Anlise funcional de genes que codificam protenas WRKY, responsivos ao ataque

do fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, agente causador da ferrugem asitica em

soja [Glycine max (L.) Merrill]

Marina Borges Osorio

Porto Alegre, Maro de 2010.

UNIVERSIDADEFEDERALDORIOGRANDEDOSUL

INSTITUTODEBIOCINCIAS

PROGRAMADEPSGRADUAOEMGENTICAEBIOLOGIAMOLECULAR

2

Anlise funcional de genes que codificam protenas WRKY, responsivos ao ataque

do fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, agente causador da ferrugem asitica em

soja [Glycine max (L.) Merrill]

Marina Borges Osorio

UNIVERSIDADEFEDERALDORIOGRANDEDOSUL

INSTITUTODEBIOCINCIAS

PROGRAMADEPSGRADUAOEMGENTICAEBIOLOGIAMOLECULAR

Dissertao submetida ao Programa de Ps-Graduao em

Gentica e Biologia Molecular da UFRGS como requisito

parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias.

Orientadora: Dra. Mrcia Margis-Pinheiro

Co-orientadora: Dra. Maria Helena Bodanese-Zanettini

Porto Alegre, Maro de 2010.

3

INSTITUIOEFONTESFINANCIADORAS

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular

Vegetal do Departamento de Gentica da UFRGS e recebeu apoio financeiro do Conselho

Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), assim como dos projetos

GENOSOJA e BIOTECSUR.

4

AGRADECIMENTOS

s minhas queridas orientadoras, Mrcia e Maria Helena: pela acolhida no

Laboratrio de Gentica Vegetal da UFRGS, por terem me disponibilizado as melhores

condies possveis para a realizao deste trabalho e principalmente, por servirem

(sempre) como grandes exemplos, tamanha a competncia e a dedicao com as quais

exercem sua profisso.

Bea: por no incio, ter facilitado enormemente minha adaptao ao novo

laboratrio; e ao longo do mestrado, por ter sido como uma terceira orientadora, sempre

prestativa e paciente, me dando dicas e sugerindo caminhos a seguir...

Aos colegas, professores e funcionrios dos diversos ncleos que formam o

Laboratrio de Gentica Vegetal, assim como do Laboratrio de Genomas e Populaes de

Plantas (CBIOT), pela amizade e pela ajuda prestada ao longo destes dois anos...em

especial ao Joo, por ter se mostrado sempre prestativo e atendido com boa vontade,

sempre que uma ajudinha lhe era requisitada (e no foram poucas...).

minha famlia e aos meus amigos pelotenses, que me deram o incentivo e o apoio

fundamentais para meu sucesso nesta etapa...

Finalmente, a Deus, por ter me provido de pacincia descomunal, sem a qual a

escrita desta dissertao no seria possvel.

Muito obrigada!

5

RESUMO

A soja [Glycine max (L.) Merrill] uma espcie da famlia Fabaceae que possui grande

importncia econmica mundial. A ferrugem asitica (ASR), causada pelo fungo Phakopsora

pachyrhizi Sydow, tornou-se nos ltimos anos uma das maiores ameaas s lavouras de soja ao

redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados resistncia ASR foram identificados.

Entretanto, at o momento, nenhuma cultivar com resistncia efetiva ao ataque pelo patgeno foi

obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistncia quebrada por ao menos um

isolado do fungo. A identificao de diversas fontes de resistncia que possibilitem a construo de

um arsenal contra a ASR no germoplasma comercial de soja, alm do entendimento ao nvel

molecular dos mecanismos de defesa desta espcie contra P. pachyrhizi, podem contribuir

significativamente no combate ao patgeno. Os fatores de transcrio WRKY so membros de uma

superfamlia com ampla distribuio no Reino Vegetal; embora suas funes regulatrias ainda no

estejam bem definidas, inmeros estudos realizados ao longo dos ltimos anos tm reunido

evidncias de seu envolvimento nas respostas a ataques por patgenos. Estas requerem uma ampla

reprogramao transcricional na clula vegetal, na qual fatores de transcrio WRKY parecem

desempenhar um papel crucial no ajuste-fino da expresso de genes de defesa. O objetivo deste

trabalho caracterizar a funo de dois genes da famlia WRKY em soja, envolvidos nas respostas

ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, atravs de estratgias de gentica reversa e estudos de

expresso gnica. As seqncias genmicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e

identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpresso e

silenciamento em soja foram construdos e os processos de transformao gentica desta espcie

foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium,

nos quais embries somticos foram utilizados como tecido alvo. Alm disso, a anlise do perfil de

expresso desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condies de

estresse salino e em resposta infeco por P. pachyrhizi.

6

ABSTRACT

Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In

the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has

become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant

genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety

presenting effectiveness towards the pathogens attack, since the resistance ruled by every single

one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The

identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in

commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybeans defense mechanisms

against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the

pathogens eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide

distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been

several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogens

attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant

cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense

related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY protein-

encoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics

strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were

isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides,

vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species

was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated

bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target

tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and

GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in

response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

7

LISTADEABREVIATURAS

aa: aminocido

ASR: ferrugem asitica (Asian Soybean Rust)

At: Arabidopsis thaliana

CaMV: vrus mosaico da couve-flor (Cauliflower mosaic virus)

CC-NB-LRR: Coiled-Coil Nucleotide Binding Leucine-Rich Repeats

cDNA: DNA complementar

CTAB: brometo de cetiltrimetilamnio

DNA: cido desoxirribonucleico

D.O.: densidade ptica

dpi: dias aps a inoculao

ESTs: etiquetas de seqncias expressas (Expressed Sequence Tags)

ET: etileno

GFP: protena fluorescente verde (Green Fluorescent Protein)

Gm: Glycine max

hpi: horas aps a inoculao

hpt: higromicina fosfotransferase

HR: resposta de hipersensibilidade (Hypersensitive response)

IPTG: Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside

JA: cido jasmnico

kb: quilobases

LB: meio de cultura Luria Broth

LRR-RLK: Leucine-Rich Repeats Receptor-like Kinase

LRR-RLP: Leucine-Rich Repeats Receptor-like Protein

MAPK: Mithogen-activated Protein Kinase

Mb: megabases

MKK7: Mithogen-activated Protein Kinase Kinase 7

MS: meio de cultura Murashinge e Skoog

Myr: milhes de anos atrs (Million years ago)

8

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NPR1: Nonexpressor of PR genes 1

P35S: promotor 35S do CaMV

pb: pares de base

PCD: morte celular programada (Programmed Cell Death)

PCR: Reao em Cadeia da Polimerase

pH: potencial hidrogeninico

PIG: Particle Inflow Gun

ProlD: rooting loci promoter de Agrobacterium rhizogenes

PRs: Pathogenesis-Related proteins

pv: patovar

RT-qPCR: PCR em Tempo Real quantitativo

RLK: Receptor-like Kinase

RNA: cido ribonucleico

RNAi: RNA de interferncia

ROS: espcies reativas de oxignio

rpm: rotaes por minuto

SA: cido saliclico

SAR: resistncia sistmica adquirida (Systemic Acquired Resistance)

T35S: terminador 35S do CaMV

T-DNA: DNA de transferncia de Agrobacterium tumefaciens

TIR-NB-LRR: Toll/Interleukin1 Receptor Nucleotide Binding Leucine-Rich Repeats

TTSS: Sistema de Secreo Tipo III (Type III Secretion System)

UTR: regio no-traduzida

UV: radiao ultravioleta

WT : planta selvagem (Wild-type)

X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside

9

SUMRIO

1. INTRODUO .................................................................................................... 14

1.1. Estresses ambientais que afetam a cultura da soja e os mecanismos de

resposta da planta ............................................................................................................. 16

1.2. A genmica funcional como ferramenta para o melhoramento de plantas .... 23

1.3. A superfamlia de fatores de transcrio WRKY ........................................... 24

1.4. Transformao gentica da soja e estudos funcionais .................................... 29

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 32

2.1. Objetivo geral ................................................................................................. 32

2.2. Objetivos especficos ...................................................................................... 32

3. METODOLOGIA ................................................................................................ 33

3.1. Material ........................................................................................................... 33

3.2. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes de interesse ....................... 33

3.3. Obteno de vetores para a transformao de soja ......................................... 34

3.3.1. Construo de superexpresso .................................................................... 35

3.3.2. Construo de silenciamento ...................................................................... 36

3.4. Transformao de Escherichia coli ................................................................ 38

3.5. Transformao de Agrobacterium tumefaciens .............................................. 39

10

3.6. Extrao de DNA............................................................................................ 40

3.7. Extrao de RNA total .................................................................................... 40

3.8. Sntese de cDNA ............................................................................................ 40

3.9. Reao em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................... 41

3.10. PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR) ............................................. 42

3.11. Anlises da expresso gnica ao longo do desenvolvimento e em resposta a

estresses............. ............................................................................................................... 44

3.11.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento ....................................... 44

3.11.2. Infeco por P. pachyrhizi ...................................................................... 45

3.11.3. Estresse salino ......................................................................................... 46

3.12. Anlises estatsticas .................................................................................... 46

3.13. Transformao gentica de soja .................................................................. 46

3.13.1. Induo de embriognese somtica e obteno de tecido embriognico

proliferativo............. ......................................................................................................... 47

3.13.2. Transformao por biobalstica (bombardeamento de partculas) .......... 47

3.13.3. Transformao via sistema integrado bombardeamento /

Agrobacterium ................................................................................................................ 48

3.13.4. Seleo de transformantes, regenerao e aclimatao das plantas

obtidas.............. ................................................................................................................. 48

11

3.13.5. Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da

expresso do gene reprter ............................................................................................... 51

4. RESULTADOS .................................................................................................... 52

4.1. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes para estudo ........................ 52

4.2. Anlises da expresso gnica ......................................................................... 57

4.2.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento ........................................... 57

4.2.2. Infeco por P. pachyrhizi .......................................................................... 59

4.2.3. Estresse salino ............................................................................................. 61

4.3. Obteno de vetores para a transformao de soja ......................................... 63

4.3.1. Construo do vetor binrio de superexpresso .......................................... 63

4.3.2. Construo dos vetores de silenciamento ................................................... 64

4.4. Obteno de plantas transgnicas ................................................................... 67

4.4.1. Transformao de Agrobacterium tumefaciens com as construes de

superexpresso e silenciamento ........................................................................................ 67

4.4.2. Transformao de embries somticos de soja via sistema integrado

bombardeamento / Agrobacterium................................................................................ 68

4.5. Anlise dos tecidos geneticamente modificados e das plantas transgnicas .. 71

4.5.1. Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da expresso

do gene reprter ................................................................................................................ 71

12

4.5.2. Confirmao da integrao do transgene por PCR ..................................... 73

4.5.3. Clculo do nmero de cpias do transgene atravs de RT-qPCR .............. 73

5. DISCUSSO ......................................................................................................... 75

5.1. Anlises in silico e isolamento dos genes em estudo ..................................... 75

5.2. Anlises da expresso gnica ......................................................................... 77

5.2.1. Genes-referncia ......................................................................................... 77

5.2.2. Expresso em diferentes rgos, fases do desenvolvimento e em resposta ao

estresse salino ................................................................................................................... 78

5.2.3. Infeco por P. pachyrhizi .......................................................................... 79

5.2.4. Estrutura, expresso e funo gnica .......................................................... 80

5.3. Obteno e anlises de plantas transgnicas para o estudo funcional de

GmWRKY20 e GmWRKY46 ............................................................................................. 84

5.3.1. Expresso GFP ............................................................................................ 84

5.3.2. Estimativa do nmero de cpias do transgene ............................................ 88

5.3.3. Revelao do fentipo................................................................................. 90

6. CONCLUSES .................................................................................................... 93

7. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 94

8. REFERNCIAS ................................................................................................... 95

13

ANEXO 1: Seqncias genmicas e codificantes de GmWRKY20 e GmWRKY46 e

alinhamento dos primers utilizados nas construes RNAi e para as anlises de expresso

por RT-qPCR. ..................................................................................................................... 102

ANEXO 2: Clculo do nmero de cpias do transgene atravs da quantificao relativa

pela anlise da curva padro. .............................................................................................. 107

14

1. INTRODUO

Leguminosas so plantas pertencentes famlia Fabaceae que, com

aproximadamente 20.000 espcies, a terceira maior famlia entre as plantas superiores.

Dentre as leguminosas, a soja [Glycine max (L.) Merrill] a espcie de maior importncia

econmica mundial. Segundo dados da FAO, a produo mundial de soja em 2008

ultrapassou 230 milhes de toneladas. Neste contexto, o Brasil aparece como o segundo

maior produtor atrs apenas dos Estados Unidos tendo produzido, em 2008, quase 60

milhes de toneladas de gros. A relevncia desta espcie na agricultura decorrente de sua

capacidade de fixao de nitrognio atmosfrico atravs da simbiose com microrganismos;

do seu alto teor protico e lipdico, sendo utilizada h milnios na alimentao humana e

animal; e mais recentemente, da possibilidade de utilizao do leo de soja para a produo

de biocombustveis, sendo esta utilidade de particular interesse do governo brasileiro

(http://www.biodiesel.gov.br/).

Devido a sua grande importncia, a comunidade cientfica internacional

recomendou sua utilizao como planta modelo entre as leguminosas para estudos

genticos e moleculares, na conferncia Cross-Legume Advances through Genomics

(CATG), realizada em 2004, nos Estados Unidos (Gepts et al. 2005). Desde ento,

diversos esforos ao redor do mundo tm sido realizados visando a obteno e a integrao

do maior volume de dados possveis sobre o genoma da soja. A comear pelo

seqenciamento do genoma da cultivar Williams 82, financiado pelo Departamento de

Energia dos Estados Unidos e realizado entre os anos de 2006 e 2008 atravs de shotgun

sequencing (http://www.jgi.doe.gov/CSP/). Alm disso, em 2007 foi criado o

International Soybean Genome Consortium (ISGC) formado por pesquisadores da China,

Japo, Coria do Sul, Estados Unidos e Brasil. O Consrcio Nacional para Estudos do

Genoma da Soja se integra ao ISGC atravs do projeto GENOSOJA, coordenado pelo

pesquisador Ricardo Vilela Abdelnoor e financiado pelo CNPq.

O projeto GENOSOJA propos o desenvolvimento de um consrcio entre diversos

grupos de pesquisa do pas para a caracterizao do genoma da soja, tendo por objetivo a

15

integrao de informaes sobre a estrutura fsica do genoma e a expresso de genes e as

protenas codificadas por eles, dando nfase s situaes de estresses biticos e abiticos

que comprometem a produtividade da cultura no Brasil e no mundo. Entre os estresses

alvos de estudo esto: a ocorrncia de secas; doenas, como a ferrugem asitica; e pragas,

como o ataque de diferentes espcies de nematides. Ferramentas de bioinformtica tornam

possvel a integrao das informaes geradas nos diferentes nveis do projeto estrutural,

transcricional, protico e funcional auxiliando na compreenso da funo e dos

mecanismos de controle da expresso de genes presentes na soja e envolvidos em processos

de desenvolvimento e/ou defesa contra estresses ambientais.

Alm do GENOSOJA, o Brasil tambm faz parte do projeto BIOTECSUR (Projeto

de Cooperao Bi-Regional entre a Unio Europia & MERCOSUL, Referncia EU

127119) que tem por objetivo a caracterizao de genes e tecnologias derivadas de sua

anlise funcional, que possam agregar valor ao cultivo da soja frente aos estresses

ambientais atravs da formao de uma rede de trabalho entre quatro pases do

MERCOSUL (Argentina, Brasil, Paraguai e Uruguai), representando um marco de

sustentabilidade ambiental, social e econmica nestes pases.

Recentemente, os primeiros resultados obtidos da anlise do seqenciamento do

genoma da soja foram publicados (Schmutz et al. 2010). Compreendendo 950 Mb, o

genoma da soja o maior genoma vegetal seqenciado por shotgun at hoje. Em termos

comparativos, duas vezes e meia maior que o genoma do arroz (389 Mb) e seis vezes

maior que o genoma de Arabidopsis thaliana (157 Mb), espcie-modelo entre as

dicotiledneas. Dividido entre 20 cromossomos, 43% de suas seqncias se encontram em

regies eucromticas, pouco repetitivas e com alta taxa de recombinao; entretanto 21,6%

dos genes preditos com alta confiabilidade (high confidence genes) so encontrados nas

regies prximas aos centrmeros, ricas em seqncias repetitivas e transposons. O genoma

da soja parece ter sofrido dois grandes eventos de duplicao (h 59 e 13 Myr) resultando

em uma conformao atual com quase 75% dos genes presentes em mltiplas cpias, que

vm sendo extraordinariamente mantidas ao longo do tempo. Ressalta-se ainda, que dos

16

46.430 loci preditos como codificantes de protenas, 12,2% foram identificados como sendo

fatores de transcrio (em Arabidopsis este nmero de apenas 7%). A distribuio geral

destes entre as famlias de fatores de transcrio conhecidas similar entre os genomas de

soja e Arabidopsis, entretanto algumas famlias so mais esparsas e outras mais abundantes

no genoma da soja, indicando que as vias regulatrias nesta espcie podem diferir daquelas

descritas para Arabidopsis. Como referido anteriormente, a composio dos leos

produzidos em sementes de soja de grande importncia para sua utilizao na indstria de

biocombustveis. Desta forma, chama-se ateno para a anlise comparativa de genes que

governam as vias de biossntese e de acmulo de lipdeos. O nmero de genes envolvidos

nas diversas etapas destas vias aparenta ser bem maior em soja, sugerindo que estas sejam

reguladas de maneira bem mais complexa nesta espcie, quando comparada a Arabidopsis.

1.1. Estresses ambientais que afetam a cultura da soja e os mecanismos de resposta da planta

Os estresses ambientais so os grandes responsveis por limitar um maior

rendimento das culturas de soja. Estes podem ser de dois tipos: estresses abiticos

(causados por alta salinidade e seca, principalmente) ou estresses biticos (causados por

pragas e doenas). Aproximadamente 40 doenas (bacterianas, fngicas, causadas por vrus

ou nematides) que afetam as lavouras de soja j foram identificadas no Brasil; dentre elas,

pode-se destacar o crestamento bacteriano da soja (Pseudomonas savastanoi pv. glycinea),

o mosaico comum da soja (Vrus do Mosaico Comum da Soja, VMCS), o nematide de

cisto da soja (Heterodera glycines), a antracnose (Colletotrichum dematium var. truncata),

a podrido de carvo (Macrophomina phaseolina) e a ferrugem asitica (Phakopsora

pachyrhizi). A expanso da cultura para novas reas, aliada a prticas inadequadas de

manejo e monocultura so os principais responsveis pelo aumento de ocorrncias e pela

diversificao das doenas que afetam a soja (EMBRAPA Soja 2005).

A ferrugem asitica (ASR, Asian Soybean Rust) uma doena causada pelo

fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow e foi identificada pela primeira vez no Japo, h mais

de um sculo [Hennings VP (1903) A few new Japanese Uredinaceae. Hedwigia 42:107-

17

108, citado em Hartman, Miles & Frederick, 2005]. Entretanto, foi apenas a partir de 2001

que a doena comeou a receber ateno por parte de agricultores e pesquisadores. Nesse

ano foi descrito o primeiro caso de ASR em lavouras de soja do Paraguai, e alguns meses

depois, no Brasil (Yorinori et al. 2005). Aps sua disperso pela Amrica do Sul, ao final

de 2004, a ASR chegou s lavouras dos Estados Unidos (Miles et al. 2006). Desde ento,

devido sua alta severidade (perdas de at 80% na produo), se tornou uma das maiores

ameaas s lavouras de soja ao redor do mundo. Estimativas apontam que a doena tenha

causado perdas econmicas de mais de 2,2 bilhes de dlares na safra 2006/2007 no Brasil

(Calvo et al., 2008). Alm disso, a USDAs Risk Management Agency (RMA), j h

alguns anos pe em alerta os agricultores norte-americanos sobre o risco de contaminao

de suas lavouras e recomenda prticas preventivas e de controle de uma possvel epidemia

(http://www.rma.usda.gov/news/2006/04/soybeanrust.html). O desenvolvimento da

infeco resulta na desfolhao prematura e reduo drstica no rendimento dos gros.

Atualmente, por no haver disponibilidade de cultivares comerciais com resistncia

gentica durvel, a principal forma de controle atravs do uso de fungicidas. Estes, alm

de aumentarem substancialmente os custos da produo e serem uma fonte constante de

contaminao ambiental, geralmente acabam sendo ineficientes, devido agressividade do

fungo e dificuldade de deteco do mesmo nos estgios iniciais da infeco (Calvo et al.,

2008; Silva et al., 2008).

O ciclo infeccioso de um fitopatgeno inicia-se pela sua penetrao no tecido

vegetal. As plantas dispem de uma imunidade pr-invasiva, na qual lanam mo de um

conjunto de barreiras fsicas pr-existentes (cutcula, tricomas e parede celular) ou

induzidas (deposio de calose, fechamento dos estmatos); alm de barreiras qumicas

(liberao de quitinases, glucanases e compostos antimicrobianos) a fim de prevenir a

invaso de microrganismos. Ao sobrepor estas barreiras, o patgeno ento exposto aos

mecanismos de defesa da imunidade ps-invasiva, a qual pode ser ativada por PAMPs

(Pathogen-associated Molecular Patterns) sendo neste caso denominada PTI (PAMP-

triggered Immunity) ou ainda, ser ativada por efetores e denominada ETI (Effector-

triggered Immunity)(Ghre et al. 2008). A PTI geralmente est associada imunidade

18

no-hospedeira e imunidade basal, que so respostas imediatas ao contato com o

patgeno. J a ETI est associada ao desenvolvimento de uma resposta de

hipersensibilidade (HR) e resistncia sistmica adquirida (SAR), sendo estas respostas de

longa durao.

Juntas, a PTI e a ETI fazem parte do modelo atualmente conhecido como o Dogma

Central da fitopatologia (Figura 1). Este importante modelo descreve um processo de co-

evoluo popularmente denominado queda-de-brao evolucionria (evolutionary arms-

race), resumido a seguir. Alm das barreiras fsicas e qumicas pr-existentes, as plantas

possuem a capacidade de detectar componentes genricos conservados dos microrganismos

(MAMPs, Microbe-associated Molecular Patterns; ou PAMPs) desencadeando a PTI. Por

sua vez, alguns microrganismos desenvolvem fatores de virulncia (efetores) capazes de

suprimir parte da resposta geral de defesa de seu hospedeiro. Estes acabaram por

desenvolver genes de resistncia (R genes) especficos, cujo produto detecta de forma

direta ou indireta os fatores de virulncia do patgeno, desencadeando a ETI. Finalmente,

atravs da eliminao ou da modificao de seus efetores, o patgeno pode mais uma vez

escapar deteco pela planta (Bent et al. 2007).

19

Figura 1. Modelo evolutivo da interao planta-patgeno. O modelo apresentado utiliza a

interao planta-bactria como exemplo geral de interao planta-patgeno: (a) O reconhecimento de PAMPs

(como a flagelina bacteriana) por receptores extracelulares RLKs prontamente ativa a imunidade basal, a qual

inclui a sinalizao por cascatas de MAPKs e a reprogramao transcricional mediada por fatores de

transcrio WRKY. (b) Bactrias patognicas utilizam o TTSS para secretar mltiplas protenas efetoras que

suprimem as respostas da imunidade basal do hospedeiro, permitindo a multiplicao do patgeno no

apoplasto vegetal. (c) Protenas de resistncia vegetais (produtos de genes R, como protenas TIR-NB-LRR)

reconhecem a atividade de efetores e restabelecem a resistncia da planta, desenvolvendo forte ETI. (d) O

20

patgeno evita a defesa mediada por genes R modificando ou eliminando os efetores que ativam esta defesa.

Este estado lembra o apresentado em (b), exceto que neste caso o patgeno teve que perder ou alterar uma

protena efetora, ou ainda desenvolver uma nova. (Retirado de Bent & Mackey, 2007).

As estruturas ou molculas conservadas pertencentes aos microrganismos que

servem como alvo do reconhecimento de receptores eucariticos so chamadas, de maneira

geral, de elicitores. Freqentemente refere-se a estes atravs das siglas PAMPs ou MAMPs,

previamente descritas. Flagelinas bacterianas, lipopolissacardeos, quitinas fngicas ou

heptaglucosdeos de oomicetos so exemplos de MAMPs detectados pelas clulas vegetais;

como estes esto geralmente envolvidos em processos biolgicos bsicos do

microrganismo, sua evoluo adaptativa a fim de evitar o reconhecimento pela planta um

processo muito lento. PRRs (Pattern Recognition Receptors) so os receptores presentes

na membrana plasmtica vegetal que estimulam cascatas de transduo de sinal ao

reconhecerem MAMPs, induzindo respostas de defesa no ncleo. Dois tipos de PRRs so

os mais conhecidos, LRR-RLKs ou LRR-RLPs e as respostas de defesa desencadeadas por

estes geralmente envolvem: o fluxo de ons de Ca2+, a formao de espcies reativas de

oxignio (ROS) e de xido ntrico (NO) e a ativao de cascatas de transduo de sinal at

o ncleo (envolvendo MAPKs e fatores de transcrio WRKY); resultando na deposio de

calose, no fechamento dos estmatos e na sntese de compostos antimicrobianos (PRs), por

exemplo. Os efetores liberados por patgenos, visando suprimir a PTI, so molculas

relacionadas sua virulncia que esto fortemente sujeitos evoluo adaptativa, por no

desempenharem uma funo fisiolgica essencial nestes organismos. Se bem sucedidos,

promovem a ocorrncia de uma interao denominada compatvel entre o patgeno e a

planta, resultando no desenvolvimento do processo infeccioso. So tambm conhecidos

como genes de avirulncia (Avr genes), pois uma vez reconhecidos por receptores do

hospedeiro nas interaes incompatveis, sua funo de virulncia ofuscada por uma

funo dominante de avirulncia e a infeco evitada. Estes efetores geralmente so

secretados no apoplasto ou no citoplasma vegetal, atravs do sistema de secreo tipo trs

(TTSS) em bactrias, ou por exocitose, no caso de fungos e oomicetos. Por fim, a ETI

desencadeada na clula vegetal quando o produto de genes R protenas receptoras de

21

membrana (do tipo LRR-RLKs ou LRR-RLPs), ou ainda intracelulares (CC-NB-LRR ou

TIR-NB-LRR) reconhece estas molculas efetoras ou o produto de sua ao. As respostas

de defesa decorrentes deste reconhecimento incluem, como referido anteriormente para a

PTI, a gerao de uma exploso oxidativa na clula, o fluxo de ons atravs da membrana

plasmtica e a expresso de genes de defesa no ncleo, ativados atravs de cascatas de

transduo de sinal. Diferentemente da PTI, na ETI geralmente ocorre o desenvolvimento

de uma HR, podendo esta eventualmente resultar em morte celular programada (PCD).

Estas e outras evidncias apontam atualmente para a ETI como sendo uma reativao da

PTI, de maneira acelerada e potencializada (Bent & Mackey, 2007; Hckelhoven, 2007;

Ghre & Robatzek, 2008).

O ciclo tpico da infeco por P. pachyrhizi comea pela germinao dos

uredinisporos, entre 1 e 2 horas aps a inoculao (hpi) sob condies adequadas: escuro,

alta umidade e temperatura permissiva, entre 15C e 25C (Tsukahara et al. 2008). Duas

horas aps a germinao formado o apressrio. Dentro deste formado um cone, a partir

do qual, 7 hpi uma hifa de penetrao atravessa a epiderme do tecido vegetal. Quando esta

atinge o espao intercelular abaixo da epiderme, um septo formado produzindo hifas

primrias (entre 15 e 20 hpi). Os haustrios, rgos especializados posicionados entre a

parede celular e a membrana plasmtica vegetal, pelos quais o fungo obtm nutrientes e

secreta protenas efetoras, so formados de 24 a 48 hpi. Neste mesmo perodo o fungo

segue colonizando o mesfilo esponjoso, atravs da formao de hifas secundrias e

haustrios adicionais. Novos uredinisporos so formados de 7 a 9 dias aps a inoculao

(dpi), sendo disseminados por at quatro semanas (van De Mortel et al. 2007).

At hoje, cinco genes dominantes relacionados resistncia ASR, Resistance to

Phakopsora pachyrhizi genes, foram identificados em soja: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e

Rpp5, sendo que cada um desses genes condiciona resistncia a um grupo limitado de

isolados de P. pachyrhizi. Trs reaes em resposta ao patgeno so possveis (Figura 2). A

reao imune (governada por Rpp1) na qual a planta no apresenta sintomas visveis; a

reao de hipersensibilidade (HR, governada por Rpp2 a Rpp5) que possui como

22

caracterstica a formao de leses avermelhadas (reddish-brown lesions, RB)

decorrentes de morte celular programada e que resultam na limitao da esporulao e do

crescimento do fungo; e a reao suscetvel, caracterizada por leses marrons (tan-

lesions, TAN) decorrentes da esporulao total das pstulas de P. pachyrhizi. Como j

mencionado, at o momento a utilizao de nenhuma destas fontes monognicas gerou

resistncia durvel em cultivares comerciais de soja, uma vez que todos os loci avaliados

tiveram sua resistncia quebrada por ao menos um isolado (Miles, Hartman, & Fredrick,

2005; Silva et al., 2008; Meyer et al., 2009). Alm do mais, a baixa variabilidade gentica

apresentada entre as cultivares de soja existentes, tanto no Brasil quanto nos Estados

Unidos, um fator agravante na busca por novas fontes de resistncia. Em 2006, Miles,

Frederick & Hartman testaram todo o banco de germoplasma dos Estados Unidos contra

cinco isolados de P. pachyrhizi e nveis de tolerncia (ao menos parcial) foram encontrados

em menos de 5 % da coleo disponvel. A identificao de diversas fontes de resistncia

que possibilitem a construo de um arsenal contra a ASR no germoplasma comercial de

soja, alm do entendimento ao nvel molecular dos mecanismos de defesa da soja contra

este fungo, podem contribuir enormemente no combate ao patgeno.

23

Figura 2. Reaes da soja em resposta ASR. (A) reao imune, sem sintomas visveis; (B) reao

de hipersensibilidade, com leses avermelhadas (RB); e (C) reao suscetvel, com leses marrons (TAN)

(Modificado de Miles, Frederick, & Hartman, 2006).

1.2. A genmica funcional como ferramenta para o melhoramento de plantas

A genmica funcional aparece como uma importante ferramenta biotecnolgica

para se incrementar as bases genticas utilizadas nos programas de melhoramento. A

utilizao combinada de tcnicas de gentica reversa, como a superexpresso de genes de

interesse ou o silenciamento gnico por RNAi, aliada a anlises de high throughput,

como o microarranjo e o MPSS (massively parallel signature sequencing), tm feito da

genmica funcional uma pea chave na era ps-genmica, de forma a possibilitar a

identificao de genes e rotas metablicas relacionadas aos mais variados processos

biolgicos, como o desenvolvimento de rgos, ciclo celular e resposta a estresses

ambientais, alm de elementos-chave na regulao destas rotas (Waterhouse & Helliwell,

2003; Gutterson & Zhang, 2004).

Recentemente, trs grupos independentes demonstraram atravs de tcnicas de

genmica funcional high throughput a modulao da expresso de vrios genes de soja

em resposta ao ataque do fungo P. pachyrhizi (Panthee et al., 2007; van De Mortel et al.,

24

2007; Choi et al., 2008; Panthee et al., 2009). O primeiro perfil do transcriptoma desta

interao foi um microarranjo realizado por Panthee et al. em 2007, onde foram analisadas

plantas jovens (estgio V2), 72 hpi com o patgeno. Em 2009, o mesmo grupo apresentou

outra anlise, desta vez comparando o perfil de expresso em duas fases distintas do

desenvolvimento da soja (estgios V4 e R1), 72 hpi. O foco destes estudos foi demonstrar

que a expresso diferencial de genes em resposta infeco depende do estgio de

desenvolvimento. Em 2008, Choi et al. obtiveram o perfil do transcriptoma atravs de

construo de bibliotecas de SSH (suppressive subtraction hybridization) seguida de

microarranjo, comparando a reao suscetvel com a imune (governada pelo gene Rpp1) 1,

6, 12, 24 e 48 hpi. Neste trabalho foi ressaltada a importncia, tanto de genes responsveis

pelo balano oxidativo (lipoxigenases e peroxidases); quanto de membros de diversas

famlias de fatores de transcrio, sugerindo um complexo padro de regulao na clula

vegetal para que a infeco seja evitada. J no trabalho realizado por van De Mortel et al.,

em 2007, a reao suscetvel foi comparada reao de hipersensibilidade (governada pelo

gene Rpp2), sendo as anlises realizadas 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120 e 168 hpi.

Atravs de microarranjo pde-se observar um grande nmero de genes diferencialmente

expressos, ressaltando em especial a expresso diferencial de 46 fatores de transcrio

pertencentes famlia WRKY, indicando que estes ocupam papel-chave na resposta da soja

infeco pelo fungo causador da ferrugem asitica.

1.3. A superfamlia de fatores de transcrio WRKY

Os fatores de transcrio WRKY so membros de uma superfamlia com ampla

distribuio no Reino Vegetal, o que pode refletir sua importncia na histria evolutiva

destes organismos (Eulgem et al., 2000). Membros desta famlia j foram identificados em

diversos txons vegetais: desde brifitas (Physcomitrella patens 38 membros) e

gimnospermas (Pinus monticola 83 membros); at angiospermas monocotiledneas

(Oryza sativa 105 membros) e dicotiledneas (Arabidopsis thaliana 74 membros,

Populus trichocarpa 100 membros) (Ulker & Somssich, 2004; Liu & Ekramoddoullah,

2009). O aparente sucesso desta superfamlia no Reino Vegetal parece ser decorrente dos

25

sucessivos eventos de duplicao gnica sofridos pelos genomas das plantas, sendo que um

grande nmero de genes WRKY duplicados foi mantido ao longo da evoluo, tanto em

espcies selvagens quanto nas cultivadas (Petitot, Lecouls, & Fernandez, 2008; Tao et al.

2009). Apesar disso, membros desta famlia foram recentemente identificados em espcies

de outros reinos, tais como Giardia lamblia (protista), Dictyostelium discoideum

(mixomicota) e Chlamydomonas reinhardtii (alga unicelular); sugerindo que possuam

origem anterior ao surgimento das plantas, tendo sido perdidos em algum momento ao

longo da evoluo de fungos e animais grupos nos quais no h registros de sua presena

(lker et al. 2004).

A principal caracterstica compartilhada pelos membros desta famlia seu domnio

de ligao ao DNA, denominado domnio WRKY: tipicamente composto por 60

aminocidos, dentre estes a seqncia conservada WRKYGQK (triptofano arginina

lisina tirosina glicina glutamina lisina) na sua poro N-terminal, alm de um

motivo zinc-finger-like na sua poro C-terminal (Eulgem et al., 2000). O domnio

WRKY possui como alvo principal de ligao, cis-elementos do tipo W-boxes

(C/TTGACT/C), apesar de stios alternativos terem sido identificados recentemente, o que

reflete a grande variao apresentada entre os aminocidos adjacentes ao motivo

conservado WRKYGQK (Pandey et al. 2009). Baseado no nmero de domnios WRKY e

nas caractersticas apresentadas por seus motivos zinc-finger-like, Eulgem et al., em

2000, dividiram os fatores de transcrio WRKY em trs subgrupos (Figura 3): protenas

do grupo I apresentam dois domnios WRKY e potenciais ligantes a zinco seguindo o

padro C2-H2 (CX45CX2223HX1H) em seus motivos zinc-finger-like; no grupo II

o padro C2-H2 permanece, mas estas protenas possuem apenas um domnio WRKY; j no

grupo III, o padro C2-HC (CX7CX23HX1C) observado e protenas deste grupo

tambm apresentam apenas um domnio WRKY.

26

Figura 3. Representao esquemtica dos domnios estruturais das protenas WRKY de salsa

(Pc), batata doce (Ib), Arabidopsis (At), tabaco (Nt), pepino (Cs) e aveia selvagem (Af). Elas so

divididas em trs grupos de acordo com o nmero e o tipo de domnio WRKY que contm. Domnios

WRKY esto representados em preto, provveis sinais bsicos de localizao nuclear em azul e zperes de

leucina em rosa. Regies ricas em serina-treonina esto em amarelo, regies ricas em glutamina em roxo,

regies ricas em prolina em verde e regies acdicas em vermelho (Retirado de Eugelm et al., 2000).

27

Embora as funes regulatrias destes genes ainda no estejam bem definidas,

inmeros estudos realizados ao longo dos ltimos anos tm demonstrado evidncias de sua

participao nos processos de senescncia, desenvolvimento de tricomas e metabolismo,

alm da resposta a estresses abiticos (seca, frio, irradiao por luz UV) e principalmente,

em resposta aos mais diversos tipos de estresses biticos (Berri et al., 2009; (Pandey et al.

2009).

Respostas a ataques por patgenos requerem uma ampla reprogramao

transcricional e estudos sugerem que a maioria dos patgenos desencadeia uma rede de

sinalizao interconectada na clula vegetal envolvendo o balano entre os hormnios

cido saliclico (SA) e cido jasmnico (JA). Esta rede intrincada compreende ainda, a ao

de ativadores e repressores transcricionais que realizam o ajuste fino da expresso de genes

de defesa. Grandes famlias de fatores de transcrio so responsveis por esta modulao;

em particular, a presena de cis-elementos do tipo W-boxes na regio promotora de genes

co-regulados em respostas de defesa, indica que fatores de transcrio WRKY

desempenham um papel amplo e crucial na resposta imune das plantas (Figura 4)(Kalde et

al., 2003; Eulgem & Somssich, 2007; Berri et al., 2009; Pandey & Somssich, 2009). Alm

do mais, a presena destes cis-elementos em suas prprias regies promotoras indicam a

existncia de um sistema de auto-regulao/regulao cruzada entre WRKYs atravs de

mecanismos de feedback especficos (Pandey & Somssich, 2009). Por fim, estudos

recentes (Navarro et al., 2008; Zhang, et al. 2008; Kuang, Padmanabhan, & Li, 2009)

demonstraram que pequenos RNAs endgenos de plantas esto amplamente envolvidos na

regulao ps-transcricional de genes envolvidos nas respostas a patgenos, apontando

ainda, para a existncia de um interatoma entre WRKYs e pequenos RNAs (Figura 5),

uma vez que WRKYs so alvos preditos de diversos miRNAs, assim como estes tambm

apresentam W-boxes em sua regio promotora.

28

Figura 4. Modelo hipottico da rede de interao entre WRKYs (de A. thaliana) envolvidos nas

respostas ao ataque por patgenos. A sinalizao de defesa celular pode ser desencadeada pelo

reconhecimento de PAMPs por receptores de membrana e subseqente ativao de cascatas de fosforilaes

envolvendo MAPKs (PTI), ou atravs da deteco de produtos de efetores do patgeno na clula vegetal por

protenas R (ETI). Em ambos os casos, rpidas alteraes da expresso gnica subseqentes so mediadas

pela ao de diversos fatores de transcrio, como WRKYs. A ETI pode ser desencadeada pela ativao de

protenas R (R inativa R ativa) mediada por efetores e subseqente inibio de WRKYs supressores da

defesa. A sinalizao por SA ativada pelo patgeno libera NPR1 de complexos oligomricos, resultando no

acmulo de monmeros de NPR1 no ncleo e sua associao com fatores de transcrio TGA em stios

promotores, sendo que conjunto de genes WRKY depende da ao de NPR1, tanto de forma positiva quanto

negativa (Modificado de Eulgem & Somssich, 2007).

29

Figura 5. Modelo do interatoma WRKYs - pequenos RNAs durante a reprogramao das

respostas de defesa vegetal. Durante o ataque do patgeno, loci geradores de pequenos RNAs podem estar

sob o controle de fatores de transcrio WRKY; ao mesmo tempo, a abundncia de WRKYs pode ser

regulada por pequenos RNAs. RdRs, RNA polimerases direcionadas RNAs (Modificado de Pandey &

Somssich, 2009).

1.4. Transformao gentica da soja e estudos funcionais

A importncia econmica da soja, aliada sua baixa variabilidade gentica e

incompatibilidade sexual desta espcie em cruzamentos interespecficos e intergenricos

(Hu et al. 1995) tm feito da transformao gentica de soja, no s uma importante

alternativa s prticas de melhoramento convencional; mas tambm, servido como

ferramenta a estas prticas, de forma a possibilitar o incremento das bases genticas

utilizadas nos programas de melhoramento. Hoje em dia, a transformao gentica vegetal

(tanto de forma estvel quanto transiente), pr-requisito para a realizao de estudos

moleculares, genticos, bioqumicos e fisiolgicos (Somers et al. 2003) que sejam

realizados, por exemplo, a partir da superexpresso, do silenciamento ou da localizao

sub-celular dos genes em estudo. Entretanto, a existncia de um sistema eficiente de

transformao essencial para que estes sejam bem sucedidos.

30

Dessa forma, diversos trabalhos tm sido desenvolvidos principalmente em

Arabidopsis thaliana que alm de ser uma espcie de fcil transformao (mtodo floral

dip; Clough & Bent, 1999) e rpido desenvolvimento, possui genoma de tamanho

reduzido que acaba por facilitar as anlises moleculares subseqentes. Mais

especificamente, no estudo de genes envolvidos nos mecanismos de interao entre planta /

patgeno pode-se citar diversos trabalhos bem sucedidos realizados atravs de tcnicas de

superexpresso e silenciamento. Navarro et al., em 2006, demonstraram pela primeira vez

o envolvimento de um microRNA endgeno de plantas (miR393 de Arabidopsis) na via de

defesa antibacteriana ativada por PAMPs (flg22 de Pseudomonas syringae pv. tomato

DC3000). Quando induzido, o microRNA em questo atuaria inibindo a expresso de genes

relacionados sinalizao de auxinas na clula vegetal. Esta via parece funcionar de forma

antagnica via de defesa contra patgenos biotrficos, mediada pelo cido saliclico, e sua

inibio resultou na restrio do crescimento bacteriano. Da mesma forma, Zhang et al., em

2007 demonstraram que a MKK7 de Arabidopsis est envolvida na regulao negativa do

transporte polar de auxinas na clula. Alm disso, a superexpresso de MKK7 aumentou a

resistncia aos patgenos Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 e

Hyaloperonospora parasitica Noco2 e seu silenciamento resultou no comprometimento,

tanto da resistncia basal quanto da resistncia sistmica adquirida (SAR) desta espcie

(Zhang et al. 2007). Alm disso, o papel regulatrio dos prprios fatores de transcrio

WRKY tem sido desvelado atravs de estudos funcionais utilizando plantas

superexpressando, silenciadas ou mutantes para um ou mais genes WRKY. Em 2006, Xu

et al. demonstraram haver uma interao fsica (formao de homo- e heterocomplexos) e

funcional (redundante ou antagnica) entre AtWRKY18, AtWRKY40 e AtWRKY60 na

resposta de Arabidopsis a diferentes patgenos. No mesmo ano, Wang, Amornsiripanitch &

Dong demonstraram que 8 fatores de transcrio WRKY estavam entre os alvos diretos de

NPR1 que um co-fator transcricional da via mediada por SA no desenvolvimento da

SAR e que estes atuam tanto de forma positiva quanto negativa na regulao da SAR.

31

A existncia de um sistema eficiente de transformao fundamental para a

realizao de estudos funcionais em uma espcie. No caso da soja, cujos processos de

transformao gentica se mostram bem mais complexos, no existem muitos relatos de

estudos funcionais que se utilizem da transformao desta espcie. Em nosso laboratrio o

protocolo de transformao de soja via bombardeamento foi estabelecido por Droste,

Pasquali & Bodanese-Zanettini em 2002. Alm disto, foi desenvolvido um sistema de

transformao de soja que combina a tcnica de bombardeamento de partculas

transformao via A. tumefaciens (Droste et al., 2000). Em ambos os sistemas, embries

somticos secundrios so utilizados como tecido-alvo, sendo este bastante promissor como

ferramenta para a realizao de estudos funcionais nesta espcie.

At o presente momento, diversas pesquisas em sistemas heterlogos de

transformao (como o caso de Arabidopsis) vm gerando informaes relacionadas

funcionalidade de genes de soja. Dentre elas pode-se citar o trabalho realizado por Zhou et

al. em 2008, relacionando a funo de GmWRKY13, GmWRKY21 e GmWRKY54

tolerncia a estresses abiticos atravs de sua superexpresso em Arabidopsis; ou o trabalho

de Zhang et al., publicado no mesmo ano, que demonstrou que a superexpresso de

GmWRKY57 em tabaco conferiu tolerncia seca nas plantas transgnicas desta espcie.

Como exceo, pode-se citar o trabalho desenvolvido por Mazarei et al. em 2007, no qual

a participao de EREBPs (Ethylene-responsive Element-binding Proteins) nas vias de

regulao mediadas por ET e JA foi demonstrada a partir da expresso destes fatores de

transcrio em soja transformada geneticamente. At o momento, nenhum trabalho

envolvendo o estudo funcional de fatores de transcrio WRKY de soja atravs da

transformao gentica desta espcie foi publicado.

32

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

O presente trabalho pretende caracterizar e determinar a funo de genes que

codificam protenas WRKY em soja, relacionados com os processos de resposta ao ataque

do fungo P. pachyrhizi, agente causador da ferrugem asitica, atravs de estratgias de

gentica reversa e estudos de expresso gnica.

2.2. Objetivos especficos

1. Isolar as seqncias genmicas e codificantes dos genes selecionados;

2. Determinar o padro de expresso desses genes em plantas de soja, atravs de

PCR em tempo real (RT-qPCR);

3. Construir vetores de transformao vegetal contendo os genes clonados, tanto

para superexpresso quanto para o silenciamento (via RNAi) da expresso dos

mesmos;

4. Obter linhagens transgnicas de soja com as construes descritas no item c;

5. Caracterizar em nvel molecular, atravs de PCR e RT-qPCR,

as linhagens de soja estavelmente transformadas.

33

3. METODOLOGIA

3.1. Material

As cultivares IAS 5, BRSMG 68 (Vencedora), e MGBR 46 (Conquista) de soja

[Glycine max (L.) Merrill] foram utilizadas para a obteno de DNA, RNA e nos

experimentos de transformao gentica. Para a multiplicao dos vetores de clonagem e de

transformao de plantas foram utilizadas as cepas de Escherichia coli X-L1 Blue

(Stratagene) e Top10 (Invitrogen). A cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi

utilizada no co-cultivo com a soja no processo de transformao gentica vegetal.

3.2. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes de interesse

A seleo dos genes de estudo, envolvidos na resposta da soja infeco pelo fungo

P. pachyrhizi, ocorreu a partir de anlise de microarranjo realizada por van De Mortel et al.

em 2007, na qual genes codificando 46 fatores de transcrio da famlia WRKY

apresentaram nveis alterados de expresso aps a inoculao de folhas de soja com o

referido patgeno. A seleo foi realizada com base nos seguintes critrios:

1. Apresentar perfil de expresso diferencial ao longo do perodo analisado;

2. Apresentar perfil de expresso diferencial entre a cultivar suscetvel (Embrapa-48)

e a linhagem resistente (PI970230) utilizadas no estudo;

3. Apresentar perfil de expresso diferencial entre si.

Alm desses, a disponibilidade destas seqncias (ao menos parciais) no Genbank

tambm foi fator determinante para a seleo dos genes em estudo. Isto porque, no

momento de sua seleo (incio de 2008), os resultados obtidos no sequenciamento do

genoma da soja ainda estavam sendo montados (esta montagem s foi finalizada no incio

de 2009), de forma que as informaes obtidas no banco de dados onde este foi depositado

(Phytozome - http://www.phytozome.org/soybean) se mostravam ainda incompletas.

34

Atravs dos cdigos de acesso obtidos no microarranjo (Gene Chip Soybean

Genome Array, Affimetrix) foi realizada a anlise in silico dos genes selecionados. Suas

ESTs e seqncias codificantes parciais foram obtidas no NCBI GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) e suas seqncias genmicas foram obtidas no

Phytozome. Estas ltimas eram verificadas medida que atualizaes no banco de dados

eram realizadas.

O isolamento das seqncias genmica e codificante dos genes selecionados foi

realizado atravs do desenho de oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficos para

cada gene, seguido de clonagem em vetor pGEM-TEasy (Promega) seguindo o protocolo

fornecido pelo fabricante. Os vetores obtidos da clonagem dos fragmentos isolados em

pGEM-TEasy foram inseridos em Escherichia coli XL-1Blue por choque trmico, como

descrito no item 3.4. A fim de obter grande quantidade de cada produto clonado, colnias

recombinantes foram cultivadas em meio LB lquido contendo 50 g.ml-1 de ampicilina e

submetidas extrao de plasmdeo (Wizard Plus SV Minipreps, Promega), de acordo

com o manual do fabricante. Os plasmdeos purificados foram enviados para

seqenciamento, para a confirmao da identidade gnica.

3.3. Obteno de vetores para a transformao de soja

Construes utilizando vetores de expresso em planta foram obtidas visando a

superexpresso e o silenciamento dos genes em estudo. Estas foram obtidas atravs da

tecnologia Gateway de clonagem (Invitrogen), baseada na utilizao de stios de

recombinao homloga que garantem a insero bem sucedida de fragmentos de DNA no

vetor de interesse, sem a necessidade de utilizao de enzimas de restrio. Primeiramente,

o fragmento de DNA isolado foi amplificado com um primer direto especfico, para que

houvesse a adio da seqncia de nucleotdeos CACC em sua extremidade 5,

possibilitando a ligao adequada do fragmento de interesse ao vetor de entrada (pENTR

Directional TOPO, Invitrogen), uma vez que este possui uma extremidade GTGG

proeminente. Esta ligao gerou uma construo que, a seguir, foi utilizada para efetivar a

transferncia do fragmento de interesse para o vetor de destino (neste caso os vetores de

35

expresso em plantas) atravs de uma recombinao LR utilizando a enzima LR

clonase II (Invitrogen) de acordo com as especificaes do fabricante. As construes

obtidas contendo os fragmentos de interesse, tanto no vetor de entrada quanto nos vetores

de destino, foram mantidas em E. coli Top 10 transformada por choque trmico, como

descrito no item 3.4.

3.3.1. Construo de superexpresso

O vetor de destino utilizado para a superexpresso foi o pH7WG2D,1 (Karimi, Inz

& Depicker, 2002 - http://www.psb.ugent.be/gateway/) (Figura 6). Este um vetor binrio

no qual o fragmento de interesse inserido entre o promotor e o terminador do 35S do

CaMV (o promotor P35S altamente ativo na maioria das clulas vegetais); genes de

resistncia estreptomicina e espectinomicina permitem a seleo em bactria e a

seleo em planta se deve presena do gene hpt (higromicina fosfotransferase) que

confere resistncia higromicina. Este plasmdeo possui ainda, um gene reprter que

codifica uma Green Fluorescent Protein (gfp), cuja expresso controlada pelo promotor

rolD.

36

Figura 6. Vetor de superexpresso pH7WG2D,1 (http://www.psb.ugent.be/gateway/). Neste

vetor, o gene de interesse inserido entre os stios attR1 e attR2 atravs de recombinao homloga,

sendo sua expresso em planta controlada pelo promotor 35S de CaMV (em amarelo). Os genes de

resistncia a antibiticos esto representados em rosa: estreptomicina (Sm) e espectinomicina (Sp)

possibilitam a seleo de bactrias recombinantes, enquanto a seleo em planta obtida pela resistncia

higromicina (Hyg). O gene reprter gfp (em verde) expresso sob o controle do promotor rolD (em

amarelo). RB e LB (em cinza) representam as bordas direita (right border) e esquerda (left border) do

T-DNA (Modificado de Karimi, Inz & Depicker, 2002).

3.3.2. Construo de silenciamento

Para o silenciamento por RNAi, o vetor de destino utilizado foi o

pH7GWIWG2(II),0 (Karimi, Inz & Depicker, 2002 - http://www.psb.ugent.be/gateway/)

(Figura 7). Neste vetor binrio, o fragmento de interesse inserido duas vezes, de forma

direta e inversa, havendo uma seqncia de ntron (de Arabidopsis) entre as duas inseres,

37

permitindo assim a formao de um hairpin RNA que resulte na ativao do

silenciamento ps-transcricional de seqncias homlogas. A seleo em bactria feita

devido presena de genes de resistncia estreptomicina e espectinomicina e a seleo

em planta obtida pela resistncia higromicina (hpt). Alm disso, o plasmdeo possui um

gene que confere resistncia ao cloranfenicol (CmR) no meio da seqncia de ntron,

permitindo a seleo apropriada deste.

Figura 7. Vetor de silenciamento pH7GWIWG2(II),0 (http://www.psb.ugent.be/gateway/).

Neste vetor, o fragmento de interesse inserido duas vezes, de forma direta e reversa, entre os stios attR1

e attR2 e expresso em planta sob controle do promotor 35S de CaMV (em amarelo). Para que ocorra a

formao apropriada do hairpin, uma seqncia de ntron (em azul) est situada entre os fragmentos

clonados. Os genes de resistncia a antibiticos esto representados em rosa: a seleo do ntron

realizada atravs da resistncia ao cloranfenicol (Cm) em bactria, estreptomicina (Sm) e espectinomicina

(Sp) so utilizadas na seleo de colnias recombinantes e a seleo em planta obtida pela resistncia

38

higromicina (Hyg). RB e LB (em cinza) representam as bordas direita (right border) e esquerda (left

border) do T-DNA (Modificado de Karimi, Inz & Depicker, 2002).

3.4. Transformao de Escherichia coli

Clulas termo-competentes de E.coli foram preparadas conforme protocolo descrito

a seguir: colnias isoladas foram cultivadas em 3 ml de meio LB lquido, na presena do

antibitico adequado para a seleo de cada cepa 10 g.ml-1 de tetraciclina para X-L1

Blue e 20 g.ml -1 de estreptomicina para Top10 sob agitao constante de 225 rpm, a

37C por 16 h. Uma pr-cultura foi feita (500 l em 20 ml de meio lquido com

antibitico), por 2 h e 30 min a 37C, sob agitao (225 rpm); sendo esta transferida para

tubos de centrfuga estreis e centrifugada (5.000 rpm por 10 min). Aps o descarte do

sobrenadante, adicionou-se ao precipitado 5 ml de CaCl2 0,1 M, seguido de

homogeneizao (vrtex). As clulas foram mantidas no gelo por 20 min, sendo ento

repetidas a centrifugao (5.000 rpm por 10 min) e o descarte do sobrenadante. Em

seguida, adicionou-se mais uma vez CaCl2 0,1 M (agora 0,5 ml) seguido da ressuspenso

do precipitado no gelo. Este foi mantido no gelo at o momento da transformao, realizada

por choque trmico, como descrito a seguir: a 100 l do precipitado bacteriano foram

adicionados 300 g do produto de cada ligao; a mistura foi mantida no gelo por 30 min,

sendo ento incubada a 42C por 2 min e levada mais uma vez ao gelo, onde foi mantida

por 2 min. A seguir, adicionou-se 400 l de meio LB lquido ao produto da transformao,

sendo este incubado a 37C por 40 min. Aps esse perodo, as clulas bacterianas foram

cultivadas em meio LB slido acrescido dos antibiticos de seleo adequados para cada

caso: para o vetor pGEM-TEasy, adicionou-se ao meio de cultivo 50 g.ml-1 de

ampicilina alm de 24 l de X-Gal (40 mg.ml-1) e 10 l de IPTG (1M)1. Colnias de E.

1 O Vetor pGEM-TEasy possui mecanismo de seleo de recombinantes atravs do operon lac: a

seqncia codificante do gene lacZ est inserida no stio mltiplo de clonagem, resultando na produo da

enzima -galactosidase (colnias azuis). A insero bem sucedida do fragmento de interesse nesta regio

resulta na interrupo do gene lacZ; neste caso a enzima no produzida e as colnias bacterianas

recombinantes so brancas.

39

coli Top10 recombinantes foram selecionadas pela adio de 50 g.ml-1 de canamicina para

o vetor de entrada (pENTR Directional TOPO); 20 g.ml -1 de estreptomicina e 75 g.ml -

1 de espectinomicina para o vetor de superexpresso (pH7WG2D,1) e 20 g.ml -1 de

estreptomicina, 75 g.ml -1 de espectinomicina e 100 g.ml -1 de cloranfenicol para o vetor

de silenciamento [pH7GWIWG2(II),0].

3.5. Transformao de Agrobacterium tumefaciens

Clulas eletro-competentes de A. tumefaciens LBA4404 foram preparadas conforme

o protocolo descrito a seguir: colnias isoladas foram cultivadas em 5 ml de meio LB

lquido com rifampicina (50 g.ml -1) sob agitao constante de 225 rpm, a 28C por 48 h.

Pr-culturas desta foram feitas (500 l em 100 ml de meio lquido com rifampicina), com

tempos diferentes. Aps 16h, a densidade ptica (D.O.) destas culturas foi medida em

espectrofotmetro, sendo utilizada a cultura que apresentasse D.O.600nm 0,5. A cultura

escolhida foi ento colocada em frascos GSA (30 ml de cultura por frasco de 40 ml) e

centrifugada a 5.000 rpm por 15 min a 4C. Descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi

ressuspenso em 150 ml de gua milli-Q a 4C. Este procedimento foi repetido trs vezes,

sendo o precipitado ressuspenso sucessivamente em 100 ml de gua milli-Q a 4C, 20 ml

de glicerol 10% estril e 2 ml de glicerol 10% estril. As clulas foram divididas em

alquotas de 100 l e armazenadas em nitrognio lquido at o momento da transformao.

Esta foi realizada por eletroporao, onde aproximadamente 200 g do DNA recombinado

foram homogeneizados a 100 l de bactria competente, sendo a mistura submetida a uma

diferena de potencial de 500 volts em eletroporador (BioRad Gene Pulser II).

Imediatamente aps o choque, foram adicionados 400 l de LB lquido s clulas

eletroporadas, sendo a suspenso cultivada por 1 h a 28C sem agitao, seguida de 2 h a

28C sob agitao constante de 225 rpm. A suspenso foi ento plaqueada em meio slido

contendo rifampicina (50 g.ml -1) estreptomicina (20 g.ml -1) e espectinomicina (75

g.ml -1). O processo foi repetido para cada construo obtida.

40

3.6. Extrao de DNA

A extrao de DNA genmico de folhas de soja foi realizada utilizando-se o tampo

CTAB, conforme protocolo descrito por Doyle & Doyle em 1987, com algumas

modificaes. Aps desidratao com slica-gel (por 48 h, no mnimo), colocou-se

aproximadamente 100 mg de cada amostra foliar em um tubo de micro-centrfuga, sendo

este mergulhado diretamente no nitrognio lquido e a amostra macerada com pistilo. A

separao dos cidos nuclicos de protenas foi realizada em duas etapas: primeiramente

adicionando-se fenol / clorofrmio (1:1) e em seguida clorofrmio / lcool isoamlico

(24:1). Na etapa de precipitao com isopropanol, adicionou-se meio volume de acetato de

amnio 7,5 M para a purificao do DNA precipitado. O DNA extrado foi solubilizado em

50 l de gua milli-Q estril e as amostras foram quantificadas atravs do sistema Qubit

(Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, Invitrogen).

3.7. Extrao de RNA total

O material vegetal foi coletado e imediatamente congelado em nitrognio lquido,

sendo armazenado a -80C at o momento da extrao de RNA total. Esta foi realizada com

o reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. Aps a extrao, a

fim de eliminar contaminantes de DNA genmico, todas as amostras foram tratadas com

DNAse (Promega), sendo ento quantificadas atravs do sistema Qubit (Quant-iT

RNA Assay Kit, Invitrogen).

3.8. Sntese de cDNA

A sntese de cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit de

transcrio reversa M-MLV (Promega), de acordo com as instrues do fabricante. Para

cada reao, utilizou-se 10 l de amostra de RNA tratado com DNAse. Aps a sntese, o

volume final obtido de cada amostra (50 l) foi diludo dez vezes (soluo estoque) em

gua milli-Q estril. Para uso nas reaes de RT-qPCR, a soluo estoque foi novamente

diluda 10 vezes (diluio de 1:100).

41

3.9. Reao em cadeia da polimerase (PCR)

As reaes de amplificao dos DNAs genmicos, plasmidiais e cDNAs foram

geralmente realizadas utilizando-se: 1 l de MgCl2 50 mM, 2,5 l de tampo 10x, 0,5 l de

dNTPS 10 mM, 1 l de cada primer (direto e reverso) 10 mM, 0,25 l de Taq DNA

Polimerase (5 U/ l), 17,75 l de gua milli-Q estril e 1 l de DNA. As condies

utilizadas para a polimerizao foram: desnaturao inicial a 94C por 5 min, 35 ciclos de

desnaturao a 94C por 1 minuto, anelamento a 59C por 1 minuto, extenso a 72C por 1

minuto e extenso final a 72C por 5 min. As amplificaes foram submetidas

eletroforese e os fragmentos foram visualizados em gel de agarose (de 0,8 a 1,5%) corados

com GelRed (Biotium, Inc) ou brometo de etdio. Uma lista com os primers utilizados

nas reaes de PCR encontra-se na Tabela 1.

42

Tabela 1. Lista dos primers utilizados nas reaes de PCR

3.10. PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR)

As reaes de RT-qPCR foram realizadas em aparelho StepOne Plus Real Time

PCR System (Applied Biosystems), conforme as seguintes condies: uma etapa de

43

desnaturao inicial de 5 min a 94oC, seguida por 45 ciclos de 10 s a 94oC, 15 s a 60oC e 15

s a 72oC. Aps a amplificao, as amostras foram mantidas por 2 min a 40oC para

reanelamento e, ento, aquecidas de 55 at 99oC com uma taxa de incremento de 0.1oC/s

para aquisio de dados e obteno da curva de desnaturao. As reaes foram feitas em

um volume final de 20 l, sendo os mesmos compostos de 2 l de tampo PCR 10x

(Invitrogen), 1,2 l de MgCl2 50 mM, 0,4 l de dNTPs 5 mM, 0,4 l de cada par de

primers 5 M, 4,95 l de gua ultra pura, 1,0 l de SYBR Green (1:100.000, Molecular

Probes Inc.) e 0,05 l de Platinum Taq DNA polimerase (5 U/l, Invitrogen). A este mix,

adicionou-se: 10 l de cDNA (diluio 1:100) nas anlises de expresso gnica; ou 10 l de

DNA genmico em diluies seriadas (1:100, 1:1.000 e 1: 10.000), para a estimativa do

nmero de cpias do transgene. A temperatura de anelamento de todos os primers foi

ajustada para 60C. Uma lista com os primers utilizados nas reaes de RT-qPCR

encontra-se na Tabela 2.

Tabela 2. Lista dos primers utilizados nas reaes de RT-qPCR

Nas anlises de expresso gnica, os resultados foram expressos atravs de uma

quantificao relativa a dois genes utilizados como controles endgenos da reao F-box

44

protein family e metalloprotease (Libault et al. 2008) atravs da metodologia 2-Ct

descrita por Livak & Schmittgen em 2001.

A estimativa do nmero de cpias do transgene por RT-qPCR foi realizada atravs

da Quantificao relativa pela anlise da curva padro (Shou et al., 2004). Nesta tcnica,

a diluio seriada das amostras possibilita a obteno de curvas-padro relativas, onde os

valores de Ct entre o gene alvo e um controle endgeno so comparados. Este controle

endgeno um gene cujo nmero de cpias no genoma em estudo pr-estabelecido,

sendo utilizado para a normalizao da reao os valores obtidos nas diluies para o

gene-alvo so divididos pelos valores obtidos para o controle endgeno (quantidade

relativa ao gene endgeno,1). Alm disso, necessria a utilizao de um calibrador,

ou seja, uma planta onde o nmero de cpias do gene-alvo conhecido. Os valores

normalizados obtidos nas amostras analisadas so divididos pelos valores normalizados

obtidos nas amostras do calibrador (nmero de cpias, 2) (Bubner & Baldwin, 2004;

Shou et al., 2004). O controle endgeno utilizado foi o gene da lectina Le1 (Schmidt et al.

2001) e plantas de soja WT foram utilizadas como calibradores.

3.11. Anlises da expresso gnica ao longo do desenvolvimento e em resposta a estresses

3.11.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento

Plantas de soja da cultivar MGBR 46 (Conquista) foram semeadas em casa de

vegetao e as amostras coletadas como especificado na Tabela 3, sendo imediatamente

congeladas em nitrognio lquido e armazenadas a -80C at o momento da extrao de

RNA. De um grupo de plantas jovens, foram coletadas amostras de raiz e folha, 14 dias

aps a semeadura destas. De outro grupo, trs meses aps a semeadura foram coletadas

amostras de flor e de folha. No ms seguinte foram coletadas deste mesmo grupo de

plantas maduras amostras de caule, alm das amostras de vagem e semente. Para cada

tipo de amostra analisada, foram utilizadas quatro replicatas biolgicas (quatro vasos),

sendo cada uma destas composta por um pool de quatro plantas diferentes.

45

Tabela 3. rgos utilizados nas anlises de expresso gnica e as respectivas fases do

desenvolvimento nas quais estes foram coletados.

3.11.2. Infeco por P. pachyrhizi

O experimento de infeco por P. pachyrhizi foi realizado em abril de 2009, na

sede da Embrapa Soja (Londrina, PR). Plantas de soja da cultivar Embrapa 48

(gentipo suscetvel) e da linhagem PI 561356 (gentipo resistente) foram semeadas em

casa de vegetao seis vasos com cada gentipo, trs plantas por vaso. Trs semanas

aps o incio do cultivo, realizou-se a inoculao com o patgeno: uredinisporos foram

coletados e ressuspensos em gua contendo gotas de Tween-20, para uma concentrao

final de 2,6 x 104 esporos. ml-1. A soluo foi borrifada nas folhas de metade das plantas

de cada gentipo, sendo a outra metade utilizada como controle (mock-inoculated). A

inoculao ocorreu aps as 18h ( noite a umidade maior, facilitando o processo de

46

infeco pelo fungo) e as plantas inoculadas permaneceram por doze horas cobertas por

plstico. Triflios foram coletados 1, 12, 24, 48, 96 e 192 hpi, sendo imediatamente

congelados em nitrognio lquido e armazenados a -80C at o momento da extrao de

RNA.

3.11.3. Estresse salino

Aps duas semanas de cultivo em cmara de crescimento (em copos plsticos

contendo vermiculita), plantas de soja foram tratadas com soluo salina (150 mM de

NaCl), duas horas aps o incio do fotoperodo. Amostras de quatro copos, com duas

plantas cada, foram utilizadas como controle (mock) e a mesma quantidade foi tratada.

Amostras de razes e folhas foram coletadas 6 h aps o tratamento, sendo imediatamente

submetidas extrao de RNA.

3.12. Anlises estatsticas

Os resultados obtidos nos experimentos de quantificao da expresso gnica (item

3.11) foram avaliados quanto a sua significncia estatstica atravs das seguintes anlises:

one-way ANOVA seguida do teste de Tukey HSD (p < 0,05) (SAS/STAT Software v.8)

nas anlises de expresso em diversos rgos e fases do desenvolvimento; e teste - T de

Student (p < 0,05) (Microsoft Office Excel 2007) nas anlises de expresso na infeco

por P. pachyrhizi e em condies de estresse salino.

3.13. Transformao gentica de soja

Uma lista com os meios de cultivo vegetal utilizados nas etapas descritas a seguir

apresentada na Tabela 4. Os conjuntos embriognicos submetidos a cada experimento de

transformao realizado so descritos na Tabela 5.

47

3.13.1. Induo de embriognese somtica e obteno de tecido embriognico

proliferativo

Vagens imaturas de soja foram colhidas de plantas cultivadas no campo e

esterilizadas pela imerso em etanol 70% (1 minuto), seguida da imerso em soluo de

hipoclorito de sdio 4% contendo gotas de Tween-20 (15 min) e de trs lavagens

subseqentes, com gua destilada autoclavada. Para a induo de embriognese somtica,

sementes (3-5mm) foram excisadas das vagens esterilizadas. As metades dos cotildones

removidos foram utilizadas como explantes e colocadas em meio de induo D40. Aps 30

dias, os explantes embriognicos foram transferidos para meio de proliferao semi-slido

D20. Aps 14 dias, os conjuntos de embries secundrios foram removidos dos cotildones

e transferidos para meio fresco. Sub-culturas destes para meio D20 fresco foram realizadas

a cada 14 dias. A cultura in vitro foi mantida em cmara de crescimento a 26+1C de

temperatura, com fotoperodo de 16 h e intensidade luminosa de 20 mol m-2s-1.

3.13.2. Transformao por biobalstica (bombardeamento de partculas)

Este processo de transformao foi realizado atravs de um acelerador de partculas

de baixa presso (PIG Finer et al., 1992), segundo protocolo descrito por Finer &

McMullen em 1991. Previamente ao bombardeio, placas de Petri com conjuntos de

embries globulares (15 conjuntos por placa) foram abertas em capela de fluxo laminar

(por 15 min) para que estes fossem parcialmente desidratados, reduzindo assim a presso de

turgor do material vegetal (Vain et al. 1993). s partculas de tungstnio diludas em gua

estril (100 mg.ml-1), adicionou-se 2 l do DNA-alvo (250 g.l-1). A esta mistura, foram

adicionados 25 l de CaCl2 2,5 M e 10 l de espermidina 0,1 M. Aps homogeneizao e

incubao no gelo (5 min), 45 l do sobrenadante foi descartado, sendo 2 l do precipitado

utilizado em cada disparo.

48

3.13.3. Transformao via sistema integrado bombardeamento /

Agrobacterium

Linhagens de A. tumefaciens recombinante foram preparadas de acordo com

procedimento descrito por Droste et al., em 2000: colnias isoladas foram cultivadas por 48

h em meio LB lquido contendo rifampicina (50 mg.l-1), canamicina (50 mg.l-1) e

acetoseringona (100 M), a 28C sob agitao continua. Aps centrifugao, as clulas

foram ressuspensas em meio lquido D10 com 100 M de acetoseringona (D.O. 600nm final

de 0,3).

A seguir, realizou-se o protocolo de bombardeamento, como descrito no item

3.13.2. Neste caso, as partculas foram preparadas livres de DNA; servindo apenas para

causar micro-ferimentos nas clulas vegetais bombardeadas, facilitando a subseqente

infeco por A. tumefaciens. Aps serem bombardeados, os conjuntos de embries foram

incubados com a suspenso bacteriana durante 20 min, sendo a seguir, secos em papel filtro

estril (para a retirada do excesso de bactria) e co-cultivados por 48 h em meio D20 com

acetoseringona (100 M). Ao co-cultivo sucedeu-se a lavagem dos embries em gua

destilada autoclavada, seguida de secagem em papel filtro estril e transferncia para meio

D20 contendo 250 mg.l-1 de cefotaxima e 250 mg.l-1 de vancomicina (Wiebke et al., 2006).

Estes antibiticos foram adicionados aos meios de cultivo subseqentes, inclusive durante o

perodo de seleo por higromicina, at que o tratamento completasse 49 dias, garantindo a

eliminao total da bactria utilizada na transformao.

3.13.4. Seleo de transformantes, regenerao e aclimatao das plantas

obtidas

Aps serem submetidos a qualquer um dos processos de transformao gentica

referidos acima, os conjuntos embriognicos de soja foram submetidos seleo de

transformantes atravs do cultivo vegetal em doses crescentes de higromicina. Esta

seleo teve incio 10 dias aps a realizao de cada experimento de transformao,

quando se adicionou 12,5 mg.l-1 de higromicina ao meio de proliferao de embries

49

(D20). Aps 21 dias, a dose de higromicina foi aumentada para 25 mg.l-1. Aps trs

meses de seleo, ao total, conjuntos de embries resistentes higromicina (que

permaneceram verdes) foram destacados dos embries no resistentes e proliferados em

meio D20 por trs meses, para que os eventos de transformao obtidos fossem

multiplicados. A seguir, os conjuntos proliferados foram transferidos para meio MSM6

(acrescido de 1% de carvo ativado) para iniciarem seu processo de histodiferenciao e

maturao, onde permaneceram por 30 dias. Por mais 30 dias, os embries

permaneceram em meio MSM6 (sem carvo ativado) para que os processos de

histodiferenciao e maturao fossem completados. Embries maduros obtidos

passaram por um processo de dessecao (Buchheim et al. 1989), permanecendo em

placas sem meio de cultura por 6 h; sendo logo em seguida transferidos para meio MSO

para a converso em plntulas (em placas de Petri) e subseqente regenerao (em

frascos). Plntulas regeneradas e enraizadas foram aclimatadas; primeiramente em copos

plsticos contendo vermiculita e cobertos com filme plstico, sendo expostas de forma

gradual s condies ambientais; e aps 10 dias (no mnimo), transferidas para vasos

com solo orgnico, sendo mantidas em cmara de crescimento com temperatura mdia

de 27+1C, fotoperodo de 16 h e intensidade luminosa de aproximadamente 60 mol m-

2 s-1.

50

Tabela 4. Composio dos meios de cultivo vegetal utilizados na cultura de embries somticos e na

transformao gentica de soja.

Bailey, Boerma & Parrott, 1993 Wright et al., 1991 Droste, Pasquali & Bodanese-Zanettini, 2000 Finer & McMullen, 1991 * Murashige & Skoog, 1962 ** Gamborg, Miller & Ojima, 1968

51

Tabela 5. Conjuntos embriognicos submetidos aos experimentos de transformao realizados.

3.13.5. Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da

expresso do gene reprter

Como previamente mencionado, o gene gfp est presente entre as bordas do T-DNA

do vetor de superexpresso utilizado (pH7WG2D,1). Este utilizado como gene reprter,

uma vez que o monitoramento da integrao do T-DNA ao genoma vegetal pode ser feito

atravs da visualizao da expresso de gfp sob luz azul. Esta foi realizada em microscpio

de fluorescncia Olympus (filtro BP; comprimentos de onde de excitao e emisso de

488 e 505-530 m, respectivamente), com cmera fotogrfica acoplada. As imagens foram

obtidas atravs do software QCapture Pro 6 (QImaging).

52

4. RESULTADOS

4.1. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes para estudo

Em 2007, van De Mortel et al. detectaram, atravs de anlise de microarranjo, a

expresso diferencial de 46 genes que codificam protenas WRKY em resposta infeco

por ASR. Alguns destes foram pr-selecionados para estudo, de acordo com seu perfil de

expresso. Entretanto, em alguns casos a etiqueta obtida atravs do cdigo do

microarranjo era insuficiente para a subseqente identificao in silico do gene, de forma

que apenas dois genes, os quais possuam uma poro considervel de sua regio

codificante disponvel no GenBank foram escolhidos para o presente estudo. Atravs de

seus respectivos cdigos do chip de microarranjo [GmaAffx.51816.1.S1_at e

Gma.1256.1.S1_at, Gene Chip Soybean Genome Array (Affimetrix)], as seqncias das

ESTs referentes a estes genes (BE804769 e BI967912) foram obtidas no GenBank. A busca

por sua identidade gnica no GenBank (ferramenta blastn), resultou em duas seqncias

parciais codificantes (EU019582.1 e EU019564.1) para ambas as ESTs, respectivamente

anotadas como GmWRKY46 e GmWRKY20. Curiosamente, quando estes dois fragmentos

so alinhados, eles se complementam de forma parcial, aparentemente representando as

extremidades amino- e carboxi-terminal da mesma protena (Figura 8) e sua seqncia

traduzida possui todas as caractersticas estruturais comuns aos membros da famlia dos

fatores de transcrio WRKY. Alm disso, ao se realizar uma busca por suas respectivas

seqncias genmicas no Phytozome, ambas as ESTs apresentaram alta similaridade com

duas regies distintas do genoma (Figura 9): scaffold_78 e scaffold_92, que foram

identificadas respectivamente como Glyma05g36970 e Glyma08g02580, aps o trmino da

organizao dos dados do genoma. Estes resultados indicavam que, apesar do resultado

obtido no GenBank, as ESTs e seus respectivos perfis de expresso se referem a dois genes

distintos, com alto grau de identidade.

53

Figura 8. Alinhamento das seqncias traduzidas das ESTs obtidas no GenBank, anotadas

respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Asteriscos (*) indicam resduos idnticos, dois

pontos (:) indicam resduos conservados e pontos (.) indicam resduos semi-conservados. O programa

ClustalW v1.81 (http://align.genome.jp/) foi utilizado para o alinhamento.

54

Figura 9. Resultado das buscas realizadas no Phytozome (www.phytozome.org/soybean). As

seqncias genmicas correspondentes s ESTs obtidas no GenBank para GmWRKY20 (A) e GmWRKY46

(B) foram buscadas no Phytozome (ferramenta blast genome). Nota-se que para ambas as ESTs

utilizadas, as mesmas duas regies do genoma (Gm05 e Gm08) apresentaram correspondncia, sendo que

cada uma destas regies apresentou maior ou menor grau de identidade com uma das duas seqncias.

Na tentativa de resolver esta contradio e confirmar a presena de dois genes

codificando protenas muito similares, primers foram desenhados visando o isolamento

tanto da seqncia genmica quanto da codificante dos genes em questo. Os fragmentos

obtidos foram clonados em vetor pGEM-TEasy (Promega) e enviados para

seqenciamento (dados no mostrados). O alinhamento das seqncias completas de

55

aminocidos de GmWRKY20 e GmWRKY46, obtidas a partir de suas seqncias de

nucleotdeos codificantes, pode ser visualizado na Figura 10. Nela esto ressaltados os

resduos de aminocidos conservados presentes em cada gene. Sua anlise possibilitou a

classificao de ambos os genes no grupo III da superfamlia de fatores de transcrio

WRKY (Eulgem et al., 2000). A Figura 11 uma representao grfica da estrutura de

xons e ntros de ambos os genes, ressaltando a presena uma pequena insero/deleo de

12 nucleotdeos situada na primeira juno xon/ntron, sendo esta a maior diferena

estrutural apresentada entre as duas seqncias. Um resumo com os dados obtidos sobre os

genes em estudo apresentado na Tabela 6.

Figura 10. Alinhamento dos aminocidos deduzidos a partir seqncias codificantes completas

clonadas de GmWRKY20 e GmWRKY46 e identificao dos resduos conservados entre WRKYs

grupo III. Asteriscos (*) indicam resduos idnticos, dois pontos (:) indicam resduos conservados e

pontos (.) indicam resduos semi-conservados. O programa ClustalW v1.81 (http://align.genome.jp/) foi

utilizado para o alinhamento. A identificao dos resduos de aminocidos conservados entre os fatores de

56

transcrio WRKY (em rosa) e do padro C2-HC nos provveis stios de ligao a zinco (em verde),

permitiu a classificao desses genes no grupo III da superfamlia (de acordo com Eulgem et al., 2000).

Figura 11. Representao grfica comparativa da estrutura de xons e ntrons de GmWRKY20

e GmWRKY46. Os xons esto representados por blocos coloridos e os ntrons por linhas cinza. A

diferena de tonalidade entre o primeiro xon de cada gene (verde claro / verde escuro) representa a

diferena de tamanho apresentada por eles: esta causada por uma insero / deleo de 12 nucleotdeos

(linhas pontilhadas verticais) ao final do primeiro xon, resultando na principal diferena estrutural

existente entre os genes em estudo. Pb, pares de base.

Tabela 6. Nomenclatura, caractersticas estruturais, classificao, localizao no genoma e

cdigos de acesso dos genes selecionados para estudo.

* de acordo com Eulgem et al., 2000.

57

4.2. Anlises da expresso gnica 4.2.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento

O nvel de expresso de transcritos de GmWRKY20 e GmWRKY46 foi medido em

diferentes rgos e fases do desenvolvimento de plantas de soja (Figura 12). Nas condies

em que o experimento foi realizado, a expresso de ambos os genes no foi detectada em

nenhuma das amostras de flor nem de semente utilizadas. Na maioria dos rgos

analisados, os nveis de expresso entre GmWRKY20 e GmWRKY46 no diferiram

estatisticamente, exceto na vagem. A expresso de GmWRKY20 foi significativamente

maior no caule de plantas maduras, sendo a folha dessas plantas o rgo que apresentou

menor expresso. De forma semelhante, o maior nvel de expresso de GmWRKY46 foi

encontrado no caule de plantas maduras. Entretanto, o nvel de expresso apresentado em

razes de plantas jovens tambm foi significativamente maior, se comparado aos outros

rgos analisados.

58

Figura 12. Expresso relativa de GmWRKY20 e GmWRKY46 em diferentes rgos. No grfico apresentada uma anlise comparativa entre os nveis de expresso obtidos nos diversos rgos

utilizados. Os valores foram normalizados em relao ao nvel de expresso obtido para GmWRKY46 no

caule (atribudo arbit