였다 . 마찬가지로 Lin

등18 )은 pRSV - galactosidase를 Sprague- Dawley rat

심근에 주입 후 - galactosidase 유전자 발현이 주입 부

위에 국한되고 그 주위로 많은 양의 염증세포 침윤이 관

찰됨을 보고하였다 . 본 실험에서도 - galactosidase 유

전자 발현 주위로 많은 양의 염증세포 침윤이 관찰되었

는데 이는 첫째, naked DNA 자체에 의한 염증반응일

수 있으나 일반적으로 naked DNA 자체는 항원성이 거

의 없음이 이미 잘 알려져 있다 . 둘째, Quiagen을 이용

한 DNA의 purification에서 E. coli의 endotoxin 등이 완

전히 제거되지 않을 수 있어서 이에 의한 염증반응일 가

능성인데, 실제 endotoxin- free column을 이용하여

DNA를 정제 후 심근에 주입한 결과 역시 많은 양의 염

증세포가 관찰되어 endotoxin으로 인한 염증세포의 침

윤이 아님을 알 수 있었다. 셋째, E- coli의 단백인

- galactosidase가 백서 심장 내에서 항원 반응을 일으켰

을 가능성으로 이는 다른 실험에서도 보고된 바 있으며,

lacZ 유전자의 전달만으로도 암의 크기가 줄어듬이 보고

되어 있다 . 따라서 본 연구에서 관찰된 심근의 염증반응

은 - galactosidase 단백 그 자체가 면역 반응을 유발하

여 염증세포의 침윤을 일으킨 것으로 생각된다. 또한

VEGF 유전자를 골격근 내에 전달 후 조직의 어떤 이상

반응도 관찰할 수 없음이 보고되어 있어1), 실제 VEGF

를 이용한 naked DNA의 투여에서는 문제가 되지 않을

것으로 생각된다 .

6. CAT 유 전자 와 VEGF 유 전자 의 발 현 양 상의 차 이

본 연구에서 pCN- hVEGF 12 1 naked plasmid를 심근

에 주입하여 얻은 VEGF 검출량은 최대 12.4 1.2

pg/ mg으로서 pCN- CAT을 백서의 심장에 주입한 후 검

출되었던 최대 CAT 단백양인 약 1856.7 287.1 pg/ mg

보다 훨씬 낮았으며, time- response 연구에서도 VEGF

- 12 -

－ Jin- Ok Jeong, et al : Characteristics of gene transfer and VEGF expressionusing naked plasmid vectors in the rat heart －

의 발현이 최고로 도달하는 시간은 2일로서 CAT 유전

자의 5일에 비하여 짧았다 . 이는 CAT이 세포 내에 존재

하는 단백으로 세포 밖으로 분비되지 않으며, 매우 안정

적이어서 비록 유전자의 발현이 감소하여도 형성된 단

백은 계속 조직 내에 존재하기 때문으로 생각된다. 그러

나, VEGF는 반감기가 약 1분으로 매우 짧고, VEGF 12 1

은 heparin- binding domain이 없어 세포외 기질에 부착

되지 않고 자유롭게 확산되기 때문에, 심장과 같이 확산

되어 체내로 방출되는 장기에서의 일정 시간에 심장 내

에 잔류하고 있는 VEGF의 농도는 매우 낮을 것으로 생

각된다 . 이런 특성은 본 연구에서 pCN- lacZ 주입 시

LacZ 유전자의 발현이 주입 부위에 국한되어 있고,

pCN- CAT 주입시 CAT 단백의 발현이 plasmid DNA가

주입된 심첨부에서만 검출된 것과 달리 VEGF의 경우

주입된 심첨부 이외에도 기저부까지 전부 VEGF가 확산

되어 검출되는 점에서도 잘 나타난다 . 따라서 hVEGF12 1

유전자를 비록 국소적으로 투여하더라도 그 치료효과는

전체 심장에 미칠 수 있음을 확인하였다. 실제로 pCN 벡

터의 mRNA level에서 유전자 발현 기간은 pCN- CAT보

다는 pCN-hVEGF12 1 유전자를 이용한 실험에서의 VEGF

단백의 time- response와 유사할 것으로 생각되며,

RT - PCR 등을 이용하여 mRNA의 발현 여부를 정량적으

로 측정하면 좀 더 정확한 naked DNA 자체의 발현 안정

성을 알 수 있을 것으로 생각된다.

요 약

목 적 : 본 연구는 intron을 포함하는 다양한 프로모터

를 갖는 서로 다른 plasmid를 이용하여 심근에서 프로모

터에 따른 유전자 발현 효율을 알아보고, 가장 높은 발

현율을 보이는 벡터를 선정, 이를 이용하여 백서 심근에

서의 reporter gene인 chloramphenicol acetyl transferase

(CAT )와 치료유전자인 hVEGF 12 1의 유전자 발현 양상

을 조사 비교하고자 하였다.

방 법 : 250- 300 gram의 생후 11- 14주 숫컷 Sprague-

Dawley rat을 이용하여 개흉술 후 심첨부에 직접

plasmid DNA를 주입한 후 유전자 발현양상을 조사 비

교하였다.

결 과 : 첫째, 백서 심근에서 hCMV IE 프로모터와

intron 1을 포함하는 pCN 벡터에 의한 유전자전달은 다

른 프로모터를 가진 벡터들에 비하여 유의하게 높았다.

둘째, pCN- CAT을 이용한 실험에서 reporter gene인

CAT은 10 ㎍까지 농도에 따라 유전자 발현이 증가하였

고, 5일에 최고로 발현되었으며 30일까지도 유전자 발현

을 확인할 수 있었다. 셋째, hVEGF 12 1 cDNA로부터 만

들어진 VEGF 단백은 vascular permeability를 증가시켜

생물학적으로 활성도가 있음을 알 수 있었다. 넷째,

pCN- hVEGF 12 1를 이용한 실험에서 심근 내 VEGF의 발

현은 plasmid 농도 500 ㎍까지 증가하였고, 주입 2일 후

최고치에 도달한 후 감소하였으나, 14일에도 심근에서

검출되었다. 다섯째, 심근의 부위에 따른 VEGF 단백은

plasmid DNA가 주입된 심첨부로부터 기저부까지 농도

경사를 형성하며 심장 전체에서 확산되어 검출되었다 .

반면, 심근의 부위에 따른 CAT 단백은 plasmid DNA가

주입된 심첨부에만 국한되어 검출되었다 .

결 론 : 본 연구 결과 naked DNA을 이용한 신혈관조

성 유전자 요법에서 CMV 프로모터와 intron 1을 포함

하는 pCN 벡터는 백서 심근에서 다른 벡터에 비해 유의

하게 유전자 발현을 유도하여 치료 효과의 증대와 치료

비용을 절감할 수 있는 유용한 벡터로 생각된다. 또한

심근에서 치료 유전자인 VEGF가 주입한 plasmid의 농

도에 따라 단백 생성이 증가하고, 주입한 부위로부터 단

백이 확산되어 심장전체에서 검출되고, 주입 14일까지도

검출되는 등의 VEGF 유전자 발현 kinetics에 대한 결과

는 앞으로 VEGF를 이용한 신혈관조성 유전자요법에 있

어서 중요한 단서를 제공할 것으로 생각된다 .

감사의 글

본 연구에 사용된 hVEGF 12 1 cDNA를 제공해주신 전

북의대 고규영 교수님께 진심으로 감사드립니다. 본 연

구는 1999년도 보건복지부 보건의료기술개발사업 (HMP-

99-B-02-0001)과 삼성생명과학연구소 연구비 (C98- 002)

의 지원으로 이루어진 것입니다 .

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