石油降解菌 Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 奎林氧化還原酶純化與生化性質研究

National Yunlin University of Science and TechnologyDept. of Environmental & Safety EngineeringNational Yunlin University of Science and TechnologyDept. of Environmental & Safety Engineering

風險評估與損失控制 CPR 實驗室Lab for control & Prediction of Risk

CPR Lab1

石油降解菌 Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5

奎林氧化還原酶純化與生化性質研究

指導教授易指導教授易逸逸波波博士博士 Yet-Pole IYet-Pole I ，， Ph. DPh. D

林林忠忠亮亮博士博士 Chung-Liang LinChung-Liang Lin ，， Ph. DPh. D..

報告人徐冠永報告人徐冠永 Kwuan-Yung ShiKwuan-Yung Shi



CPR Lab2

報告架構研究背景與現況研究目的文獻回顧研究架構研究方法結果與討論結論與展望



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一 . 研究背景與現況研究背景與現況 (1)(1)石油主要成分包括飽和烴類、芳香族類、瀝青、樹脂等柏油類，並含有少量的氮、氧及硫化物。

自工業革命以來，稱得上是最重要的能量及物質來源，其同時可以做為燃料以及石化工業原料的性質在現代甚至是近三十年內都占有舉足輕重的地位。



CPR Lab4

一 . 研究背景與現況研究背景與現況 (2)(2)

在開採、運送、產製相關原料的過程中，因人為、設備失誤或交通意外而引起工業事故，導致大量之油品或石化相關物質洩漏至環境中。這些不屬於生物體且不存在於自然環境中之外來物質分解甚為緩慢。



CPR Lab5


大規模的原油洩漏對海生及陸生生物具有長期性危害，其中危害可以分為兩大類：

物理性危害主要是原油黏度高，遮蓋海面造成透光性及通氣性下降威脅到海底生物

化學性危害則是石油對生物具有直接毒性。



CPR Lab6

一 . 研究背景與現況研究背景與現況 (4)(4) 當石油洩漏到環境中若僅依靠自然的光分解和物化作用來清

除的速度相對較緩慢，目前所採取的處理方式為下面三種：處理方式方法敘述

物理性藉吸油棉、攔油繩 (網 )、沖洗法、高壓蒸氣洗除法和超音波震盪將懸浮於水中的油污打散或集中予以清除。

化學性使用分散劑 (dispersants) 或界面活性劑 (surfactants) 藉此來增加油品的乳化性，使其呈現小油滴狀以利清除。

生物性

以環境中之微生物來分解油污，具有不會造成二次污染之優點，由於石油的成分多半是碳氫化合物，是可以被微生物當作碳源或能量的來源，利用微生物進行降解可將複雜的大分子有機物分解成小分子。一般而言，利用微生物對 NAHs 進行生物分解有不錯的效率，但是這類微生物的分解能力較易受到真實環境因子的限制而降低其降解速率。



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Polycyclic aromatic Hydrocarbons (PAH) 污染物中通常約 2/3 都含有雜環的結構，而含有 N 官能基的雜環化合物被稱為 NAHs (Nitrogen Heterocyclic Aromatic Hydrocarbons) 。

一般係由有機物經過高溫 (500~800oC)狀態下不完全氧化的熱解作用與其他有機顆粒再結合所產生的。



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一 . 研究背景與現況研究背景與現況 (6)(6)NAHs 在自然環境系統的降解途徑如下 1. 陽光照射而產生的光氧化作用 (Photooxidation) 進而被分解

2.在水體方面的物理作用上，污染物常因水體本身的流動而被乳化，形成所謂的乳膠 (Emulsion) ，這些被水所包覆的膠體就會因重力作用而自然沉降水底並遭底泥吸附。

3.最重要的主要降解途徑是以揮發方式，較光解或生物分解來得重要。



CPR Lab9

一 . 研究背景與現況研究背景與現況 (7)(7)本研究的對象是含氮雜環碳氫化合物中的奎林，此污染物是由兩個六碳環相連組成，其中一個碳環的第一個碳被氮元素所取代。相關衍生物是在第二、三或第四個碳的位置上被加上一個官能基 (如圖 ) 。



CPR Lab10

二 .研究目的 (1)台灣本土所篩選出具降解奎林能力之菌株，以往研究中幾乎只針對生長最適化、酵素活性測試及代謝過程等生理作用機制進行探討。

目前對於奎林氧化還原酶 (Qor) 的分子生物層面與其生化性質則未有較深入的探討。

本研究著重奎林氧化還原酶之純化與其生化性質探討研究為主要目的，針對奎林降解菌株 Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 的 Qor 進行研究。



CPR Lab11

二 .研究目的 (2)

若能只利用酵素製劑就達到油污分解的效果，即可避免去生物復育法對環境可能產生菌相甚至於是生態系的變化。站在減少環境衝擊的角度而言無寧是一個更好的選擇。



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三 .文獻回顧 (1)作者年代內容

Coughlan 等人 1980研究中顯示能催化此種 hydroxylation 反應的酵素是一種含鉬的去氫酶。

Tada 等人 1980目前在降解奎林的研究中發現，不同污染源所分離出的菌種 ( 不論是好氧或厭氧菌 ) 在降解奎林時的方式不外乎兩種代謝途徑。

Shukla 等人 1986

Pseudomonas putida Chin IK 則可利用 Coumarin 或 Furan-2-carboxylate 當作主要的碳源，在此反應代謝作用中崁入環內的氧原子是由水分子衍生的，而並非直接來自於氧分子的介入，故一般認為 Pseudomonas putida Chin IK 的奎林代謝途徑是經由 coumarin pathway 。

Liu 等人 1994針對厭氧環境下， Quinoline 在甲烷生成狀態下可被快速分解，硫酸還原態次之，在去硝化狀態下則不分解。

微生物降解奎林之相關研究微生物降解奎林之相關研究



CPR Lab13

三 .文獻回顧 (2)奎林降解的分解情形

某些分解菌以奎林當作基質利用其實仍需要經過一段時間的馴化動作，但直至馴化階段的菌株尚無法完全利用奎林作為唯一碳源，尤其是生長環境中有其它較易分解且可當作碳源來源的化合物，或是有抗生素存在的情況下。

但 PAH5的特性並非是由一生長時期的結束來誘使另一階段的反應作用；相反的它是一種同時分解兩種以上化合物的代謝方式。



CPR Lab14

三 .文獻回顧 (3)酶的特性

酶，泛指所有有機催化劑它具有幾種性質 : 1.在反應中不消耗或生成 2.不改變反應物生成的總量 3. 每秒鐘可催化 1000到 100， 000 個分子

在生物體內只需要很少量



CPR Lab15

三 .文獻回顧 (4)各種輔因子介紹

酶在作用中的活性常來自於它的構型，為了維持構型有時候會需要金屬離子，這個一般會稱為輔因子

金屬離子在酵素中的功能Fe 過氧化酶

Mn 氧化光合作用

Mo 氧化還原酶W 嗜熱菌中氧的傳輸

Zn DNA， RNA 形成酶

Ni 氫化酶



CPR Lab16

三 .文獻回顧 (5)鉬酸鹽在菌體生長中的地位

奎林的環狀結構被裂解時會衍生出一鎢酸鹽的物質，進而有效的抑制分解菌的生長，故一般來說奎林降解實驗的培養基中會添加鉬酸鹽 (molybdstate) 來達到專一性對抗的目的，以利菌種的生長並維持分解酵素的活性 (Blaschke et al.， 1991) 。



CPR Lab17

三 .文獻回顧 (6)色層分析法的純化概述

色層分析法：係利用分離物在流動相中移動的速度不同加以分離。



CPR Lab18

三 .文獻回顧 (7)色層分析法與吸附模式

膠體一般可視為多孔性的小球體，而蛋白質則視為固相的顆粒。

Langmuir的假設 1. 同一處不會發生堆疊吸附 2. 兩相近吸附點不會互相干擾 3. 各吸附點的吸附能力相同



CPR Lab19


模式中參數介紹 α : 吸 /脫附平衡常數 Vo : 空白體積 (1-α)*Vo/Vt : 溶質分子 ( 在此指蛋白質 )保持自由不被膠體吸附的機率

Vt : 總有效空間



CPR Lab20


溶質流率 =Fout(1-α)*Vo/Vt ( 理想式 )

此式可以用於調整管柱體積與流動相速率



CPR Lab21

三 .文獻回顧 (9)吸附簡化模式

mt=m+q， pt=p+q， α=q/pt取代 q=ptα， m=mt-q ， p=pt-q可以得出 Kp=m*p/q = [mt*(1-α)]/α p：蛋白質在溶液中總濃度 m：總有效結合位址 q：結合相的蛋白質濃度 Rf ：溶質移動到液相中的移動率 Kp = (m*p)/q：蛋白質與固定相的分離常數 α=(1-Rf) ：溶質的移動率總有效吸附位址濃度為 mt 總蛋白質濃度為 pt( 自由加結合 )



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三 .文獻回顧 (10)離心回收數學模式

T=[9/2*η/ω2 *γ2 *(ρ–ρo) ]*ln xb/xtη ：溶液動態黏度ω : 離心陀角速度 γ : 顆粒的平均粒徑ρ : 含有懸浮顆粒的溶液平均密度ρ0 : 空白溶液的密度 xb : 離心管底到軸心的距離 xt : 顆粒密度中心到軸心的距離



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純水 ρo=1丙酮 ρo=0.93無水蛋白質 ρ=1.34飽和蛋白質水溶液ρ=1/2(1+1.34)=1.17其 (ρ–ρo)=1.17-1=0.17>0而若以丙酮為溶劑則 (ρ–ρo)=0.2藉由更換液相可以控制離心最低所需時間



CPR Lab24


飽和硫酸銨溶液在水中濃度約 4 M，比重 1.235

3M磷酸鈉溶液在 pH7.4 時比重高達 1.35(ρ–ρo)=((1.34+1.35)-1.35)<0則 T式不成立，離心無法收集其中的蛋白質

此式也可以應用於緩衝液的選擇



CPR Lab25

菌體自休眠中活化

離心收集

擴大培養

初步馴化

破菌處理

離子交換管柱層析

疏水性膠體管柱層析

硫銨分劃膠體過濾管柱層析

電泳檢定

菌體收集段

酵素粗抽段層析純化段

酵素鑑定段

四 . 研究架構

透析脫鹽

過濾濃縮



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五 .研究方法 (1)實驗菌種• 奎林降解菌： Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 【格蘭氏陰性 (Gram negative) 短桿菌，具運動性。在好氧環境環境下會生長，厭氧環境下不生長，不會產生內生孢子】



CPR Lab27

五 .研究方法 (2)菌株的培養以 LB 培養基批次培養至對數生長期後期菌體的收集以離心機 10000 rpm、離心時間 10分鐘，收集菌體

菌體的破碎：以超音波震盪在冰水浴中加以破碎，作用時間一秒鐘，冷卻時間一秒鐘為 1循環，每 20循環停機冷卻20 秒，全部操作時間為 15分鐘



CPR Lab28

五 .研究方法 (3)將粗抽液以硫酸銨分劃做分離

分離成五個 Fraction ，分別測定活性及蛋白質濃度

將活性最高的分劃部分，冰存預備做為後續純化步驟所用



CPR Lab29

NH4+

SO42-

SO42-

NH4+

SO42-

NH4+

H2OH2O

硫酸銨在液相中與水分子競爭吸附於蛋白質表面示意圖

蛋白質分子



CPR Lab30

五 .研究方法 (3)選擇硫酸銨當鹽析工具的理由 1. 中性且具有很大分子量 2. 溶劑度在攝氏 0~30 度變化很小 3. 溶液密度不影響蛋白質沉降 4. 可以與螯合劑結合保護酵素 5. 高濃度鹽可抑制細菌及原生生物生長 6. 便宜



CPR Lab31

五 .研究方法 (4)蛋白質濃度測定法此定量方法利用 Coomassie Brilliant Blue G-250 會與蛋白質結合的特性，在 coomassie blue與蛋白質結合後，其顏色會從棕紅色轉變成為藍色，此顏色變化在 595nm波長光中有特殊吸收峰，可簡單的用分光光度計測定。

必須配合標準品檢量線做內插法



CPR Lab32

五 .研究方法 (5)蛋白質標準檢量線的製作 :

將 BSA標準品配為 10mg/ml‚再以連續稀釋的方法稀釋為 1‚ 0.8‚ 0.6‚ 0.4‚ 0.2‚ 0.1(mg/ml)五組，加入檢測用的染劑 (coomassie blue 20% 溶液 ) 取標準品以 1比 50的比例加入染劑震盪使完全混合再靜置 5分鐘後以 A.595 測定其吸光值。



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五 .研究方法 (6)有關酵素的定量有兩種性質，一個是酵素的總量‚另一個是酵素的活性。

酵素總量可以用蛋白質濃度測定法測得之，但是有兩種問題會干擾 ;其中之一是酵素純度問題，另一個問題是酵素活性不一定是 100% 。

因此需要針對酵素活性做檢測



CPR Lab34

五 .研究方法 (7)檢測酵素活性，必須建立兩個前提 : １ . 活性定義

２．活性偵測法



CPR Lab35

五 .研究方法 (8)酵素確實的含量，通常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種 :

1. 以 units/ml表示，即 1 ml 的抽出液中含有多少 unit (單位 )的該種酵素活性。

2. 以 unit/mg表示，即抽出液中，每 1 mg 的蛋白質含有多少 unit (單位 )的該種酵素活性。



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五 .研究方法 (9)酵素活性單位 (unit) ，一般係指在單位時間( 通常為分鐘 ) 內，酵素催化使得基質減少或是產物增加的量。

產物增加量 μmole 每一個活性 U = (反應時間 -分鐘 )



CPR Lab37

五 .研究方法 (10)活性分析法係使用 INT reduction 方法，利用 INT 接受反應中產生的電子並呈現粉紅色的變化。• INT=2-p-iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazoliu

m chloride

INT 平常時的溶液為無色微偏淡黃，接受電子之後的產物稱為 INT Formazan ，為粉紅到紅色，此顏色在 503nm 波長下有特殊吸收峰，可為分光光度計所測得。

必須配合標準品的檢量線做內插法



CPR Lab38

五 .研究方法 (11)

使用乙醇將 INT formazan溶解懸浮並配成不同濃度的溶液，再模擬活性分析法中的濃度分配稀釋，然後測定其吸光值即可用做活性分析之用。



CPR Lab39

五 . 研究方法 (12)活性分析的試劑 : 1.500λ Tris buffer(with 0.75% Triton X-100) 2.500λ INT solution(2.5mM in D.D.water) 3.50 λ Quinoline(170mM in 2-Propanol) 4.10 λ sample(Enzyme Solution)反應五分鐘以後，以攝氏 100 度水浴一分鐘中止反應，待放涼之後，以分光光度計測定其吸光值。



CPR Lab40

五 .研究方法 (13)將硫酸銨分劃後的樣本以色層分析法做進一步的純化。

色層分析法係指利用依據不同性質在相同背景內有不同移動速率，產生空間上的分開而將混合物加以分離。

移動的速度差異來自於分離物的各種性質如顆粒大小、表面帶電性、親 /疏水性等等



CPR Lab41

五 . 研究方法 (14)本實驗使用 FPLC系統來執行色層分析

FPLC 為 Amersham 所發展的系統，可以不用很高的壓力，而其容量更大於 HPLC ，可用在製備式純化上 ( 樣本量可達 500 mg)



CPR Lab42

五 .研究方法 (15)在實驗中實際上會看到的圖型



CPR Lab43

五 . 研究方法 (16)以三根管柱對 Qor 做純化 1. 疏水性層析法

2. 離子交換層析法

3. 膠體過濾層析法



CPR Lab44

五 .研究方法 (17) 疏水性層析法 (Hydrophobic Interaction Chromatography， HIC)

Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) 蛋白質分子表面有部份疏水性區域，若在一極性很強的環境中，則會被吸附在非極性的固定相擔体上；若環境的極性降低，則可被溶離出來。



CPR Lab45

五 .研究方法 (18)離子交換層析法 (Ion Exchange) DEAE pharose Fast Flow 利用分子的帶電性質進行分離，解析力好且具多樣性，是重要而應用極廣的純化方法。

隨著擔體不同可以分為兩大類 1. 陽離子交換膠體 2.陰離子交換膠體



CPR Lab46

五 .研究方法 (19)膠體過濾法 (Gel filtration) Sephasryl S-300此種膠體顆粒內有相當長的孔道，越小的分子會在孔道中走的距離越長，導致流出時間越晚 (pass through);相對的，大分子則會從顆粒間空隙直接通過 (by pass) ，因此流出時間越早。



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五 .研究方法 (20)SDS-PAGE

利用膠體電泳將純化後的酵素做分子量大小及等電點的測定。

將 Enzyme solution加熱到攝氏 100度，五分鐘，使其蛋白質變性以後放置使其冷卻至室溫。注入膠體開始電泳，結束之後取出膠片以 Coomassie Blue 染色並觀察。



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六 .結果與討論 (1)菌體生長的生長曲線

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

OD600

PAH5

菌體生長曲線



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六 .結果與討論 (2)蛋白質濃度與吸光值檢量線

蛋白質濃度與吸光值檢量線

R2 = 0.9985

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9BSA (mg/ml)濃度

A.503nm吸光值595nm



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六 .結果與討論 (3)INT Formazan 模擬 INT 反應活性全濃度圖

INT Formazan標準曲線

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10 12 14INT Formazan (micromolar)濃度

503nm波長吸光值



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六 .結果與討論 (4)INT formazan 具較高線性範圍的細部圖

INT' Formazan標準曲線R2 = 0.9939

y = 0.1288x + 0.0264

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 0.5 1 1.5 2 2.5

INT' Formazan (micromole)濃度

A.5

03吸光值



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六 .結果與討論 (5)降解 Quinoline 時間與吸光值對照圖

菌液與空白品的活性比較測定

0

0.05

0.1

0.15

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

(min)時間

吸光值空白樣菌液



CPR Lab53

六 .結果與討論 (6) 酵素位置確認結果

A:發酵液全液

B：離心分離後的菌體

C：破菌後粗抽液

D：膜蛋白

E：使用後的 LB

F： Tris Buffer（空白組）

G：空白未使用過的 LB

H： BSA Standard

各種不同實驗組的活性

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

A B C D E F G H

實驗組

吸光值



CPR Lab54

六 .結果與討論 (7)硫酸銨分劃各濃度區蛋白與酵素活性圖

改成柱狀圖

硫酸銨分劃圖

0100200300400500600700800

0-20 20-40 40-60 60-80 80-100

硫酸銨百分濃度分劃

蛋白質濃度(mg/ml)

0

1

2

3

4

5

6

7

(U)活性

(U)活性(mg/ml)蛋白質濃度



CPR Lab55

六 .結果與討論 (8)以 HIC 進行疏水性層析法活性與蛋白量比較圖

HIC /活性蛋白質洗出圖

05

10

152025

1 21 41 61 81 100 120 140 160 180

Fraction NO.

活性(U/5ml)

0

1000

2000

3000

4000A.280

U/5ml活性A.280

U



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六 .結果與討論 (8)疏水性層析法操作條件

A. 高鹽度 buffer 40 mM Tris/HCl with 100 mM Ammonium Sulfate B. 低鹽度 buffer 10 mM Tris/HCl No Ammonium Sulfate C. 平衡膠體用的 buffer 100mM Tris/HCl with 750 mM Ammonium Sul

fate D. 流洗管內其他未被吸附的物質的流洗液 100mM Tris/HCl with 300

mM Ammonium Sulfate pH :8.5 流速 : 40ml/Hr 每管收集體積 : 5ml 操作結束之後 ,將回收的樣本以透析法脫鹽並用於離子交換法



CPR Lab57

六 .結果與討論 (9)離子交換法活性與蛋白量比較圖

Ion Exchange /活性蛋白質量流洗圖

0

2

4

6

8

10

12

14

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91

Fraction NO.

(U)活性

0

20

40

60

80

100

120

140

A.280吸收度

(U)活性

A.280



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六 .結果與討論 (9)離子交換層析法操作條件

A: 低鹽度 buffer 50mM Tris/HCl buffer 200mM NaCl B: 高鹽度 buffer 50mM Tris/HCl buffer 700mM NaCl C: 平衡膠體用兼流洗不吸附蛋白 buffer 50mM Tris/HCl buffe

r pH : 8.0 流速 : 100 ml/Hr 每管收集體積 : 10ml 操作結束之後 ,將回收的樣本以濃縮過濾法調整體積並用於

膠體過濾層析法



CPR Lab59

六 .結果與討論 (10)膠體過濾法中蛋白質量與活性比較圖

Gel Filtration /活性蛋白質量流洗圖

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91

Fraction NO.

(U)活性

0

5

10

15

20

25

A.280吸光值

(U)活性280nm吸光值



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六 .結果與討論 (10)膠體過濾法操作條件

A: 流洗 buffer : 100 mM Tris/HCl buffer

pH: 8.0流速 : 40 ml/Hr每管收集體積 :3.6 ml



CPR Lab61

六 .結果與討論 (11)PAH5 奎林氧化還原酶之純化結果

Total protein

(mg)

Totalactivity(units)

Specifiic activity

(units/mg)

Yield(%)

Purification(fold)

Crude Extract 4587.16 202.40 0.044 100 1

20-40%AmmoniumSulfatefractionation

1203.20 88.16 0.073 43.56 1.66

Phenylsephacryl 62.10 61.15 0.985 30.21 22.32

DEAE Sephacel 6.03 38.41 6.370 18.98 144.27

Sephacryl S-300 2.72 8.57 3.150 4.23 71.59



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六 .結果與討論 (12)經粗抽所得 Qor 之 SDS-PAGE(12%)

菌體粗抽

20

28

37

50

92116203



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七 . 結論與展望 (1)以實驗中得到的結果來說，此一純化策略應為成功，比活性隨著純化步驟增加而逐步提高。

待後人進行生理活性等各項測試以後，應能夠對於 Qor的性質有更高掌握度。



CPR Lab64

七 . 結論與展望 (2)未來的研究中，建議針對酵素活性的不穩定做探討。

針對結果來推測，可能是源菌的活性不足以及管柱操作技巧不純熟這兩個原因，以致於未能夠順利將酵素的活性保存至最後步驟。



CPR Lab65

七 . 結論與展望 (3)在目前菌體的擴大培養過程中 ,需要使用大量的三角搖瓶 ,方法相當麻煩。

本實驗室專題生實驗發現 ,PAH5在發酵槽中活性顯著的降低。

未來建議也可以在 PAH5於５公升發酵槽中之生長最適化做相關討論 ,以方便擴大樣本量。



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