科学研究費助成事業　　研究成果報告書

様　式　Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９ （共通）

機関番号：

研究種目：

課題番号：

研究課題名（和文）

研究代表者

研究課題名（英文）

交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

１４５０１

若手研究(B)

2016～2015

iPS細胞を用いた統合失調症グルタミン酸仮説の検討

Investigation of the glutamate hypothesis for schizophrenia using iPS cells

００６４２１２５研究者番号：

毛利　健太朗（Mouri, Kentaro）

神戸大学・医学研究科・助教

研究期間：

１５Ｋ１９７２８

平成 年 月 日現在２９ ６ １

円 3,100,000

研究成果の概要（和文）：NMDA受容体の輸送に重要な役割を担っているKIF17と統合失調症との関連について、KIF17遺伝子上のアミノ酸置換を伴うSNPについて統合失調症群で有意に高いことを見出した。また死後脳研究では統合失調症群においてKIF17蛋白の有意な減少を認めた。マウスの神経前駆細胞においてKIF17遺伝子をノックダウンし増殖能を評価したが、有意な変化は認めなかった。またアストロサイトにクロザピンを投与し解析したところ、アストロサイトのKIF17 mRNA発現の有意な変化を認めた。ヒト由来iPS細胞については、神経細胞への分化誘導の系を確立できたため、分化に及ぶ影響を解析する予定である。

研究成果の概要（英文）：The KIF17 gene plays an important role in transport of NMDA receptors . We found that a missense SNP of KIF17 was significantly higher in schizophrenia group on the relationship between KIF 17. The protein expression of KIF17 in schizophrenic postmortem brains was significantly less than that in controls. We knocked down KIF17 gene in mouse neural progenitor cells (mNPCs) and the proliferation ability of the mNPCs was evaluated but no significant change was observed. In astrocytes treated with clozapine , KIF 17 mRNA expression were significantly decreased . For iPS cells derived from human, since it was possible to establish a system of induction of differentiation from human iPS cells to neurons, we will continue to analyze the influence on differentiation after continuing operations such as suppressing the expression of KIF17 gene .

研究分野： 医学研究科

キーワード： 臨床精神分子遺伝学

１版

様 式

１．研究開始当初の背景統合失調症は生涯有病率が

common diseaseされていない深刻な精神疾患である。調症の有受容体を介したグルタミン酸系神経伝達機能低下いる。（キネシンスーパーファミリータンパク質）が関与することが明らかとなっている。で申請者らは、について、った。SNP(rs2296225)患者群とたところ、同合失調症群で有意に高いことを見出した。また当研究室対照群の死後脳前頭前野組織を用いて蛋白の定量を行ったところ、統合失調症群において

２．研究の目的本研究の目的は、

割を担っている影響を、駆細胞（イトを用いてを解明するである。 ３．研究の方法①KIF17C57BL/6し初代培養系を立ち上げKIF17生存（抗アポトーシス）といった型に対する増殖についてはイによマーカーにより、生存についてはいた②抗精神病薬がGRIN2bKIF17影響のアストロサイトおよびニューロン初代培養系を立ち上げる種の抗精神病薬をの mRNAにより③ヒト由来シナプスの神経伝達や形態変化に与えている影響の樹立とドパミン神経に分化さオーバーエクスプレッション、ノックダウン等の操作を行する。

式 Ｃ－１９、Ｆ－１９

１．研究開始当初の背景統合失調症は生涯有病率が

common disease であり、十分な治療法が確立されていない深刻な精神疾患である。調症の有力な病態機序の一つと受容体を介したグルタミン酸系神経伝達機能低下＝グルタミン酸仮説いる。この NMDA（キネシンスーパーファミリータンパク質）が関与することが明らかとなっている。で申請者らは、KIF17について、SNP 関連解析、蛋白発現解析を行った。KIF17 遺伝子上のアミノ酸置換を伴うSNP(rs2296225)について、慢性期統合失調症患者群と健常対照群たところ、同 SNP合失調症群で有意に高いことを見出した。ま

研究室が保有する統合失調症患者及び対照群の死後脳前頭前野組織を用いて蛋白の定量を行ったところ、統合失調症群において KIF17 蛋白の有意な減少を認めた。

２．研究の目的 本研究の目的は、

割を担っているKIF17影響を、ヒト iPS駆細胞（NPC）、ニューロンおよびアストロサイトを用いて解析し、統合失調症の病態機序

解明するための研究基盤を確立するである。

３．研究の方法 KIF17がNPCの

C57BL/6 マウスの新生仔脳よりし初代培養系を立ち上げ

17 遺伝子をノックダウンし、生存（抗アポトーシス）といった型に対する KIF17増殖については FACSイにより、分化についてはマーカーにより、生存についてはいた TUNEL 法により評価する。②抗精神病薬が、GRIN2b（NMDAKIF17 が特異的に輸送）

の解析。C57BL/6アストロサイトおよびニューロン初代培養系を立ち上げる種の抗精神病薬を

mRNA 発現の変化により評価する。ヒト由来 iPS 細胞

シナプスの神経伝達や形態変化に与えている影響の解析。患者及び健常者からの樹立と集積を行う。ドパミン神経に分化さオーバーエクスプレッション、ノックダウン等の操作を行った上で、表現型の変化を解析する。

Ｃ－１９、Ｆ－１９

１．研究開始当初の背景 統合失調症は生涯有病率が

であり、十分な治療法が確立されていない深刻な精神疾患である。

な病態機序の一つと受容体を介したグルタミン酸系神経伝達機

＝グルタミン酸仮説がNMDA 受容体の輸送には

（キネシンスーパーファミリータンパク質）が関与することが明らかとなっている。

KIF17 と統合失調症との関連関連解析、蛋白発現解析を行

遺伝子上のアミノ酸置換を伴うについて、慢性期統合失調症

健常対照群による関連解析SNP のマイナーアレル頻度が統

合失調症群で有意に高いことを見出した。まが保有する統合失調症患者及び

対照群の死後脳前頭前野組織を用いて蛋白の定量を行ったところ、統合失調症群に

蛋白の有意な減少を認めた。

本研究の目的は、NMDA 受容体に重要な役

KIF17が神経系細胞に与えるiPS 細胞、マウス

）、ニューロンおよびアストロサ解析し、統合失調症の病態機序

ための研究基盤を確立する

の表現型に及ぼす影響

マウスの新生仔脳よりし初代培養系を立ち上げる。

遺伝子をノックダウンし、生存（抗アポトーシス）といった

KIF17 遺伝子の影響FACS を用いた

分化については Tuj1マーカーにより、生存については

により評価する。、KIF17 遺伝子発現

NMDA 受容体のサブユニットが特異的に輸送）遺伝子発現に与える

C57BL/6 マウスの新生仔脳よりアストロサイトおよびニューロン初代培養系を立ち上げる。それらに種の抗精神病薬を処置し、KIF17

変化について。 細胞を用いた

シナプスの神経伝達や形態変化に与えていの解析。患者及び健常者から集積を行う。さらに SFEBq

ドパミン神経に分化させる。オーバーエクスプレッション、ノックダウン

った上で、表現型の変化を解析

Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９

統合失調症は生涯有病率が 0.6～1.9％のであり、十分な治療法が確立

されていない深刻な精神疾患である。統合失な病態機序の一つとして、NMDA

受容体を介したグルタミン酸系神経伝達機が広く知られて

受容体の輸送には KIF17（キネシンスーパーファミリータンパク質）が関与することが明らかとなっている。そこ

と統合失調症との関連関連解析、蛋白発現解析を行

遺伝子上のアミノ酸置換を伴うについて、慢性期統合失調症

による関連解析を行っナーアレル頻度が統

合失調症群で有意に高いことを見出した。まが保有する統合失調症患者及び

対照群の死後脳前頭前野組織を用いて KIF17蛋白の定量を行ったところ、統合失調症群に

蛋白の有意な減少を認めた。

受容体に重要な役が神経系細胞に与える

細胞、マウス由来の神経前）、ニューロンおよびアストロサ解析し、統合失調症の病態機序

ための研究基盤を確立すること

及ぼす影響の解析。マウスの新生仔脳より NPC を分離

。RNAi 法により遺伝子をノックダウンし、増殖、分化、

生存（抗アポトーシス）といった NPC の表現影響を評価する

を用いた BrdU アッセTuj1 など各種分化

マーカーにより、生存については FACS を用により評価する。

遺伝子発現、およびサブユニット

遺伝子発現に与えるマウスの新生仔脳より

アストロサイトおよびニューロンを分離しそれらに対し、KIF17 と GRIN2b

について、Q-RT-PCR

を用いた KIF17 遺伝子シナプスの神経伝達や形態変化に与えてい

の解析。患者及び健常者から iPS 細胞SFEBq 法により

せる。KIF17 遺伝子のオーバーエクスプレッション、ノックダウン

った上で、表現型の変化を解析

、Ｚ－１９、ＣＫ－１９

％のであり、十分な治療法が確立

統合失NMDA

受容体を介したグルタミン酸系神経伝達機広く知られて

KIF17（キネシンスーパーファミリータンパク質）

そこと統合失調症との関連

関連解析、蛋白発現解析を行遺伝子上のアミノ酸置換を伴うについて、慢性期統合失調症

を行っナーアレル頻度が統

合失調症群で有意に高いことを見出した。まが保有する統合失調症患者及び

KIF17蛋白の定量を行ったところ、統合失調症群に

蛋白の有意な減少を認めた。

受容体に重要な役が神経系細胞に与える

神経前）、ニューロンおよびアストロサ解析し、統合失調症の病態機序

こと

解析。を分離

法により増殖、分化、

の表現を評価する。

アッセなど各種分化

を用

、およびサブユニット、

遺伝子発現に与えるマウスの新生仔脳より、

を分離し、対し、各

GRIN2bPCR 法

遺伝子がシナプスの神経伝達や形態変化に与えてい

細胞法により遺伝子の

オーバーエクスプレッション、ノックダウンった上で、表現型の変化を解析

４．研究成果①新生仔し培養系を立ち上げた。さらにをノックダウンし、を評価し（下図、シス）についてさらに解析をすすめてい ②新生仔マウスし初代培養系を立ち上げた。さら薬（クロルプロマジン、ハロペリドール、リスペリドン、クロザピン）を処置し、及び価した。クロザピンし、現のの薬剤では有意な変化を認めなかった。

、ＣＫ－１９（共通）

４．研究成果 新生仔マウス

し培養系を立ち上げた。さらにをノックダウンし、を評価したところ、下図、N=3）。分化および生存（抗アポトー

シス）についてさらに解析をすすめてい

新生仔マウスし初代培養系を立ち上げた。さら薬（クロルプロマジン、ハロペリドール、リスペリドン、クロザピン）を処置し、及び GRIN2b の遺伝子発現を価した。クロザピン、50µM で KIF17の有意な減少を認めた

の薬剤では有意な変化を認めなかった。

GFAP

（共通）

マウスより NPC を分離し、継代維持

し培養系を立ち上げた。さらにをノックダウンし、BrdU アッセイで増殖能

たところ、有意な差は認めなかった。分化および生存（抗アポトー

シス）についてさらに解析をすすめてい

新生仔マウスよりアストロサイトを分離し初代培養系を立ち上げた。さら薬（クロルプロマジン、ハロペリドール、リスペリドン、クロザピン）を処置し、

の遺伝子発現を価した。クロザピンで濃度依存性に発現低下

KIF17 及び GRIN2b有意な減少を認めた（p<0.05,

の薬剤では有意な変化を認めなかった。

を分離し、継代維持し培養系を立ち上げた。さらに KIF17 遺伝子

アッセイで増殖能有意な差は認めなかった

。分化および生存（抗アポトーシス）についてさらに解析をすすめてい

よりアストロサイトを分離し初代培養系を立ち上げた。さらに抗精神病薬（クロルプロマジン、ハロペリドール、リスペリドン、クロザピン）を処置し、KIF17

の遺伝子発現を Q-RT-PCR濃度依存性に発現低下

GRIN2b の遺伝子発p<0.05, N=3）

の薬剤では有意な変化を認めなかった。

＊

＊

を分離し、継代維持遺伝子

アッセイで増殖能有意な差は認めなかった

。分化および生存（抗アポトーシス）についてさらに解析をすすめている。

よりアストロサイトを分離に抗精神病

薬（クロルプロマジン、ハロペリドール、リKIF17

PCR で評濃度依存性に発現低下

の遺伝子発）。他

の薬剤では有意な変化を認めなかった。

＊

さらに、ニューロンの初代培養系を立ち上げ、クロザピンKIF17少を認めた（ ③患者及び健常者からを継続して行っている。ミン神経に分化させる実験系を立ち上げている。細胞からドパミン神経細胞への分化に及ぼす KIF17 TH

Tuj1

さらに、ニューロンの初代培養系を立ち上げ、クロザピン 50µMKIF17 及び GRIN2b少を認めた（p<0.05,

患者及び健常者からを継続して行っている。ミン神経に分化させる実験系を立ち上げている。KIF17 遺伝子操作を行った上で、細胞からドパミン神経細胞への分化に及ぼ

KIF17 の影響の解析を行う予定である。

TH

Tuj1

さらに、ニューロンの初代培養系を立ち上50µMを処置した。その結果、

GRIN2b の遺伝子発現p<0.05, N=6）。

患者及び健常者から iPS 細胞の樹立と集積を継続して行っている。SFEBqミン神経に分化させる実験系を立ち上げて

遺伝子操作を行った上で、細胞からドパミン神経細胞への分化に及ぼ

の影響の解析を行う予定である。

さらに、ニューロンの初代培養系を立ち上を処置した。その結果、の遺伝子発現の有意な減

細胞の樹立と集積SFEBq 法によりドパ

ミン神経に分化させる実験系を立ち上げて遺伝子操作を行った上で、

細胞からドパミン神経細胞への分化に及ぼの影響の解析を行う予定である。

＊

＊

さらに、ニューロンの初代培養系を立ち上を処置した。その結果、

有意な減

細胞の樹立と集積法によりドパ

ミン神経に分化させる実験系を立ち上げて遺伝子操作を行った上で、iPS

細胞からドパミン神経細胞への分化に及ぼの影響の解析を行う予定である。

抗精神病薬処置によって、アストロサイトとニューロンにおいて遺伝子発現が変化することが示唆された。後もへの表現型への影響について、iPS ５．主な発表論文（研究代表者、研究分担者は下線） 〔雑誌論文〕（計1.

2.

3.

4.

5.

〔学会発表〕（計1.

2.

抗精神病薬処置によって、アストロサイトとニューロンにおいて遺伝子発現が変化することが示唆された。後もさらに、KIF17への表現型への影響について、iPS 細胞を用いた解析をすすめていく。

．主な発表論文（研究代表者、研究分担者は下線）

〔雑誌論文〕（計 Ratta-apha W, Boku S,

Otsuka I, Watanabe Y, Nunokawa A, Someya T, Shirakawa O, Sora I, HishimotoA. Association analysis of the HLA-DRB1*01 and HLAschizophrenia by tag SNP genotyping in the Japanese population. Psychiatry Res. 229:627-628 (2015)

Otsuka I, Watanabe Y, Hishimoto A, Boku S, Mouri K, Shiroiwa K, Okazaki S, Nunokawa A, ShiraI. Association analysis of the Cadherin13 gene with schizophrenia in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat. 11:1381-1393 (2015)

Ratta-Apha W, H, Okazaki S, Otsuka I, Sora I, Arinami T, Shirakawa O, Hishimoto A. A decrease in protein level and a missense polymorphism of KIF17 are associated with schizophrenia..Psychiatry Res. 230(2):424-

Okazaki S, Boku S, Otsuka I, Aoyama S, Shiroiwa K, Sora I, Fujita A, Shirai Y, Shirakawa O, KA. The cell cyclebiomarkers for schizophrenia.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2016 3;70:85

Shimmyo N, Hishimoto A, Otsuka I, Okazaki S, Boku S, Takahashi M, Ueno Y, Shirakawa O, Sora I. Association study of MIF promoter polymorphisms with suicide completers in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat. 2017 Mar 22;13:899

〔学会発表〕（計 岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、朗、白岩恭一、大塚郁夫、白井豊、藤田愛子、白川治、湖海正尋、曽良一郎．統合失調症における細胞周期関連遺伝子に着目した45 回日本神経精神薬理学会・第本生物学的精神医学会年 9 月

岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、朗、竹村幸洋、麻生克郎、山本訓也、曽

抗精神病薬処置によって、アストロサイトとニューロンにおいて KIF17遺伝子発現が変化することが示唆された。

KIF17 遺伝子による神経系細胞への表現型への影響について、

細胞を用いた解析をすすめていく。

．主な発表論文等 （研究代表者、研究分担者及び連携研究者

〔雑誌論文〕（計 5 件） apha W, Boku S, Mouri K

Otsuka I, Watanabe Y, Nunokawa A, Someya T, Shirakawa O, Sora I, HishimotoA. Association analysis of the

DRB1*01 and HLAschizophrenia by tag SNP genotyping in the Japanese population. Psychiatry Res.

628 (2015) Otsuka I, Watanabe Y, Hishimoto A, Boku S,

, Shiroiwa K, Okazaki S, Nunokawa A, Shirakawa O, Someya T, Sora I. Association analysis of the Cadherin13 gene with schizophrenia in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat.

1393 (2015) Apha W, Mouri K

H, Okazaki S, Otsuka I, Sora I, Arinami T, O, Hishimoto A. A decrease in

protein level and a missense polymorphism of KIF17 are associated with schizophrenia..Psychiatry Res.

-429 (2015) Okazaki S, Boku S, Otsuka I, Aoyama S, Shiroiwa K, Sora I, Fujita A, Shirai Y, Shirakawa O, KA. The cell cycle-related genes as biomarkers for schizophrenia.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2016 3;70:85-91. Shimmyo N, Hishimoto A, Otsuka I, Okazaki S, Boku S, Mouri KTakahashi M, Ueno Y, Shirakawa O, Sora I. Association study of MIF promoter polymorphisms with suicide completers in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat. 2017 Mar 22;13:899

〔学会発表〕（計 3 件） 岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、

、白岩恭一、大塚郁夫、白井豊、藤田愛子、白川治、湖海正尋、曽良一郎．統合失調症における細胞周期関連遺伝子に着目した 3 段階 mRNA

回日本神経精神薬理学会・第本生物学的精神医学会

岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、、竹村幸洋、麻生克郎、山本訓也、曽

抗精神病薬処置によって、アストロサイトKIF17 及び GRIN2b

遺伝子発現が変化することが示唆された。遺伝子による神経系細胞

への表現型への影響について、NPC および細胞を用いた解析をすすめていく。

及び連携研究者

Mouri K, Okazaki S,

Otsuka I, Watanabe Y, Nunokawa A, Someya T, Shirakawa O, Sora I, HishimotoA. Association analysis of the

DRB1*01 and HLA-DRB1*04 with schizophrenia by tag SNP genotyping in the Japanese population. Psychiatry Res.

Otsuka I, Watanabe Y, Hishimoto A, Boku S, , Shiroiwa K, Okazaki S,

kawa O, Someya T, Sora I. Association analysis of the Cadherin13 gene with schizophrenia in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat.

Mouri K, Boku S, Ishiguro H, Okazaki S, Otsuka I, Sora I, Arinami T,

O, Hishimoto A. A decrease in protein level and a missense polymorphism of KIF17 are associated with schizophrenia..Psychiatry Res.

Okazaki S, Boku S, Otsuka I, Mouri KAoyama S, Shiroiwa K, Sora I, Fujita A, Shirai Y, Shirakawa O, Kokai M, Hishimoto

related genes as biomarkers for schizophrenia.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.

Shimmyo N, Hishimoto A, Otsuka I, Mouri K, Horai T,

Takahashi M, Ueno Y, Shirakawa O, Sora I. Association study of MIF promoter polymorphisms with suicide completers in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat. 2017 Mar 22;13:899-908

岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、毛利健太、白岩恭一、大塚郁夫、白井豊、藤田

愛子、白川治、湖海正尋、曽良一郎．統合失調症における細胞周期関連遺伝子

mRNA 発現解析．回日本神経精神薬理学会・第 37

本生物学的精神医学会 合同年会．

岡﨑賢志、菱本明豊、朴秀賢、毛利健太、竹村幸洋、麻生克郎、山本訓也、曽

抗精神病薬処置によって、アストロサイトGRIN2b の

遺伝子発現が変化することが示唆された。今遺伝子による神経系細胞

および細胞を用いた解析をすすめていく。

及び連携研究者に

, Okazaki S, Otsuka I, Watanabe Y, Nunokawa A, Someya T, Shirakawa O, Sora I, Hishimoto A. Association analysis of the

DRB1*04 with schizophrenia by tag SNP genotyping in the Japanese population. Psychiatry Res.

Otsuka I, Watanabe Y, Hishimoto A, Boku S, , Shiroiwa K, Okazaki S,

kawa O, Someya T, Sora I. Association analysis of the Cadherin13 gene with schizophrenia in the Japanese population. Neuropsychiatr Dis Treat.

, Boku S, Ishiguro H, Okazaki S, Otsuka I, Sora I, Arinami T,

O, Hishimoto A. A decrease in protein level and a missense polymorphism of KIF17 are associated with schizophrenia..Psychiatry Res.

Mouri K, Aoyama S, Shiroiwa K, Sora I, Fujita A,

okai M, Hishimoto related genes as

biomarkers for schizophrenia.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.

Shimmyo N, Hishimoto A, Otsuka I, , Horai T,

Takahashi M, Ueno Y, Shirakawa O, Sora I. Association study of MIF promoter polymorphisms with suicide completers in the Japanese population. Neuropsychiatr

毛利健太、白岩恭一、大塚郁夫、白井豊、藤田

愛子、白川治、湖海正尋、曽良一郎．統合失調症における細胞周期関連遺伝子

発現解析．第37 回日．2015

毛利健太、竹村幸洋、麻生克郎、山本訓也、曽

良一郎．危険ドラッグの臨床症状への影響および遺伝子多型との関連の検討．第27 回日本依存神経精神科学会．2015 年10 月

3. Akitoyo Hishimoto, Shuken Boku, Hiroki Ishiguro, Kentaro Mouri, Woraphat Ratta-apha, Ichiro Sora. A decrease in protein level and a missense polymorphism of KIF17 are associated with schizophrenia 30th CINP WORLD CONGRESS OF NEUROPSYCHOPHAMACOLOGY. 2016年 7 月

〔図書〕（計 0 件） 〔産業財産権〕 ○出願状況（計 0 件） ○取得状況（計 0 件） 〔その他〕 なし ６．研究組織 (1) 研究代表者 毛利健太朗（Kentaro, Mouri） 神戸大学・大学院医学研究科・助教

研究者番号：00642125