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I n a r e c e n t r e p o r t ( B o k v i s t e t a l . 1 9 9 9 ) , w e d e m o n s t r a t e d

t h e p r e s e n c e o f s u l p h o n y l u r e a r e c e p t o r s a n d A T P - s e n s i t i v e

K ( K A T P ) c h a n n e l s i n r a t p a n c r e a t i c A _ c e l l s . I n h i b i t i o n o f

K A T P c h a n n e l a c t i v i t y m a y a c c o u n t f o r t h e p r e v i o u s l y

r e p o r t e d s t i m u l a t o r y e f f e c t s o f t h e s u l p h o n y l u r e a s o n

g l u c a g o n s e c r e t i o n ( G r o d s k y e t a l . 1 9 7 7 ; E f e n d i c e t a l . 1 9 7 9 ) .

C l o s u r e o f t h e K A T P c h a n n e l s l e a d s t o m e m b r a n e

d e p o l a r i z a t i o n a n d o p e n i n g o f v o l t a g e - d e p e n d e n t N - a n d

L _ t y p e C a c h a n n e l s , w h i c h c u l m i n a t e s i n t h e i n i t i a t i o n o f

C a - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s ( G r o m a d a e t a l . 1 9 9 7 ) .

I n t e r e s t i n g l y , h i g h - a f f i n i t y s u l p h o n y l u r e a _ b i n d i n g s i t e s a r e

n o t o n l y f o u n d i n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f r a t A _ c e l l s . A s i n

t h e i n s u l i n - s e c r e t i n g B _ c e l l s , t h e y a l s o a s s o c i a t e w i t h

g l u c a g o n - c o n t a i n i n g g r a n u l e s ( C a r p e n t i e r e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e

J o u r n a l o f P h y s i o l o g y ( 2 0 0 0 ) , 5 2 7 . 1 , p p . 1 0 9 1 2 0

1 0 9

T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s o f g l u c a g o n b y i n h i b i t i o n o f

a m i t o c h o n d r i a l - l i k e A T P - s e n s i t i v e K ( K A T P ) c o n d u c t a n c e i n

r a t p a n c r e a t i c A _ c e l l s

M a r i a n n e H y , H e r v r L . O l s e n , K r i s t e r B o k v i s t , K a r s t e n B u s c h a r d * ,

S e b a s t i a n B a r g , P a t r i k R o r s m a n a n d J e s p e r G r o m a d a

L a b o r a t o r y o f I s l e t C e l l P h y s i o l o g y , N o v o N o r d i s k A S , N o v o A l l e , D K - 2 8 8 0 B a g s v a e r d ,

* B a r t h o l i n I n s t i t u t t e t , K o m m u n e h o s p i t a l e t , s t e r F a r i m a g s g a d e 5 , D K - 1 3 5 3 C o p e n h a g e n ,

D e n m a r k a n d D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g i c a l S c i e n c e s , D i v i s i o n o f M o l e c u l a r a n d C e l l u l a r

P h y s i o l o g y , L u n d U n i v e r s i t y , S

o l v e g a t a n 1 9 , S - 2 2 3 6 2 L u n d , S w e d e n

( R e c e i v e d 1 0 M a r c h 2 0 0 0 ; a c c e p t e d a f t e r r e v i s i o n 1 9 M a y 2 0 0 0 )

1 . C a p a c i t a n c e m e a s u r e m e n t s w e r e u s e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f t h e s u l p h o n y l u r e a

t o l b u t a m i d e o n C a - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s i n i s o l a t e d g l u c a g o n - s e c r e t i n g r a t p a n c r e a t i c

A _ c e l l s .

2 . W h e n a p p l i e d e x t r a c e l l u l a r l y , t o l b u t a m i d e s t i m u l a t e d d e p o l a r i z a t i o n - e v o k e d e x o c y t o s i s

4 2 _ f o l d w i t h o u t a f f e c t i n g t h e w h o l e - c e l l C a c u r r e n t . T h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f t h e

s t i m u l a t o r y a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n t r a c e l l u l a r a p p l i c a t i o n t h r o u g h t h e r e c o r d i n g

p i p e t t e . T o l b u t a m i d e p r o d u c e d a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n c e l l c a p a c i t a n c e . H a l f -

m a x i m a l s t i m u l a t i o n w a s o b s e r v e d a t 3 3 a n d t h e m a x i m u m s t i m u l a t i o n c o r r e s p o n d e d t o

a 3 4 - f o l d e n h a n c e m e n t o f e x o c y t o s i s .

3 . T h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f t o l b u t a m i d e w a s d e p e n d e n t o n p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y . T h e

a c t i o n o f t o l b u t a m i d e w a s m i m i c k e d b y t h e g e n e r a l K c h a n n e l b l o c k e r s T E A ( 1 0 m ) a n d

q u i n i n e ( 1 0 ) . A s i m i l a r s t i m u l a t i o n w a s e l i c i t e d b y 5 - h y d r o x y d e c a n o a t e ( 5 _ H D ; 1 0 ) ,

a n i n h i b i t o r o f m i t o c h o n d r i a l A T P - s e n s i t i v e K ( K A T P ) c h a n n e l s .

4 . T o l b u t a m i d e - s t i m u l a t e d , b u t n o t T E A - i n d u c e d , e x o c y t o s i s w a s a n t a g o n i z e d b y t h e K

c h a n n e l o p e n e r s d i a z o x i d e , p i n a c i d i l a n d c r o m a k a l i m .

5 . D i s s i p a t i n g t h e t r a n s g r a n u l a r K g r a d i e n t w i t h n i g e r i c i n a n d v a l i n o m y c i n i n h i b i t e d

t o l b u t a m i d e - a n d C a - e v o k e d e x o c y t o s i s . F u r t h e r m o r e , t o l b u t a m i d e - a n d C a - i n d u c e d

e x o c y t o s i s w e r e a b o l i s h e d b y t h e H i o n o p h o r e F C C P o r b y a r r e s t i n g t h e v a c u o l a r ( V _ t y p e )

H _ A T P a s e w i t h b a f i l o m y c i n A 1 o r D C C D . F i n a l l y , a m m o n i u m c h l o r i d e s t i m u l a t e d

e x o c y t o s i s t o a s i m i l a r e x t e n t t o t h a t o b t a i n e d w i t h t o l b u t a m i d e .

6 . W e p r o p o s e t h a t d u r i n g g r a n u l a r m a t u r a t i o n , a g r a n u l a r V - t y p e H - A T P a s e p u m p s H i n t o

t h e s e c r e t o r y g r a n u l e l e a d i n g t o t h e g e n e r a t i o n o f a p H g r a d i e n t a c r o s s t h e g r a n u l a r

m e m b r a n e a n d t h e d e v e l o p m e n t o f a p o s i t i v e v o l t a g e i n s i d e t h e g r a n u l e s . T h e p u m p i n g o f H

i s f a c i l i t a t e d b y t h e c o n c o m i t a n t e x i t o f K t h r o u g h g r a n u l a r K c h a n n e l s w i t h

p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s s i m i l a r t o t h o s e o f m i t o c h o n d r i a l K A T P c h a n n e l s . R e l e a s e o f

g r a n u l e s t h a t h a v e b e e n p r i m e d i s t h e n f a c i l i t a t e d b y t h e a d d i t i o n o f K c h a n n e l b l o c k e r s .

T h e r e s u l t i n g i n c r e a s e i n m e m b r a n e p o t e n t i a l p r o m o t e s e x o c y t o s i s b y u n k n o w n m e c h a n i s m s ,

p o s s i b l y i n v o l v i n g g r a n u l a r a l k a l i n i z a t i o n .

0 8 2 3

K e y w o r d s :

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r o l e o f t h e g r a n u l a r s u l p h o n y l u r e a - b i n d i n g s i t e s i s n o t

k n o w n . H o w e v e r , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e y , b y

a n a l o g y t o w h a t a p p e a r s t o b e t h e c a s e i n i n s u l i n - s e c r e t i n g

m o u s e p a n c r e a t i c B _ c e l l s ( E l i a s s o n e t a l . 1 9 9 6 ; B a r g e t a l .

1 9 9 9 ; S m i t h e t a l . 1 9 9 9 ) , p a r t i c i p a t e i n t h e r e g u l a t i o n o f

g l u c a g o n s e c r e t i o n b y i n t e r a c t i o n w i t h t h e e x o c y t o t i c

m a c h i n e r y . I n t h i s p a p e r w e h a v e i n v e s t i g a t e d t h i s a s p e c t

a n d p r o v i d e c i r c u m s t a n t i a l e v i d e n c e f o r t h e p a r t i c i p a t i o n o f

a g r a n u l a r m i t o c h o n d r i a l - l i k e K A T P c h a n n e l i n t h e c o n t r o l o f

e x o c y t o s i s i n t h e g l u c a g o n - s e c r e t i n g p a n c r e a t i c A _ c e l l s .

M E T H O D S

P r e p a r a t i o n o f s i n g l e r a t A _ c e l l s a n d p i t u i t a r y s o m a t o t r o p h s

M a l e L e w i s r a t s ( 2 5 0 3 0 0 g ; M l l e g a a r d , L i l l e S k e n s v e d , D e n m a r k )

w e r e a n a e s t h e t i z e d w i t h p e n t o b a r b i t a l ( 1 0 0 m g k g i . p . ) a n d k i l l e d

b y d e c a p i t a t i o n . T h e u s e o f a n i m a l s w a s a p p r o v e d b y t h e l o c a l

e t h i c a l c o m m i t t e e f o r a n i m a l s t u d i e s . T h e p a n c r e a t i c d u c t w a s

l i g a t e d d i s t a l l y a n d i n j e c t e d w i t h a n i c e - c h i l l e d s o l u t i o n o f 6 0 0

U m l c o l l a g e n a s e , 5 g m l D N a s e a n d 5 6 m g l u c o s e i n H e p e s -

b u f f e r e d s a l i n e s o l u t i o n ( H B S S ) . T h e p a n c r e a s w a s r e m o v e d a n d

i n c u b a t e d f o r 2 4 5 m i n i n a s h a k i n g w a t e r b a t h a t 3 7 C

( 2 0 0 s t r o k e s m i n ; a m p l i t u d e , 5 c m ) . T h e s u s p e n s i o n w a s p a s s e d

t h r o u g h a 1 4 g a u g e i . v . c a t h e t e r , c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n t h e

b o t t o m l a y e r o f a d i s c o n t i n u o u s F i c o l l g r a d i e n t ( 1 3 , 1 9 5 , 2 0 5 a n d

2 4 5 % ) . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 5 m i n a t 8 0 0 g a t r o o m

t e m p e r a t u r e , t h e i s l e t s w e r e r e c o v e r e d f r o m t h e i n t e r f a c e s a n d

w a s h e d i n H B S S , a n d f i n a l l y h a n d - p i c k e d u n d e r a

s t e r e o m i c r o s c o p e . T h e i s l e t s w e r e s t o r e d a t 4 C o v e r n i g h t i n

R P M I 1 6 4 0 t i s s u e c u l t u r e m e d i u m ( G i b c o B R L , L i f e T e c h n o l o g i e s

L t d , P a i s l e y , U K ) w i t h 1 0 % f e t a l c a l f s e r u m . T h e i s l e t s w e r e

d i s p e r s e d i n t o s i n g l e c e l l s u s i n g d i s p a s e a n d p a n c r e a t i c A _ c e l l s w e r e

s e p a r a t e d b y f l u o r e s c e n c e - a c t i v a t e d c e l l s o r t i n g a s d e s c r i b e d

e l s e w h e r e ( J o s e f s e n e t a l . 1 9 9 6 ) . B a s e d o n t h e h o r m o n e c o n t e n t s a n d

t h e g l u c o s e s e n s i t i v i t y o f e l e c t r i c a l a c t i v i t y , w e e s t i m a t e t h a t t h e

p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d > 8 0 % A _ c e l l s a n d < 3 % B _ c e l l s ( J o s e f s e n e t

a l . 1 9 9 6 ; G r o m a d a e t a l . 1 9 9 7 ) . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s p l a t e d o n

3 5 m m d i a m e t e r P e t r i d i s h e s a n d i n c u b a t e d i n a h u m i d i f i e d

a t m o s p h e r e f o r u p t o 3 d a y s i n R P M I 1 6 4 0 m e d i u m s u p p l e m e n t e d

w i t h 1 0 % ( v v ) h e a t - i n a c t i v a t e d f e t a l c a l f s e r u m , 1 0 0 I U m l

p e n i c i l l i n a n d 1 0 0 g m l s t r e p t o m y c i n .

P i t u i t a r y s o m a t o t r o p h s f r o m a l b i n o m a l e S p r a g u e - D a w l e y r a t s

( 2 5 0 g ; M l l e g a a r d ) w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o R a u n e t a l . ( 1 9 9 8 ) .

T h e a n i m a l s w e r e k i l l e d b y d e c a p i t a t i o n . T h e c e l l s u s p e n s i o n

c o n t a i n e d 7 0 % p i t u i t a r y c e l l s . A f t e r i s o l a t i o n t h e c e l l s w e r e

p l a t e d o n t o p l a s t i c P e t r i d i s h e s a n d m a i n t a i n e d f o r u p t o 2 d a y s i n

D u l b e c c o s m o d i f i e d E a g l e s m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 2 5 m

H e p e s , 4 m g l u t a m i n e , 0 0 7 5 % N a C O , 0 1 % n o n - e s s e n t i a l

a m i n o a c i d s , 2 5 % f e t a l c a l f s e r u m , 3 % h o r s e s e r u m , 1 0 % f r e s h r a t

s e r u m , 1 n T a n d 4 0 g l d e x a m e t h a s o n e ( p H 7 3 0 ) . A l l t i s s u e

c u l t u r e m e d i a w e r e o b t a i n e d f r o m L i f e T e c h n o l o g i e s .

E l e c t r o p h y s i o l o g y

P i p e t t e s w e r e p u l l e d f r o m b o r o s i l i c a t e g l a s s , c o a t e d w i t h S y l g a r d

n e a r t h e i r t i p s a n d f i r e p o l i s h e d . W h e n f i l l e d w i t h p i p e t t e s o l u t i o n s ,

t h e e l e c t r o d e s h a d a r e s i s t a n c e o f 3 4 M . E x o c y t o s i s w a s

m e a s u r e d a s i n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e ( N e h e r & M a r t y , 1 9 8 2 )

u s i n g , e x c e p t f o r F i g . 1 , a n E P C _ 9 p a t c h - c l a m p a m p l i f i e r ( H E K A

E l e k t r o n i k , L a m p r e c h t P f a l z , G e r m a n y ) a n d P u l s e s o f t w a r e

( v e r s i o n 8 . 3 0 ; H E K A E l e k t r o n i k ) . T h e i n t e r v a l b e t w e e n t w o

s u c c e s s i v e p o i n t s w a s 0 2 s a n d t h e m e a s u r e m e n t s o f c e l l

c a p a c i t a n c e w e r e i n i t i a t e d < 5 s a f t e r e s t a b l i s h m e n t o f t h e w h o l e _ c e l l

c o n f i g u r a t i o n . I n F i g . 1 , c h a n g e s i n c e l l c a p a c i t a n c e w e r e e l i c i t e d b y

v o l t a g e - c l a m p d e p o l a r i z a t i o n s t o 0 m V f r o m a h o l d i n g p o t e n t i a l o f

7 0 m V u s i n g a n E P C _ 7 p a t c h - c l a m p a m p l i f i e r ( L i s t E l e k t r o n i k )

a n d i n - h o u s e s o f t w a r e w r i t t e n i n A x o B a s i c ( A x o n I n s t r u m e n t s ) a s

d e t a i l e d e l s e w h e r e (

A m m

a l

a e t a l . 1 9 9 3 ) . A l l e x p e r i m e n t s , e x c e p t

t h o s e i n F i g . 1 i n w h i c h t h e p e r f o r a t e d - p a t c h w h o l e - c e l l

c o n f i g u r a t i o n w a s u s e d , w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e s t a n d a r d w h o l e -

c e l l r e c o r d i n g m o d e . T h e v o l u m e o f t h e r e c o r d i n g c h a m b e r w a s

0 4 m l a n d t h e s o l u t i o n e n t e r i n g t h e b a t h ( 1 5 2 m l m i n ) w a s

m a i n t a i n e d a t + 3 3 C .

S o l u t i o n s

T h e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m c o n s i s t e d o f ( m ) : 1 3 8 N a C l , 5 6 K C l ,

2 6 C a C l , 1 2 M g C l , 5 H e p e s ( p H 7 4 w i t h N a O H ) a n d 5 _ g l u c o s e .

T h e e x t r a c e l l u l a r s o l u t i o n u s e d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f c e l l

c a p a c i t a n c e e v o k e d b y v o l t a g e - c l a m p d e p o l a r i z a t i o n c o n t a i n e d

( m ) : 1 1 8 N a C l , 2 0 T E A - C l , 5 6 K C l , 1 2 M g C l , 2 6 C a C l , 5

H e p e s ( p H 7 4 0 w i t h N a O H ) a n d 5 g l u c o s e . T E A - C l w a s i n c l u d e d i n

t h e m e d i u m t o b l o c k t h e o u t w a r d d e l a y e d r e c t i f y i n g K c u r r e n t ,

w h i c h o t h e r w i s e o b s c u r e s t h e s m a l l e r C a c u r r e n t ( R o r s m a n &

T r u b e , 1 9 8 6 ) . T h e p i p e t t e s o l u t i o n u s e d f o r t h e i n f u s i o n

e x p e r i m e n t s c o n s i s t e d o f ( m ) : 1 2 5 p o t a s s i u m g l u t a m a t e , 1 0 K C l ,

1 0 N a C l , 1 M g C l , 5 o r 9 C a C l , 3 M g - A T P , 1 0 E G T A a n d 5 H e p e s

( p H 7 1 5 w i t h K O H ) . I n t h e e x p e r i m e n t s w h e r e i n t e r n a l K w a s

r e p l a c e d w i t h C s ( F i g . 5 B ) , t h e p i p e t t e s o l u t i o n c o n s i s t e d o f ( m ) :

1 2 5 c a e s i u m g l u t a m a t e , 1 0 C s C l , 1 0 N a C l , 1 M g C l , 5 C a C l , 3

M g _ A T P , 1 0 E G T A a n d 5 H e p e s ( p H 7 1 5 w i t h C s O H ) . T h e f r e e

C a c o n c e n t r a t i o n o f t h e r e s u l t i n g b u f f e r s w a s e s t i m a t e d a s 0 2 2 o r

2 u s i n g t h e b i n d i n g c o n s t a n t s o f M a r t e l l & S m i t h ( 1 9 7 1 ) . F o r

p e r f o r a t e d - p a t c h w h o l e - c e l l e x p e r i m e n t s ( F i g . 1 ) , t h e p i p e t t e

s o l u t i o n w a s c o m p o s e d o f ( m ) : 7 6 C s S O , 1 0 K C l , 1 0 N a C l , 1

M g C l a n d 5 H e p e s ( p H 7 3 5 w i t h C s O H ) . E l e c t r i c a l c o n t a c t w a s

e s t a b l i s h e d b y a d d i n g 0 2 4 m g m l a m p h o t e r i c i n B t o t h e p i p e t t e

s o l u t i o n (

A m m

a l

a e t a l . 1 9 9 3 ) . P e r f o r a t i o n r e q u i r e d a f e w m i n u t e s

a n d t h e v o l t a g e c l a m p w a s c o n s i d e r e d s a t i s f a c t o r y w h e n t h e s e r i e s

c o n d u c t a n c e w a s s t a b l e a n d > 3 5 4 0 n S . P i n a c i d i l , g l i b e n c l a m i d e ,

g l i p i z i d e , d i a z o x i d e a n d t o l b u t a m i d e w e r e o b t a i n e d f r o m R B I

( N a t i c k , M A , U S A ) . R p _ c A M P S ( R P _ c y c l i c 3 ' , 5 ' - h y d r o g e n

p h o s p h o r o t h i o a t e a d e n o s i n e t r i e t h y l a m m o n i u m s a l t ) w a s f r o m

B i o l o g ( H a m b u r g , G e r m a n y ) . B a f i l o m y c i n A 1 w a s o b t a i n e d f r o m

C a l b i o c h e m ( L a J o l l a , C A , U S A ) . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e

p u r c h a s e d f r o m S i g m a . I n t h e e x p e r i m e n t s u t i l i z i n g t h e P K A a n d

P K C i n h i b i t o r s R p _ c A M P S a n d s t a u r o s p o r i n e , t h e c e l l s w e r e f i r s t

p r e - i n c u b a t e d f o r > 2 0 m i n w i t h 0 1 m R p _ c A M P S o r 0 1

s t a u r o s p o r i n e . T h e p r o t e i n k i n a s e i n h i b i t o r s w e r e t h e n i n c l u d e d a t

t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n d i a l y s i n g t h e c e l l

i n t e r i o r d u r i n g t h e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l m e a s u r e m e n t s .

D a t a a n a l y s i s

I n t h e i n f u s i o n e x p e r i m e n t s , t h e e x o c y t o t i c r a t e w a s e s t i m a t e d b y

u s i n g a l i n e a r c o m p o n e n t o f t h e c a p a c i t a n c e i n c r e a s e l a s t i n g a t l e a s t

3 0 s d u r i n g t h e f i r s t 6 0 s f o l l o w i n g t h e e s t a b l i s h m e n t o f t h e w h o l e -

c e l l c o n f i g u r a t i o n , i g n o r i n g a n y r a p i d c h a n g e s o c c u r r i n g d u r i n g t h e

i n i t i a l 1 0 s . S t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e s w e r e e v a l u a t e d u s i n g

S t u d e n t s t t e s t f o r u n p a i r e d d a t a ( F i g s 1 , 3 , 5 B a n d 8 E a n d F ) ,

D u n n e t t s t e s t f o r m u l t i p l e c o m p a r i s o n s t o a s i n g l e c o n t r o l ( F i g s 2 ,

4 , 7 a n d 8 A D ) a n d D u n c a n s t e s t w h e n c o m p a r i n g m u l t i p l e m e a n s

w i t h i n a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s ( F i g s 5 a n d 6 ) . D a t a a r e q u o t e d a s

m e a n v a l u e s s . e . m . o f t h e i n d i c a t e d n u m b e r o f e x p e r i m e n t s

( = c e l l s , n ) .

M . H y a n d o t h e r s

J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 0

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3/12

R E S U L T S

T o l b u t a m i d e p o t e n t i a t e s d e p o l a r i z a t i o n - i n d u c e d

e x o c y t o s i s i n r a t A _ c e l l s

F i g u r e 1 A i l l u s t r a t e s w h o l e - c e l l C a c u r r e n t s a n d t h e

a s s o c i a t e d c h a n g e s i n c e l l c a p a c i t a n c e e l i c i t e d b y 5 0 0 m s

d e p o l a r i z a t i o n s f r o m 7 0 t o 0 m V i n a n i n t a c t r a t A _ c e l l

u s i n g t h e p e r f o r a t e d - p a t c h c o n f i g u r a t i o n . U n d e r b a s a l

c o n d i t i o n s , t h e i n t e g r a t e d C a c u r r e n t a m o u n t e d t o 6 9 p C

a n d a c a p a c i t a n c e i n c r e a s e o f 3 1 f F w a s e v o k e d . T h e l a t t e r

v a l u e c o r r e s p o n d s t o t h e d i s c h a r g e o f 1 6 g r a n u l e s u s i n g a

c o n v e r s i o n f a c t o r o f 2 f F p e r g r a n u l e ( G r o m a d a e t a l . 1 9 9 7 ) .

T w o m i n u t e s a f t e r i n c l u s i o n o f 0 1 m t o l b u t a m i d e i n t h e

b a t h i n g s o l u t i o n , t h e s a m e m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n

p r o d u c e d a n i n t e g r a t e d C a c u r r e n t o f 6 7 p C a n d a

c a p a c i t a n c e i n c r e a s e o f 8 1 f F ( 1 6 1 % s t i m u l a t i o n ) . T h e

e f f e c t s o f t o l b u t a m i d e a r e s u m m a r i z e d i n F i g . 1 B , w h i c h

i l l u s t r a t e s t h e a m p l i t u d e o f t h e e x o c y t o t i c r e s p o n s e s a g a i n s t

t h e t i m e e l a p s e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f t o l b u t a m i d e . I t c a n b e

s e e n t h a t t o l b u t a m i d e p r o d u c e d a 2 3 4 1 6 % ( P < 0 0 1 ;

n = 5 ) s t i m u l a t i o n o f e x o c y t o s i s w i t h i n 2 m i n . F o r

c o m p a r i s o n , t h e e x o c y t o t i c r e s p o n s e s i n c e l l s n o t s t i m u l a t e d

b y t o l b u t a m i d e a r e s h o w n . I t c a n b e s e e n t h a t t h e r e w e r e n o

s p o n t a n e o u s c h a n g e s o f t h e e x o c y t o t i c c a p a c i t y t h a t c o u l d

c o n t r i b u t e t o t h e o b s e r v e d s t i m u l a t i o n b y t o l b u t a m i d e . T h e

s t i m u l a t o r y a c t i o n o f t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s w a s n o t

a s s o c i a t e d w i t h a c h a n g e o f t h e i n t e g r a t e d C a c u r r e n t

( F i g . 1 C ) .

T o l b u t a m i d e a n d e x o c y t o s i s i n p a n c r e a t i c A _ c e l l s

J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 1

F i g u r e 1 . T o l b u t a m i d e s t i m u l a t i o n o f d e p o l a r i z a t i o n - i n d u c e d e x o c y t o s i s i n r a t A _ c e l l s

A , C a c u r r e n t ( I C a , m i d d l e ) a n d m e m b r a n e c a p a c i t a n c e ( C m , b o t t o m ) i n c r e a s e s e v o k e d b y 5 0 0 m s

d e p o l a r i z a t i o n s f r o m 7 0 t o 0 m V ( V m , m e m b r a n e p o t e n t i a l ; t o p ) b e f o r e a n d 2 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f

0 1 m t o l b u t a m i d e . B , t i m e - d e p e n d e n t c h a n g e s i n e x o c y t o t i c r e s p o n s e s b e f o r e ( 2 a n d 0 m i n ) a n d 2 , 4 a n d

6 m i n a f t e r a d d i t i o n o f 0 1 m t o l b u t a m i d e ( 0 ) . N o c h a n g e s i n t h e e x o c y t o t i c c a p a c i t y w e r e o b s e r v e d o v e r

t i m e i n a p a r a l l e l s e r i e s o f c o n t r o l e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d i n t h e a b s e n c e o f t o l b u t a m i d e ( 1 ) . C , h i s t o g r a m

s u m m a r i z i n g t h e i n t e g r a t e d C a c u r r e n t ( Q C a ) i n t h e a b s e n c e ( ) a n d p r e s e n c e ( + ) o f t o l b u t a m i d e ( T o l b )

b e f o r e ( 0 m i n ) a n d 2 m i n a f t e r a d d i t i o n o f t o l b u t a m i d e . T h e d a t a a r e m e a n s s . e . m . o f 5 e x p e r i m e n t s .

* P < 0 0 1 v s . C o n t r o l .

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4/12

T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s e v o k e d b y i n t r a -

c e l l u l a r i n f u s i o n o f C a

I t s e e m s l i k e l y t h a t t h e e f f e c t s o f t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s

a r e e x e r t e d f o l l o w i n g i t s u p t a k e i n t o t h e A _ c e l l . I t h a s

p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d i n p a n c r e a t i c B _ c e l l s t h a t

t o l b u t a m i d e r e m a i n s a p o t e n t s t i m u l a t o r o f e x o c y t o s i s w h e n

a p p l i e d i n t r a c e l l u l a r l y t h r o u g h t h e p a t c h e l e c t r o d e d u r i n g

s t a n d a r d w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s ( B a r g e t a l . 1 9 9 9 ) . S u b s e q u e n t

e x p e r i m e n t s w e r e t h e r e f o r e p e r f o r m e d u s i n g t h e l a t t e r

c o n f i g u r a t i o n . T h i s h a s t h e a d d i t i o n a l a d v a n t a g e t h a t t h e

d i f f u s i o n b a r r i e r r e p r e s e n t e d b y t h e p l a s m a m e m b r a n e i s

r e m o v e d . F o l l o w i n g e s t a b l i s h m e n t o f t h e w h o l e - c e l l

c o n f i g u r a t i o n a n d i n f u s i o n o f a C a b u f f e r w i t h a f r e e C a

c o n c e n t r a t i o n o f 0 2 2 , e x o c y t o s i s w a s i n i t i a t e d a n d w a s

o b s e r v e d a s a g r a d u a l c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( F i g . 2 A ,

C o n t r o l ) . I n g e n e r a l , t h e c e l l c a p a c i t a n c e r e a c h e d a n e w

s t e a d y - s t a t e l e v e l w i t h i n 2 m i n . I t i s c l e a r t h a t i n c l u s i o n o f

0 1 m t o l b u t a m i d e i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n e x e r t e d a s t r o n g

s t i m u l a t o r y a c t i o n o n t h e i n c r e a s e i n c e l l c a p a c i t a n c e

( F i g . 2 A , T o l b u t a m i d e ) . O n a v e r a g e , t o l b u t a m i d e e v o k e d a

3 _ f o l d s t i m u l a t i o n o f b o t h t h e r a t e a n d t o t a l a m p l i t u d e o f

t h e c a p a c i t a n c e i n c r e a s e . T h e e f f e c t o f t o l b u t a m i d e o n

e x o c y t o s i s w a s d e p e n d e n t o n d o s e ( F i g . 2 B ) . N o s t i m u l a t i o n

o f e x o c y t o s i s w a s o b s e r v e d w i t h 1 t o l b u t a m i d e . A t

h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , t o l b u t a m i d e a c c e l e r a t e d t h e i n c r e a s e

i n c e l l c a p a c i t a n c e b y 3 9 3 3 9 % . A p p r o x i m a t i n g t h e d a t a

p o i n t s t o t h e H i l l e q u a t i o n y i e l d e d v a l u e s o f t h e a s s o c i a t i o n

c o n s t a n t ( K a ) a n d c o - o p e r a t i v i t y f a c t o r o f 3 3 a n d 6 5 ,

r e s p e c t i v e l y . M a x i m a l s t i m u l a t i o n o f e x o c y t o s i s w a s s e e n a t

c o n c e n t r a t i o n s o f t o l b u t a m i d e 1 0 0 ( F i g . 2 B ) .

F i g u r e 2 C s h o w s t h a t t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f t o l b u t a m i d e

o n e x o c y t o s i s w a s m i m i c k e d b y t h e s e c o n d - g e n e r a t i o n

s u l p h o n y l u r e a s g l i b e n c l a m i d e a n d g l i p i z i d e . W h e n a p p l i e d

a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 n , e x o c y t o s i s w a s i n c r e a s e d

3 _ f o l d b y b o t h c o m p o u n d s ( P < 0 0 1 ; n = 4 f o r g l i b e n c l a m i d e

a n d n = 5 f o r g l i p i z i d e ) . A c c o r d i n g l y , t h e s e c o m p o u n d s w e r e

1 0 0 0 - f o l d m o r e p o t e n t t h a n t h e p r o t o t y p e s u l p h o n y l u r e a

t o l b u t a m i d e .

T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s P K C - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s

I n p a n c r e a t i c B _ c e l l s t o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s b y a

p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) - d e p e n d e n t m e c h a n i s m ( E l i a s s o n e t


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 2

F i g u r e 2 . I n t r a c e l l u l a r a p p l i c a t i o n o f t o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s

e x o c y t o s i s i n r a t A _ c e l l s

A , i n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e o b s e r v e d d u r i n g t h e f i r s t 2 m i n a f t e r

e s t a b l i s h m e n t o f t h e s t a n d a r d w h o l e - c e l l c o n f i g u r a t i o n e l i c i t e d b y i n t r a -

c e l l u l a r i n f u s i o n w i t h a C a - E G T A b u f f e r w i t h a f r e e C a c o n c e n t r a t i o n

o f 0 2 2 i n t h e a b s e n c e ( C o n t r o l ) o r p r e s e n c e o f 0 1 m t o l b u t a m i d e i n

t h e p i p e t t e s o l u t i o n . T h r o u g h o u t t h e r e c o r d i n g , t h e c e l l w a s c l a m p e d a t

7 0 m V i n o r d e r t o a v o i d a c t i v a t i o n o f t h e v o l t a g e - d e p e n d e n t C a

c h a n n e l s t h a t w o u l d o t h e r w i s e i n t e r f e r e w i t h t h e c a p a c i t a n c e

m e a s u r e m e n t . B , d o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f o r t o l b u t a m i d e - i n d u c e d

s t i m u l a t i o n o f e x o c y t o s i s . T h e r a t e o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t ) w a s

m e a s u r e d d u r i n g t h e l i n e a r c o m p o n e n t o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e a s

i n d i c a t e d b y t h e d o t t e d l i n e i n A . T h e l i n e i s t h e b e s t f i t o f t h e m e a n d a t a

t o t h e H i l l e q u a t i o n . C , h i s t o g r a m d e p i c t i n g m e a n r a t e s o f i n c r e a s e i n c e l l

c a p a c i t a n c e i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 0 1 m t o l b u t a m i d e , 1 0 0 n

g l i b e n c l a m i d e o r 1 0 0 n g l i p i z i d e . D a t a a r e m e a n v a l u e s s . e . m . o f

4 1 1 d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . * P < 0 0 1 v s . C o n t r o l .

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5/12

a l . 1 9 9 6 ) . T h i s a l s o a p p l i e s t o p a n c r e a t i c A _ c e l l s a s s u g g e s t e d

b y t h e f a i l u r e o f t o l b u t a m i d e t o b e s t i m u l a t o r y f o l l o w i n g

i n h i b i t i o n o f P K C b y s t a u r o s p o r i n e ( 0 1 f o r 2 0 m i n ;

F i g . 3 A a n d B ) . B y c o n t r a s t , i n h i b i t i o n o f P K A b y

R p _ c A M P S ( 0 1 m ) d i d n o t a f f e c t t h e a b i l i t y o f t o l b u t a m i d e

t o s t i m u l a t e a n i n c r e a s e i n c e l l c a p a c i t a n c e ( F i g . 3 C ) . U n d e r

t h e s e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t o l b u t a m i d e e n h a n c e d t h e

e x o c y t o t i c r e s p o n s e 3 _ f o l d ( P < 0 0 1 ; n = 5 ; F i g . 3 D ) .


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 3

F i g u r e 3 . T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s i n a P K C -

d e p e n d e n t f a s h i o n

C h a n g e s i n c e l l c a p a c i t a n c e w e r e e l i c i t e d b y i n t r a c e l l u l a r d i a l y s i s

o f s i n g l e r a t A _ c e l l s w i t h 0 2 2 f r e e C a i n t h e a b s e n c e o r

p r e s e n c e o f 0 1 m t o l b u t a m i d e . A a n d C , c e l l s w e r e t r e a t e d

w i t h 0 1 s t a u r o s p o r i n e ( A ) o r 0 1 m R p - c A M P S ( C ) . B a n d

D , t h e h i s t o g r a m s u m m a r i z e s m e a n l i n e a r r a t e s o f c a p a c i t a n c e

i n c r e a s e ( C m t ) o c c u r r i n g i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f

t o l b u t a m i d e i n c e l l s t r e a t e d w i t h s t a u r o s p o r i n e ( B ; S t a u r o ) o r

R p - c A M P S ( D ) . D a t a a r e g i v e n a s m e a n v a l u e s s . e . m . o f 4 5

e x p e r i m e n t s . * P < 0 0 1 v s . c o n t r o l .

F i g u r e 4 . K c h a n n e l o p e n e r s i n h i b i t t o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s

A , c h a n g e s i n c e l l c a p a c i t a n c e w h e n A _ c e l l s w e r e d i a l y s e d w i t h 0 2 2 f r e e C a i n t h e p r e s e n c e o f 0 1 m

t o l b u t a m i d e a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h d i a z o x i d e . B , m e a n r a t e s o f l i n e a r c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t )

i n t h e p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e a l o n e ( T o l b ) a n d w h e n d i a z o x i d e ( d i a ) , p i n a c i d i l ( p i n ) o r c r o m a k a l i m ( c r o m )

w e r e i n c l u d e d i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n i n t h e c o n t i n u e d p r e s e n c e o f t h e s u l p h o n y l u r e a . C , c h a n g e s i n c e l l

c a p a c i t a n c e w h e n A _ c e l l s w e r e i n f u s e d w i t h a m a x i m a l l y s t i m u l a t o r y f r e e C a c o n c e n t r a t i o n ( 2 ) i n t h e

a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f d i a z o x i d e . D , m e a n r a t e s o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f

d i a z o x i d e , p i n a c i d i l o r c r o m a k a l i m . I n a l l e x p e r i m e n t s t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e K c h a n n e l o p e n e r s w a s

0 1 m . T h e d a t a a r e m e a n s s . e . m . o f 3 1 1 d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . * P < 0 0 1 v s . T o l b ( B ) o r C o n t r o l ( D ) .

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6/12

D i a z o x i d e i n h i b i t s t o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s

F i g u r e 4 A s h o w s t h a t i n c l u s i o n o f t h e K c h a n n e l o p e n e r

d i a z o x i d e ( 0 1 m ) i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n a n t a g o n i z e d

t o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s . D i a z o x i d e c o m p l e t e l y

i n h i b i t e d t h e t o l b u t a m i d e - e v o k e d i n c r e a s e i n c e l l c a p a c i t a n c e

a n d t h e r a t e o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e i n t h e p r e s e n c e o f

t o l b u t a m i d e a n d d i a z o x i d e w a s n o t d i f f e r e n t f r o m t h a t

o b s e r v e d u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s ( a b s e n c e o f d r u g s ) . O t h e r

K A T P c h a n n e l o p e n e r s s u c h a s p i n a c i d i l a n d c r o m a k a l i m

( b o t h 0 1 m ) a l s o s h o w e d a n i n h i b i t o r y a c t i o n a n d r e d u c e d

e x o c y t o s i s t o a s i m i l a r e x t e n t ( F i g . 4 B ) . T h i s c o n t r a s t s w i t h

w h a t a p p e a r s t o b e t h e c a s e i n m o u s e B _ c e l l s ( S . B a r g ,

L . E l i a s s o n & E . R e n s t r

o m , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e

K c h a n n e l o p e n e r s ( 0 1 m ) a l s o r e d u c e d e x o c y t o s i s e v o k e d

b y i n f u s i o n o f h i g h [ C a ] b u f f e r ( 2 f r e e C a ; F i g . 4 C

a n d D ) .

K c h a n n e l b l o c k e r s m i m i c t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f

t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s

I n t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s , w e i n v e s t i g a t e d p o s s i b l e

m e c h a n i s m s b y w h i c h t o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s .

W e f i r s t i n v e s t i g a t e d w h e t h e r o t h e r K c h a n n e l b l o c k e r s

s h a r e t h e e f f e c t s o f t h e s u l p h o n y l u r e a s . F i g u r e 5 A i l l u s t r a t e s

t h e f i n d i n g t h a t i n c l u s i o n o f t h e b r o a d - s p e c t r u m K c h a n n e l

b l o c k e r T E A ( 1 0 m ) i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n e l i c i t e d a

s t i m u l a t i o n o f e x o c y t o s i s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d w i t h

t o l b u t a m i d e . O n a v e r a g e , T E A a c c e l e r a t e d t h e e x o c y t o t i c

r e s p o n s e 2 4 - f o l d ( P < 0 0 1 ; n = 6 ; F i g . 5 B ) . T o l b u t a m i d e

w a s u n a b l e t o p r o d u c e a f u r t h e r s t i m u l a t i o n w h e n a p p l i e d i n

t h e p r e s e n c e o f 1 0 m T E A ( F i g . 5 B ) s u g g e s t i n g t h a t t h e

a c t i o n s o f t o l b u t a m i d e a n d T E A c o n v e r g e o n t h e s a m e

c e l l u l a r m e c h a n i s m , p o s s i b l y a g r a n u l a r K c o n d u c t a n c e .

M o r e o v e r , q u i n i n e ( a n o t h e r w i d e l y u s e d K c h a n n e l b l o c k e r )

l i k e w i s e s t i m u l a t e d e x o c y t o s i s 2 8 - f o l d ( P < 0 0 1 ; n = 5 )

w h e n a p p l i e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 . W e a l s o t e s t e d

t h e e f f e c t s o f t h e K c h a n n e l o p e n e r s d i a z o x i d e , p i n a c i d i l

a n d c r o m a k a l i m o n T E A - s t i m u l a t e d e x o c y t o s i s ; a l l

c o m p o u n d s w e r e i n e f f e c t i v e ( F i g . 5 B ) . F i n a l l y , w e

i n v e s t i g a t e d t h e c o n s e q u e n c e s o f s u b s t i t u t i n g C s f o r K i n

t h e p i p e t t e s o l u t i o n . A s s h o w n i n F i g . 5 B , t h i s h a d l i t t l e

e f f e c t o n e i t h e r b a s a l o r t o l b u t a m i d e - s t i m u l a t e d s e c r e t i o n .

T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s b y a c t i v a t i o n o f a

m i t o c h o n d r i a l - l i k e K A T P c h a n n e l

F i g u r e 6 A s h o w s t h a t i n c l u s i o n o f 5 - h y d r o x y d e c a n o a t e

( 5 _ H D ; 1 0 ) , a n i n h i b i t o r o f m i t o c h o n d r i a l K A T P c h a n n e l s

( H u e t a l . 1 9 9 9 ) , i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n s t i m u l a t e d

e x o c y t o s i s t o a n e x t e n t c o m p a r a b l e t o t h a t o b s e r v e d w i t h

t o l b u t a m i d e . A s i m i l a r i n c r e a s e i n t h e r a t e o f e x o c y t o s i s w a s

o b s e r v e d a t a 1 0 t i m e s h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f 5 _ H D ( d a t a

n o t s h o w n ) . F u r t h e r m o r e , n o a d d i t i v e e f f e c t o n t h e s e c r e t i o n

r a t e w a s o b t a i n e d w h e n e i t h e r t o l b u t a m i d e ( 0 1 m ) o r T E A

( 1 0 m ; F i g . 6 B ) w a s a d d e d i n t h e s i m u l t a n e o u s p r e s e n c e o f

5 _ H D . T h i s f i n d i n g i s s i m p l e s t t o e x p l a i n i f 5 _ H D b l o c k s t h e

s a m e K c o n d u c t a n c e a s t o l b u t a m i d e o r T E A . I n k e e p i n g

w i t h t h i s i d e a , d i a z o x i d e ( 0 1 m ) w a s c a p a b l e o f r e v e r s i n g

t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f 5 _ H D o n e x o c y t o s i s ( F i g . 6 B ) .

C o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s r e p o r t e d b y o t h e r s ( J a g g e r e t a l .

1 9 9 3 ) , t h e s e e f f e c t s o f 5 _ H D o n e x o c y t o s i s w e r e n o t

p a r a l l e l e d b y a n i n h i b i t o r y a c t i o n o f p l a s m a m e m b r a n e

K A T P c h a n n e l a c t i v i t y ( n o t s h o w n ) .

D i s s i p a t i o n o f a g r a n u l a r K g r a d i e n t i n h i b i t s

t o l b u t a m i d e - e v o k e d e x o c y t o s i s

T h e a b o v e d a t a i n d i c a t e t h a t t o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s

e x o c y t o s i s b y c l o s u r e o f a g r a n u l a r K c o n d u c t a n c e . T h e

f i n d i n g t h a t r e p l a c e m e n t o f c y t o p l a s m i c K w i t h C s h a d n o

e f f e c t o n e x o c y t o s i s f u r t h e r a r g u e s t h a t t h e s e c h a n n e l s

m e d i a t e t h e e f f l u x o f K f r o m t h e i n t e r i o r o f t h e g r a n u l e s t o


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 4

F i g u r e 5 . T E A a n d q u i n i n e s t i m u l a t e e x o c y t o s i s i n r a t A _ c e l l s

A , i n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e e l i c i t e d b y 0 2 2 f r e e C a i n t h e

a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 0 m T E A . B , m e a n r a t e s o f l i n e a r c a p a c i t a n c e

i n c r e a s e ( C m t ) m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e ( C o n t r o l ) a n d p r e s e n c e o f

T E A ( 1 0 m ) , w i t h T E A + t o l b u t a m i d e ( b o t h 0 1 m ) , q u i n i n e ( 1 0 ) ,

T E A + d i a z o x i d e ( 1 0 a n d 0 1 m ) , T E A + p i n a c i d i l ( 1 0 a n d 0 1 m )

a n d T E A + c r o m a k a l i m ( 1 0 a n d 0 1 m ) , a n d f o l l o w i n g e q u i m o l a r

r e p l a c e m e n t o f K i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n w i t h C s a l o n e o r i n

c o m b i n a t i o n w i t h t o l b u t a m i d e . D a t a a r e m e a n s s . e . m . o f 5 8

i n d i v i d u a l c e l l s u n d e r e a c h e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n . * P < 0 0 1 .

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7/12

t h e c y t o p l a s m . A r o l e f o r a g r a n u l a r K c o n d u c t a n c e i n t h e

s t i m u l a t o r y e f f e c t o f t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s i s a l s o

s u g g e s t e d b y t h e f i n d i n g t h a t i n c l u s i o n o f t h e K i o n o p h o r e

n i g e r i c i n ( 1 0 ) i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n a b o l i s h e d

t o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s ( F i g . 7 A a n d B ) . T h e s a m e

e f f e c t w a s o b t a i n e d w i t h 0 2 m v a l i n o m y c i n ( F i g . 7 B ) .

I n t e r e s t i n g l y , t h e K c h a n n e l i o n o p h o r e s a l s o r e d u c e d

e x o c y t o s i s e v o k e d b y i n f u s i o n o f h i g h [ C a ] b u f f e r ( 2

f r e e C a ; F i g . 7 C a n d D ) .

I t h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d t h a t D I D S - s e n s i t i v e C l

c h a n n e l s p a r t i c i p a t e i n t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f t o l b u t a m i d e

o n C a - i n d u c e d e x o c y t o s i s i n m o u s e B _ c e l l s ( B a r g e t a l .

1 9 9 9 ) . W e t h e r e f o r e e x p l o r e d w h e t h e r s u c h c h a n n e l s a l s o

p a r t i c i p a t e i n t o l b u t a m i d e - e v o k e d e x o c y t o s i s i n t h e A _ c e l l .

H o w e v e r , i n c l u s i o n o f 0 2 m D I D S i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n

d i a l y s i n g t h e c e l l d i d n o t a f f e c t t h e a b i l i t y o f t o l b u t a m i d e t o

s t i m u l a t e e x o c y t o s i s ( n o t s h o w n ) . T h e s a m e n e g a t i v e f i n d i n g

w a s m a d e w i t h 0 1 m N P P B , a n o t h e r C l c h a n n e l b l o c k e r .


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 5

F i g u r e 7 . T h e K i o n o p h o r e n i g e r i c i n a b o l i s h e s

t o l b u t a m i d e - a n d C a - i n d u c e d e x o c y t o s i s

A , i n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e e l i c i t e d b y 0 2 2 f r e e

C a i n t h e p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e ( 0 1 m ) a l o n e o r i n

c o m b i n a t i o n w i t h n i g e r i c i n ( 1 0 ) . B , h i s t o g r a m d e p i c t i n g

m e a n l i n e a r r a t e s o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t ) i n t h e

p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h

n i g e r i c i n o r v a l i n o m y c i n ( 0 2 m ) . C a n d D , a s i n A a n d B ,

e x c e p t t h a t e x o c y t o s i s w a s s t i m u l a t e d b y 2 f r e e C a i n

t h e a b s e n c e o f t o l b u t a m i d e . D a t a a r e m e a n s s . e . m . o f 5

i n d i v i d u a l c e l l s u n d e r e a c h e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n .

* P < 0 0 1 v s . T o l b ( B ) o r C o n t r o l ( D ) .

F i g u r e 6 . 5 - H y d r o x y d e c a n o a t e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s i n r a t A _ c e l l s

A , i n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e e l i c i t e d b y 0 2 2 f r e e C a i n t h e a b s e n c e ( C o n t r o l ) a n d p r e s e n c e o f 1 0

5 - h y d r o x y d e c a n o a t e ( 5 - H D ) . B , m e a n r a t e s o f l i n e a r c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t ) m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e

a n d p r e s e n c e o f 5 - H D ( 1 0 ) a n d i n t h e s i m u l t a n e o u s p r e s e n c e o f 5 - H D ( 1 0 ) a n d t o l b u t a m i d e ( 0 1 m ) ,

d i a z o x i d e ( 0 1 m ) o r T E A ( 1 0 m ) . D a t a a r e m e a n s s . e . m . o f 4 1 0 i n d i v i d u a l c e l l s u n d e r e a c h

e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n . * P < 0 0 1 .

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8/12

T o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s d e p e n d s o n a

t r a n s g r a n u l a r H g r a d i e n t

T h e a b o v e d a t a s u g g e s t t h a t t h e K g r a d i e n t a c r o s s t h e

g r a n u l a r m e m b r a n e m i g h t b e i m p o r t a n t f o r t o l b u t a m i d e -

i n d u c e d e x o c y t o s i s . S e c r e t o r y g r a n u l e s c h a r a c t e r i s t i c a l l y

h a v e a n a c i d i c p H . I n t h e n e x t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w e

i n v e s t i g a t e d t h e i m p o r t a n c e o f a n a c i d i c i n t r a g r a n u l a r p H

f o r e x o c y t o s i s . I n c l u s i o n o f t h e H i o n o p h o r e F C C P ( 0 1 m )

c o m p l e t e l y i n h i b i t e d t o l b u t a m i d e - e v o k e d s e c r e t i o n ( F i g . 8 A ) .

F C C P a l s o r e d u c e d c o n t r o l s e c r e t i o n b y > 5 0 % . T h i s i s

c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t F C C P ( 0 1 m ) a l s o

r e d u c e d s e c r e t i o n i n d u c e d b y h i g h [ C a ] ( F i g . 8 B ) .

I n s u l i n - c o n t a i n i n g s e c r e t o r y g r a n u l e s p o s s e s s a v a c u o l a r -

t y p e H _ A T P a s e t h a t m a i n t a i n s t h e g r a n u l e i n t e r i o r a t o r

b e l o w p H 6 ( H u t t o n , 1 9 8 2 ; O r c i e t a l . 1 9 8 6 ) . T o i n v e s t i g a t e

t h e e f f e c t o f t h e g r a n u l a r H p u m p o n t o l b u t a m i d e - e v o k e d

s e c r e t i o n , c e l l s w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e V _ t y p e

H _ A T P a s e i n h i b i t o r b a f i l o m y c i n A 1 ( 5 ) . B a f i l o m y c i n A 1

n o t o n l y a b o l i s h e d t h e a b i l i t y o f t o l b u t a m i d e t o s t i m u l a t e

e x o c y t o s i s ( F i g . 8 C ) b u t a l s o r e d u c e d e x o c y t o s i s u n d e r

c o n t r o l c o n d i t i o n s a s w e l l a s e x o c y t o s i s s t i m u l a t e d b y h i g h

f r e e [ C a ] ( 2 ; F i g . 8 D ) . S i m i l a r e f f e c t s w e r e o b s e r v e d

w i t h 0 1 m D C C D , a n o t h e r V _ t y p e H _ A T P a s e i n h i b i t o r

( B o w m a n e t a l . 1 9 8 8 ; Y o s h i m o r i e t a l . 1 9 9 1 ; d a t a n o t

s h o w n ) . W e c a n e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t F C C P a c t s b y

i n t e r f e r i n g w i t h m i t o c h o n d r i a l A T P g e n e r a t i o n . A l t h o u g h

m i t o c h o n d r i a l A T P p r o d u c t i o n u n d o u b t e d l y i s c o m p r o m i s e d

b y F C C P , t h i s i s u n l i k e l y t o h a v e a n y m a j o r e f f e c t o n t h e

c y t o p l a s m i c c o n c e n t r a t i o n o f A T P u n d e r t h e s e e x p e r i m e n t a l

c o n d i t i o n s , s i n c e t h i s i s d e t e r m i n e d b y t h e s u p p l y o f

e x o g e n o u s A T P t h r o u g h t h e r e c o r d i n g e l e c t r o d e . I n d e e d , a s


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 6

F i g u r e 8 . T o l b u t a m i d e - a n d C a - i n d u c e d e x o c y t o s i s d e p e n d o n t h e t r a n s g r a n u l a r H g r a d i e n t

A , c h a n g e s i n c e l l c a p a c i t a n c e e l i c i t e d b y 0 2 2 f r e e C a i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f 0 1 m

t o l b u t a m i d e a l o n e o r i n t h e s i m u l t a n e o u s p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e a n d 0 1 m F C C P . T h e h i s t o g r a m d e p i c t s

t h e m e a n l i n e a r r a t e s o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t ) i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e o r i n t h e

s i m u l t a n e o u s p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e a n d F C C P . B , e f f e c t s o f F C C P o n h i g h f r e e [ C a ] ( 2 ) - i n d u c e d

e x o c y t o s i s . T h e h i s t o g r a m d e p i c t s t h e m e a n l i n e a r r a t e o f c a p a c i t a n c e i n c r e a s e i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f

F C C P . C , a s i n A e x c e p t t h a t F C C P w a s r e p l a c e d w i t h 5 b a f i l o m y c i n A 1 ( B a f A 1 ) . D , e f f e c t o f

b a f i l o m y c i n A 1 o n h i g h f r e e [ C a ] - i n d u c e d e x o c y t o s i s . E , o l i g o m y c i n ( 1 g m l ; O l i g o m ) d o e s n o t p r e v e n t

t h e a b i l i t y o f t o l b u t a m i d e t o s t i m u l a t e e x o c y t o s i s i n t h e p r e s e n c e o f 0 2 2 f r e e C a . F , e f f e c t s o f N H

( 0 5 m ) o n e x o c y t o s i s e l i c i t e d b y 0 2 2 f r e e C a . D a t a a r e m e a n v a l u e s s . e . m . o f 3 1 1 i n d i v i d u a l c e l l s .

* P < 0 0 1 .

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9/12

s h o w n i n F i g . 8 E , a p p l i c a t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n h i b i t o r

o l i g o m y c i n ( 1 g m l ) w a s w i t h o u t e f f e c t o n t o l b u t a m i d e -

s t i m u l a t e d e x o c y t o s i s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n

c e l l s w e r e p r e - t r e a t e d f o r 1 5 m i n w i t h 1 g m l o l i g o m y c i n .

W e p o i n t o u t t h a t c y t o p l a s m i c C a i s e f f e c t i v e l y b u f f e r e d b y

t h e p r e s e n c e o f a h i g h i n t r a c e l l u l a r E G T A c o n c e n t r a t i o n s o

t h e e f f e c t s o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n h i b i t o r s c a n n o t s i m p l y b e

a t t r i b u t e d t o r e l e a s e o f m i t o c h o n d r i a l C a .

T h e a b o v e d a t a s u g g e s t t h a t g r a n u l a r p H i s i m p o r t a n t f o r

c o n t r o l l i n g e x o c y t o s i s . P r e v i o u s e x p e r i m e n t s h a v e

d e m o n s t r a t e d t h a t a d d i t i o n o f w e a k b a s e s n e u t r a l i z e s

g r a n u l a r p H a n d r e s u l t s i n s w e l l i n g o f t h e g r a n u l e s d u e t o t h e

e x i s t e n c e o f a n a c t i v e a c c u m u l a t i o n m e c h a n i s m f o r H a c r o s s

t h e g r a n u l a r m e m b r a n e ( P a c e & S a c h s , 1 9 8 2 ) . I n t e r e s t i n g l y ,

a d d i t i o n o f t h e w e a k b a s e a m m o n i u m ( N H , 0 5 m ) t o t h e

p i p e t t e s o l u t i o n p r o d u c e d a s t r o n g , b u t t r a n s i e n t i n c r e a s e i n

t h e r a t e o f e x o c y t o s i s ( F i g . 8 F ) .

E f f e c t s o f s u l p h o n y l u r e a s o n e x o c y t o s i s i n p i t u i t a r y

s o m a t o t r o p h s

T o t e s t w h e t h e r t h e a c t i o n o f t h e s u l p h o n y l u r e a s o n

e x o c y t o s i s i s c o n f i n e d t o i s l e t c e l l s w e i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t

o f t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s i n r a t p i t u i t a r y s o m a t o t r o p h s .

I n a s e r i e s o f f i v e e x p e r i m e n t s , 0 1 m t o l b u t a m i d e i n t h e

p i p e t t e s o l u t i o n i n c r e a s e d t h e e x o c y t o t i c r e s p o n s e s 1 4 - f o l d

( P < 0 0 1 ) f r o m 7 8 0 9 f F s u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s t o

1 8 8 1 7 f F s i n t h e p r e s e n c e o f t h e s u l p h o n y l u r e a

( T a b l e 1 ) . G l i b e n c l a m i d e w a s a s e f f e c t i v e a s t o l b u t a m i d e i n

s t i m u l a t i n g e x o c y t o s i s ( T a b l e 1 ) . T h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f

t o l b u t a m i d e c o u l d b e f u l l y a n t a g o n i z e d b y 0 1 m d i a z o x i d e

( P < 0 0 1 ; n = 5 ) , p i n a c i d i l ( P < 0 0 1 ; n = 4 ) a n d

c r o m a k a l i m ( P < 0 0 1 ; n = 4 ) . I n a c c o r d a n c e w i t h t h e d a t a

o b t a i n e d i n A _ c e l l s , T E A ( 1 0 m ) a n d 5 _ H D ( 1 0 )

s t i m u l a t e d t h e r a t e o f e x o c y t o s i s 1 6 - f o l d ( P < 0 0 1 f o r b o t h

c o n d i t i o n s ) . N o e f f e c t w a s o b s e r v e d b y i n c l u d i n g D I D S

( 0 2 m ) i n t h e p i p e t t e s o l u t i o n ( T a b l e 1 ) .

D I S C U S S I O N

U s i n g c a p a c i t a n c e m e a s u r e m e n t s o f e x o c y t o s i s , w e

d e m o n s t r a t e h e r e t h a t t o l b u t a m i d e p r o d u c e s a 3 - f o l d

p o t e n t i a t i o n o f C a - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s i n r a t p a n c r e a t i c

A _ c e l l s . T h i s e f f e c t i s m i m i c k e d b y s e c o n d - g e n e r a t i o n

s u l p h o n y l u r e a s a n d i s o b s e r v a b l e a t t h e r a p e u t i c

c o n c e n t r a t i o n s . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e m a d e i n r a t

s o m a t o t r o p h s ( T a b l e 1 ) s u g g e s t i n g t h a t t h e p r o c e s s e s w e

d e s c r i b e c o u l d h a v e i m p l i c a t i o n s f o r e x o c y t o s i s i n g e n e r a l .

O u r d a t a a r e a t f i r s t g l a n c e s i m i l a r t o t h o s e p r e v i o u s l y

d o c u m e n t e d i n m o u s e p a n c r e a t i c B _ c e l l s ( E l i a s s o n e t a l .

1 9 9 6 ; B a r g e t a l . 1 9 9 9 ; S m i t h e t a l . 1 9 9 9 ) . H o w e v e r , t h e

o b s e r v a t i o n s r e p o r t e d h e r e m a k e i t l i k e l y t h a t d i f f e r e n t

m e c h a n i s m s a r e i n v o l v e d , t h e m o s t n o t a b l e b e i n g t h e

i n v o l v e m e n t o f K c h a n n e l s r a t h e r t h a n C l c h a n n e l s .

R o l e f o r P K C i n t o l b u t a m i d e - i n d u c e d e x o c y t o s i s

W e d e m o n s t r a t e t h a t t o l b u t a m i d e p o t e n t i a t e s e x o c y t o s i s b y

a m e c h a n i s m d e p e n d e n t o n P K C a c t i v i t y a n d t h a t i t i s

e x e r t e d a t a l e v e l d i s t a l t o a r i s e i n [ C a ] . T h i s i s c o n s i s t e n t

w i t h t h e r e s u l t s p r e v i o u s l y o b t a i n e d i n m o u s e B _ c e l l s

( E l i a s s o n e t a l . 1 9 9 6 ) a s w e l l a s i n M I N 6 i n s u l i n o m a c e l l s

( T i a n e t a l . 1 9 9 8 ) . R e c e n t l y i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t

t o l b u t a m i d e r e l e a s e s m i t o c h o n d r i a l C a a n d b a s e d o n t h i s

o b s e r v a t i o n i t w a s a r g u e d t h a t t h e r e s u l t a n t e l e v a t i o n o f

[ C a ] l e a d s t o s t i m u l a t i o n o f P K C ( S m i t h e t a l . 1 9 9 9 ) .

H o w e v e r , i t i s d i f f i c u l t t o s e e h o w t h i s m e c h a n i s m c o u l d

p o s s i b l y b e o p e r a t i o n a l u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d i n m o s t o f

o u r e x p e r i m e n t s b e c a u s e C a w a s s t r o n g l y b u f f e r e d u s i n g

1 0 m E G T A . A n y C a r e l e a s e d f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s

w o u l d c o n s e q u e n t l y b e e x p e c t e d t o b e c h e l a t e d b e f o r e a n y

a c t i v a t i o n o f P K C h a d t a k e n p l a c e .

T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s b y i n t e r f e r e n c e

w i t h a g r a n u l a r K c o n d u c t a n c e

S e v e r a l f e a t u r e s o f t h e e f f e c t s o f t h e s u l p h o n y l u r e a s o n

e x o c y t o s i s a r e s u g g e s t i v e o f a n i n v o l v e m e n t o f K A T P c h a n n e l s

w i t h p h a r m a c o l o g i c a l f e a t u r e s s i m i l a r t o t h o s e d o c u m e n t e d

f o r t h e m i t o c h o n d r i a l v a r i e t y o f t h i s c h a n n e l . F o r e x a m p l e ,

t h e s e n s i t i v i t y o f e x o c y t o s i s t o p i n a c i d i l a n d 5 _ H D c o n f o r m s

t o t h e p r o p e r t i e s e x p e c t e d f o r a m i t o c h o n d r i a l - l i k e K A T P

c h a n n e l . I n t e r e s t i n g l y , m i t o c h o n d r i a l K A T P c h a n n e l s r e q u i r e

P K C a c t i v i t y f o r m a i n t e n a n c e o f t h e i r a c t i v i t y ( S a t o e t a l .

1 9 9 8 ) . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e P K C d e p e n d e n c e

o f t h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f t o l b u t a m i d e o n e x o c y t o s i s i s

a t t r i b u t a b l e t o t h i s m e c h a n i s m . M o r e o v e r , t h e r e c e n t

o b s e r v a t i o n t h a t p i n a c i d i l a n d c r o m a k a l i m a l s o r e v e r s e d t h e


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 7

T a b l e 1 . T o l b u t a m i d e s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s i n r a t p i t u i t a r y

c e l l s

C o n d i t i o n C m t n

( f F s )

C o n t r o l 7 8 0 9 5

T o l b u t a m i d e 1 8 8 1 7 * 5

G l i b e n c l a m i d e 1 6 6 2 3 * 5

5 - H y d r o x y d e c a n o a t e 2 0 5 2 1 * 4

T E A 2 1 6 2 2 * 5

T o l b u t a m i d e + D I D S 2 1 2 1 0 5

T o l b u t a m i d e + d i a z o x i d e 7 2 1 2 5

T o l b u t a m i d e + p i n a c i d i l 6 6 1 5 4

T o l b u t a m i d e + c r o m a k a l i m 8 4 2 1 4

I n c r e a s e s i n c e l l c a p a c i t a n c e w e r e e l i c i t e d b y i n t r a c e l l u l a r i n f u s i o n

o f a p i p e t t e s o l u t i o n w i t h a f r e e C a c o n c e n t r a t i o n o f 0 2 2 .

T h r o u g h o u t t h e r e c o r d i n g , t h e c e l l w a s c l a m p e d a t 7 0 m V i n o r d e r

t o a v o i d a c t i v a t i o n o f t h e v o l t a g e - d e p e n d e n t C a c h a n n e l s , w h i c h

w o u l d o t h e r w i s e i n t e r f e r e w i t h t h e m e a s u r e m e n t s . T h e r a t e s o f

c a p a c i t a n c e i n c r e a s e ( C m t ) w e r e m e a s u r e d o v e r t h e f i r s t 6 0 s

a f t e r e s t a b l i s h m e n t o f t h e w h o l e - c e l l c o n f i g u r a t i o n ( e x c l u d i n g t h e

i n i t i a l 1 0 s ) . T h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s w e r e u s e d : t o l b u t a m i d e ,

d i a z o x i d e , p i n a c i d i l a n d c r o m a k a l i m , 0 1 m ; g l i b e n c l a m i d e ,

1 0 0 n ; T E A , 1 0 m ; 5 - h y d r o x y d e c a n o a t e , 1 0 ; a n d D I D S ,

0 2 m . * P < 0 0 1 v s . C o n t r o l ; P < 0 0 1 v s . T o l b u t a m i d e .

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10/12

e n h a n c e m e n t o f s e c r e t i o n b y g l i b e n c l a m i d e i n P C 1 2 c e l l s

( T a y l o r e t a l . 1 9 9 9 ) s u g g e s t s t h a t s i m i l a r c h a n n e l s a l s o

p a r t i c i p a t e i n t h e c o n t r o l o f e x o c y t o s i s i n o t h e r c e l l s

e x h i b i t i n g r e g u l a t e d s e c r e t i o n .

I t s e e m s r e a s o n a b l e t o c o n c l u d e t h a t t o l b u t a m i d e - s t i m u l a t e d

e x o c y t o s i s i s a s s o c i a t e d w i t h t h e c l o s u r e o f K c h a n n e l s ,

w h i c h m e d i a t e t h e e x i t o f K f r o m t h e g r a n u l e i n t e r i o r t o

t h e c y t o p l a s m . T h i s p r o p o s a l r e s t s o n t h e f i n d i n g t h a t

r e p l a c e m e n t o f c y t o p l a s m i c K w i t h C s d o e s n o t i n t e r f e r e

w i t h t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f t o l b u t a m i d e . T h e e f f e c t s o f

t h e s u l p h o n y l u r e a s a n d t h e K c h a n n e l o p e n e r s m a y w e l l b e

m e d i a t e d b y a g r a n u l a r s u l p h o n y l u r e a r e c e p t o r , p o s s i b l y

r e l a t e d t o t h a t w h i c h i s p a r t o f t h e p l a s m a m e m b r a n e K A T P

c h a n n e l s , b u t i t s e e m s u n l i k e l y t h a t t h i s i s t h e m e c h a n i s m

b y w h i c h T E A a n d q u i n i n e a c t . T h e e f f e c t s o f t h e s e K

c h a n n e l b l o c k e r s , w h i c h a r e c h e m i c a l l y u n r e l a t e d t o t h e

s u l p h o n y l u r e a s , a r e m o r e p r o b a b l y m e d i a t e d b y d i r e c t

b i n d i n g t o t h e K c h a n n e l i t s e l f .

H o w d o e s t o l b u t a m i d e e n h a n c e e x o c y t o s i s i n A _ c e l l s ?

A s i n o t h e r n e u r o e n d o c r i n e c e l l s , t h e s e c r e t o r y g r a n u l e s o f

t h e r a t A _ c e l l b e l o n g t o a t l e a s t t w o f u n c t i o n a l l y d i s t i n c t

p o o l s : t h e r e a d i l y r e l e a s a b l e a n d t h e r e s e r v e p o o l s . I n t h e

A _ c e l l , t h e r e a d i l y r e l e a s a b l e p o o l h a s b e e n e s t i m a t e d t o

c o n t a i n 5 0 g r a n u l e s ( G r o m a d a e t a l . 1 9 9 7 ) . T h i s v a l u e

c o r r e s p o n d s t o a c a p a c i t a n c e i n c r e a s e o f 1 0 0 f F . S i n c e

t h i s v a l u e i s m u c h l e s s t h a n t h e c h a n g e n o r m a l l y o b s e r v e d i n

t h e C a - i n f u s i o n e x p e r i m e n t s ( 5 0 0 1 0 0 0 f F ) , w e c o n c l u d e

t h a t a s i g n i f i c a n t p a r t o f t h e o b s e r v e d r e s p o n s e s i s

a t t r i b u t a b l e t o t h e m o b i l i z a t i o n o f n e w g r a n u l e s f r o m t h e

r e s e r v e p o o l .

F i g u r e 9 s u m m a r i z e s a m o d e l t h a t a t t e m p t s t o i n c o r p o r a t e

b o t h t h e a c i d i c i n t r a g r a n u l a r p H a n d t h e i n v o l v e m e n t o f

t o l b u t a m i d e - s e n s i t i v e m i t o c h o n d r i a l - l i k e K A T P c h a n n e l s i n

t h e g r a n u l a r m e m b r a n e . U n d e r b a s a l c o n d i t i o n s , t h e a c t i v i t y

o f t h e V _ t y p e H _ A T P a s e l e a d s t o g r a n u l a r u p t a k e o f

p r o t o n s , a c i d i f i c a t i o n a n d t h e g e n e r a t i o n o f a p o s i t i v e

m e m b r a n e p o t e n t i a l . T h e c o n c o m i t a n t e f f l u x o f K t h r o u g h

g r a n u l a r K A T P c h a n n e l s e n s u r e s t h a t t h e m e m b r a n e

p o t e n t i a l d o e s n o t b e c o m e s o p o s i t i v e a s t o c o n s t i t u t e a n

i n s u r m o u n t a b l e b a r r i e r f o r f u r t h e r H p u m p i n g . I t s h o u l d

b e e m p h a s i z e d t h a t i n a s m a l l s t r u c t u r e l i k e t h e g r a n u l e

( d i a m e t e r , 2 0 0 n m ; v o l u m e , 4 a l ) , a c h a n g e i n p H o f 2

u n i t s ( i . e . b e t w e e n p H 7 a n d p H 5 ) c o r r e s p o n d s t o t h e n e t

u p t a k e o f o n l y 2 0 p r o t o n s a s s u m i n g n o b u f f e r i n g . A l t h o u g h

t h i s a s s u m p t i o n i s c l e a r l y u n r e a l i s t i c , t h i s e s t i m a t e

n e v e r t h e l e s s i l l u s t r a t e s t h a t t h e n e t t r a n s p o r t o f o n l y a f e w

p r o t o n s i s r e q u i r e d t o a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d p H

g r a d i e n t s . T h e e x i t o f K i s f a v o u r e d b y t h e p o s i t i v e i n t e r i o r

o f t h e g r a n u l e s . T h e i n i t i a l K c o n t e n t o f t h e g r a n u l e s w e

a t t r i b u t e t o s o m e s o r t ( o r a c o m b i n a t i o n ) o f e x c h a n g e

p r o c e s s ( e s ) , e . g . a N a K s y m p o r t o r a H K a n t i p o r t .

H o w e v e r , w e p o i n t o u t t h a t b e c a u s e o f t h e p o s i t i v e v o l t a g e

i n s i d e t h e g r a n u l e s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f K i n s i d e t h e

g r a n u l e s n e e d n o t b e p a r t i c u l a r l y h i g h . F o r e x a m p l e ,

a s s u m i n g t h a t t h e v o l t a g e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c y t o p l a s m

a n d t h e g r a n u l e i n t e r i o r i s 5 0 m V ( H u t t o n , 1 9 8 9 ) , a n d a

c y t o s o l i c K c o n c e n t r a t i o n o f 1 3 5 m , i t c a n b e e s t i m a t e d

f r o m t h e N e r n s t e q u a t i o n t h a t K w i l l f l o w o u t o f t h e

g r a n u l e p r o v i d e d t h e c o n c e n t r a t i o n i s 2 0 m .

T h i s m o d e l i s c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t m a t u r e g r a n u l e s

h a v e a n a c i d i c i n t e r i o r . I t s e e m s p o s s i b l e t h a t a n a c i d i c

g r a n u l e i n t e r i o r m a y b e r e q u i r e d n o t o n l y f o r t h e f i n a l

p r o c e s s i n g o f t h e h o r m o n e b u t a l s o t o m a k e t h e g r a n u l e s

r e l e a s e c o m p e t e n t . I n t h i s c o n t e x t i t m a y b e s i g n i f i c a n t t h a t

v a c u o l e a c i d i f i c a t i o n i s r e q u i r e d f o r t h e p a i r i n g o f t h e

S N A R E p r o t e i n s i n y e a s t ( U n g e r m a n n e t a l . 1 9 9 9 ) . I f t h i s

a l s o a p p l i e s t o t h e S N A R E p r o t e i n s i n v o l v e d i n t h e f u s i o n

b e t w e e n t h e g r a n u l e s a n d p l a s m a m e m b r a n e , t h e n i t i s e a s y

t o s e e t h e c o n n e c t i o n b e t w e e n a n a c i d i c i n t e r i o r o f t h e

g r a n u l e s a n d t h e i r p r e p a r a t i o n f o r r e l e a s e .

H o w d o t h e e f f e c t s o f t h e s u l p h o n y l u r e a s f i t i n t o t h i s

s c e n a r i o ? W e h y p o t h e s i z e t h a t a d d i t i o n o f t h e

s u l p h o n y l u r e a s l e a d s t o t h e c l o s u r e o f t h e g r a n u l a r K

c h a n n e l s . T h e s e c h a n n e l s a r e p h a r m a c o l o g i c a l l y s i m i l a r t o

t h e m i t o c h o n d r i a l K A T P c h a n n e l s i n b e i n g s e n s i t i v e t o 5 _ H D

a n d p i n a c i d i l b u t a r e d i f f e r e n t f r o m t h e K A T P c h a n n e l s i n

t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e r e d u c t i o n o f K e f f l u x m a k e s t h e

g r a n u l a r m e m b r a n e p o t e n t i a l m o r e p o s i t i v e ( c o m p a r e e f f e c t s

o n B _ c e l l m e m b r a n e p o t e n t i a l b y K A T P c h a n n e l c l o s u r e ) . T h e

i n c r e a s e i n m e m b r a n e p o t e n t i a l p r e v e n t s H p u m p i n g b y

t h e H _ A T P a s e . C o n s e q u e n t l y , o n e w o u l d e x p e c t t h e

g r a n u l e t o a l k a l i f y i n t h e p r e s e n c e o f t o l b u t a m i d e . P r e c i s e l y

h o w a l k a l i n i z a t i o n p r o m o t e s e x o c y t o s i s r e m a i n s u n c l e a r b u t

i t i s c e r t a i n l y o f i n t e r e s t t h a t t r a n s i e n t C a - d e p e n d e n t p H

j u m p s ( 1 p H u n i t a l k a l i n i z a t i o n ) h a v e b e e n r e p o r t e d t o

p r e c e d e e x o c y t o s i s i n m u c o s a l m a s t c e l l s ( W i l l i a m s e t a l .

1 9 9 9 ) a n d t h a t i n f u s i o n o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f N H

s t i m u l a t e s e x o c y t o s i s t o t h e s a m e e x t e n t a n d w i t h a s i m i l a r


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 8

F i g u r e 9 . M o d e l s u m m a r i z i n g t h e r e s u l t s

S e e t e x t f o r d e t a i l s . P C O , p o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r ; S U R ,

s u l p h o n y l u r e a r e c e p t o r ; , m e m b r a n e p o t e n t i a l .

8/7/2019 0.Glucagon

11/12

t i m e c o u r s e t o t h a t o b s e r v e d w i t h t o l b u t a m i d e ( F i g . 8 F ) .

T h e c o n c e p t p r e d i c t s t h a t a d d i t i o n o f t o l b u t a m i d e s h o u l d

p r e v e n t p r i m i n g o f n e w g r a n u l e s a s i t c o u n t e r a c t s i n t r a -

g r a n u l a r a c i d i f i c a t i o n . T h i s m a y b e t h e r e a s o n w h y

e x o c y t o s i s i n t h e A _ c e l l o f t e n p l a t e a u s w i t h i n 6 0 s a f t e r

e s t a b l i s h m e n t o f t h e w h o l e - c e l l c o n f i g u r a t i o n ( s e e F i g . 2 A ) .

T h i s w e a t t r i b u t e t o a n i n t e r r u p t e d s u p p l y o f n e w g r a n u l e s

f o r r e l e a s e . C l e a r l y i t i s n o w i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e h o w t h e

g r a n u l a r p H v a r i e s d u r i n g t h e d i f f e r e n t s t a g e s o f t h e r e l e a s e

p r o c e s s e s a n d h o w K c h a n n e l m o d u l a t o r s a f f e c t i t . W e

s p e c u l a t e t h a t t h e g r a n u l a r K A T P c h a n n e l s a r e o n l y a c t i v e

w h e n s i t u a t e d i n t h e s e c r e t o r y g r a n u l e s a n d t h a t t h e y

i n a c t i v a t e w h e n t h e g r a n u l a r m e m b r a n e i s i n s e r t e d i n t o t h e

p l a s m a m e m b r a n e , a c c o u n t i n g f o r t h e l a c k o f e f f e c t o f t h e s e

K A T P c h a n n e l b l o c k e r s i n t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s o f K A T P

c u r r e n t s ( B o k v i s t e t a l . 1 9 9 9 ) . F i n a l l y , t h e o b s e r v a t i o n t h a t

t h e i n h i b i t o r y a c t i o n s o f t h e K c h a n n e l o p e n e r s a n d

i o n o p h o r e s w e r e n o t r e s t r i c t e d t o t o l b u t a m i d e - s t i m u l a t e d

e x o c y t o s i s a n d t h a t t h e y a l s o s u p p r e s s e d e x o c y t o s i s e v o k e d

b y h i g h [ C a ] s u g g e s t s t h a t t h e t o l b u t a m i d e - s e n s i t i v e

m e c h a n i s m w e o u t l i n e h e r e i s n o t o n l y i m p o r t a n t f o r

p h a r m a c o l o g i c a l r e g u l a t i o n o f g l u c a g o n r e l e a s e b u t a l s o

f o r m s p a r t o f t h e m e c h a n i s m u t i l i z e d p h y s i o l o g i c a l l y f o r

C a - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s .

A m m

a l

a , C . , E l i a s s o n , L . , B o k v i s t , K . , L a r s s o n , O . , A s h c r o f t ,

F . M . & R o r s m a n , P . ( 1 9 9 3 ) . E x o c y t o s i s e l i c i t e d b y a c t i o n p o t e n t i a l s

a n d v o l t a g e - c l a m p c a l c i u m c u r r e n t s i n i n d i v i d u a l m o u s e p a n c r e a t i c

B - c e l l s . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 4 7 2 , 6 6 5 6 8 8 .

B a r g , S . , R e n s t r

o m , E . , B e r g g r e n , P . - O . , B e r t o r e l l o , A . ,

B o k v i s t , K . , B r a u n , M . , E l i a s s o n , L . , H o l m e s , W . E . , K

o h l e r ,

M . , R o r s m a n , P . & T h

e v e n o d , F . ( 1 9 9 9 ) . T h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f

t o l b u t a m i d e o n C a - d e p e n d e n t e x o c y t o s i s i n p a n c r e a t i c c e l l s i s

m e d i a t e d b y a 6 5 - k D a m d r - l i k e P - g l y c o p r o t e i n . P r o c e e d i n g s o f t h e

N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U S A 9 6 , 5 5 3 9 5 5 4 4 .

B o k v i s t , K . , O l s e n , H . L . , H y , M . , G o t f r e d s e n , C . F . , H o l m e s ,

W . F . , B u s c h a r d , K . , R o r s m a n , P . & G r o m a d a , J . ( 1 9 9 9 ) .

C h a r a c t e r i s a t i o n o f s u l p h o n y l u r e a a n d A T P - s e n s i t i v e K - c h a n n e l s

i n r a t p a n c r e a t i c A _ c e l l s . P f l

u g e r s A r c h i v 4 3 8 , 4 2 8 4 3 6 .

B o w m a n , E . J . , S i e b e r s , A . & A l t e r d o r f , K . ( 1 9 8 8 ) . B a f i l o m y c i n s : a

c l a s s o f i n h i b i t o r s o f m e m b r a n e A T P a s e s f r o m m i c r o o r g a n i s m s ,

a n i m a l c e l l s , a n d p l a n t c e l l s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f

S c i e n c e s o f t h e U S A 8 5 , 7 9 7 2 7 9 7 6 .

C a r p e n t i e r , J . - L . , S a w a n o , F . , R a v a z z o l a , M . & M a l a i s s e , W . J .

( 1 9 8 6 ) . I n t e r n a l i z a t i o n o f H - g l i b e n c l a m i d e i n p a n c r e a t i c i s l e t c e l l s .

D i a b e t o l o g i a 2 9 , 2 5 9 2 6 1 .

E f e n d i c , S . , E n z m a n n , F . , N y l

e n , A . , U v n

a s - W a l l e n s t e n , K . &

L u f t , R . ( 1 9 7 9 ) . E f f e c t o f g l u c o s e s u l f o n y l u r e a i n t e r a c t i o n o n

r e l e a s e o f i n s u l i n , g l u c a g o n , a n d s o m a t o s t a t i n f r o m i s o l a t e d

p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f

S c i e n c e s o f t h e U S A 7 6 , 5 9 0 1 5 9 0 4 .

E l i a s s o n , L . , R e n s t r

o m , E . ,

A m m

a l

a , C . , B e r g g r e n , P . - O . ,

B e r t o r e l l o , A . M . , B o k v i s t , K . , C h i b a l i n , A . , D e e n e y , J . T . ,

F l a t t , P . R . , G

a b e l , J . , G r o m a d a , J . , L a r s s o n , O . , L i n d s t r

o m , P . ,

R h o d e s , C . J . & R o r s m a n , P . ( 1 9 9 6 ) . P K C - d e p e n d e n t s t i m u l a t i o n o f

e x o c y t o s i s b y s u l f o n y l u r e a s i n p a n c r e a t i c c e l l s . S c i e n c e 2 7 1 ,

8 1 3 8 1 5 .

G r o d s k y , G . M . , E p s t e i n , G . H . , F a n s k a , R . & K a r a m , J . H . ( 1 9 7 7 ) .

P a n c r e a t i c a c t i o n o f t h e s u l f o n y l u r e a s . F e d e r a l P r o c e e d i n g s 3 6 ,

2 7 1 4 2 7 1 9 .

G r o m a d a , J . , B o k v i s t , K . , D i n g , W . - G . , B a r g , S . , B u s c h a r d , K . ,

R e n s t r

o m , E . & R o r s m a n , P . ( 1 9 9 7 ) . A d r e n a l i n e s t i m u l a t e s

g l u c a g o n s e c r e t i o n i n p a n c r e a t i c A _ c e l l s b y i n c r e a s i n g t h e C a

c u r r e n t a n d t h e n u m b e r o f g r a n u l e s c l o s e t o t h e L - t y p e C a

c h a n n e l s . J o u r n a l o f G e n e r a l P h y s i o l o g y 1 1 0 , 2 1 7 2 2 8 .

H u , H . , S a t o , T . , S e h a r a s e y o n , J . , L i u , S . , J o h n s , D . C . , O R o u r k e ,

B . & M a r b

a n , E . ( 1 9 9 9 ) . P h a r m a c o l o g i c a l a n d h i s t o l o g i c a l

d i s t i n c t i o n s b e t w e e n m o l e c u l a r d e f i n e d s a r c o l e m m a l K A T P c h a n n e l s

a n d n a t i v e c a r d i a c m i t o c h o n d r i a l K A T P c h a n n e l s . M o l e c u l a r

P h a r m a c o l o g y 5 5 , 1 0 0 0 1 0 0 5 .

H u t t o n , J . C . ( 1 9 8 2 ) . T h e i n t e r n a l p H a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l o f t h e

i n s u l i n - s e c r e t o r y g r a n u l e . B i o c h e m i c a l J o u r n a l 2 0 4 , 1 7 1 1 7 8 .

H u t t o n , J . C . ( 1 9 8 9 ) . T h e i n s u l i n s e c r e t o r y g r a n u l e . D i a b e t o l o g i a 3 2 ,

2 7 1 2 8 1 .

J a g g a r , J . H . , S q u i r e s , P . E . & D u n n e , M . J . ( 1 9 9 3 ) . E f f e c t s o f

h y d r o x y d e c a n o a t e o n A T P - r e g u l a t e d p o t a s s i u m i o n c h a n n e l s i n

i n s u l i n - s e c r e t i n g c e l l s . B i o c h e m i c a l S o c i e t y T r a n s a c t i o n s 2 1 , 4 2 7 S .

J o s e f s e n , K . , S t e n v a n g , J . P . , K i n d m a r k , H . , B e r g g r e n , P . - O . ,

H o r n , T . , K j r , T . & B u s c h a r d , K . ( 1 9 9 6 ) . F l u o r e s c e n c e -

a c t i v a t e d c e l l s o r t e d r a t i s l e t c e l l s a n d s t u d i e s o f t h e i n s u l i n

s e c r e t o r y p r o c e s s . J o u r n a l o f E n d o c r i n o l o g y 1 4 9 , 1 4 5 1 5 4 .

M a r t e l l , A . E . & S m i t h , R . M . ( 1 9 7 1 ) . C r i t i c a l S t a b i l i t y C o n s t a n t s ,

v o l . 1 , A m i n o A c i d s , a n d v o l . 2 , A m i n e s . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k .

N e h e r , E . & M a r t y , A . ( 1 9 8 2 ) . D i s c r e t e c h a n g e s o f t h e c e l l

c a p a c i t a n c e o b s e r v e d u n d e r c o n d i t i o n s o f e n h a n c e d s e c r e t i o n i n

b o v i n e a d r e n a l c h r o m a f f i n c e l l s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l

A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U S A 7 9 , 6 7 1 2 6 7 1 6 .

O r c i , L . , R a v a z z o l a , M . , A m h e r t , M . , M a d s e n , O . , P e r r e l e t , A . ,

V a s s a l l i , J . D . & A n d e r s o n , R . G . ( 1 9 8 6 ) . C o n v e r s i o n o f p r o i n s u l i n

t o i n s u l i n o c c u r s c o o r d i n a t e l y w i t h a c i d i f i c a t i o n o f m a t u r i n g

s e c r e t o r y v e s i c l e s . J o u r n a l o f C e l l B i o l o g y 1 0 3 , 2 2 7 3 2 2 8 1 .

P a c e , C . S . & S a c h s , G . ( 1 9 8 2 ) . G l u c o s e - i n d u c e d p r o t o n u p t a k e i n

s e c r e t o r y g r a n u l e s o f _ c e l l s i n m o n o l a y e r c u l t u r e . A m e r i c a n J o u r n a l

o f P h y s i o l o g y 2 4 2 , C 3 8 2 3 8 7 .

R a u n , K . , H a n s e n , B . S . , J o h a n s e n , N . L . , T h g e r s e n , H . ,

M a d s e n , K . , A n k e r s e n , M . & A n d e r s e n , P . H . ( 1 9 9 8 ) .

I p a m o r e l i n , t h e f i r s t s e l e c t i v e g r o w t h h o r m o n e s e c r e t a g o g u e .

E u r o p e a n J o u r n a l o f E n d o c r i n o l o g y 1 3 9 , 5 5 2 5 6 1 .

R o r s m a n , P . & T r u b e , G . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m a n d d e l a y e d p o t a s s i u m

c u r r e n t s i n m o u s e p a n c r e a t i c _ c e l l s u n d e r v o l t a g e - c l a m p c o n d i t i o n s .

J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 3 7 4 , 5 3 1 5 5 0 .

S a t o , T . , O R o u r k e , B . & M a r b

a n , E . ( 1 9 9 8 ) . M o d u l a t i o n o f

m i t o c h o n d r i a l A T P - d e p e n d e n t K c h a n n e l s b y p r o t e i n k i n a s e C .

C i r c u l a t i o n R e s e a r c h 8 3 , 1 1 0 1 1 4 .

S m i t h , P . A . , P r o k s , P . & M o o r h o u s e , A . ( 1 9 9 9 ) . D i r e c t e f f e c t s o f

t o l b u t a m i d e o n m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n , i n t r a c e l l u l a r C a a n d

e x o c y t o s i s i n p a n c r e a t i c _ c e l l s . P f l

u g e r s A r c h i v 4 3 7 , 5 7 7 5 8 8 .

T a y l o r , S . C . , C a r p e n t i e r , E . , R o b e r t s , M . L . & P e e r s , C . ( 1 9 9 9 ) .

P o t e n t i a t i o n o f q u a n t a l c a t e c h o l a m i n e s e c r e t i o n b y g l i b e n c l a m i d e :

e v i d e n c e f o r a n o v e l r o l e o f s u l p h o n y l u r e a r e c e p t o r s i n r e g u l a t i n g

t h e C a s e n s i t i v i t y o f e x o c y t o s i s . J o u r n a l o f N e u r o s c i e n c e 1 9 ,

5 7 4 1 5 7 4 9 .

T i a n , Y . - M . , J o h n s o n , G . & A s h c r o f t , S . J . H . ( 1 9 9 8 ) . S u l f o n y l u r e a s

e n h a n c e e x o c y t o s i s f r o m p a n c r e a t i c _ c e l l s b y a m e c h a n i s m t h a t

d o e s n o t i n v o l v e d i r e c t a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C . D i a b e t e s 4 7 ,

1 7 2 2 1 7 2 6 .

U n g e r m a n n , C . , W i c k n e r , W . & X u , Z . ( 1 9 9 9 ) . V a c u o l e a c i d i f i c a t i o n

i s r e q u i r e d f o r t r a n s - S N A R E p a i r i n g , L M A 1 r e l e a s e , a n d

h o m o t y p i c f u s i o n . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s

o f t h e U S A 9 6 , 1 1 1 9 4 1 1 1 9 9 .


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 1 9

8/7/2019 0.Glucagon

12/12

W i l l i a m s , R . M . , Z i p f e l , W . R . & W e b b , W . W . ( 1 9 9 9 ) . G r a n u l a r p H

j u m p s p r e c e d i n g e x o c y t o s i s i m a g e d d u r i n g m u c o s a l m a s t c e l l

s e c r e t i o n . B i o p h y s i c a l J o u r n a l 7 6 , A 3 9 7 .

Y o s h i m o r i , T . , Y a m a m o t o , A . , M o r i y a m a , Y . , F u t a i , M . & T a s h i r o ,

Y . ( 1 9 9 1 ) . B a f i l o m y c i n A 1 , a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f v a c u o l a r - t y p e

H ( + ) - A T P a s e , i n h i b i t s a c i d i f i c a t i o n a n d p r o t e i n d e g r a d a t i o n i n

l y s o s o m e s o f c u l t u r e d c e l l s . J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 6 6 ,

1 7 7 0 7 1 7 7 1 2 .

A c k n o w l e d g e m e n t s

W e w o u l d l i k e t o t h a n k J e t t e M l l e r a n d B i r g i t S . H a n s e n f o r t h e

p i t u i t a r y s o m a t o t r o p h s a n d J e n s P e t e r S t e n v a n g f o r t e c h n i c a l

a s s i s t a n c e . T h i s s t u d y w a s s u p p o r t e d b y t h e J u v e n i l e D i a b e t e s

F o u n d a t i o n I n t e r n a t i o n a l , t h e K n u t a n d A l i c e W a l l e n b e r g s

S t i f t e l s e , t h e S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l ( g r a n t s 8 6 4 7 ,

1 2 2 3 4 a n d 1 3 1 4 7 ) , t h e S w e d i s h F o u n d a t i o n f o r S t r a t e g i c R e s e a r c h ,

t h e S w e d i s h D i a b e t e s A s s o c i a t i o n , t h e A a g e a n d L o u i s e H a n s e n

F o u n d a t i o n a n d t h e N o v o N o r d i s k F o u n d a t i o n .

C o r r e s p o n d i n g a u t h o r

J . G r o m a d a : L a b o r a t o r y o f I s l e t C e l l P h y s i o l o g y , I s l e t D i s c o v e r y

R e s e a r c h , B u i l d i n g 1 K S . 1 8 , N o v o N o r d i s k A S , N o v o A l l

e ,

D K _ 2 8 8 0 B a g s v a e r d , D e n m a r k .

E m a i l : j l g @ n o v o . d k


J . P h y s i o l . 5 2 7 . 1

1 2 0

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