01520 Tong Quan Tai Lieu Ve Biosensor.doc.Doc

Ñoà aùn: Toång quan taøi lieäu veà Biosensor

CHÖÔNG 1

GIÔÙI THIEÄU CHUNG VEÀ BIOSENSOR

1.1 LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN CUÛA BIOSENSOR

Naêm 1956, giaùo sö Leland Clark Jnr – ngöôøi khai sinh veà khaùi nieäm ñieän cöïc sinh hoïc (Biosensor) ñaõ coù coâng boá veà ñieän cöïc Oxy. Döïa treân kinh nghieäm vaø taâm huyeát cuûa mình, oâng ñaõ phaùt trieån lónh vöïc phaân tích giuùp coù theå ño löôøng ñöôïc trong cô theå.

Naêm 1962, taïi Hoäi nghò Khoa hoïc ôû Vieän haøn laâm New York, oâng ñaõ coù baøi dieãn thuyeát: “Laøm theá naøo ñeå caùc ñieän cöïc ñieän hoùa (phöông phaùp pH, cöïc phoå, pheùp ño ñieän theá, pheùp ño ñoä daãn ñieän) thoâng minh hôn”. Trong ñoù, oâng trình baøy caùch laøm ñieän cöïc ñieän hoùa thoâng minh hôn baèng caùch theâm enzym vaøo maùy chuyeån ñoåi nhö nhöõng chieác baùnh sandwich ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp maøng.

Naêm 1975, yù töôûng cuûa Clark trôû thaønh hieän thöïc vôùi söï coâng boá cuûa coâng ty Yellow Springs Instrument (Ohio) veà maùy phaân tích glucose döïa treân vieäc ño doøng ñieän cuûa hydro peroxide. Ñaây laø laàn ñaàu tieân caùc phoøng thí nghieäm treân theá giôùi phaân tích döïa treân moät Biosensor. Cuõng vaøo naêm naøy, Biosensor tieán theâm moät böôùc môùi laø khi Divis ñeà xuaát raèng vi khuaån coù theå ñöôïc duøng nhö moät yeáu toá sinh hoïc trong ñieän cöïc vi khuaån ñeå ño haøm löôïng röôïu.

Naêm 1976, La Roche (Thuïy Só) giôùi thieäu maùy phaân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) trong ñoù söû duïng taùc nhaân trung gian hexacyanoferrat hoøa tan ñeå chuyeån caùc electron töø lactatdehydrogenase tôùi moät ñieän cöïc. Maëc duø khoâng thaønh coâng treân thöông tröôøng nhöng laø böôùc ñoät phaù quan troïng cho moät theá heä cuûa Biosensor ñöôïc öùng duïng trong theå thao vaø chaån ñoaùn laâm saøng.

Naêm 1987, ñieän cöïc enzym screen-printed ñöôïc coâng boá bôûi Medisense (Cambridge, USA) vôùi duïng cuï ño coù kích thöôùc nhö moät chieác buùt cho pheùp giaùm saùt löôïng glucose trong maùu taïi nhaø. Ñieän cöïc naøy ñöôïc thieát keá laïi laøm cho thoâng duïng hôn vaø soá löôïng baùn cuûa Medisense ñaõ ñaït tôùi 175 trieäu

1


ñoâla naêm 1996 khi hoï ñöôïc Abbort mua laïi. Hieän nay Haõng Boehringer, Manheim vaø Bayer ñang caïnh tranh nhau raát gay gaét veà Biosensor vaø löôïng baùn ra cuûa ba coâng ty chieám öu theá treân thò tröôøng Biosensor cuûa theá giôùi tôùi 85%.

1.2. KHAÙI NIEÄM VEÀ BIOSENSOR

Biosensor thöïc chaát laø moät thieát bò phaân tích chuyeån moät tín hieäu sinh hoïc thaønh moät tín hieäu ñieän. Ñaàu tieân, Biosensor seõ nhaän daïng hieän töôïng vaø bieân dòch thaønh moät ñaëc tính coù theå ñònh löôïng ñöôïc, sau ñoù ñaëc tính ñònh löôïng naøy ñöôïc chuyeån ñoåi thaønh moät tín hieäu ñieän bôûi moät boä bieán naêng. Trong Biosensor, hieän töôïng ñöôïc nhaän daïng bôûi moät heä thoáng sinh hoïc goïi laø cô quan thuï caûm sinh hoïc (bioreceptor). Heä thoáng naøy seõ tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi maãu phaân tích gaây ra phaûn öùng vaø taïo thaønh hôïp chaát nhaïy caûm cho Biosensor. Cô quan thuï caûm sinh hoïc coù ñaëc tính choïn loïc ñaëc bieät ñoái vôùi chaát phaân tích.

Hình 1.1. Sô ñoà caáu taïo cuûa biosensor

Chuù thích: Chaát xuùc taùc sinh hoïc (a) chuyeån cô chaát (S) thaønh saûn phaåm (P). Boä bieán naêng (b) chuyeån saûn phaåm phaûn öùng thaønh tín hieäu ñieän. Boä khueách ñaïi (c) nhaèm khueách ñaïi tín hieäu ñieän cuûa boä bieán naêng. Boä vi xöû lyù tín hieäu (d). Maøn hình hieån thò (e).

1.3.ÑAËC ÑIEÅM – YEÂU CAÀU CUÛA BIOSENSOR

Ñeå ñònh löôïng, Biosensor phaûi ñaùp öùng yeâu caàu lieân quan ñeán ño löôøng: khaû naêng laëp laïi, khaû naêng taùi söû duïng cao,

2


tính choïn loïc, tính nhaïy caûm, vuøng traû lôøi tuyeán tính vaø thôøi gian ñaùp öùng tín hieäu toát.

Caùc pheùp ño coù ñoä laëp laïi toát neáu nhö hai loaït keát quaû thu ñöôïc töông töï nhau ñöôïc thöïc hieän bôûi cuøng ngöôøi phaân tích, söû duïng cuøng biosensor trong cuøng moät maãu phaân tích.

Phöông phaùp ño coù khaû naêng taùi söû duïng cao neáu caùc keát quaû tröôùc coù theå ñaït ñöôïc khi tieán haønh phaân tích laëp laïi laàn hai.

Tính choïn loïc cuûa biosensor theå hieän ôû khaû naêng nhaän ra moät hôïp chaát ñôn trong hoãn hôïp caùc caáu töû cuûa maãu, khaû naêng naøy phuï thuoäc vaøo cô quan thuï caûm sinh hoïc vaø boä bieán naêng. Moät biosensor coù tính choïn loïc cao neáu nhö thaønh phaàn taïp chaát cuûa maãu thaáp.

Tính nhaïy caûm cuûa biosensor theå hieän ôû söï thay ñoåi veà löôïng thì seõ gaây ra söï thay ñoåi veà tín hieäu traû lôøi:

a = s m

Trong ñoù a : Ñoä dao ñoäng veà bieân ñoä cuûa doøng ra

m : Ñoä dao ñoäng veà bieân ñoä cuûa doøng vaøo

s : Ñoä nhaïy caûm cuûa biosensor, ñaëc tröng cho möùc ñoä phuø hôïp cuûa biosensor trong moät öùng duïng cuï theå.

Ñoái vôùi Biosensor ño baèng ñieän theá thì bieân ñoä cuûa tín hieäu traû lôøi tyû leä thuaän vôùi logarite cuûa noàng ñoä chaát phaân tích. Theo ñònh luaät Nernst: a = s (logc).

Vuøng tín hieäu tuyeán tính thu ñöôïc laø moät ñöôøng cong hieäu chænh cuûa tín hieäu traû lôøi vôùi noàng ñoä khaùc nhau cuûa chaát phaân tích. Ñöôøng cong chæ thaät söï coù yù nghóa neáu tieán haønh hieäu chænh caû hai loaït noàng ñoä taêng vaø giaûm. Ñöôøng cong hieäu chænh goïi laø toát neáu nhö tín hieäu traû lôøi oån ñònh theo thôøi gian.

Thôøi gian ñaùp öùng khaù daøi bôûi baûn chaát cuûa ñöôøng cong hieäu chænh, noù cho bieát moät phöông phaùp ño cho tín hieäu traû lôøi nhanh hay chaäm khi thay ñoåi noàng ñoä.

3


1.4.NGUYEÂN LYÙ HOAÏT ÑOÄNG CUÛA BIOSENSOR

Caùc chaát caàn phaân tích trong maãu phaân tích seõ ñi vaøo trong ñieän cöïc. Maøng ngoaøi (external membrane) cuûa biosensor seõ cho caùc chaát caàn phaân tích thaám qua. Caùc thaønh phaàn sinh hoïc (enzym, teá baøo vi sinh vaät, moâ, cô quan) seõ phaûn öùng vôùi chaát caàn phaân tích vaø taïo ra caùc ñaùp öùng maø caùc boä bieán naêng (transducer) coù theå phaùt hieän ñöôïc. Caùc thaønh phaàn sinh hoïc ôû ñaây thöïc hieän caùc hoaït ñoäng sau:

Bieán ñoåi caùc chaát caàn phaân tích thaønh caùc chaát hoùa hoïc khaùc thoâng qua caùc phaûn öùng sinh hoùa (bieåu dieãn baèng voøng troøn roãng trong sô ñoà).

Giaûi phoùng ra caùc saûn phaåm hoùa hoïc roài töø ñaây taïo ra caùc taùc nhaân kích thích.

Thay ñoåi caùc ñaëc tính nhö quang hoïc, ñieän hoïc, cô hoïc.

Taïo ra moät soá caùc ñaùp öùng khaùc nhau vôùi löôïng coù theå ño ñöôïc.

Coøn coù moät soá maøng khaùc gaàn boä phaän transducer, nhöõng maøng naøy coù theå coù caùc ñaëc tính thaám khaùc nhau so vôùi maøng beân ngoaøi. Tín hieäu ra cuûa ñieän cöïc thöôøng phuï thuoäc vaøo loaïi bieán naêng maø noù söû duïng.

4


Hình 1.2: Nguyeân lyù hoaït ñoäng chung cuûa moät Biosensor:

- Chaát caàn phaân tích

- Taùc nhaân kích thích (chaát taïo ra tín hieäu)

Baûng 1.1: Moät soá ñieän cöïc enzym thöôøng söû duïng

Ñieän cöïc ñeå xaùc ñònh

Enzym Saûn phaåm

Glucose Glucooxydase vaø catalase H2O2, O2

Saccarose Invertase, glucooxydase H2O2

Lactose -galactosidase, glucooxydase

H2O2

Röôïu Alcoloxydase H2O2

Ure Urease NH4+, CO2

Pennicillin Pennicillinase H+

CHÖÔNG 2

PHAÂN LOAÏI BIOSENSOR

2.1. ÑIEÄN CÖÏC ÑIEÄN HOÙA (Electrochemical biosensor)

2.1.1. Ñieän cöïc ño ñieän theá (potentiometric biosensor)

Ñieän cöïc ño ñieän theá hoaït ñoäng döïa treân nguyeân taéc xaùc ñònh söï khaùc nhau veà ñieän theá giöõa ñieän cöïc ño (probe electrode) vaø ñieän cöïc so saùnh (reference electrode) (laø ñieän cöïc coù ñieän theá khoâng ñoåi). Söï khaùc nhau veà ñieän theá giöõa hai ñieän cöïc laø haøm cuûa hoaït ñoä caùc ion trong dung dòch ñieän phaân nô ñaët ñieän cöïc (ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc ño ñieän theá laø khoâng coù doøng ñieän trong maïch ño, vì theá ngöôøi ta goïi noù laø ñieän cöïc coù doøng ñieän baèng khoâng). Ñieän theá naøy ñöôïc xaùc ñònh theo phöông trình Nerst:

Trong ñoù: Eo: Ñieän theá oxy hoùa-khöû tieâu chuaån;

5


R: Haèng soá khí;

T: Nhieät ñoä tuyeät ñoái;

F: haèng soá Faraday;

N: soá ñieän töû trao ñoåi cuûa cô chaát;

1, 2: Hoaït ñoä trong dung dòch vaø trong lôùp maøng ñieän cöïc.

Ñieän cöïc ño (probe electrode):

Ñieän cöïc ño laø ñieän cöïc coù tham gia phaûn öùng ñieän hoùa vôùi moät trong caùc caáu töû cuûa caân baèng ñieän theá. Ñieän cöïc ño phaûi coù theá ñieän cöïc ñöôïc thieát laäp ñuû nhanh vaø coù ñoä chính xaùc cao. Trong ñieän cöïc ñieän hoùa, ñieän cöïc ño thöôøng duøng laø ñieän cöïc maøng vaø ñieän cöïc khí.

Ñieän cöïc khí :

Ñieän cöïc ñöôïc caáu taïo bôûi kim loaïi trô nhö Pt, Au…tieáp xuùc ñoàng thôøi vôùi khí vaø dung dòch chöùa ion töông öùng vôùi khí naøy. Treân thò tröôøng ñaõ coù ñieän cöïc khí hydro, ñieän cöïc Oxy, ñieän cöïc khí clo ñöôïc söû duïng roäng raõi.

Ñieän cöïc maøng choïn loïc ion :

Ñieän cöïc maøng choïn loïc thoâng thöôøng laø caùc baùn pin coù lôùp maøng phaân caùch dung dòch caàn phaân tích vôùi moät dung dòch chuaån ôû beân trong. Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc maøng laø döïa vaøo söï xuaát hieän cuûa moät ñaïi löôïng ñieän theá treân beà maët cuûa maøng phaân caùch chöù khoâng phaûi do phaûn öùng ñieän hoùa keøm theo söï vaän chuyeån ion. Maøng coù taùc duïng thuaän nghòch vôùi moät ion hay moät nhoùm ion trong dung dòch moät caùch choïn loïc. Ñieän cöïc thuûy tinh laø ñieän cöïc ñieån hình cuûa loaïi ñieän cöïc maøng naøy. Taát caû caùc loaïi ñieän cöïc maøng ñeàu phaûi ñaùp öùng caùc yeâu caàu baét buoäc sau ñaây:

1. Maøng phaûi khoâng ñöôïc tan trong dung dòch caàn phaân tích. Ñeå ñaùp öùng ñöôïc ñieàu naøy, maøng phaûi ñöôïc caáu taïo töø nhöõng chaát coù phaân töû löôïng lôùn nhö thuûy tinh silicate hoaëc nhöïa polymer.

6


2. Maøng choïn loïc phaûi coù ñoä daãn ñieän. Ñoä daãn ñieän naøy thöôøng ñöôïc taïo ra nhôø vaøo söï dòch chuyeån cuûa caùc ion hoùa trò moät beân trong maøng.

3. Maøng hoaëc moät vaøi phaàn töû chöùa trong boä khung cuûa maøng phaûi coù khaû naêng taùc duïng choïn loïc vôùi ion caàn khaûo saùt theo nguyeân taéc: trao ñoåi ion, keát tinh hay taïo phöùc. Hai nguyeân taéc ñaàu phoå bieán hôn nguyeân taéc thöù ba.

Ñieän cöïc maøng thuûy tinh:

Ñaây laø loaïi ñieän cöïc maøng thoâng duïng nhaát. Ñieän cöïc goàm moät oáng thuûy tinh, ôû ñaàu cuûa oáng laø moät baàu troøn caáu taïo baèng thuûy tinh moûng (0.06-0.10mm). Ñaây chính laø lôùp maøng thuûy tinh coù thaønh phaàn xaùc ñònh vaø coù khaû naêng trao ñoåi choïn loïc vôùi proton vaø caùc cation khaùc.

Ñieän cöïc maøng thuûy tinh ño pH: Phoå bieán nhaát laø thuûy tinh chöùa 22%Na2O, 6%CaO vaø 72%SiO2 coù khaû naêng trao ñoåi choïn loïc ion H+ ñeán pH xaáp xæ 9. ÔÛ pH cao hôn, lôùp maøng thuûy tinh trôû neân keùm choïn loïc vôùi H+ vì coù theå trao ñoåi vôùi Na+ cuõng nhö caùc cation hoùa trò I khaùc. Ngaøy nay ngöôøi ta ñaõ söû duïng loaïi thuûy tinh trong ño Na+ vaø Ca2+ ñöôïc thay theá bôûi Li+ vaø Ba2+ coù khaû naêng xaùc ñònh choïn loïc H+ ôû pH cao hôn.

Phaàn cuoái cuûa ñieän cöïc laø moät baàu thuûy tinh coù thaønh moûng vaø coù thaønh phaàn ñaëc bieät. Beân trong baàu thuûy tinh chöùa dung dòch H+ coù noàng ñoä xaùc ñònh. Nhuùng vaøo dung dòch H+ laø daây daãn Pt hay kim loaïi Ag phuû AgCl. Toaøn boä boä phaän treân ñöôïc ñaët trong oáng baûo veä.

Khi nhuùng ñieän cöïc thuûy tinh vaøo dung dòch chöùa ion H+, ôû hai beà maët cuûa maøng thuûy tinh tieáp xuùc vôùi H+ coù phaûn öùng trao ñoåi:

nghóa laø ôû hai maët cuûa lôùp thuûy tinh seõ taïo ra hai lôùp “gel” H2SiO3 (daøy 10-4-10-5 mm) do söï hieän ñieän cuûa H+ trong thuûy tinh. Vì coù hieän töôïng trao ñoåi ion xaûy ra ôû hai maët cuûa maøng thuûy tinh neân moãi lôùp gel seõ xuaát hieän moät ñieän theá coù giaù trò phuï thuoäc vaøo hoaït ñoä cuûa H+ trong dung dòch vaø hoaït ñoä cuûa H+ trong lôùp gel. Hay noùi caùch khaùc, hieäu theá maøng E

7


qua lôùp thuûy tinh seõ phuï thuoäc vaøo hoaït ñoä cuûa H+ beân trong baàu, cuûa H + ôû ngoaøi baàu vaø hoaït ñoä H+ ôû trong hai lôùp gel. Vôùi giaû söû raèng hieän töôïng trao ñoåi ion xaûy ra ôû hai maët thuûy tinh gaàn gioáng nhau vaø do coá ñònh hoaït ñoä H + ôû trong baàu thuûy tinh neân hieäu theá maøng E chæ phuï thuoäc vaøo hoaït ñoä cuûa H+ trong dung dòch caàn khaûo saùt.

Baèng vieäc thay theá thaønh phaàn cuûa thuûy tinh sao cho ñieän theá maøng khoâng phuï thuoäc vaøo giaù trò pH, thöôøng söû duïng Al2O3 vaø B2O3 ta coù theå taïo ra caùc ñieän cöïc maøng thuûy tinh duøng xaùc ñònh caùc cation hoùa trò I nhö Na+, K+, NH4

+…

Ñaàu doø khí:

Ñaàu doø khí laø caùc thieát bò ño coù tính choïn loïc vaø ñoä nhaïy cao duøng ñeå xaùc ñònh caùc khí hoøa tan hoaëc caùc ion coù theå chuyeån thaønh khí hoøa tan khi ñieàu chænh pH cuûa moâi tröôøng. Boä phaän chính cuûa ñaàu doø khí laø moät lôùp maøng xoáp moûng ñöôïc laép vaøo phaàn cuoái cuûa ñaàu doø vaø coù theå ñöôïc thay theá moät caùch deã daøng. Taám maøng naøy ñöôïc goïi laø maøng thaám khí, ñöôïc cheá taïo töø caùc polymer chòu nöôùc nhö polytetrafluoroethylene hoaëc polypropylene vôùi ñoä xoáp khoaûng 70% (kích thöôùc loã xoáp nhoû hôn 1m). Lôùp maøng naøy seõ phaân taùch dung dòch caàn phaân tích vôùi dung dòch NaHCO3 vaø NaCl (neáu thieát bò duøng ñeå ño CO2 hoøa tan).

Ñieän cöïc chuaån:

Trong haàu heát caùc öùng duïng ñieän hoùa, ngoaøi ñieän cöïc ño ta phaûi söû duïng theâm moät ñieän cöïc coù ñieän theá xaùc ñònh vaø khoâng ñoåi. Ñieän cöïc naøy ñöôïc goïi laø ñieän cöïc chuaån hay ñieän cöïc so saùnh. Ñieän cöïc chuaån phaûi khoâng tham gia phaûn öùng vôùi baát kyø thaønh phaàn naøo trong dung dòch caàn khaûo saùt, phaûi thuaän nghòch vaø tuaân theo phöông trình Nerst, phaûi coù ñieän theá khoâng ñoåi theo thôøi gian vaø coù theå laáy laïi giaù trò theá ban ñaàu sau khi coù doøng ñieän nhoû chaïy qua… Ñieän cöïc chuaån thöôøng laø ñieän cöïc kim loaïi loaïi hai (kim loaïi M phuû moät lôùp hôïp chaát ít tan MA cuûa kim loaïi ñoù vaø ñöôïc nhuùng vaøo trong dung dòch muoái coù chöùa anion A- coù noàng ñoä xaùc ñònh).

Ñieän cöïc calomel :

8


Ñieän cöïc calomel ñöôïc taïo thaønh bôûi kim loaïi Hg tieáp xuùc vôùi dung dòch chöùa muoái Hg2Cl2 baõo hoøa vaø KCl coù noàng ñoä xaùc ñònh (baõo hoøa hay 1M).

Ñieän cöïc Ag/AgCl:

Ngaøy nay ñieän cöïc Ag/AgCl ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå laøm ñieän cöïc chuaån thay cho ñieän cöïc calomel. Noàng ñoä dung dòch KCl söû duïng laø baõo hoøa hay 3.5M

Caùc ñieän cöïc chuaån thöôøng coù moät loã nhoû ôû gaàn ñaàu phía treân. Loã naøy thöôøng coù moät nuùt ñaäy kín khi khoâng söû duïng ñeå choáng laïi söï bay hôi cuûa dung dòch phía trong.

9


Hình 2.1: Caáu taïo cuûa moät biosensor ño ñieän theá ñôn giaûn

Chuù thích:

a) Maøng baùn thaám

b) Thaønh phaàn sinh hoïc

c) Maøng thuûy tinh

d) Ñieän cöïc thuûy tinh ño pH

e) Ñieän theá giöõa ñieän cöïc ño vaø ñieän cöïc so saùnh

g) Dung dòch HCl

f) Ñieän cöïc ño Ag/AgCl

h) Ñieän cöïc so saùnh

ÖÙng duïng: Ñieän cöïc ño ñieän theá ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh glucose vôùi söï coá ñònh enzym glucooxydase leân ñieän cöïc:

Ño löôïng H+ taïo thaønh (ño pH sau khi giaûi phoùng H+) seõ xaùc ñònh haøm löôïng D -glucose.

Xaùc ñònh Ure vôùi söï coù maët cuûa enzym Urease:

10


Hình 2.2: Caáu taïo ñieän cöïc pCO2

Xaùc ñònh lysin:

2.1.2. Ñieän cöïc ño doøng ñieän (Amperometric biosensor)

Ñieän cöïc ño doøng ñieän hoaït ñoäng döïa vaøo doøng ñieän chaïy qua maïch ño khi ñaët moät hieäu ñieän theá giöõa hai ñieän cöïc (ñieän cöïc ño vaø ñieän cöïc so saùnh). Maät ñoä cuûa caùc haït tích ñieän tyû leä thuaän vôùi cöôøng ñoä doøng ñieän chaïy giöõa hai ñieän cöïc.

Cöôøng ñoä doøng ñieän chaïy giöõa hai ñieän cöïc laø haøm cuûa maät ñoä caùc haït tích ñieän trong dung dòch vaø ñieän theá ñaët giöõa hai ñieän cöïc. Trong ña soá tröôøng hôïp, ngöôøi ta thöôøng tieán haønh oxy hoùa hoaëc khöû moät loaïi haït tích ñieän treân cöïc ño.

Neáu ñaët vaøo ñieän cöïc ño moät ñieän theá E bieán thieân so vôùi ñieän cöïc so saùnh vaø veõ ñöôøng cong I = f(E), chieàu cao I cuûa baäc giôùi haïn khueách taùn seõ tyû leä vôùi noàng ñoä cuûa haït bò oxy hoùa hoaëc bò khöû treân ñieän cöïc ño.

11

Chuù thích:c – Caùp baûo veäe – Dung dòch ñieän phaânm – maøng kî nöôùcr – ñieän cöïc so saùnh


Hình 2.3: Ñoà thò I = f(E)

Chuù thích: 1- E quaù nhoû ñeå söï oxy hoùa coù theå xaûy ra

2- vaän toác oxy hoùa ñieän hoùa vaø cöôøng ñoä doøng ñieän seõ taêng cöôøng vôùi söï taêng hieäu ñieän theá

3- cöôøng ñoä khoâng phuï thuoäc vaøo hieäu ñieän theá vaø I = K.Cred

Hieän nay caùc ñieän cöïc ño doøng ñieän ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi laø ñieän cöïc oxy vaø ñieän cöïc hydroperoxyde. Oxy vaø hydroperoxyde (H2O2) ñeàu laø nhöõng chaát ñöôïc sinh ra trong moät soá phaûn öùng coù enzym xuùc taùc, cuõng nhö trong phaûn öùng coù caùc chaát trung gian oxy hoùa-khöû nhaân taïo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) vaø benzoqiunon vaø chuùng coù theå xaùc ñònh nhôø ño doøng ñieän.

Caùc ñieän cöïc ño doøng ñieän thöôøng söû duïng caùc enzym oxydoreductase ñeå gaén vaøo maøng. Oxy, NAD+, NADP+ ñöôïc duøng nhö chaát nhaän ñieän töû ñeå phuïc hoài enzym sau khi tham gia phaûn öùng xuùc taùc cô chaát. Caùc enzym söû duïng Oxy nhö oxydase vaø enzym söû duïng NAD+, NADP+ ñöôïc goïi laø dehydrogenase hay reductase. Trong hai nhoùm enzym naøy thì oxydase ñöôïc duøng nhieàu nhaát. Caùc ñieän cöïc ño doøng ñieän ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh caùc cô chaát cuûa enzym nhö glucose, monosacharide, hypoxanthyl, lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate vaø pyruvate.

Ñieän cöïc enzym ñeå ño noàng ñoä glucose coù caáu taïo goàm: moät anod Pt vaø moät catod Ag phuû AgCl tieáp xuùc vôùi maøng ñaõ coá ñònh glucoseoxydase (GOD). Caû hai ñeàu ñöôïc ñaët trong dung dòch ñieän phaân KCL. Ñieän aùp phaân cöïc 0.68 Volt ñöôïc ñaët vaøo giöõa hai ñieän cöïc. Döôùi taùc ñoäng cuûa ñieän aùp phaân cöïc naøy H2O2 ñöôïc giaûi phoùng ra seõ bò oxy hoùa ôû maët phaân caùch giöõa anod vaø maøng theo phaûn öùng:

12


Doøng ñieän ño ñöôïc tyû leä vôùi löôïng H2O2 bò oxy hoùa vaø do ñoù tyû leä vôùi löôïng glucose trong moâi tröôøng caàn ño.

Hình 2.4: Sô ñoà nguyeân taéc cuûa ñieän cöïc ño doøng ñieän

Cuõng nhö ño glucose, ñeå ño löôïng lactate, duøng ñieän cöïc coù gaén lactatoxydase (LOD) töø Pediscoccuspecies xuùc taùc phaûn öùng:

Ñeå ño löôïng cholesterol thì gaén enzym cholesteroloxydase (ChOD) töø Rhodococcus eryththropolis, xuùc taùc phaûn öùng:

Ñeå ño löôïng lactose thì gaén enzym -galactosidase (-GAL) töø E.coli vaø glucoozydase (GOD) töø A.niger, xuùc taùc caùc phaûn öùng:

Do quaù trình chuyeån khoái H2O2 ñeán ñieän cöïc anod maø vaän toác phaûn öùng ôû anod thöôøng bò giôùi haïn. Khi ñoù, cöôøng ñoä doøng ñieän ôû anod tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä H2O2 trong moâi tröôøng tieáp xuùc vôùi anod.

13


Cuõng coù theå xaùc ñònh löôïng glucose qua ño noàng ñoä Oxy hoøa tan trong dung dòch nhôø ñieän cöïc Oxy hay ñieän cöïc Clark, coù caáu taïo goàm: hai ñieän cöïc coù khaû naêng phaân cöïc, moät catod baèng Pt vaø moät anod baèng Ag phuû AgCl. Caû hai ñieän cöïc ñöôïc ñaët vaøo chaát ñieän phaân laø KCl. Heä thoáng ñieän cöïc naøy ñöôïc ngaên caùch vôùi moâi tröôøng nghieân cöùu baèng moät maøng thaám khí kî nöôùc baèng teflon hay polypropylen) cho Oxy thaám qua. Döôùi taùc duïng cuûa ñieän aùp phaân cöïc 0.65V ñaët vaøo giöõa hai ñieän cöïc, Oxy khueách taùn qua maøng seõ bò khöû taïi catod theo phaûn öùng:

O2 + 4e- + 4H+ 2H2O

Hình 2.5: Caáu taïo cuûa ñieän cöïc Oxy xaùc ñònh noàng ñoä Glucose

Doøng ñieän chaïy giöõa hai ñieän cöïc do phaûn öùng ñieän hoùa tyû leä vôùi löôïng O2 bò khöû vaø do ñoù tyû leä vôùi löôïng O2 vaø löôïng glucose. Doøng ñieän ñöôïc ño sau khi khueách ñaïi vaø ñöôïc chæ thò tröïc tieáp baèng soá hoaëc bieåu dieãn döôùi daïng noàng ñoä Oxy hay aùp suaát rieâng phaàn cuûa Oxy.

Phöông phaùp ño doøng ñieän naøy coù nhöõng ñaëc ñieåm sau:

Phaûn öùng Enzym seõ phuï thuoäc vaøo vaän toác khueách taùn cuûa cô chaát qua maøng

Khi phaûn öùng oxy hoùa – khöû xaûy ra, gradient noàng ñoä cuûa cô chaát giaûm daàn, do ñoù vaän toác chuyeån khoái

14


chaäm vaø coù theå doøng ñieän bò khöû, ñeå duy trì doøng ñieän khoâng ñoåi caàn phaûi giöõ vöõng vuøng tieáp xuùc caøng nhoû caøng toát (töùc laø caàn ñieàu cheá caùc vi ñieän cöïc coù ñöôøng kính raát nhoû, ñeán vaøi m).

Vaän toác phaûn öùng oxy hoùa – khöû phuï thuoäc vaøo noàng ñoä Oxy hoøa tan. Ñeå haïn cheá aûnh höôûng cuûa noàng ñoä Oxy hoøa tan trong dung dòch ñeán keát quaû phaân tích thì ngöôøi ta khoâng söû duïng oxy laøm chaát nhaän ñieän töû maø söû duïng caùc chaát trung gian ñeå vaän chuyeån ñieän töû ñeán beà maët ñieän cöïc. Caùc chaát vaän chuyeån ñieän töû trung gian coù theå laø ion Fe3+, N-methylphenazinium (NMP) hoaëc tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate.

2.2. ÑIEÄN CÖÏC ÑO NHIEÄT (Calorimetric biosensor)

Caùc phaûn öùng giöõa cô chaát vaø chaát xuùc taùc sinh hoïc thöôøng giaûi phoùng ra nhieät naêng vaø ngöôøi ta coù theå ño löôïng nhieät giaûi phoùng ra ñoù baèng moät thieát bò ñ nhieät (ñieän cöïc ño nhieät), töø ñoù seõ tính ñöôïc löôïng cô chaát ban ñaàu. Khi nhieät löôïng toûa ra caøng lôùn thì ñoä nhaïy phaùt hieän caøng lôùn. Do ñoù ñeå taêng nhieät löôïng toûa ra, coù theå coá ñònh ñoàng thôøi 2 hoaëc 3 enzym (cuõng coù theå leân tôùi 4-5 enzym).

Baûng 2.1: Enthanpi cuûa moät soá phaûn öùng coù enzym xuùc taùc:

Cô chaát Enzym xuùc taùc -H, kJ/mol

H2O2 Catalase 100.4

Cholesterol Cholesterol oxydase 52.9

Glucose Glucooxydase 80.0

Glucose Hexokinase 27.6

Ure Urease 6.6

Uric acide Uricase 49.1

Ester Chymotrypsin 4-16

Pennicilin G Pennicillinase 67

Tinh boät Amylase 8

15


Saccharose Invertase 20

Söû duïng ñoàng thôøi enzym glucooxydase oxy hoùa ñöôøng glucose vaø enzym catalase ñeå oxy hoùa peroxide. Hai phaûn öùng naøy xaûy ra cuøng moät luùc do ñoù löôïng nhieät toûa ra nhieàu hôn.

Qua nghieân cöùu ta thaáy cöù 0.1M cô chaát chuyeån hoùa hoaøn toaøn thaønh saûn phaåm seõ taïo ra 100 kJ/mol. Caùc thieát bò naøy phaûi luoân ñöôïc ñaët trong heä thoáng caùch nhieät ñeå giöõ moâi tröôøng oån ñònh nhieät ñoä.

2.2.1. Ñieän cöïc enzym – caëp nhieät

Trong loaïi ñieän cöïc naøy, boä bieán naêng laø caëp nhieät ñieän. Treân caêp nhieät, ngöôøi ta phuû moät lôùp maøng chöùa enzym. Caëp nhieät coù caáu taïo goàm hai daây daãn noái vôùi nhau nhôø moái haøn. Söùc ñieän ñoäng E cuûa maïch phuï thuoäc vaøo baûn chaát cuûa daây daãn vaø vaøo nhieät ñoä T1, T2. Thoâng thöôøng nhieät ñoä cuûa moät moái haøn ñöôïc giöõ ôû giaù trò khoâng ñoåi vaø bieát tröôùc, goïi laø nhieät ñoä chuaån T1 = Tref. Nhieät ñoä cuûa moái haøn thöù hai khi ñaët trong moâi tröôøng nghieân cöùu seõ nhaïy caûm vôùi söï thay ñoåi nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng gaây ra do phaûn öùng xuùc taùc bôûi enzym.

Öu ñieåm: Kích thöôùc caëp nhieät nhoû neân coù theå ño nhieät ñoä ôû töøng thôøi ñieåm cuûa ñoái töôïng caàn nghieân cöùu vaø taêng vaän toác hoài ñaùp tín hieäu (do nhieät dung nhoû). Treân cô sôû naøy, Bataillard ñaõ ñöa ra caûi tieán laø söû duïng moät caëp nhieät baùn daãn (intergrated silicon) ñeå ñònh löôïng glucose, ure vaø penicillin. Do tính chaát cuûa caëp nhieät vaø lôùp tieáp xuùc enzym-caëp nhieät coù tính truyeàn nhieät cao cho pheùp khoâng phaûi kieåm soaùt chaët cheõ nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng xung quanh, do ñoù coù theå thu nhoû kích thöôùc cuûa thieát bò ñeå coù theå caáy vaøo döôùi da ño tröïc tieáp noàng ñoä caùc chaát trong maùu.

16


Hình 2.6: Sô ñoà ñieän cöïc enzym-caëp nhieät

2.2.2. Ñieän cöïc enzym- nhieät ñieän trôû:

Loaïi ñieän cöïc naøy coøn coù theå goïi laø ñieän cöïc aùo nhieät vì buoàng ño nhieät hoaøn toaøn bò coâ laäp vôùi moâi tröôøng xung quanh nhôø lôùp aùo nhieät, quaù trình naøy gaàn gioáng vôùi quaù trình ñoaïn nhieät. Loaïi thieát bò naøy coù caáu taïo ñôn giaûn vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát.

Hình 2.7: Sô ñoà ñieän cöïc enzym – nhieät ñieän trôû.

Chuù thích: a- OÁng mao daãn

b- lôùp voû aùo nhieät

c- Thieát bò trao ñoåi nhieät

d- lôùp caùch nhieät

e- nhieät ñieän trôû so saùnh

f- coät enzym (1mL)

g- nhieät ñieän trôû ño

h- oáng mao daãn

i- Nguoàn ñieän

17


Cô chaát ñöôïc ñi vaøo thieát bò trao ñoåi nhieät roài qua coät enzym ñeå phaûn öùng vôùi enzym vaø giaûi phoùng ra nhieät, nhieät ñoä giaûi phoùng ra seõ ñöôïc ño bôûi nhieät ñieän trôû so saùnh. Keát quaû ño ñöôïc sau ñoù ñi ra qua boä xöû lyù ñeå thu nhaän tín hieäu.

Moái quan heä giöõa ñieän trôû vaø nhieät ñoä ñöôïc xaùc ñònh theo phöông trình:

Hay:

Trong ñoù R1: ñieän trôû cuûa nhieät ñieän trôû so saùnh, R2: ñieän trôû cuûa nhieät ñieän trôû ño, T1: nhieät ñoä cuûa maãu sau khi qua boä phaän gia nhieät, T2: nhieät ñoä cuûa maãu sau khi qua coät enzym, B: Haèng soá nhieät ñoä cuûa nhieät ñieän trôû.

Khi söï thay ñoåi nhieät ñoä raát nhoû, B(1/T1-1/T2) nhoû hôn 1 thì khi ñoù eB(1/T1-1/T2) ~ 1 + B(1/T1-1/T2) vaø do ñoù ta coù:

Khi T1~T2 thì bieåu thöùc treân trôû thaønh:

Ñoä giaûm töông ñoái ñieän trôû (R/R) cuûa nhieät ñieän trôû thì tyû leä thuaän vôùi ñoä taêng nhieät ñoä T. Haèng soá tyû leä (-B/T1

2) laø -4%oC-1. Do ñoù döïa vaøo söï thay ñoåi nhieät ñoä maø coù theå xaùc ñònh ñöôïc chaát caàn phaân tích.

Ngoaøi caùch cheá taïo coät vaät lieäu sinh hoïc nhö treân, ngöôøi ta coøn coù theå bao beân ngoaøi nhieät ñieän trôû moät lôùp voû silicon vaø ñaët maøng coá ñònh enzym ôû treân, nhôø ñoù thu nhoû ñöôïc kích thöôùc thieát bò.

18


Hình 2.8: Ñieän cöïc Enzym-nhieät ñieän trôû coù voû boïc silicon

Cuõng coù theå tích hôïp nhieàu nhieät ñieän trôû taïo ra ñieän cöïc nhieät ñònh löôïng ñoàng thôøi nhieàu chaát. Caùc nghieân cöùu veà loaïi ñieän cöïc nhieät ñoä cho thaáy ngoaøi nhöõng öùng duïng trong caùc lónh vöïc y teá, moâi tröôøng, thöïc phaåm, chuùng coøn coù theå coù nhöõng öùng duïng ñaëc hieäu nhö:

- Xaùc ñònh caùc haèng soá Ki, Km, Vm cuûa enzym coá ñònh (Stefuca, 1990)

- Ñònh löôïng ADP, ATP baèng caùch söû duïng puruvatkinase vaø hexokinase ñoàng thôøi coá ñònh treân aminopropyl CPG (Kirstein, 1989).

2.3. ÑIEÄN CÖÏC ÑO QUANG (Optical Biosensor)

Ñieän cöïc ño quang ñöôïc cheá taïo döïa vaøo caùc tính chaát vaät lyù cuûa aùnh saùng ñeå phaùt hieän ra söï bieán ñoåi nhoû trong maãu phaân tích.

Nguyeân taéc hoaït ñoäng: Dung dòch phaân tích ñöôïc tieáp xuùc vôùi maøng vaø khi phaûn öùng enzym xaûy ra thì seõ coù hieän töôïng aùnh saùng bò haáp thuï hoaëc phaùt ra aùnh saùng maøu. Ngöôøi ta coù theå xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng caùc chaát cuûa maãu phaân tích thoâng qua vieäc ño ñoä haáp thuï aùnh saùng hoaëc söï phaùt quang aùnh saùng cuûa caùc chaát taïo thaønh do phaûn öùng xuùc taùc bôûi enzym.

Cô sôû cuûa kieåu ñieän cöïc quang laø söï keát hôïp caùc sôïi daãn aùnh saùng vôùi pheùp traéc phoå quang, pheùp traéc huyønh quang,

19


hoaëc pheùp ño phaûn xaï quang. Noù coù khaû naêng chæ baùo nhöõng thay ñoåi cuûa caùc thoâng soá quang hoïc, chaúng haïn nhö söï haáp thuï aùnh saùng, chieàu daøi böôùc soùng hoaëc chæ soá phaûn xaï trong moâi tröôøng ño bao quanh sôïo daãn. Nhöõng thieát bò naøy gaén vaøo hoaëc laø sôïi ñôn hoaëc laø chuøm sôïi keùp ñeå aùnh saùng tôùi vaø chuøm tia saùng ñöôïc ño.

2.3.1. Ñieän cöïc ño phaûn xaï quang:

Ñieän cöïc naøy hoaït ñoäng theo nguyeân taéc: naêng suaát phaûn xaï töø maët phaûn xaï tuaân theo phöông trình:

Trong ñoù R- naêng suaát phaûn xaï, R0-haèng soá phaûn xaï cuûa moâi tröôøng chuaån, I-cöôøng ñoä cuûa tia tôùi, Io- cöôøng ñoä cuûa tia phaûn xaï.

Moái quan heä giöõa R vôùi noàng ñoä chaát haáp thuï maøu theo phöông trình:

Trong ñoù C-noàng ñoä chaát haáp thuï, K-haèng soá haáp thuï, haèng soá taùn saéc

Kyõ thuaät naøy ñöôïc duøng ñeå ñònh löôïng glucose trong maùu nhôø thuoác hieän maøu MBTH (3-methyl-2-benzotiazolinon) vaø DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid). Hai enzym Glucooxydase (GOD) vaø peroxydase ñöôïc coá ñònh baèng caùch haáp thuï leân beà maët taám neàn ñaõ phuû thuoác nhuoäm. Khi maãu phaân tích tieáp xuùc vôùi taám neàn thì phaûn öùng xaûy ra nhö sau:

neáu H2O2 coù noàng ñoä cao thì phaûi duøng enzym catalase. Maãu phaân tích sau ñoù ñöôïc ñem ño naêng suaát phaûn xaï ôû böôùc soùng thích hôïp vaø töø ñoù seõ tính ñöôïc haøm löôïng glucose.

Vôùi Biosensor döïa treân neàn taûng cuûa söï phaûn xaï toaøn phaàn (total internal reflection – TIR) thì beà maët daây daãn ñöôïc phuû

20


khaùng theå, seõ tieáp xuùc vôùi maãu phaân tích. Khi soùng aùnh saùng ñi ñeán lôùp maøng nhaïy thì chæ coù moät phaàn nhoû soùng aùnh saùng bò haáp thuï vaøo trong moâi tröôøng, coøn taát caû chuùng bò phaûn xaï laïi nhieàu laàn vaø daàn daàn nguoàn saùng bò suy giaûm. Döïa vaøo löôïng aùnh saùng phaûn xaï, ta coù theå tính ñöôïc haøm löôïng maãu phaân tích.

Hình 2.9: Biosensor döïa treân hieän töôïng phaûn xaï toaøn phaàn

2.3.2. Ñieän cöïc ño phaùt quang :

Nguyeân taéc hoaït ñoäng: Cô chaát taùc duïng vôùi enzym coá ñònh ñeå taïo thaønh saûn phaåm coù khaû naêng phaùt ra aùnh saùng maøu. Ño aùnh saùng maøu ñoù ôû moät böôùc soùng nhaát ñònh seõ suy ra ñöôïc noàng ñoä cô chaát.

Döïa vaøo ñaëc tính naøy, ngöôøi ta thöôøng söû duïng noù ñeå xaùc ñònh caùc vi khuaån trong thöïc phaåm. Khi caùc vi khuaån taùc duïng ñaëc hieäu vôùi ATP vaø D-luciferin döôùi taùc duïng cuûa enzym luciferase seõ taïo thaønh oxyluciferin, AMP. Pyrophosphate, CO2 vaø aùnh saùng vaøng ño ñöôïc ôû böôùc soùng 562nm. Töø ñoù xaùc ñònh löôïng vi khuaån coù maët trong thöïc phaåm.

2.4. ÑIEÄN CÖÏC ÑIEÄN AÙP (Piezoelectric biosensor):

Nguyeân lyù cuûa loaïi ñieän cöïc naøy döïa vaøo söï dao ñoäng cuûa caùc tinh theå. Caùc chaát ñieän moâi töï nhieân nhö thaïch anh, tuamalin, hoaëc nhaân taïo nhö liti sulfat, thaïch anh toång hôïp…dao ñoäng khi chòu taùc ñoäng cuûa töø tröôøng. Taàn soá dao ñoäng cuûa

21


tinh theå phuï thuoäc vaøo ñoä daøy vaø söï bieán daïng cuûa tinh theå, moãi tinh theå coù moät taàn soá dao ñoäng ñaëc tröng. Taàn soá dao ñoäng naøy thay ñoåi theo söï haáp thuï hay nhaû haáp thuï töø beà maët tinh theå, thoâng thöôøng noù seõ taêng khi coù taïp chaát haáp thu leân treân beà maët cuûa tinh theå. Ño taàn soá dao ñoäng seõ bieát ñöôïc noàng ñoä cuûa cô chaát caàn ño.

Taàn soá dao ñoäng ñöôïc tính theo coâng thöùc:

trong ñoù: f: Cheânh leäch taàn soá dao ñoäng (Hz), m: cheânh leäch khoái löôïng cuûa chaát haáp thu (g), K: haèng soá ñaëc tröng cho söï dao ñoäng cuûa tinh theå, phuï thuoäc vaøo beà daøy vaø ñoä nöùt cuûa tinh theå, A: dieän tích beà maët haáp thu (cm2).

Ñieän cöïc ñieän aùp ñöôïc duøng ñeå ño amoniac, methane, löu huyønh dioxit vaø cô chaát phosphate höõu cô. Ta coù theå duøng noù ñeå xaùc ñònh noàng ñoä formaldehyde nhôø formaldehyde dehydrogenase hay xaùc ñònh dö löôïng thuoác tröø saâu voâ cô phospho voán kìm haõm enzym xholinesterase.

Öu ñieåm: Cho thôøi gian ñaùp öùng nhanh, nhoû goïn vaø reû tieàn

Nhöôïc ñieåm: Khoâng duøng phaân tích maãu daïng loûng, deã bò hö hoûng do ñoä aåm khoâng khí.

Hình 2.10: Sô ñoà caáu taïo cuûa ñieän cöïc ñieän aùp

22


2.5. ÑIEÄN CÖÏC MIEÃN DÒCH (Immunobiosensor):

Ñieän cöïc mieãn dòch hoaït ñoäng döïa treân tính chaát khaùng nguyeân – khaùng theå. Töùc laø caùc khaùng theå phaûn öùng ñaëc hieäu vôùi caùc khaùng nguyeân sinh ra noù.

Moãi khaùng theå laø moät protein hình chöõ Y, goàm 4 chuoãi polypeptide, trong ñoù coù hai chuoãi naëng vaø hai chuoãi nheï lieân keát vôùi nhau bôûi caùc caàu disulfite. Moät phaàn caáu truùc cuûa caùc chuoãi laø coá ñònh, nhöng caùc phaàn ñaàu muùt cuûa hai nhaùnh chöõ Y laïi bieán ñoåi vaø taïo neân caùc vò trí keát hôïp coù khaû naêng phaûn öùng vôùi caùc chaát hoùa hoïc khaùc goïi laø khaùng nguyeân. Khaùng nguyeân laø caùc “chaát laï” coù baûn chaát protein hay hydrat cacbon.

Phaûn öùng khaùng nguyeân – khaùng theå ñöôïc xaùc ñònh baèng nhieàu caùch, trong ñoù coù kyõ thuaät ELISA (enzym linked immunosorben assay: kyõ thuaät haáp thuï mieãn dòch coù gaén enzym). Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät ELISA nhö sau:

Khaùng theå ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân ñöôïc coá ñònh treân beà maët cuûa moät oáng. Moät hoãn hôïp goàm moät löôïng ñaõ bieát phöùc keát enzym-khaùng nguyeân vaø moät löôïng chöa bieát khaùng nguyeân cuûa maãu ñöôïc ñaët vaøo oáng. Sau moät thôøi gian thích hôïp khaùng theå, phöùc enzym-khaùng nguyeân vaø khaùng nguyeân töï do coù theå gaén keát hoaëc vaãn ôû traïng thaùi töï do, phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cuûa chuùng. Caùc khaùng nguyeân töï do ñöôïc röûa troâi vaø loaïi boû. Löôïng phöùc keát enzym-khaùng nguyeân gaén vôùi khaùng theå ñöôïc xaùc ñònh baèng vaän toác phaûn öùng enzym.

23


Hình 2.11: Nguyeân lyù hoaït ñoäng cuûa kyõ thuaät ELISA

ELISA ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän vaø khueách ñaïi moät phaûn öùng khaùng nguyeân-khaùng theå. Löôïng khaùng nguyeân lieân keát vôùi enzym gaén vôùi khaùng theå coá ñònh ñöôïc xaùc ñònh baèng noà ñoä töông ñoái giöõa khaùng nguyeân lieân keát vaø khaùng nguyeân töï do vaø ñöôïc ñònh löôïng baèng tyû leä cuûa phaûn öùng enzym. Ñeå coù theå ñaùp öùng nhanh choùng, ngöôøi ta söû duïng caùc enzym coù khaû naêng söû duïng laïi nhieàu laàn. Ñoä nhaïy cuûa phöông phaùp naøy cuõng coù theå taêng leân baèng caùch söû duïng caùc phaûn öùng coù xuùc taùc enzym. Caùc phaûn öùng naøy cho ñaùp öùng nhanh hôn: chaúng haïn taïo ra caùc saûn phaåm phaùt quang, hoaëc huyønh quang, hoaëc coù maøu ñaäm hôn. Kyõ thuaät naøy hieän nay ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc phoøng phaân tích thí nghieäm.

24


Gaàn ñaây ñeå taêng phaïm vi öùng duïng, vaän toác vaø ñoä nhaïy, kyõ thuaät ELISA ñöôïc keát hôïp vôùi caùc boä Biosensor hình thaønh phöông phaùp söû duïng ñieän cöïc mieãn dòch (immunosensor). Caùc ñieän cöïc mieãn dòch naøy raát thích hôïp khi söû duïng vôùi ñieän cöïc ñieän aùp hoaëc caùc ñieän cöïc ño ñieän theá.

Hình 2.12: Nguyeân lyù hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc mieãn dòch

(I): Ñieän cöïc sinh hoïc duøng ôû ñaây thay theá cho heä thoáng giaùm ñònh maøu truyeàn thoáng.

a) OÁng ñöôïc phuû khaùng nguyeân coá ñònh. Moät löôïng dö phöùc keát enzym-khaùng theå ñöôïc ñaët vaøo trong oáng vaø xaûy ra söï gaén keát;

25


b) sau moät thôøi gian thích hôïp, nhöõng phaân töû naøo khoâng ñöôïc gaén keát seõ bò röûa troâi;

c) dung dòch chöùa khaùng nguyeân phaân tích ñöôïc ñöa vaøo oáng, phuï thuoäc vaøo noàng ñoä khaùng theå maø xaûy ra söï gaén keát vaø loaïi moät soá phöùc keát enzym-khaùng theå. Löôïng phöùc keát enzym-khaùng theå loaïi ra ñöôïc xaùc ñònh baèng tín hieäu ñaùp öùng töø boä ñieän cöïc sinh hoïc.

(II): Ñieän cöïc sinh hoïc naøy döïa vaøo giaùm ñònh tröïc tieáp caùc khaùng nguyeân gaén beà maët ñöôïc phuû khaùng theå.

a) ñieän cöïc sinh hoïc ñöôïc phuû khaùng theå (coá ñònh), ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân phaân tích. Boä chuyeån ñoåi ñöôïc ngaâm trong dung dòch chöùa moät hoãn hôïp goàm moät löôïng ñaõ bieát phöùc keát enzym-khaùng nguyeân vaø noàng ñoä chöa bieát khaùng nguyeân phaân tích;

b) sau moät thôøi gian thích hôïp, khaùng nguyeân vaø phöùc keát enzym-khaùng theå ñöôïc gaén vôùi khaùng theå;

c) nhöõng phaân töû naøo khoâng ñöôïc gaén vôùi khaùng theå bò röûa troâi vaø loaïi boû. Löôïng phöùc enzym-khaùng nguyeân gaén vôùi khaùng theå ñöôïc xaùc ñònh tröïc tieáp töø tín hieäu chuyeån ñoåi.

2.6. ÑIEÄN CÖÏC VI SINH VAÄT (microbial biosensor)

Ñieän cöïc vi sinh vaät ñöôïc cheá taïo ñeå phaùt hieän caùc chaát hoùa hoïc, döïa vaøo söï hoâ haáp vaø trao ñoåi chaát cuûa vi sinh vaät.

Ñieän cöïc naøy goàm hai loaïi:

Ñieän cöïc duøng ñeå ño söï thay ñoåi hoaït löïc hoâ haáp cuûa vi sinh vaät coá ñònh vôùi moät thieát bò ño ñieän theá.

Ñieän cöïc duøng ñeå ño caùc chaát sinh ra töø vi sinh vaät vaø phaûn öùng deã daøng vôùi ñieän cöïc.

Caùc vi khuaån hieáu khí söû duïng Oxy vaø saûn sinh naêng löôïng. Nhôø vieäc ño löôïng Oxy tieâu thuï thoâng qua ñieän cöïc O2, ta coù theå xaùc ñònh vaø ñaùnh giaù ñöôïc hoaït löïc hoâ haáp cuûa vi khuaån. Oxy thaám qua maøng teflon vaø bò khöû treân treân ñieän cöïc platin. Neáu caùc thaønh phaàn cuûa dung dòch coù aûnh höôûng

26


ñeán hoaït löïc hoâ haáp thì noàng ñoä cuûa noù coù theå ñöôïc ñònh löôïng thoâng qua vieäc xaùc ñònh noàng ñoä Oxy.

Ngöôøi ta thöôøng duøng ñieän cöïc naøy ñeå xaùc ñònh chæ soá BOD (Biochemical Oxygen Demand – nhu caàu Oxy sinh hoùa) ( laø löôïng Oxy do vi sinh vaät tieâu thuï ñeå oxy hoùa sinh hoïc caùc chaát höõu cô trong boùng toái ôû ñieàu kieän chuaån veà nhieät ñoä vaø thôøi gian). Chæ soá BOD laø thöôùc ño löôïng chaát höõu cô gaây oâ nhieãm nöôùc vaø noù ñöôïc söû duïng ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng nöôùc. Caùc chaát gaây oâ nhieãm coù theå bò phaân huûy bôûi vi sinh vaät nhôø tieâu thuï Oxy. Vì vaäy möùc ñoä oâ nhieãm coù theå ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua vieäc ño löôïng Oxy.

Ñieän cöïc ñöôïc cheá taïo baèng caùc coá ñònh trichosporon cutaneun vaøo maøng cellulose vaø gaén vôùi ñieän cöïc Oxy.

Nguyeân lyù hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc ño BOD: Oxy khueách taùn töø dung dòch baõo hoøa khoâng khí qua maøng thaåm tích ñi vaøo maøng coù chöùa caùc teá baøo vi sinh vaät roài qua maøng teflon vaø cuoái cuøng chuùng bò khöû treân beà maët catod Pt cuûa ñieän cöïc oxy. Doøng ñieän cuûa ñieän cöïc Oxy daàn daàn oån ñònh do vaän toác khueách taùn cuûa Oxy qua maøng caân baèng vôùi vaän toác tieâu thuï Oxy do hoâ haáp cuûa vi sinh vaät coá ñònh treân maøng. Ngöôøi ta goïi doøng ñieän naøy laø doøng ñieän cô baûn (base current). Neáu ta cho chaát ñoàng hoùa höõu cô vaøo dung dòch ño thì khaû naêng phaân taùn oxy hoøa tan trong dung dòch taêng do ñoù vi sinh vaät seõ söû duïng oxy cho hoâ haáp toát hôn. Keát quaû laø vaâïn toác hoâ haáp taêng daàn coøn noàng ñoä oxy hoøa tan giaûm daàn, daãn ñeán doøng giaûm daàn cho tôùi khi ñaït ñeán traïng thaùi oån ñònh môùi vaø ngöôøi ta goïi doøng ñieän naøy laø doøng ñænh (pick current). Söï khaùc nhau giöõa doøng cô baûn vaø doøng ñænh ñöôïc goïi laø doøng ra (output), tín hieäu cuûa doøng ra tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä cuûa caùc chaát höõu cô bò phaân huûy sinh hoïc cuûa maãu ño. Vì vaäy ta coù theå bieát ñöôïc noàng ñoä BOD döïa treân ñieän cöïc vi sinh vaät.

27

CHÖÔNG 3

PHÖÔNG PHAÙP CHEÁ TAÏO BIOSENSOR

Vieäc cheá taïo Biosensor bao goàm ba böôùc:

Choïn löïa boä thuï caûm sinh hoïc

Choïn löïa boä bieán naêng

Coá ñònh thaønh phaàn sinh hoïc leân boä bieán naêng.

3.1. CHOÏN LÖÏA BOÄ THUÏ CAÛM SINH HOÏC (Bioreceptor):

Boä thuï caûm sinh hoïc ñoùng moät vai troø laø thieát bò nhaän daïng sinh hoïc. Khi coù maët chaát caàn kieåm tra, boä thuï caûm sinh hoïc phaûi taïo ra moät hieäu öùng hoùa lyù coù khaû naêng phaùt hieän bôûi boä bieán naêng. Ñieàu naøy lieân quan nhieàu quaù trình chaúng haïn nhö söï xuùc taùc sinh hoïc, söï caëp ñoâi mieãn dòch hay söï nhaän caûm hoùa hoïc.

3.1.1. Enzym:

Chaát xuùc taùc sinh hoïc thöôøng ñöôïc söû duïng laø enzym vì coù saün treân thò tröôøng, chaúng haïn nhö glucose oxidase (enzym oxy hoùa glucose) vaø urease (Enzym thuûy phaân ure). Caùc enzym naøy ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn sinh hoïc khaùc nhau vaø ñöôïc söû duïng moät mình hay keát hôïp vôùi cofactor cuûa chuùng nhö NAD+ vaø NADP+.

Söï söû duïng caùc enzym thöông maïi coù nhieàu thuaän lôïi chaúng haïn nhö khaû naêng saûn xuaát haøng loaït vôùi nhöõng ñaëc ñieåm, thôøi gian soáng bieát tröôùc vaø saün coù. Vì vaäy caùc enzym thöông maïi ñoùng moät vai troø quan troïng trong caùc Biosensor hieän ñang coù maët treân thò tröôøng. Nhöng beân caïnh ñoù chuùng coù nhöõng baát lôïi nhö ít beàn vaø khi hoaït ñoäng caàn coù cofactor keát hôïp, ñoàng thôøi moät enzym ñôn leû thì khoâng xuùc taùc hoaøn toaøn cho moät chuoãi phaûn öùng, vì vaäy trong biosensor thöôøng keát hôïp nhieàu enzym vôùi nhau theo moät trình töï hôïp lyù ñeå ñaûm baûo söï hoaït ñoäng toái öu cuûa Biosensor.

3.1.2. Vi sinh vaät:

Cô theå vi sinh vaät coù ñaày ñuû caùc enzym vaø cofactor caàn thieát trong moät moâi tröôøng ñaõ ñöôïc toái öu hoùa. Trong moâi tröôøng thích hôïp, Vi sinh vaät seõ saûn sinh vaø ñeàn buø baát cöù söï maát maùt hoaït tính cuûa Enzym theo thôøi gian.

3.1.3. Moâ vaø cô quan :

Coù theå taän duïng caùc phaàn moâ thöïc vaät hay moâ ñoäng vaät laøm nguoàn nguyeân lieäu cung caáp enzym vì chuùng coù khaû naêng gaén keát cao, coù moät caáu truùc ñuû maïnh ñeå gaén keát tröïc tieáp leân boä bieán naêng maø khoâng caàn ñeán kyõ thuaät coá ñònh protein.

Moâ thöïc vaät – ñoäng vaät :

Thöïc vaät laø nguoàn enzym höõu duïng cho hoùa hoïc phaân tích. Baèng vieäc söû duïng boä bieán naêng thích hôïp, coù theå cheá taïo Biosensor coù tính naêng oån ñònh cao vì caùc enzym vaãn ñöôïc duy trì hoaït tính trong moâ thöïc vaät. Töông töï nhö vaäy, moâ ñoäng vaät ñöôïc xem nhö laø moät boä thuï caûm sinh hoïc höõu duïng cho söï phaùt hieän choïn loïc L-amiono acid maø khoâng bò aûnh höôûng ñaùng keå bôûi D-amino acid. Ñeå taêng khaû naêng choïn loïc coù theå keát hôïp moät chaát khaùng khuaån ñeå traùnh söï nhieãm khuaån, chaúng haïn nhö theâm 0.02% NaOH vaøo ñieän cöïc glutamine.

Boä phaän cô quan :

Caùc xuùc taùc sinh hoïc cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caùc cô quan teá baøo nhö lysosome, luïc laïp, theå haït vaø vi theå vì chuùng chöùa nhieàu heä thoáng enzym ñöôïc duøng trong biosensor. Chaúng haïn nhö vi theå gan coù heä thoáng enzym monooxidase vôùi cytochrome P 450 xuùc taùc cho phaûn öùng oxy hoaù nhieàu acid beùo, hormone steroids… Caùc cô quan teá baøo ñöôïc gaén tröïc tieáp leân boä bieán naêng ño doøng ñieän trong thieát bò Biosensor.

3.1.4. Taùc nhaân mieãn dòch :

Khaùng nguyeân vaø khaùng theå cuõng ñöôïc söû duïng laøm boä thuï caûm sinh hoïc. Tính choïn loïc cuûa Biosensor ñöôïc quyeát ñònh bôûi khaùng theå vaø tính nhaïy caûm ñöôïc quyeát ñònh bôûi enzym keát hôïp. Khaùng theå ñöôïc coá ñònh vaøo boä bieán naêng nhôø vaøo kyõ thuaät Mieãn dòch hoïc Enzym (EIA). Hoaëc thay enzym baèng chaát mang ion ñoùng vai troø nhö chaát trung gian cuûa caùc

quaù trình ñieän hoùa mieãn dòch. Khaùng nguyeân thích hôïp vôùi khaùng theå ñöôïc keát hôïp vôùi chaát mang ion taïo ra söï tieáp hôïp ñöôïc phaùt hieän bôûi boä bieán naêng ñieän hoùa.

3.1.5. Boä thuï caûm hoùa hoïc:

Maøng teá baøo cuõng ñöôïc söû duïng do khaû naêng kích thích hoùa hoïc gaây ra söï thay ñoåi caáu taïo. Caùc teá baøo thaàn kinh cuõng ñöôïc duøng trong phaùt hieän thuoác, ñoäc toá hay caùc chaát khaùc.

3.2. CHOÏN LÖÏA BOÄ BIEÁN NAÊNG:

Baûng 3.1: Hieän traïng nghieân cöùu cuûa Biosensor vôùi boä bieán naêng töông öùng:

Boä bieán naêng

Biosensor

EnzymTeá

baøo, vi sinh vaät

Taùc nhaân mieãn dòch

Moâ thöïc vaät-ñoäng vaät

Boä thuï caûm

hoùa hoïc

Teá baøo ñieän hoùa

Ño doøng ñieän

xxx xx xx x

Ño ñieän theá

xxx xx xx x x

Baùn daãn (IFET)

xx x

Ño nhieät (Thermistor)

x x

Ño quang (sôïi quang hoïc)

x x

Aùp ñieän x xCô hoùa hoïc x

Chuù thích: x: Ñang nghieân cöùu cô baûn

xx: Ñaõ nghieân cöùu vaø phaùt trieån nhöõng maãu ñaàu tieân

xxx: Nhöõng thieát bò coù maët treân thò tröôøng

Phuï thuoäc vaøo kieåu phaûn öùng vaø töøng öùng duïng cuï theå cuûa Biosensor maø choïn boä bieán naêng phuø hôïp.

Neáu noù ñöôïc duøng trong sinh hoïc thì caàn phaûi ñaùp öùng caùc tieâu chuaån töông öùng nhö khaû naêng taùch protein, lipid hay teá baøo.

Neáu noù ñöôïc duøng trong invivo thì caàn phaûi giaûm kích thöôùc toái thieåu vaø ñoøi hoûi hình daïng cuûa noù phaûi phuø hôïp ñeå khoâng phaù huyû moâ thöïc vaät-ñoäng vaät, ñoàng thôøi cuõng coù khaû naêng loaïi boû ñoäc toá, kim loaïi hoaëc caùc thaønh phaàn ña phaân töû ra khoûi boä bieán naêng.

Vaán ñeà taùc ñoäng hoùa hoïc cuõng aûnh höôûng ñeán söï choïn löïa boä bieán naêng. Coù theå keát hôïp enzym urese vaøo caùc ñieän cöïc pH, pCO2, hay pNH3. Boä bieán naêng toát nhaát cho vieäc xaùc ñònh ure trong moät maãu sinh hoïc laø caùc ñieän cöïc pCO2, pNH3 bôûi chuùng coù moät maøng thaåm thaáu ñeå loaïi boû taát caû nhöõng aûnh höôûng cuûa cation vaø anion.

3.3. SÖÏ COÁ ÑÒNH THAØNH PHAÀN SINH HOÏC LEÂN BOÄ BIEÁN NAÊNG:

Vieäc coá ñònh caùc thaønh toá sinh hoïc, nhaát laø enzym thöôøng ñem laïi nhieàu lôïi nhuaän hôn trong vieäc öùng nhö:

Laøm cho enzym trong nhieàu tröôøng hôïp beàn hôn.

Taùch phöùc enzym – chaát mang ra khoûi maãu deã daøng.

Hoaït ñoä enzym giöõ ñöôïc oån ñònh trong moät thôøi gian daøi.

Tuy nhieân, vieäc söû duïng enzym coá ñònh cuõng coù nhöõng haïn cheá nhaát ñònh nhö:

Söï chuyeån khoái bò haïn cheá.

Coù theå maát hoaït tính khi coá ñònh.

Khoâng coù hieäu quaû ñoái vôùi cô chaát raén.

Maát tính thích nghi hình theå.

Nhöng nhöõng haïn cheá treân laø khoâng ñaùng keå so vôùi nhöõng lôïi ích maø enzym coá ñònh mang laïi. Do vaäy ngaøy caøng coù

nhieàu nghieân cöùu môùi cuõng nhö caùc coâng ngheä môùi ñeå coá ñònh enzym.

Ngöôøi ta thöôøng coá ñònh caùc thaønh phaàn sinh hoïc leân moät chaát mang raén baèng nhieàu caùch. Trong kyõ thuaät coá ñònh, caàn ñaûm baûo nhöõng yeâu caàu nhaát ñònh, nhaát laø khi caùc ñieän cöïc sinh hoïc (biosensor) ñöôïc ñöa vaøo söû duïng trong thöïc teá:

Caùc caáu töû sinh hoïc phaûi giöõ ñöôïc hoaït ñoä khi gaén treân beà maët biosensor.

Maøng sinh hoïc phaûi ñöôïc gaén chaët vôùi beà maët caûm bieán vaø vaãn giöõ ñöôïc caáu truùc vaø chöùc naêng.

Maøng sinh hoïc ñaõ ñöôïc coá ñònh phaûi oån ñònh vaø beàn trong moät thôøi gian daøi.

Vaät lieäu sinh hoïc caàn coù tính ñaëc tröng rieâng ñoái vôùi töøng caáu töû sinh hoïc.

Ñeå coá ñònh caùc thaønh phaàn sinh hoïc trong Biosensor, ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc kyõ thuaät nhö haáp thuï vaät lyù, bao goùi trong khuoân gel hoaëc trong polymer, lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi chaát mang vaø lieân keát cheùo caùc protein.

Hình 3.1: Moät soá phöông phaùp coá ñònh thöôøng duøng trong ñieän cöïc sinh hoïc

3.3.1. Söï coá ñònh Enzym:

a. Söï coá ñònh baèng haáp thuï vaät lyù:

Ñieän cöïc Enzym ñaàu tieân ñöôïc cheá taïo bôûi Updike vaø Hicks baèng caùch coá ñònh Enzym Glucose oxidase trong moät lôùp gel polyacrylamide, sau ñoù Enzym naøy ñöôïc gaén leân maøng Plastic cuûa ñieän cöïc oxy. Hoaëc coù theå coá ñònh moät enzym leân moät thaønh phaàn nhaïy caûm cuûa moät ñieän cöïc baèng maøng thaåm thaáu ngaên caûn söï khueách taùn protein. Guibault vaø Shu ñaõ cheá taïo moät ñieän cöïc enzym nhaïy caûm vôùi ure baèng caùch traûi moät dung dòch huyeàn phuø cuûa enzym urease leân beà maët cuûa ñieän cöïc coù maøng nilon vaø bao boïc khít hoaøn toaøn baèng maøng thaåm thaáu, sau ñoù ñieän cöïc enzym naøy ñöôïc röûa saïch vôùi nöôùc vaø saün saøng ñeå söû duïng.

Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp haáp phuï vaät lyù nhö sau:

Haáp phuï enzym leân chaát mang nhôø löïc töông taùc yeáu giöõa chaát mang vaø protein nhö löïc Valderwaalls, lieân keát hydro vaø lieân keát kî nöôùc. Khi chaát mang khoâng coù loã xoáp, enzym baùm treân beà maët chaát mang. Khi chaát mang coù loã xoáp, enzym chui vaøo trong caùc loã xoáp cuûa chaát mang.

Neáu chaát mang coù chöùa ñieän tích, lieân keát giöõa chaát mang vaø enzym laø lieân keát ion (Lieân keát naøy beàn hôn so vôùi haáp phuï).

Moät soá chaát mang thöôøng söû duïng ñeå coá ñònh enzym baèng phöông phaùp haáp phuï hay lieân keát ion:

Chaát mang höõu cô: than hoaït tính, cellulose, tinh boät, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin.

Chaát mang voâ cô: silic, thuûy tinh xoáp, oxide cuûa kim loaïi.

Chaát trao ñoåi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose.

Polymer toång hôïp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl.

Phöông phaùp ñieàu cheá: Cho enzym vaø chaát mang tieáp xuùc vôùi nhau (khuaáy troän), sau ñoù röûa ñeå loaïi boû nhöõng phaân töû bò gaén yeáu leân chaát mang.

Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán löôïng enzym coá ñònh ñöôïc vaø ñoä beàn cuûa lieân keát coá ñònh:

Noàng ñoä protein enzym: löôïng enzym coá ñònh leân chaát mang thöôøng tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä cuûa noù ôû moät giôùi haïn nhaát ñònh.

pH: pH moâi tröôøng phuï thuoäc vaøo soá löôïng vaø baûn chaát cuûa caùc nhoùm tích ñieän ôû chaát mang cuõng nhö ôû protein enzym. Söï thay ñoåi pH thöôøng aûnh höôûng lôùn ñeán löôïng enzym coá ñònh ñöôïc baèng lieân keát ion. Ñoàng thôøi söï thay ñoåi pH ñoät ngoät thöôøng daãn ñeán söï nhaû haáp phuï cuûa enzym.

Löïc ion cuûa moâi tröôøng: söï coù maët cuûa caùc muoái tích ñieän traùi daáu vôùi chaát mang coù theå keùo theo söï keát tuûa cuïc boä cuûa protein trong dung dòch. Tuy nhieân, söï coù maët cuûa muoái cuõng coù theå laøm taêng ñoä hoøa tan cuûa protein do ñoù aûnh höôûng xaáu ñeán hieäu quaû coá ñònh.

Nhieät ñoä: nhieät ñoä taêng laøm duoãi maïch protein enzym, do ñoù laøm taêng lieân keát protein enzym vôùi chaát mang, nhöng cuõng laøm maát hoaït tính cuûa enzym.

Khoái löôïng phaân töû vaø baûn chaát cuûa chaát mang: enzym coù khoái löôïng phaân töû caøng nhoû thì haáp phuï caøng cao. Nhöõng chaát mang coù chöùa nhieàu nhoùm haùo nöôùc haáp phuï toát hôn vaø beàn hôn.

Tuy nhieân söï coá ñònh vaät lyù ngaøy nay ít ñöôïc söû duïng do söï coù maët cuûa enzym trong dung dòch khoâng giöõ ñöôïc hoaït tính trong thôøi gian daøi. Do ñoù söï coá ñònh hoùa hoïc, söû duïng caùc lieân keát ñoàng hoùa trò seõ ñaûm baûo ñoä beàn cuûa enzym trong moät thôøi gian khaù daøi.

b. Söï coá ñònh baèng lieân keát ngang (cross – linking immobilization):

Söï taïo lieân keát ngang laø quaù trình söû duïng moät taùc nhaân ña chöùc ñeå taïo caàu noái giöõa caùc nhoùm xuùc taùc sinh

hoïc khaùc nhau hay protein khaùc nhau ñeå taïo ra moät hôïp chaát coù troïng löôïng phaân töû lôùn raát nhieàu vaø khoâng coù tính hoøa tan.

Coù theå taïo lieân keát ngang caùc phaân töû cuûa cuøng enzym hay coá keát hai hay nhieàu protein vôùi nhau (enzym vôùi enzym hay enzym vôùi protein hoaëc nhieàu enzym treân protein mang chaúng haïn nhö albumin trong huyeát thanh cuûa boø (BSA). Ngay caû cô quan hay caùc teá baøo cuõng coù theå keát dính ñöôïc baèng vieäc taïo ra caùc lieân keát ngang.

Glutaraldehyde laø taùc nhaân taïo lieân keát ngang thöôøng duøng. Taùc nhaân coù hai nhoùm chöùc aldehyde ôû caùc ñaàu maïch naøy seõ phaûn öùng vôùi nhoùm amine treân phaân töû protein hay enzym vaø taïo ra caùc hôïp chaát mang tính base:

Cuõng coù theå thay Glutaraldehyde baèng taùc nhaân hai chöùc khaùc nhö hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O laøm taùc nhaân taïo lieân keát ngang.

Coù 4 phöông phaùp chính ñeå coá ñònh enzym baèng lieân keát ngang:

Phöông phaùp ngaâm (Immersion method)

ÖÙng duïng: Phöông phaùp ngaâm naøy duøng ñeå coá ñònh enzym urease leân ñieän cöïc thuûy tinh hay ñieän cöïc pH-nhaïy caûm vôùi caùc cation hoùa trò I.

Nguyeân taéc: Chuaån bò dung dòch coá ñònh: Laáy 600 ñôn vò I.U enzym Urease hoøa tan trong 1ml ñeäm phosphate 0.02M, pH = 6.8. Theâm vaøo 1 ml dung dòch albumine huyeát thanh boø 17.5%, sau ñoù theâm 0.07 ml dung dòch glutaraldehyde 25% ñeå thu ñöôïc noàng ñoä cuoái cuøng 0.8%. Khuaáy dung dòch trong 2 phuùt.

Chuaån bò beà maët hoaït ñoäng: Ñaàu tieân ñieän cöïc cation ñöôïc röûa baèng nöôùc caát, sau ñoù lau khoâ baèng giaáy loïc.

Nhuùng ngaäp baàu ñieän cöïc trong dung dòch coá ñònh treân, xoay ñieän cöïc nheï nhaøng xung quanh truïc cuûa ñieän cöïc trong 15 phuùt ñeå taïo moät lôùp dung dòch coá ñònh ñoàng nhaát. Moät voøng “O” ñöôïc gaén khít vaøo ñeå giöõ cho maøng enzym naøy baùm chaët leân baàu ñieän cöïc. Sau ñoù röûa ñieän cöïc baèng nöôùc caát, dung dòch glycine, vaø cuoái cuøng baèng nöôùc caát ñeå taùch röûa hay trung hoøa taùc nhaân taïo lieân keát ngang.

Hình 3.2: Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ngaâm

Öu ñieåm: Phöông phaùp thöïc hieän ñôn giaûn, thích hôïp cho vieäc coá ñònh caùc Enzym leân ña soá caùc boä bieán naêng, ñaëc bieät boä bieán naêng nhoû.

Phöông phaùp keát hôïp tröïc tieáp (Direct binding method):

Nguyeân taéc: Nhoû 10 l dung dòch chöùa enzym leân treân ñænh cuûa moät ñieän cöïc, sau ñoù nhoû 10l dung dòch chöùa taùc nhaân taïo lieân keát glutaraldehyde.

Phöông phaùp naøy cuõng ñöôïc duøng ñeå coá ñònh enzym leân maøng kî nöôùc cuûa caùc ñieän cöïc caûm öùng khí nhö maøng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene.

Hình 3.3: Phöông phaùp keát hôïp tröïc tieáp

Öu ñieåm: Tieát kieäm enzym, duøng ñeå coá ñònh caùc enzym coù giaù thaønh cao.

Phöông phaùp söû duïng bình phun (Use of aerosol):

Nguyeân taéc: ñaàu nhaïy caûm cuûa moät ñieän cöïc ñöôïc röûa vaø ngaâm trong dung dòch enzym khoaûng 20 phuùt ñeå ñaûm baûo söï haáp thu enzym leân ñieän cöïc enzym. Ñieän cöïc naøy sau ñoù ñöôïc saáy khoâ ôû 4oC vaø xoay. Glutaraldehyde ñöôïc bôm leân treân ñieän cöïc töø moät khoaûng caùch ñuû lôùn ñeå ngaên caûn taïo gioït. Sau khi taïo lieân keát ngang, ñieän cöïc enzym ñöôïc röûa vôùi nöôùc, saün saøng cho vieäc söû duïng.

Öu ñieåm: beà daøy lôùp enzym cöïc kyø moûng (1-2m) vaø caùc biosensor taïo ra coù thôøi gian ñaùp öùng cöïc ngaén (5-10s).

ÖÙng duïng: Phöông phaùp naøy duøng ñeå coá ñònh enzym pennicilinase, urease vaø acetylcholinesterase, coá ñònh caùc protein leân nhieàu chaát mang.

Hình 3.4: Phöông phaùp söû duïng bình phun

Söû duïng maøng membrane:

Caùc maøng membrane taêng cöôøng-gia coá (Re-inforced membranes): Enzym ñöôïc coá ñònh leân moät dieän tích roäng cuûa maøng nylon baèng nhöõng dóa nhoû chöùa membrane enzym coù cuøng meû vaø söï coá ñònh gioáng nhau. Sau ñoù caùc maøng naøy ñöôïc keïp vaøo trong boä bieán naêng. Maøng membran taêng cöôøng-gia coá naøy coù phaàn sôïi do ñoù caûi thieän tính chaát cô hoïc cuûa maøng enzym.

Caùc maøng membrane gaén nhoùm chöùc saün (Prefunctionalized membrane) duøng caùc maøng membrane xoáp saün coù treân thò tröôøng. Nhöõng maøng naøy coù caùc nhoùm chöùc lieân keát coù khaû naêng phaûn öùng vôùi vò trí töï do cuûa enzym. Caùc maøng naøy sau ñoù ñem ngaâm trong dung dòch chöùa enzym ñaõ choïn ñeå thu ñöôïc moät maøng enzym vôùi nhöõng tính chaát cô hoïc höõu duïng.

3.1.3. Söï coá ñònh cofactor:

Cofactor ñöôïc coá ñònh leân chaát mang ñoàng thôøi cuøng luùc vôùi enzym baèng phöông phaùp haáp thuï vaät lyù, hay baèng lieân keát ngang.

3.2. Coá ñònh Vi sinh vaät

Vi sinh vaät coù kích thöôùc lôùn hôn enzym do ñoù deã daøng coá ñònh baèng phöông phaùp vaät lyù. Chuùng coù theå ñöôïc coá ñònh baèng gel agar hay polyacrylamide hoaëc maøng thaåm thaáu vaø maøng loïc membrane nhö millipore 0.22 m – cheá taïo töø ester cellulosic. Toaøn boä teá baøo vi sinh vaät ñöôïc coá ñònh trong huyeàn phuø collagen ñaõ ñöôïc xöû lyù bôûi glutaraldehyde. Maøng collagen cuõng ñöôïc söû duïng nhö moät chaát mang vaät lyù.

Maøng kî nöôùc vaø vi sinh vaät coù theå ñöôïc gaén ñoàng thôøi leân caùc ñieän cöïc khueách taùn khí chaúng haïn nhö ñieän cöïc pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vaät ñöôïc nhoát trong caùc loã maøng loïc cellulose acetate, sau ñoù röûa caùc teá baøo vi sinh vaät töï do treân beà maët vaø ñaët maøng vi sinh vaät treân vaøo ñieän cöïc duøng maøng thaåm thaáu vaø ngaâm trong dung dòch ñeäm ñeå loaïi boû caùc thaønh phaàn dinh döôõng aûnh höôûng tôùi pheùp ño. Caùc

ñieän cöïc vi sinh vaät ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä 40C trong dung dòch ñeäm phosphate.

Hình 3.5: Ñieän cöïc vi khuaån ño doøng ñieän

Cuõng coù theå coá ñònh moät enzym vaø moät teá baøo vi sinh vaät leân cuøng boä bieán naêng. Vi sinh vaât ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp vaät lyù vaø enzym ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp lieân keát ñoàng hoùa trò ñeå traùnh söï nhaû protein.

Vi khuaån acetic thuoäc loaøi Acetobacter xylinum coù khaû naêng taïo ra maøng moûng trong moâi tröôøng tónh sau khi xöû lyù vôùi glutaraldehyde vaø coù nhöõng tính chaát cô hoïc nhaát ñònh thì coù theå coá ñònh tröïc tieáp vaøo ñieän cöïc Oxy maø khoâng caàn duøng maøng thaåm thaáu.

3.3.2. Coá ñònh caùc taùc nhaân mieãn dòch:

Nhieàu ñieän cöïc mieãn dòch ñöôïc taïo ra baèng caùc coá ñònh caùc taùc nhaân mieãn dòch leân caùc boä bieán naêng khaùc nhau.

a) Coá ñònh khaùng theå (Immobillization of antibodies):

Muïc ñích: Ñeå phaùt hieän ra khaùng nguyeân töông öùng taïo ra khaùng theå. Do khaùng theå coù caáu truùc laø protein neân phöông phaùp coá ñònh khaùng theå töông töï nhö phöông phaùp coá ñònh enzym: duøng phöông phaùp coá ñònh tröïc tieáp hay söû duïng maøng membrane.

Coá ñònh tröïc tieáp leân boä bieán naêng:

Caùc khaùng theå coù theå ñöôïc gaén leân moät ñieän cöïc carbon baèng lieân keát coäng hoùa trò. Caùc nhoùm COOH ñöôïc taïo ra treân ñieän cöïc carbon baèng phaûn öùng ñieän hoùa trong moâi tröôøng acid nitric HNO3 vaø kali bicromat K2Cr2O7 vaø gaén vôùi khaùng theå baèng moät taùc nhaân taïo lieân keát ngang nhö carbodiimide.

Hoaëc coù theå coá ñònh baèng phöông phaùp haáp phuï khaùng theå leân caùc lôùp kim loaïi vaøng hay baïc laéng treân thuûy tinh. Sau ñoù duøng phöông phaùp doø coäng höôûng gen nguyeân sinh beà maët.

Söï coá ñònh baèng maøng membrane:

Caùc khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh leân caùc maøng membrane theo trình töï nhö sau: ñaàu tieân maøng bromo-acetylcellulose ñöôïc ngaâm trong dung dòch chöùa hexamethylene diamine, sau ñoù ngaâm trong dung dòch diepoxy butadiene, dung dòch naøy taïo ra caùc nhoùm seõ phaûn öùng vôùi khaùng theå, cuoái cuøng maøng naøy vôùi khaùng theå ñaõ ñuôïc coá ñònh ñöôïc röûa vôùi dung dòch ethanolamine ñeå loaïi boû nhöõng nhoùm epoxy khoâng phaûn öùng.

Khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh trong caùc maïng nylon hoaëc haáp thuï vaät lyù baèng caùc maøng collagen vaø polyvinylbutyral, sau ñoù ñöôïc laép vaøo ñieän cöïc ISFET. Maøng naøy ñöôïc hoaït hoùa vôùi glutaraldehyde tröôùc khi keát hôïp vôùi khaùng theå. Caùc khaùng theå cuõng coù theå ñöôïc coá ñònh leân sôïi quang hoïc.

b) Söï coá ñònh khaùng nguyeân:

Khaùng nguyeân laø caùc hôïp chaát bao goàm protein, hydratcarbon,…chuùng ñöôïc coá ñònh baèng nhöõng caùch khaùc nhau, khoâng nhö khaùng theå vaø enzym. Yeáu toá quyeát ñònh tính khaùng nguyeân dinitrophenol (DNP) coù theå ñöôïc keát hôïp vôùi moät chaát mang ion dibenzo-18-crown-6 (DB18C6) vaø sau ñoù ñöôïc coá ñònh trong maøng polymer. Ñaàu tieân, ether naøy ñöôïc chuyeån thaønh daãn xuaát daïng trans-dinitro vaø sau ñoù thaønh daãn xuaát arylaminey thích hôïp cho vieäc keát hôïp vôùi fluorodinitrobenzene. Phöùc hôïp naøy ñöôïc hoøa tan trong tetrahydrosulfan vaø theâm dibutylsebacate, sau ñoù keát hôïp phöùc hôïp naøy trong maøng polyvinylchloride (PVC). Cuoái cuøng maøng khaùng nguyeân ñöôïc chia thaønh nhöõng ñóa nhoû ñöôïc gaén leân treân ñænh cuûa ñieän cöïc. Caùc biosensor taïo ra nhaïy caûm tröïc tieáp vôùi caùc khaùng

theå. Tuy nhieân, ñieän cöïc taïo ra baèng caùch naøy vaãn coù nhöôïc ñieåm ñoù laø DNP coù moät aùi löïc ñoái vôùi ion K+ cuûa dung dòch chaát ñieän phaân beân trong ñieän cöïc, do ñoù cho keát quaû khoâng chính xaùc. Ñeå haïn cheá ñieàu naøy, moät ñieän cöïc raén vôùi nhöïa epoxy nhoài ñaù granite ñöôïc cheá taïo. Ñaàu tieân, ngöôøi ta ñoå nay nhöïa thoâng vaøo beân trong oáng PVC chöùa moät dóa baèng Pt cuøng ñöôøng kính vôùi oáng, sau ñoù ñoå dung dòch tetrahydrofuran, 10 mg/ml DNP-khaùng nguyeân vaø 15% triocyl acetate vaøo trong loã khoan cuûa nhöïa thoâng.

Hình 3.6: Söï coá ñònh khaùng theå leân maøng membrane bromo-acetylcellulose

Hình 3.7: Ñieän cöïc khaùng nguyeân duøng PVC raén vôùi DNP

c) Söï gaén enzym:

Khi moät taùc nhaân mieãn dòch ñöôïc coá ñònh leân boä bieán naêng hay leân maøng membrane thì söï keát hôïp mieãn dòch giöõa khaùng nguyeân vaø khaùng theå xaûy ra nhöng khoù ñöôïc phaùt hieän bôûi boä bieán naêng, thoâng thöôøng phaûn öùng mieãn dòch coù theå ñöôïc doø khi boå sung vaøo enzym ñeå xuùc taùc quaù trình phaûn öùng. Khaùng nguyeân hay khaùng theå ñöôïc gaén vôùi moät enzym söû duïng kyõ thuaät EIA (mieãn dòch enzym) hay ELISA. Enzym ñöôïc gaén vôùi taùc nhaân mieãn dòch baèng taùc nhaân taïo lieân keát ngang hai chöùc glutaraldehyde.

Tuyø thuoäc vaøo töøng loaïi boä bieán naêng maø gaén khaùng nguyeân hay khaùng theå vôùi enzym cho phuø hôïp: Neáu söû duïng boä bieán naêng laø ñieän cöïc pO2 thì khaùng nguyeân ñöôïc gaén vôùi enzym glucose oxidase hoaëc catalase. Khi boä bieán naêng laø ñieän cöïc pNH3 khaùng nguyeân ñöôïc gaén vôùi enzym urease.

3.3.3. Coá ñònh moâ, cô quan vaø chemoreceptor :

a) Cô quan vaø moâ thöïc vaät – ñoäng vaät:

Ñaàu tieân, moät laùt moâ thöïc vaät hay ñoäng vaät ñöôïc caét ra, vaø cheøn vaøo giöõa hai maøng baùn thaám roài gaén chuùng leân boä bieán naêng. Thöôøng duøng ñieän cöïc pO2, pCO2, hay pNH3. Moâ ñoäng vaät coù theå laø gan boø, gan thoû, baép thòt thoû hay cô ruoät, hay thaønh phaàn teá baøo. Caùc cô quan naøy ñöôïc gaén vaøo boä bieán naêng seõ laøm cho Biosensor choïn loïc hôn bôûi vì chuùng chöùa nhöõng enzym ñaëc bieät.

Biosensor gaén moâ thöïc vaät – ñoäng vaät nhìn chung coù thôøi gian ñaùp öùng daøi hôn Biosensor gaén enzym. Thôøi gian ñaùp öùng nhanh cuûa Biosensor naøy coù theå ñaït ñöôïc neáu nhö gaén caùc moâ naøy trong boät than daïng paste nhaèm taïo ra söï tieáp xuùc lôùn hôn giöõa chaát xuùc taùc sinh hoïc vaø thaønh phaàn caûm öùng: Caét nhöõng laùt moâ vaø nhoài vaøo trong hoà vöõa, sau ñoù troän vôùi daàu khoaùng vaø boät than chì ñeå taïo hoãn hôïp nhaõo vaø cuoái cuøng traûi ñeàu leân ñaàu ñieän cöïc.

b) Chemoreceptor:

Receptor laø raâu nhoû cuûa loaøi cua xanh Callinectes sapidus coù sôïi thaàn kinh ñöôïc söû duïng nhö boä bieán naêng ñeå truyeàn daãn xung ñoäng thaàn kinh gaây ra bôûi khöùu giaùc hay vò giaùc, chuùng ñöôïc coá ñònh tröïc tieáp vaøo ñieän cöïc doø Pt cuûa ñieän cöïc ño ñieän theá. Ñieän cöïc so saùnh Ag/AgCl ñöôïc nhuùng vaøo dung dòch muoái, vaø seõ taïo ra söï cheânh leäch ñieän theá so vôùi ñieän cöïc doø. Baèng vieäc duøng caùc lieàu taùc nhaân kích thích khaùc nhau vaøo trong doøng chaát mang seõ gaây ra nhöõng thay ñoåi veà caáu taïo cuûa receptor vaø keát quaû taïo ra moät söï thay ñoåi veà khaû naêng thaám cuûa maøng kích thích hay söï thay ñoåi hoaït tính enzym ñöôïc gaén leân maøng. Söï phaân cöïc cuûa sôïi truïc axon seõ laøm taêng ñieän theá ño ñöôïc.

Biosensor döïa treân caùc receptor thaàn kinh coù theå duøng ñeå phaùt hieän ñoäc toá hay caùc chaát ñoäc hoùa hoïc ñaõ söû duïng trong chieán tranh. Söû duïng receptor acetylcholine coù theå xaùc ñònh acetylcholine baèng caùch doø trôû khaùng ñaëc tröng so vôùi caùc boä truyeàn thaàn kinh khaùc, receptor naøy ñöôïc gaén enzym acetylcholinesterase nhaïy caûm vôùi hôïp chaát phosphor höõu cô vaø carbamate, receptor ñöôïc coá ñònh leân boä bieán naêng thích hôïp baèng caùch ngaâm ñaàu nhaïy caûm cuûa ñieän cöïc vaøo trong dung dòch liposome chöùa receptor.

CHÖÔNG 4

ÑIEÄN CÖÏC ENZYM

4.1. NGUYEÂN TAÉC HOAÏT ÑOÄNG:

Ñieän cöïc enzym hoaït ñoäng nhö sau:

Chuyeån cô chaát töø trong dung dòch vaøo trong maøng enzym

Khueách taùn cô chaát beân trong maøng enzym, keøm theo quaù trình bieán ñoåi cô chaát thaønh saûn phaåm nhôø phaûn öùng coù enzym xuùc taùc.

Chuyeån saûn phaåm veà phía boä bieán naêng

Chuyeån ñoåi noàng ñoä saûn phaåm ôû beà maët phaân caùch giöõa boä bieán naêng vaø saûn phaåm thaønh tín hieäu ñieän nhôø boä bieán naêng.

Hình 4.1: Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa ñieän cöïc enzym

S : cô chaát P: saûn phaåm

Lôùp maøng enzym caøng moûng thì söï caân baèng noàng ñoä cô chaát beân trong vaø beân ngoaøi lôùp maøng enzym caøng nhanh

ñaït ñöôïc. Dung dòch maãu caàn ñöôïc khuaáy ñaûo ñoàng ñeàu ñeå ñaûm baûo cô chaát laø ñoàng nhaát.

4.2. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT:

Söï xuùc taùc cuûa enzym thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch taïo ra ít nhaát moät phöùc hôïp taïm thôøi giöõa enzym vaø cô chaát. Moâ hình ñôn giaûn nhaát laø moâ hình cuûa Michaelis. Moâ hình naøy thöøa nhaän raèng phaûn öùng chæ xaûy ra vôùi moät cô chaát vaø taïo ra chæ moät saûn phaåm:

Toác ñoä phaûn öùng: (2)

Vôùi Km laø haèng soá Michaelis, ,

Vm laø toác ñoä phaûn öùng cöïc ñaïi khi [S] >> Km, Vm = k+2 [E0] – [E0]: noàng ñoä enzym ban ñaàu.

[S]: noàng ñoä cô chaát

[P]: noàng ñoä saûn phaåm.

Ñoái vôùi enzym ñaõ bieát, toác ñoä phaûn öùng V laø haøm cuûa tyû

soá [S]/Km. Khi , thì . Khi thì .

Beân trong lôùp maøng enzym, toác ñoä phaûn öùng bao goàm caû toác ñoä khueách taùn nhieàu cô chaát trong dung dòch:

(3)

(4)

Vôùi t: thôøi gian phaûn öùng,

DS, DP laø heä soá khueách taùn cuûa cô vaø saûn phaåm ôû beân trong lôùp maøng enzym

x: khoaûng caùch giöõa moät ñieåm cho tröôùc trong maøng enzym vaø beà maët ngoaøi cuûa ñieän cöïc.

4.2.1. Söï traû lôøi tín hieäu ôû traïng thaùi nhanh:

Phöông trình (3) vaø (4) cho bieát noàng ñoä cuûa cô chaát vaø saûn phaåm ôû beà maët boä bieán naêng phuï thuoäc vaøo haèng soá Michaelis Km, vaän toác phaûn öùng cöïc ñaïi Vm cuûa lôùp maøng enzym, beà daøy cuûa lôùp maøng vaø heä soá khueách taùn DS, DP. Giaû thieát raèng noàng ñoä cuûa saûn phaåm ôû beà maët ngoaøi cuûa ñieän cöïc baèng khoâng (do söï khueách taùn chæ xaûy ra ôû trong lôùp maøng enzym. Nhieät ñoä, Vm, Km, DS, DP xem nhö khoâng ñoåi trong suoát toaøn boä lôùp maøng. Ñoàng thôøi giaû ñònh raèng boä bieán naêng khoâng laøm thaát thoaùt saûn phaåm hay cô chaát.

Ta coù:

Vôùi e: beà daøy cuûa lôùp maøng enzym.

Khi ñoù phöông trình (3) vaø (4) trôû thaønh:

(3’)

(4’)

ÔÛ giai ñoaïn naøy, phaûn öùng xaûy ra nhanh choùng, coù söï keát hôïp giöõa cô chaát vaø enzym ñeå taïo ra phöùc hôïp enzym - cô chaát.

Noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm trong moät ñôn vò theå tích dung dòch laø Km, thôøi gian khueách taùn cuûa cô chaát qua beà daøy cuûa lôùp maøng laø e2/DS. ÔÛ thôøi gian t = 0, noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm trong maøng baèng 0. Noàng ñoä cô chaát trong dung dòch luoân luoân giöõ khoâng ñoåi vaø baèng Km.

Ñoái vôùi maøng enzym: Vm = 1,92.10-6 mol.cm-3.s-1

Km = 2,1.10-5 mol.cm-3

e = 2,5.10-3 cm

DS = DP = 1,2.10-5 cm2.s-1.

Thôøi gian ñeå ñaït tôùi traïng thaùi oån ñònh: t = 0.7. e2/DS = 36 giaây.

Tyû soá e2/DS xaùc ñònh thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor bôûi vì noù bieåu dieãn thôøi gian maø lôùp maøng enzym ñaït ñeán traïng thaùi oån ñònh. Coù theå giaûm thôøi gian naøy baèng caùch taêng tính thaám cuûa maøng ñoái vôùi cô chaát (taêng DS) hay giaûm beà daøy cuûa lôùp maøng (giaûm e), trong ñoù giaûm e laø phöông phaùp hieäu quaû nhaát. Nhöng giaûm e seõ aûnh höôûng ñeán tính chaát vaät lyù cuûa maøng enzym. Ngoaøi ra thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor luoân lôùn hôn thôøi gian ñaùp öùng cuûa boä bieán naêng.

4.2.2. Söï traû lôøi tín hieäu ôû traïng thaùi oån ñònh:

Trong giai ñoaïn oån ñònh, thôøi gian ñaùp öùng cuûa Biosensor phuï thuoäc raát nhieàu vaøo tyû soá [S]/Km. Khi [S]/Km lôùn, toác ñoä phaûn öùng tieán tôùi giaù trò cöïc ñaïi Vm, tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä enzym coá ñònh. Sau ñoù toác ñoä phaûn öùng ñoäc laäp vôùi noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm ôû beà maët tieáp xuùc vôùi boä bieán naêng khoâng ñoåi khi noàng ñoä cô chaát lôùn.

Hình 4.2: Ñoà thò bieåu dieãn noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä cô chaát öùng vôùi caùc giaù trò khaùc nhau.

Ñöôøng cong bieåu dieãn moái quan heä phuï thuoäc giöõa noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm coù ñaëc ñieåm:

Tuyeán tính ôû noàng ñoä cô chaát nhoû hôn 0.1Km, khi taêng thì vuøng tuyeán tính cuõng taêng theo

Ñoä doác cuûa ñöôøng tuyeán tính khoâng phuï thuoäc vaøo giaù trò .

Khi ñuû lôùn, ñöôøng tuyeán tính naøy daàn ñaït ñeán ñöôøng thaúng taïi ñieåm coù noàng ñoä [P]e = [S]o.

Vuøng tuyeán tính naøy phuï thuoäc raát nhieàu vaøo chaát löôïng cuûa enzym söû duïng.

Vuøng tuyeán tính naøy töông ñöông vôùi ñoäng hoïc enzym baäc moät theo noàng ñoä cô chaát, ngöôïc laïi vuøng coù noàng ñoä cao hôn thì töông ñöông vôùi ñoäng hoïc baäc khoâng.

a) Ñoäng hoïc phaûn öùng enzym baäc I:

Ñoäng hoïc enzym xaûy ra khi [S] << Km, khi ñoù, phöông trình (3) vaø

(4) ñaït ñeán traïng thaùi oån ñònh: :

(6)

(7)

Noàng ñoä saûn phaåm ôû boä bieán naêng ñöôïc tính theo coâng thöùc:

(8), trong ñoù = Vm/(DSKm) vaø cosh(e) laø

haøm cos hyperbolic cuûa (e).

Noàng ñoä saûn phaåm [P]e tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä cô chaát [S]o

b) Ñoäng hoïc baäc 0:

Ñoäng hoïc baäc 0 xaûy ra khi [S] >>Km ôû traïng thaùi oån ñònh vaø phöông trình (3) vaø (4) trôû thaønh:

(10)

(11)

khi ñoù [P]e = Vme2/2DP, noàng ñoä cô chaát ñöôïc doø bôûi boä bieán naêng thì ñoäc laäp vôùi caû noàng ñoä cô chaát vaø Km, khi noàng ñoä cô chaát [S]>>Km thì biosensor khoâng coøn khaû naêng xaùc ñònh cô chaát nhöng coù theå xaùc ñònh chaát öùc cheá, chaát naøy aûnh höôûng ñeán toác ñoä phaûn öùng cöïc ñaïi Vm.

4.2.3. Chaát öùc cheá enzym:

Chaát öùc cheá (chaát kìm haõm) enzym laø nhöõng hôïp chaát hoùa hoïc coù hình daïng vaø caáu truùc töông töï nhö cô chaát, seõ laøm chaäm quaù trình phaûn öùng enzym.

Chaát öùc cheá ñöôïc chia laøm ba loaïi:

Chaát kìm haõm caïnh tranh (Competitive inhibitors)

Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh (Non – competitive inhibitors)

Chaát kìm haõm phi caïnh tranh (Uncompetitive inhibitors)

Hình 4.3: Sô ñoà caùc kieåu kìm haõm phaûn öùng enzym

a) Chaát kìm haõm caïnh tranh: ( Competitive inhibitors)

Trong ñoù KI laø haèng soá phaân ly cuûa phöùc hôïp EI. Toác ñoä phaûn öùng k hi coù maët chaát öùc cheá, VI ñöôïc xaùc ñònh:

Ñaët i = [I]/KI vaø s = [S]/Km thì khi ñoù .

Möùc ñoä kìm haõm cuûa phaûn öùng ñöôïc ñaëc tröng bôûi ñaïi löôïng

Maø V = Vm [s / (1+s)] neân . Do ñoù coù theå giaûm ñoä kìm

haõm neáu noàng ñoä cô chaát taêng. Söï kìm haõm caïnh tranh coù theå bò loaïi boû neáu nhö dö noàng ñoä cô chaát.

b) Chaát kìm haõm phi caïnh tranh (uncompetitive inhibitors)

Chaát kìm haõm phi caïnh tranh chæ töông taùc vôùi phöùc hôïp ES theo phöông trình phaûn öùng:

ÔÛ traïng thaùi oån ñònh, ta thu ñöôïc:

Do ñoù ñoä kìm haõm ñöôïc tính theo coâng thöùc: , gia taêng

theo noàng ñoä cô chaát [S] khi cuøng noàng ñoä chaát kìm haõm [I].

c) Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh (non – competitive inhibitors)

Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi caû enzym vaø phöùc hôïp ES taïi moät vò trí khaùc vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa enzym.

Keát quaû taïo ra 3 phöùc hôïp ES, EI, ESI maø chæ coù ES taïo ra saûn phaåm cuûa phaûn öùng. Chaáp nhaän raèng töông taùc qua laïi giöõa enzym vaø chaát caïnh tranh khoâng bò aûnh höôûng bôûi cô chaát, do ñoù KI ~K’I, khi ñoù toác ñoä phaûn öùng kìm haõm enzym laø:

Khi ñoù , ñoäc laäp vôùi noàng ñoä cô chaát. Do ñoù loaïi chaát

kìm haõm naøy khoâng ñöôïc loaïi boû bôûi söï dö thöøa cô chaát.

Duøng ñaïi löôïng ñeå ñaëc tröng cho phaûn öùng kìm haõm

enzym

Khi ñoù duøng KP laø haèng soá toác ñoä phaûn öùng kìm haõm, VP laø toác ñoä phaûn öùng kìm haõm cöïc ñaïi.

KP = r.Km vaø VP = Vm (phaûn öùng kìm haõm caïnh tranh)

KP = Km / r vaø VP = Vm /r (phaûn öùng kìm haõm phi caïnh tranh)

KP = Km vaø VP = r.Vm (phaûn öùng kìm haõm khoâng caïnh tranh).

d) Ñieàu khieån phaûn öùng kìm haõm:

Khi enzym ñöôïc coá ñònh leân chaát mang raén, phaûn öùng xaûy ra trong pha dò theå do taâm hoaït ñoäng cuûa enzym naèm trong pha raén cuûa chaát mang vaø cô chaát naèm trong pha loûng cuûa dung dòch. Noàng ñoä cô chaát khaùc nhau taïi moïi ñieåm trong chaát mang, do ñoù toác ñoä phaûn öùng enzym khoâng gioáng nhau. Noàng ñoä cô chaát trong lôùp maøng enzym luoân thaáp hôn so vôùi trong dung dòch.

Nhö vaäy ñeå loaïi boû aûnh höôûng cuûa chaát kìm haõm ñeán phaûn öùng enzym, caàn coù söï dö thöøa noàng ñoä cô chaát, noàng ñoä enzym cao vaø ñoä tinh saïch cuõng nhö tính ñaëc hieäu cuûa enzym.

e) Söï ñaùp öùng tính hieäu cuûa ñieän cöïc enzym khi coù maët caùc chaát kìm haõm:

Ñoà thò log – log moâ taû moái quan heä giöõa noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä cô chaát theo caùc kieåu kieàm haõm khaùc nhau:

Ñoà thò a) : Kìm haõm caïnh tranh.

Toác ñoä phaûn öùng khi coù maët chaát kìm haõm caïnh tranh ñoäc laäp vôùi noàng ñoä chaát kìm haõm thuoäc vuøng coù ñoäng hoïc baäc 0 vaø ñöôïc moâ taû theo phöông trình:

Chaát kìm haõm caïnh tranh chæ phuï thuoäc vaøo giaù trò Km maø khoâng aûnh höôûng giaù trò cöïc ñaïi [P]e. Ngöôïc laïi, vuøng tuyeán tính coù ñoäng hoïc baäc I, theo phöông trình:

vôùi (e)2 = = Vm.e2/ KmD.

Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh laøm taêng giaù trò Km, giaûm vaø do ñoù laøm giaûm log[P]e.

Ñoà thò b): kìm haõm phi caïnh tranh

Khi coù maët chaát kìm haõm phi caïnh tranh thì khoâng laøm thay ñoåi tyû leä Vm/Km, do ñoù vuøng tuyeán tính coù ñöôøng cong ñaùp öùng laø nhö nhau ñoái vôùi moïi giaù trò r. Ngöôïc laïi, nhöõng chaát naøy laøm giaûm vuøng ñoäng hoïc baäc 0 qua vieäc giaûm giaù trò Vm

xuoáng Vm/r.

Hình 4.4: Söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc enzym theo caùc kieåu kìm haõm khaùc nhau

Ñoà thò c): kìm haõm khoâng caïnh tranh:

Chaát kìm haõm naøy chæ aûnh höôûng ñeán giaù trò (giaûm) thoâng qua Vm, do ñoù vuøng tuyeán tính vaø vuøng ñoäng hoïc baäc 0 ôû moãi giaù trò r laø khaùc nhau.

Nhö vaäy qua vieäc quan saùt ñöôøng cong traû lôøi cuûa ñieän cöïc ño ñieän theá seõ xaùc ñònh ñöôïc kieåu kìm haõm phaûn öùng enzym

4.3. CAÙC YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG ÑEÁN SÖÏ TRAÛ LÔØI CUÛA ÑIEÄN CÖÏC ENZYM

4.3.1. Thôøi gian ñaùp öùng:

Thôøi gian ñaùp öùng laø thôøi gian ñaït ñöôïc traïng thaùi oån ñònh cuûa biosensor, cuõng laø thôøi gian ñaït ñöôïc traïng thaùi maø taïi ñoù noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm laø haèng soá.

Hình 4.5: Söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc acetylcholinesterase ôû caùc noàng ñoä cô chaát khaùc nhau

Giaù trò naøy raát khoù ñaùnh giaù chính xaùc do phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö boä bieán naêng, söï ñaûo troän, phöông phaùp coá ñònh enzym. Neáu söû duïng maøng enzym urease coá ñònh leân ñieän cöïc cation hoùa trò I thì cho thôøi gian traû lôøi döôùi 1 phuùt. Nhöng neáu coá ñònh noù leân ñieän cöïc pCO2 cho thôøi gian daøi hôn 2-3 phuùt. Ñoù laø do khi duøng ñieän cöïc pCO2 thì xaûy ra söï khueách taùn CO2 qua maøng thaám khí. Söû duïng phöông phaùp coá ñònh baèng lieân keát ngang seõ taïo ra maøng enzym cöïc moûng 1 – 2m cho thôøi gian traû lôøi chæ trong vaøi giaây ñeán vaøi phuùt. Khuaáy ñaûo maãu ñeå taêng khaû naêng khueách taùn khí cuõng giaûm ñöôïc thôøi gian ñaùp öùng.

4.3.2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï ñaùp öùng tín hieäu cuûa biosensor:

Ñoä beàn cuûa ñieän cöïc enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo caùc thoâng soá vaät lyù vaø hoùa hoïc.

Vaät lyù: Ñoä daøy cuûa maøng enzym: maøng caøng moûng thì ñoä beàn caøng taêng

Noàng ñoä enzym caøng lôùn thì thôøi gian traû lôøi caøng toái öu

Beà maët boä bieán naêng

Hoùa hoïc: phöông phaùp coá ñònh enzym: enzym coá ñònh leân maøng thaåm thaáu ít beàn hôn enzym coá ñònh trong maøng gel. Enzym coá ñònh baèng lieân keát ngang cho ñieän cöïc enzym coù ñoä beàn nhaát

a) Aûnh höôûng cuûa pH:

Vì pH aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzym vaø pH aûnh höôûng ñeán söï phaân ly saûn phaåm cuûa phaûn öùng enzym ñöôïc phaùt hieän hieän bôûi boä bieán naêng neân pH cuõng aûnh höôûng ñeán söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc enzym.

Hoaït tính enzym giaûm coù theå ñieàu chænh baèng caùch taêng noàng ñoä enzym trong lôùp maøng, khi ñoù cô chaát bò bieán ñoåi ôû möùc ñoä lôùn nhaát neân ñieän cöïc enzym ít phuï thuoäc vaøo pH.

Hình 4.6: Söï phuï thuoäc cuûa tín hieäu traû lôøi vaøo pH cuûa ñieän cöïc AchE ôû 25oC

b) Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä:

Khi nhieät ñoä taêng seõ laøm cho hoaït löïc xuùc taùc cuûa enzym e taêng do ñoù toác ñoä phaûn öùng cuõng taêng, nhöng nhieät ñoä cao laøm bieán tính enzym.

Taêng nhieät ñoä seõ laøm taêng toác ñoä khueách taùn cuûa caùc chaát hoùa hoïc khaùc nhau trong maøng enzym do ñoù laøm giaûm thôøi gian traû lôøi tín hieäu.

Trong vuøng nhieät ñoä töø 10 – 40oC: tín hieäu traû lôøi töông ñoái oån ñònh, treân 40oC, hoaït tính enzym bò bieán tính do ñoù tín hieäu traû lôøi seõ giaûm nhanh choùng, nhieät ñoä döôùi 10oC hoaït tính enzym bò yeáu neân tín hieäu traû lôøi thaáp.

Do ñoù ñieän cöïc neân hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä khoaûng 30oC laø toái öu.

Hình 4.7: Söï phuï thuoäc tín hieäu traû lôøi cuûa ñieän cöïc AchE theo nhieät ñoä ôû noàng ñoä Acetylcholin 10-2M

c) Aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát khaùc:

AÛnh höôûng tôùi boä bieán naêng:

Moät boä bieán naêng coù theå ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh nhieàu chaát khaùc nhau nhö coù theå duøng ñieän cöïc pNH4 trong ño noàng ñoä ure, nhöng noù seõ phaùt hieän caùc ion NH4

+, Li+, Na+, K+. Do ñoù laøm aûnh höôûng ñeán tính chính xaùc cuûa pheùp ño.

Vì vaäy, tuøy saûn phaåm taïo thaønh maø duøng boä bieán naêng nhaïy caûm ñaëc bieät vôùi saûn phaåm cho phuø hôïp. Trong tröôøng hôïp treân neân duøng ñieän cöïc pCO2 ñeå loaïi boû bôùt aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát ion.

Aûnh höôûng ñeán hoaït tính enzym:

Trong maãu thöôøng coù chaát öùc cheá cuõng nhö chaát kích thích phaûn öùng enzym, khi ñoù chuùng seõ kìm haõm hay gia taêng toác ñoä phaûn öùng, do ñoù aûnh höôûng ñeán tín hieäu traû lôøi cuûa ñieän cöïc enzym. Neáu trong maãu coù maët chaát öùc cheá thì coù theå loaïi boû chuùng baèng caùch taêng noàng ñoä enzym trong maøng enzym.

Khi xaùc ñònh noàng ñoä ure trong maùu coù maët chaát öùc cheá NaF, neáu ñieän cöïc duøng 5 ñôn vò hoaït ñoä urease trong 1 mm3 thì seõ khoâng bò aûnh höôûng ñeán söï traû lôøi tín hieäu cuûa ñieän cöïc

bôûi noàng ñoä NaF tôùi 5.10-2M, coøn neáu duøng 0.5 ñôn vò hoaït ñoä treân 1 mm3 thì tín hieäu traû lôøi bò aûnh höôûng ôû {NaF] = 3.10-3M.

Hình 4.8 Noàng ñoä cô chaát vaø noàng ñoä saûn phaåm theo noàng ñoä enzym trong lôùp maøng enzym

Ñoà thò a): Lôùp enzym coá ñònh coù noàng ñoä thaáp:

Noàng ñoä cô chaát giaûm khi khueách taùn vaøo trong boä bieán naêng, noàng ñoä naøy coù giaù trò [S]e ôû beà maët boä bieán naêng, saûn phaåm khueách taùn töø lôùp maøng enzym vaøo beà maët boä bieán naêng [P]e luoân nhoû hôn noàng ñoä cô chaát ban ñaàu [S]o. ÔÛ traïng thaùi oån ñònh, taïi moïi ñieåm trong maøng enzym ta luoân coù [S] + [P] = [S]0.

Ñoà thò b): Lôùp maøng enzym coù noàng ñoä cao:

Khi noàng ñoä cô chaát cao, toác ñoä bieán ñoåi cô chaát nhanh, do ñoù phaûn öùng chæ xaûy ra ôû moät phaàn cuûa maøng enzym. Cuoái maøng, noàng ñoä cô chaát [S]e = 0, vuøng naøy goïi laø “deadcore”. Xung quanh vuøng naøy, enzym coù hoaït tính khaùc so vôùi hoaït tính enzym coá ñònh, noàng ñoä saûn phaåm tieán tôùi giaù trò [P]e vaø giaù trò naøy baèng vôùi [S]0 trong maãu . Do ñoù khoâng coù söï aûnh höôûng cuûa chaát öùc cheá trong vuøng naøy neân coù theå loaïi boû aûnh höôûng cuûa chaát kìm haõm baèng vieäc duøng noàng ñoä enzym cao trong maøng.

Hoaït tính cuûa enzym cuõng bò aûnh höôûng neáu duøng enzym khoâng ñaëc hieäu. Cho neân caàn söû duïng caùc enzym coù tính ñaëc hieäu cao vôùi cô chaát cuõng nhö tinh khieát khi coá ñònh leân maøng enzym.

Aûnh höôûng ñeán cô chaát:

Khi coù maët caùc chaát khaùc, noù seõ laøm giaûm khaû naêng khueách taùn cuûa cô chaát vaøo trong maøng enzym, cuõng nhö kìm haõm quaù trình phaûn öùng enzym, do ñoù caàn loaïi boû caùc chaát naøy ra khoûi maãu tröôùc khi phaân tích, hoaëc söû duïng boä bieán naêng ñaëc bieät nhaïy caûm vôùi chaát caàn phaân tích.

Baûng 4.1: Moät soá ñieän cöïc enzym ño ñieän theá

Chaát phaân tích

Enzym (E) Kyõ thuaät coá ñònhBoä bieán

naêngThôøi gianñaùp öùng

Vuøng tuyeán tính

(M)

Ure Urease

E + polyacrylamide pNH425 – 60 giaây

5.10-5 – 10-2

E + BSA + GA pNH430 giaây –1

phuùt10-4 – 10-2

E + polyacrylamide pNH4

(nonactine)30 – 40 giaây

10-5 – 2.10-2

E + ñoàng polymer methacrylamide –

acrylamide

pH(thuûy tinh)

5 – 10 giaây 5.10-5 – 5.10-4

E + BSA + GA PH ( 1 – 1.5 phuùt 2.10-4 – 2.10-3

(E) hoøa tan/maøng thaåm thaáu

pCO2 1 – 5 phuùt 10-4 – 10-1

E + BSA + GA pCO2 2 – 3 phuùt 3.10-4 – 10-2

E + BSA + GA pCO2 1 – 2 phuùt 3.10-4 – 10-2

E + GA pNH3 1.5 – 2 phuùt 10-4 – 10-2

(E) hoøa tan/ maøng cellophane

pNH3 5 – 8 phuùt 5.10-4 – 7.10-2

E + BSA + GA pNH3 2 – 3 phuùt 3.10-4 – 10-2

E / nylon pNH326 – 38 giaây

0.2 – 10 mg/dl

Glucose Glucose oxidase

E + BSA + GA Pt – Ir - 1 – 150 mg/dl

Acid amin L – amino acid oxidase

E + polyacrylamide pNH4 3 – 5 phuùt 2.10-4 – 2.10-3

D – amino acid oxidase

E + polyacrylamide pNH4 1 – 2 phuùt 10-4 - 5.10-3

L – amino acid oxidase

E + BSA + GA pNH430 giaây-1

phuùt10-4 – 10-2

Glutamin Glutaminase E / nylon / cellophan pNH4 1 – 2 phuùt 10-4 – 10-1

E / maøng thaåm thaáu pNH3 4 – 5 phuùt 10-4–2.10-3

Tyrosin Tyrosine decarboxylase

E / giaáy thaåm thaáu pCO2 1 – 5 phuùt 3.10-4–5.10-3

Lysin Lysine decarboxylase

E + BSA + GA pCO2 5 – 7 phuùt 10-4–3.10-3

Phenylalanin

Phenylalanin ammonia lyase

E / vi loã pNH3 12 phuùt 10-4–6.10-4

Methionin Methionin lyase E + BSA + GA pNH3 3 phuùt 10-5 – 10-2

Histidin Histidin ammonia lyase

E + BSA + GA pNH3 3 – 8 phuùt 10-5 – 10-2

AspartamCarboxypeptid

ase A, L-aspartase

E + BSA + GA pNH3 4 – 8 phuùt4,25.10-4– 8,1.10-3

Amygladin

- glucosidase E + polyacrylamide pCN 10 – 30 phuùt

4.10-5–10-3

Penicillin Penicillinase E + polyacrylamide pH 2 – 3 phuùt 4.10-5–10-3

Adenosin Adenosine deaminase

E + BSA/maøng thaåm thaáu

pNH3 7 - 12 phuùt 7.10-7-10-2

E + BSA + GA/collagen pNH3 5 – 14 phuùt 3,5.10-5 – 1,6.10-2

Acetylcholin

Acetylcholin esterase

E + GA pH 1 phuùt 10-4 – 3.10-3

E + polyacrylamide pH 1 – 3 phuùt 2.10-5 – 10-3

Nicotine E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 10-3 – 10-1

Neostigmin

E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 5.10-7 – 5.10-5

Physotigmin

E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 3.10-8 – 3.10-6

FluorideUrease E + BSA + GA pCO2 2 – 5 phuùt 3.10-4 – 10-2

Acetylcholinesterase

E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt 10-4 – 2.10-2

Ag+

UreaseE + BSA + GA pCO2 1 – 2 phuùt 10-8 – 3.10-7

Hg2+ E + GA pCO2 1 – 2 phuùt 2.10-8 – 2.10-6

Thuoác tröø saâu

(TTS)Cholinesterase E + BSA + GA pH 2 – 3 phuùt

10-8 – 10-5 (tuøy loaïi TTS)

H2O2 Peroxidase E + BSA + GA/collagen pF - 8.10-5 – 10-2

Arginase urease E + polyacrylamide pNH4 < 10 phuùt 1.6 – 16 UI

Baûng 4.2: Moät soá ñieän cöïc enzym ño doøng ñieän:

Chaát phaân tích

Enzym (E) Kyõ thuaät coá ñònhBoä

bieán naêng

Thôøi gianñaùp öùng

Vuøng tuyeán tính

(M)Glucose Glucose

oxidaseE + polyacrylamide pO2

30 giaây – 3 phuùt

0 – 0.5 g/l

E + BSA + GA pO2 1 – 3 phuùt 0 – 2.10-2

E/nylon pO2 26 – 38 giaây 1 – 20mg/dlE +

polyacrylamide/miliporepO2 1 – 2 phuùt 0 – 200 mg/l

E + gelatin + GA pO2 2 – 3 phuùt 0 – 2 g/lE + polyacrylamide Pt 1 phuùt 0 –1.5.10-2

E/collagen Pt 2 – 3 phuùt 10-7 – 2.10-3

E + BSA + GA Pt 10 giaây 10-7 – 2.10-3

E + silan + GA SnO2 10 phuùt 10-4 – 10-2

E + p-benzoqiunon + BSA/cellulose

Pt 0.5 - 3 phuùt 10-6 – 3.10-3

E + silan + GA/silicon Pt 2 – 3 phuùt 0 – 6 g/lE + acrylamide/maøng thaåm thaáu/ maøng

siliconPt 1 – 10 phuùt 0 – 2,5.10-2

E + BSA + GA Pt 1 – 2 phuùt 0 – 2.7.10-2

E /maøng baùn thaám Pt 6 phuùt 10-5 – 7.10-3

E/cellophan Pt 3 – 4 phuùt 5.10-4 – 6.10-3

E + ferrocene graphite Graphite 1 – 1.5 phuùt 10-2 – 3.10-2

E + NMP+ TCNQ- Pt - 0 – 2.6.10-3

Glucose dehydrogenase

E + BSA + GA pO2 3 – 15 phuùt 8.10-4 – 10-3

ethanol

Alcohol dehydrogenase

E/maøng thaåm thaáu Pt 5 – 10 phuùt -

E /collagen Pt 30 phuùt -

Alcohol oxidasecatalase

E + GA pO2 1-2 phuùt 0 – 25 mg/l

Tinh boäta-amylase

glucose oxidase

E + BSA + GA Pt 2 – 3 phuùt -

Cholin Cholin oxidase E/nylon pO2 1 - 2 phuùt 2.10-5–2.10-4

C HÖÔNG 5

ÖÙNG DUÏNG CUÛA BIOSENSOR

5.1. ÖÙNG DUÏNG TRONG COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM:

Trong ngaønh thöïc phaåm, vieäc kieåm tra chaát löôïng thöïc phaåm döïa treân caùc phöông phaùp truyeàn thoáng thöôøng maát nhieàu thôøi gian töø vaøi giôø ñeán vaøi ngaøy. Nhöng vôùi kyõ thuaät duøng biosensor ñaõ mang laïi cho ngaønh coâng nghieäp thöïc phaåm moät thieát bò theo doõi vaø ño löôøng nhanh, ñoä nhaïy cao, söû duïng thuaän lôïi hôn so vôùi nhöõng phöông phaùp truyeàn thoáng.

Baûng 5.1: Moät soá öùng duïng cuûa biosensor trong coâng nghieäp thöïc phaåm:

Hôïp chaát caàn ño

Öùng duïng phaùt hieän (ñònh tính vaø ñònh löôïng)

Caùc acid amin

Alanin, arginin, asparagin, acid aspartic, cystein, glutamin, acid glutamic, glutathiol, histidin, leucin, lysin, methionin, N-acetyl methionin, phenylalanin,

sarcosin, serin, tyrosin, tryptophan, valinCaùc hôïp

chaát amin, amid, dò

voøng

Aminopyrin, anilin, amin thôm, acetyl cholin, cholin, phosphatidyl-cholin, creatin, guanidin, guanosin,

penicilline, spermin, creatin, acid uric, ure, xanthyl, hypoxanthin.

Hydratcarbon Amygdalin, galactose, glucose, glucose-6-phosphat, lactose, maltose, sacharose, tinh boät.

Acid höõu côAcid acetic, acid formic, acid gluconic, acid isocitric, acid ascorbic, acid lactic, acid malic, acid oxalic, acid

pyruvic, acid succinic, acid nitrylacetic.Caùc röôïu vaø caùc phenol

Acetaldehyde, bilirubin, catechol, cholesterol, cholesterol ester, ethanol, glycerol, glycerol ester,

methanol, phenol.Caùc hôïp

chaát khaùcChaát khaùng sinh, ñoä töôi cuûa caù thòt, vitamin

a) Ño noàng ñoä glutamin vaø noàng ñoä glutamat

Glutamat trong thöïc phaåm khoâng chæ aûnh höôûng ñeán muøi vò cuûa thöïc phaåm maø coøn lieân quan ñeán khía caïnh an toaøn veä sinh thöïc phaåm. Caùc loaïi ñoà hoäp thòt caù , ñoà hoäp nöôùc xuùp, daàu giaám, nöôùc soát ñöôïc boå sung moät löôïng mono natri glutamat coù taùc duïng taêng muøi vò, nhöng moät löôïng lôùn glutamat coù theå gaây ra nhöõng daáu hieäu beänh lyù nghieâm troïng aûnh höôûng söùc khoûe con ngöôøi nhö: tim ñaäp nhanh, ñau daï daøy.

Ñeå ñònh löôïng glutamat, söû duïng ñieän cöïc ño doøng ñieän coù gaén maøng enzym coá ñònh glutamat oxydase. Glutamat oxydase cuõng coù theå ñöôïc ñoàng coá ñònh vôùi glutaminase ñeå ño noàng ñoä glutamin döïa treân phaûn öùng:

Vieäc ño noàng ñoä glutamin coù yù nghóa raát quan troïng bôûi ñoù laø chæ tieâu ñaùnh giaù nguoàn nitô cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät coâng nghieäp.

Glutamat oxydase coù hoaït tính toái öu taïi pH = 7.8, coøn glutaminase töø E.coli laïi hoaït ñoäng taïi vuøng acid. Neáu thay theá baèng glutaminase trung tính töø Bacillus thì caû hai enzym naøy ñeàu coù hoaït tính toái öu taïi pH = 7 vaø coù tính chòu nhieät toát. Maøng enzym taïo thaønh raát oån ñònh vaø coù hoaït tính toát ñöôïc söû duïng trong thöông maïi.

Maøng enzym cho keát quaû ño ñaït tuyeán tính ñeán 8mM glutamin, khoâng ñaùp öùng vôùi caùc chaát khaùc (tröø glutamat), vaø giöõ ñöôïc traïng thaùi khoâ trong thôøi gian ít nhaát 6 thaùng ôû 4oC, thôøi gian ñaùp öùng 30 giaây nhanh hôn raát nhieàu so phöông phaùp saéc lyù loûng cao aùp HPLC.

b) Ño noàng ñoä cholin:

Trong cô theå, cholin laø thaønh phaàn cuûa phospholipid caáu taïo neân maøng teá baøo vaø maøng cuûa nhieàu baøo quan trong teá baøo, maët khaùc cholin coøn laø tieàn chaát ñeå toång hôïp neân acetylcholin (chaát coù vai troø chuyeån söï kích thích thaàn kinh), ñoàng thôøi cuõng laø nguoàn caùc nhoùm methyl trong cô theå.

Cholin thöôøng ñöôïc boå sung vaøo thöùc aên cho treû em vaø caùc saûn phaåm dinh döôõng cho ngöôøi lôùn.

Vieäc xaùc ñònh noàng ñoä cholin coù theå thöïc hieän baèng phöông phaùp theo doõi söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät treân moâi tröôøng cô chaát, baèng phöông phaùp quang phoå hay saéc kyù. Tuy nhieân, caùc phöông phaùp naøy thöôøng ít chính xaùc, thôøi gian daøi vaø giaù thaønh cao. Vôùi söï söû duïng ñieän cöïc enzym coù gaén cholin oxydase ñöôïc cheá taïo döïa treân cô sôû phaûn öùng oxy hoùa seõ cho thôøi gian nhanh, chính xaùc hôn raát nhieàu.

Phaûn öùng oxy hoùa xaûy ra trong ñieän cöïc:

Giaù trò cuûa pheùp ño ñaït tuyeán tính trong khoaûng töø 5mg/l ñeán ít nhaát laø 160 mg/l khi söû duïng dung dòch cholin hydroxyde noàng 111mg/l laøm chuaån. Thôøi gian thu ñöôïc keát quaû chæ sau 30 giaây vaø giaù reû.

c) Ño haøm löôïng coàn:

Haøm löôïng coàn ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch söû duïng alcohol oxydase:

Tuy nhieân moät haïn cheá cuûa ñieän cöïc naøy laø tính khoâng beàn cuûa alcohol oxydase ôû daïng khoâ, do ñoù caàn coù bieän phaùp baûo quaûn thích hôïp ñeå oån ñònh hoaït tính enzym.

d) Phaùt hieän söï coù maët cuûa vi khuaån coù maët trong thöïc phaåm:

Duøng ñieän cöïc sinh hoïc phaùt quang ñeå phaùt hieän söï coù maët cuûa vi khuaån trong thöïc phaåm khi vi khuaån naøy taùc duïng

ñaëc hieäu vôùi ATP vaø D-luciferin ñeå giaûi phoùng ra aùnh saùng phaùt quang nhôø taùc duïng xuùc taùc cuûa enzym luciferase:

e) Ñieän cöïc mieãn dòch ño haøm löôïng albumin, insulin:

Ñieän cöïc mieãn dòch keát hôïp vôùi ñieän cöïc ño doøng ñieän ñeå xaùc ñònh insulin, albumin:

Cho khaùng theå khaùng insulin ñaõ bieát (laáy töø lôïn) leân treân moät lôùp maøng ñaõ gaén trong ñieän cöïc Oxy ñeå caùc khaùng theå coù theå baùm treân lôùp maøng ñoù, sau ñoù cho insulin caàn kieåm tra leân maøng vaø cho tieáp khaùng nguyeân (insulin) ñaõ gaén catalase vaø boå sung cô chaát laø H2O2, phaûn öùng nhö sau:

Haøm löôïng O2 taïo thaønh ñöôïc ñònh löôïng nhôø ñieän cöïc O2

töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng insulin.

Ñieän cöïc mieãn dòch keát hôïp vôùi ñieän cöïc ño quang:

Hình 7.1 moâ taû ñieän cöïc mieãn dòch söû duïng boä chuyeån ñoåi quang hoïc, trong ñoù bieán ñoåi sinh hoïc taïo ra ñaùp öùng quang thoâng qua moät maøng ñieän cöïc (sensor chip).

Khi maãu chöùa khaùng nguyeân ñi qua seõ phaûn öùng ñaëc hieäu vôùi khaùng theå treân beà maët sensor chip vaø do ñoù laøm thay ñoåi böôùc soùng vaø goùc phaûn xaï cuûa aùnh saùng chieáu vaøo maët beân kia cuûa sensor chip. Ño caùc thoâng soá quang hoïc seõ cho ta noàng ñoä khaùng nguyeân coù trong maãu.

f) Kieåm tra haøm löôïng cloramphenicol trong saûn phaåm thuûy saûn:

Duøng ñieän cöïc mieãn dòch döïa treân nguyeân taéc ELISA ñeå kieåm tra haøm löôïng cloramphenicol trong thuûy saûn.

Caùc gieáng ñöôïc phuû lôùp khaùng theå khaùng cloramphenicol (cloramphenicol chuaån hoaëc dung dòch chuaån). Cloramphenicol gaén enzym vaø khaùng theå khaùng cloramphenicol ñöôïc boå sung vaøo gieáng. Cloramphenicol töï do vaø cloramphenicol gaén keát enzym seõ caïnh tranh caùc vò trí keát gaén cuûa khaùng theå khaùng cloramphenicol (phaûn öùng mieãn dòch enzym caïnh tranh). Ñoàng thôøi caùc khaùng theå ñöôïc boå sung vaøo ñöôïc coá ñònh laïi bôûi caùc khaùng theå treân thaønh gieáng. Cloramphenicol keát gaén enzym bò dö thì seõ ñöôïc loaïi boû baèng caùch röûa. Boå sung vaøo gieáng cô chaát cuûa enzym (ure peroxyde) vaø chaát taïo maøu (tetramethyl benzidin) vaø uû. Enzym gaén keát seõ chuyeån hoùa chaát taïo saéc voán khoâng maøu thaønh saûn phaåm coù maøu xanh. Khi boå sung chaát keát thuùc phaûn öùng seõ chuyeån töø maøu xanh sang maøu vaøng. Ño cöôøng ñoä maøu treân maùy ño maøu quang ñieän ôû böôùc soùng 450 nm, thì nhaän thaáy cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi haøm löôïng cloramphenicol coù trong maãu.

Giai ñoaïn uû ñöôïc thöïc hieän trong maùy uû oån ñònh nhieät ñoä. Keát quaû phaûn öùng ñöôïc ñoïc baèng maùy ñoïc theo nguyeân taéc so maøu vaø so saùnh vôùi ñoà thò chuaån ñeå xaùc ñònh noàng ñoä khaùng sinh. Phöông phaùp naøy coù theå phaùt hieän cloramphenicol ôû noàng ñoä 0.05ppb.

Loaïi thieát bò naøy coøn ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra moät soá chaát khaùc baèng caùc loaïi chaát chuaån khaùc nhau (caùc kit chuaån) vôùi giôùi haïn phaùt hieän raát thaáp.

Baûng 5.2: Moät soá caùc kit chuaån söû duïng vaø giôùi haïn phaùt hieän:

Loaïi kit Giôùi haïn phaùt hieän cloramphenicol- maãu söõa- maãu thòt, tröùng- maãu toâm

0.15 ppb0.10 ppb0.05 ppb

clenbuterol- maãu nöôùc tieåu- maãu thòt

0.10 ppb0.04 ppb

diethylstilbestrol 0.02 ppb Histamin- caù tuyeát- boät caù

20 ppb125 ppb

g) Xaùc ñònh haøm löôïng mycotoxin trong nguõ coác vaø thöïc phaåm

Mycoloxin laø ñoäc toá sinh ra trong quaù trình phaùt trieån cuûa naám moác coù maët trong caùc saûn phaåm nhö: laïc, nguõ coác, hoa quaû.chuùng cuõng coù theå xuaát hieän trong thöùc aên gia suùc. Gia suùc khi aên caùc thöùc aên naøy, ñoäc toá mycotoxin coù theå ñi qua quaù trình trao ñoåi chaát roài coù maët trong caùc saûn phaåm nhö tröùng, söõa, thòt.

Coù nhieàu phöông phaùp xaùc ñònh mycotoxin trong ñoù phöông phaùp xaùc ñònh baèng ñieän cöïc mieãn dòch ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi. Phöông phaùp naøy döïa treân nguyeân taéc lieân keát ñaëc hieäu khaùng nguyeân – khaùng theå. Moät noàng ñoä coá ñònh cuûa khaùng theå ñöôïc troän vôùi maãu caàn phaân tích coù chöùa haøm löôïng mycotoxin chöa bieát, khaùng theå vaø mycotoxin seõ taïo thaønh phöùc. Ñieän cöïc seõ xaùc ñònh noàng ñoä khaùng theå töï do (khoâng taïo phöùc vôùi mycotoxin). Döïa vaøo ñoà thò mycotoxin chuaån coù theå ñònh löôïng ñöôïc mycotoxin coù trong maãu caàn phaân tích.

5.2. ÖÙNG DUÏNG TRONG MOÂI TRÖÔØNG

Caùc ñieän cöïc enzym söû duïng trong phaân tích moâi tröôøng coù theå chia thaønh ba nhoùm döïa vaøo ñaëc ñieåm cuûa moät phaûn öùng enzym:

Nhoùm thöù nhaát : caùc chaát ñöôïc ñònh löôïng laø cô chaát cuûa phaûn öùng enzym.

Nhoùm thöù hai: caùc chaát ñöôïc ñònh löôïng laø caùc chaát kìm haõm hoaït tính xuùc taùc cuûa enzym. Ví duï, caùc hôïp chaát cô phospho vaø cacbonat.

Nhoùm thöù ba: noàng ñoä caùc ion kim loaïi döôïc phaùt hieän nhôø vaøo vieäc chuùng lieân keát vôùi phaàn “apoenzym” do ñoù phuïc hoài hoaït tính cuûa enzym.

a) Ñònh löôïng ion kim loaïi naëng

Caùc enzym thuoäc nhoùm metalloenzym caàn coù caùc ion kim loaïi tham gia vaøo trung taâm hoaït ñoäng ñeå duy trì ñöôïc hoaït tính

xuùc taùc cuûa enzym, do ñ1o khi caùc ion kim loaïi naøy bò taùch ra khoûi enzym ( ví duï, do taùc duïng cuûa taùc nhaân taïo phöùc) thì seõ laøm maát hoaït tính xuùc taùc cuûa enzym.hoaït tính xuùc taùc cuûa enzymcoù theå phuïc hoài khi cho enzym tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng chöùa ion kim loaïi thì ion kim loaïi seõ thu huùt laïi vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Do ñoù coù theå ñònh löôïng ñöôïc noàng ñoä kim loaïi naëng trong maãu thoâng qua vieäc xaùc ñònh hoaït ñoäng xuùc taùc cuûa enzym taïo thaønh sau khi cho phaàn “apoenzym” ñaõ ñöôïc coá ñònh tieáp xuùc vôi maãu.

Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø coù theå phaùt hieän caùc kim loaïi ôû noàng ñoä raát nhoû ( mol) vaø coù theå ph1t hieän ñöôïc baát kyø moät kim loaïi naøo coù maët trong nhoùm metalloenzym.

Baûng 5.3: giôùi thieäu moät soá ñieän cöïc xaùc ñònh ion kim loaïi

Kim loaïi

Enzym Ñieän cöïc Noàng ñoä (mmol/l)

Hg (II) Urease Ñieän cöïc NH4+ 0 – 150 nm/l

Zn (II)phosphatase kieàm

apoenzym: phosphatase

PH – ISFETÑieän cöïc nhieät

ñieän trôû

0.01 – 1 (sai soá 2.3%)

0.01 – 1

Cu (II) Apoenzym: galactooxydase

Ñieän cöïc Pt/Ag/AgCl

0.1 – 1 (sai soá 7%)

Cu (II) Apoenzym: tyrosinase

Ñieän cöïc O2 < 0.5

b) Ñònh löôïng phenol:

Vieäc phaân tích noàng ñoä caùc hôïp chaát phenol döïa treân phaûn öùng:

Baûng 5.4: Ñieän cöïc duøng tyrosinase:

Ñieän cöïc

Noàng ñoä phaùt hieän Sai soá Thôøi gian

Ñieän cöïc graphit vôùi TCNQ

0.23 – 0.65 12 – 35 s

Ñieän cöïc O2 (Clark)

1 – 46 (trong hexan)5 – 190 (trong dung dòch ñeäm)

4.4% (trong hexan)7.2% (trong dung dòch ñeäm)

< 2 phuùt

Ñieän cöïc O2 (Clark)

0.1 – 5 (trong dung dòch ñeäm vaø cloroform

3 phuùt

c) Ñònh löôïng phosphat, nitrit, nitrat, sulfat

Caùc hôïp chaát naøy ngaøy caøng coù maët nhieàu trong moâi tröôøng, ñaëc bieät laø trong nöôùc uoáng. Söï gia taêng nguoàn nitô, phospho trong nöôùc coù theå gaây ra hieän töôïng phì döôõng, gaây maát caân baèng sinh thaùi (theo tieâu chuaån EC, noàng ñoä cho pheùp cuûa phospho laø: 5mg/l P2 O5 ). Noàng ñoä cuûa phospho thoâng thöôøng ñöôïc xaùc ñònhbaèng phöông phaùp ño maøu. Tuy nhieân, noàng ñoä cuûa phospho trong nöôùc coù theå ñöôïc ñònh löôïng baèng caùc ñieän cöïc enzym.

Theo Kubo(1991), noàng ñoä phosphat coù theå xaùc ñònh baèng caùch söû duïng ñieän cöïc pyruvatoxydase töø pediococcus xuùc taùc vôùi oxy hoaù pyruvat trong ñieàu kieän coù maët phosphat vaø O2 ñeå taïo thaønh acetylphosphat, hydro peroxyt vaø CO2. Löôïng O2 tieâu thuï ñöôïc duøng ñeå dònh löôïng phosphat:

Caùc hôïp chaát chöùa nitrat, nitrit coù theå ñònh löôïng theo phaûn öùng oxy hoùa khöû xuùc taùc bôûi nitratreductase vaø nitritreductase:

Baûng 5.5: Ñònh löôïng nitrit, nitrat, sulfat

Chaát EnzymÑieän cöïc chæ thò

Giôùi haïn phaùt hieän

(mmol/l)Nitrit Nitrit reductase Ñieän cöïc NH3 50

NitrateNitrat reductase

vaø nitrit reductase

Ñieän cöïc NH4+ 50

Sufate Arylsulfatase Ñieän cöïc Pt 100

Baûng 5.6: Ñieän cöïc enzym ñònh löôïng phosphate:

Enzym

Noàng ñoä

(mol/l)

Sai soá (%)

Ñieän cöïc chæ thò

Thôøi gian ñaùp öùng

(phuùt)

Tính oån ñònh

Phosphatase vaø glucooxydase ≥ 0.01 5.9 H2O2 5 – 10

> 100 thí nghieäm (TN)/ 3 thaùng

Nucleosiphosphorilase vaø

xanthinoxydase

0.3 – 1 mM

10 O2 3> 70 TN/ 1

thaùng


xanthinoxydase10 – 250 5.9 H2O2 2 30 TN

Pyruvat oxydase 12 – 80 5.9 O2 7

7 ngaøy (khaû naêng

ñaùp öùng giaûm 50%)


xanthinoxydase0.5 – 100 5 O2 1.5

> 8 ngaøy/ 300 ngaøy

d) Ñònh löôïng caùc chaát ñoäc

Caùc loaïi thuoác tröø saâu phospho coù ñoäc tính raát cao, ngoaøi taùc duïng ñoäc sô caáp, chuùng coøn laøm bieán ñoåi caùc quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo baèng caùch taùc duïng leân caùc enzym thieát yeáu cuûa teá baøo nhö esterase, oxydase, phosphorylase, dehydrogenase. Theo tieâu chuaån EC, noàng ñoä toái ña cho pheùp cuûa dö löôïng caùc chaát naøy trong nöôùc uoáng laø 0.1 g/l ñoái vôùi moãi loaïi rieâng bieät vaø 0.5 g/l ñoái vôùi hoãn hôïp. Vieäc xaùc ñònh caùc chaát ñoäc naøy ñöôïc thöïc hieän baèng saéc kyù loûng cao aùp (HPLC) hoaëc saéc kyù khoái phoå (GC/MS) nhöng thieát bò ñaét tieàn, phöông phaùp phöùc taïp vaø trình ñoä kyõ thuaät cao.

Söû duïng ñieän cöïc coù gaén enzym cholinesterase döïa vaøo ñaëc ñieåm caùc chaát ñoäc naøy seõ kìm haõm enzym naøy ñem laïi nhieàu thuaän lôïi trong phaân tích.

Quaù trình phaûn öùng thuûy phaân cholin nhôø cholinesterase nhö sau:

Phaûn öùng oxy hoùa taïo thaønh H+, treân cô sôû ñoù coù theå duøng ñieän cöïc pH hay duøng phaûn öùng oxy hoùa tiocholin taïi ñieän cöïc Pt ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä enzym.

e) Kyõ thuaät ELISA trong xaùc ñònh dö löôïng thuoác tröø saâu

Kyõ thuaät ELISA ñeå xaùc ñònh dö löôïng tröø saâu goàm hai phöông phaùp cd – ELISA (competitive direct ELISA – ELISA caïnh tranh tröïc tieáp) vaø phöông phaùp ci – ELISA (competive indirect ELISA – ELISA caïnh tranh giaùn tieáp).

Trong cd – ELISA, khaùng theå ñöôïc coá ñònh treân beà maët caùc gieáng giaù theå raén, cho maãu thuoác tröø saâu coù haøm löôïng nhaát ñònh ñaõ ñöôïc gaén enzym vaø thuoác tröø saâu caàn phaân tích vaøo caùc gieáng naøy, chuùng seõ caïnh tranh ñeå baùm vaøo khaùng theå. Sau moät thôøi gian phaûn öùng caùc chaát coøn dö seõ bò röûa troâi. Cuoái cuøng, cô chaát naøy seõ bò enzym xuùc taùc vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu saéc. Cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi löôïng thuoác tröø saâu caàn xaùc ñònh trong maãu. Neáu thuoác tröø saâu nhieàu thì löôïng coäng hôïp enzym do tính caïnh tranh keùm hôn seõ bò giöõ laïi ít, maøu yeáu vaø ngöôïc laïi.

Trong kyõ thuaät ci – ELISA, caùc gieáng ñöôïc phuû moät lôùp thuoác tröø saâu lieân keát vôùi protein, coøn thuoác tröø saâu caàn xaùc ñònh ñöôïc theâm vaøo vôùi moät löôïng khaùng theå coá ñònh. Ñeå moät thôøi gian, thuoác tröø saâu caàn phaân tích (khaùng nguyeân) vaø thuoác tröø saâu lieân keát seõ caïnh tranh baùm vaøo caùc khaùng theå, löôïng thuoác tröø saâu caøng nhieàu thì löôïng khaùng theå ban ñaàu bò giöõ laïi baèng caùch cho cô chaát vaøo, chuyeån hoùa taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu. Cöôøng ñoä maøu tyû leä nghòch vôùi löôïng chaát caàn xaùc ñònh trong maãu ban ñaàu.

Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø giaù thaønh reû, deã töï ñoäng hoùa, nhöng nhöôïc ñieåm laø trong moät thôøi gian chæ phaùt hieän ñöôïc moät loaïi thuoác tröø saâu.

f) Ñieän cöïc ñeám vi sinh vaät:

Vi sinh vaät ñöôïc ñeám baèng thí nghieäm vi sinh vaät, nhöng thöôøng toán nhieàu thôøi gian, ñaëc bieät khi xaùc ñònh vi sinh vaät gaây beänh nhö Samonella vaø Listeria sp. Khi xaùc ñònh Samonella, tröôùc tieân caàn 24 giôø ñeå laøm moâi tröôøng, laøm cho vi sinh vaät caàn xaùc ñònh töø traïng thaùi tónh trong thöïc phaåm sang traïng thaùi hoaït ñoäng. Sau ñoù canh tröôøng ñöôïc uû ñeå Samonella phaùt trieån. Sau 24 giôø phaùt trieån, caáy moâi tröôøng coù chöùa vi sinh vaät sang ñóa thaïch, moät hoaëc hai ngaøy sau xaùc ñònh löôïng Samonella. Keát quaû tìm ñöôïc caùc loaïi khaùng theå nhö somatic (O) hay flagella (H). Phöông phaùp naøy chính xaùc nhöng thôøi gian laâu gaàn 5 ngaøy, keát quaû ñöa ra chæ mang tính ñònh tính.

Caùc duïng cuï phaân tích nhanh hôn thuoäc kyõ thuaät ELISA ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh Samonella, Staphylococcus vaø caùc

noäi ñoäc toá: maãu thöïc phaåm ñöôïc xöû lyù baèng enzym ñeå ñaït tôùi moät kích thöôùc nhaát ñònh, sau ñoù ñöôïc loïc treân maøng loïc keû oâ kî nöôùc HGMF (hydrophobic grid membrane filter) ñeå chuaån bò cho böôùc xaùc ñònh tieáp theo.

Hình 7.2: Biosensor phaùt hieän E.coli

5.3. ÖÙNG DUÏNG TRONG Y HOÏC:

Ñieän cöïc enzym coù raát nhieàu öùng duïng trong vieäc phaùt hieän vaø chaån ñoaùn beänh taät. Ngaøy nay noù coøn laø coâng cuï höõu hieäu ñeå chaêm soùc söùc khoûe taïi nhaø vôùi raát nhieàu tính naêng toát.

a) Ño noàng ñoä glucose:

Glucose laø nguyeân nhaân chính gaây ra beänh tieåu ñöôøng. Beänh naøy seõ laøm ngöôøi beänh maát khaû naêng kieåm soaùt noàng ñoä glucose trong maùu daãn ñeán söï taêng quaù ñöôøng huyeát, coù theå gaây töû vong neáu quaù ít glucose ñeán naõo. Vieäc ñieàu trò beänh tieåu ñöôøng ñoøi hoûi ngöôøi beänh phaûi ñöôïc theo doõi thöôøng xuyeân haøm löôïng glucose trong maùu, do ñoù yeâu caàu ñaët ra laø phaûi phaùt trieån moät thieát bò cho pheùp ngöôøi beänh coù theå töï theo doõi ñöôïc ôû nhaø. Biosensor vôùi khaû naêng chính xaùc, coù khaû naêng taùi söû duïng vaø ñaùp öùng ñöôïc caùc yeâu caàu treân.

Biosensor ño noàng ñoä glucose hieän nay coù maët treân thò tröôøng hoaït ñoäng theo nguyeân taéc nhö ñieän cöïc ño doøng ñieän, ñieän cöïc ño quang nhöng ñeàu döïa treân phaûn öùng xuùc taùc oxy hoùa vôùi söï coù maët cuûa GOD (glucooxydase). Trong ñoù ñaùng chuù yù laø loaïi thieát bò caàm tay vôùi loaïi chip cheá taïo treân cô sôû cuûa ñieän cöïc choïn loïc ion vaø ñieän cöïc ño doøng ñieän, kích thöôùc nhoû, deã mang theo, tieän söû duïng.

b) Ño noàng ñoä ure

Vieäc kieåm tra noàng ñoä ure trong maùu, ñaëc bieät ñoái vôùi nhöõng ngöôøi maéc beänh thaän coù yù nghóa quan troïng.

Thieát bò naøy hoaït ñoäng treân nguyeân taéc ñieän cöïc ño ñieän theá, ure bò thuûy phaân döôùi taùc duïng cuûa xuùc taùc urease:

Noàng ñoä NH4+ tyû leä vôùi noàng ñoä ure ñöôïc ño baèng caùch

duøng moät lôùp maøng thaám choïn loïc ion NH4+.

CHÖÔNG 6

KEÁT LUAÄNBiosensor ñaõ phaùt trieån vöôït baäc nhanh choùng trong suoát

nhieàu naêm qua. Nhôø vaøo caùc phöông phaùp keát hôïp môùi cuûa caùc boä thuï caûm vôùi nhieàu boä bieán naêng . Ñaëc ñieåm, tính chaát cuûa caùc biosensor naøy ñaõ ñöôïc caûi thieän vaø tính xaùc thöïc caøng ngaøy caøng cao ñaõ taïo ra nhieàu öùng duïng môùi.

ÖÙng duïng chính cuûa Biosensor laø trong lónh vöïc y khoa (chaêm soùc söùc khoûe beänh nhaân). Biosensor ñaëc bieät thích hôïp cho phaân tích caùc maãu trong moâi tröôøng sinh hoïc phöùc taïp maø khoâng caàn taùc nhaân phaûn öùng hoùa hoïc. Biosensor coù theå

Hình 7.3 : Moät soá Biosensor thöông maïi

ñöôïc duøng in-vivo bôûi vì noù taïo ra moät tín hieäu lieân tuïc, coù theå ñieàu khieån noàng ñoä caùc chaát taïo thaønh trong quaù trình trao ñoåi chaát trong moät thôøi gian nhaát ñònh neân ñöôïc öùng duïng quan troïng trong kieåm soaùt noàng ñoä ñöôøng trong maùu ngöôøi beänh.

Caùc öùng duïng cuûa Biosensor trong coâng ngheä thöïc phaåm cuõng raát phaùt trieån. Ñoät phaù quan troïng laø khaû naêng khöû truøng trong caùc quaù trình leân men. Biosensor cuõng ñoùng vai troø quan troïng trong kieåm soaùt tröïc tieáp chaát löôïng thöïc phaåm.

Moâi tröôøng cuõng caàn coù söï kieåm soaùt chaát löôïng lieân tuïc maø caùc kyõ thuaät hoùa lyù hieän taïi thì giôùi haïn ñaëc bieät khi kieåm tra ñoä ñoäc haïi cuûa moâi tröôøng. Biosensor ra ñôøi ñaõ ñaùp öùng ñöôïc nhöõng nhu caàu ñoù.

Nghieân cöùu hieän taïi taäp trung vaøo vieäc caûi thieän tính nhaïy caûm cuõng nhö tính choïn loïc cuûa biosensor. Nhieàu coâng ty Nhaät Baûn ñaõ phaùt trieån vaø saûn xuaát nhieàu loaïi biosensor. Naêm 2000, thò tröôøng veà Biosensor ñaõ ñöôïc thaønh laäp vaø toå chöùc 2 naêm moät laàn. Taïi ñaây taäp trung caùc nghieân cöùu phaùt trieån biosensor trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau cuûa caùc chuyeân gia ñaàu ngaønh vaø coù giaûi thöôûng trao taëng. Ñieàu naøy ñaõ khaúng ñònh söï phaùt trieån nhanh choùng cuûa Biosensor.

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

[1]. TRAN MINH CANH, Biosensor, Chapman & Hall[2]. PGS.TS ÑAËNG THÒ THU, PGS. LEÂ NGOÏC TUÙ, TS. TOÂ KIM ANH,

PGS.TS PHAÏM THU THUÛY, T.S. NGUYEÃN XUAÂN NAM, Coâng ngheä Enzym, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc Kyõ thuaät Haø Noäi

[3]. TRAN MINH CANH, BROUN G., Construction and study of electrodes using cross – linked enzymes

[4]. UPDIKE S.J., HICKS G.P., The enzyme electrode, Nature

[5]. YODAK., Methods in Enzymology, Vol 137[6]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/biosensors.html[7]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/calorimetric.html[8]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/potentiometric.html[9]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/amperometric.html[10].http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/optical.html[11]. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/piezo.html[12].http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/immuno.html[13]. http://www.biodot.com/products/products_biosensor.htm[14].http://www.biosensors-congress.elsevier.com/

http://www.biosensors-congress.elsevier.com/

http://www.biodot.com/products/products_biosensor.htm

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/immuno.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/piezo.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/optical.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/amperometric.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/potentiometric.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/calorimetric.html

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/biosensors.html

Documents

01520 Tong Quan Tai Lieu Ve Biosensor.doc.Doc