Embed Size (px)
Citation preview
1
1 ALKOHOLNA FERMENTACIJA
Alkoholna fermentacija ili kako se često naziva alkoholno vrenje biokemijski je proces
transformacije monosaharida (glukoza, fruktoza) u alkohol i ugljični dioksid posredstvom
kvasaca i uz sudjelovanje cijelog niza enzima. Prvu formulu kemijskog procesa alkoholne
fermentacije postavio je Gay-Lussac, 1815. godine:
C6H12O6 = 2 CH3 CH2OH + CO2
Liebig – 1845. godine postavlja kemijsku teoriju – prema kojoj je fermentacija čisto
kemijski proces, «aktivnost kvasca nije rezultat njegovog života, već naprotiv njegovog
raspadanja».
L. Paster- postavlja biološku teoriju - smatra da proces alkoholne fermentacije nije
rezultat raspadanja kvasca, već naprotiv rezultat života i razmnožavanja kvasaca «bez
života nema fermentacije».
Djelujući preko raznih enzima, koje je 1895. godine otkrio Buchner, kvasac je stvarni
nosilac svih reakcija, koje predstavljaju manifestaciju njegovih životnih funkcija pod
određenim aerobnim i anaerobnim uvjetima. Danas znamo da se alkoholna fermentacija
odvija u kvašćevoj stanici, posredstvom grupe enzima zajedničkog naziva zimaza. Budući
da su kvasci obrađeni u kolegiju Mikrobiologija mošta i vina, ovdje ćemo samo podsjetiti
da su za fermentaciju značajni kvasci iz grupe Saccharomyces sensu stricto (S. cerevisiae,
S. paradoxus, S. bayanus i S. pastorianus). Najznačajniji među njima je svakako S.
cerevisiae koji se smatra „glavnim“ vinskim kvascem.
Pod aerobnim uvjetima transformacija šećera ide do kraja, tj. stvara se ugljični
dioksid i voda i oslobađa velika količina energije. To je s energetskog gledišta vrlo
ekonomičan proces jer malom pretvorbom šećera, kvasac osigurava veliku količinu
energije za svoj razvoj.
C6H12O6 + 6 O2 = 6 CO2 + 6 H2O + 688 kcal
2
Alkoholna fermentacija s druge strane predstavlja biokemijski proces razgradnje
šećera u anaerobnim uvjetima tj. bez prisutnosti kisika, koji se odigrava u živoj stanici
kvasca. Krajnji produkti ovih reakcija je etanol i ugljični dioksid. Pod anaerobnim
uvjetima transformacija šećera ne ide do kraja već samo do formiranja alkohola (etanola) i
ugljičnog dioksida, a pri tome se oslobađa samo 56 kcal/mol. S energetskog stanovišta taj
proces nije tako ekonomičan, kao disanje i ne daje dovoljno energije za razmnožavanje
kvasca. Zato da bi osigurao potrebnu energiju kvasac mora fermentirati veliku količinu
šećera, što je od velikog praktičnog značaja.
C6H12O6 = 2 C2H5OH + 2 CO2 + 56 kcal
Alkoholnoj fermentaciji podliježu monosaharidi s 6 atoma ugljika (glukoza, fruktoza,
manoza). Većina kvasaca podjednako fermentira glukozu i fruktozu, dok manozu teže
fermentiraju i to tek nakon prethodna dva šećera. Disaharidi (saharoza, maltoza, laktozai
dr.) u pravilu ne fermentiraju osim u slučaju kada su kvasci u stanju sintetizirati
odgovarajuće hidrolitičke enzime (saharazu i invertazu i dr.), a isti je slučaj i s
trisaharidima (rafinoza). Međutim pentoze (ksiloza i arabinoza) nije u stanju fermentirati
niti jedan kvasac.
Biokemijski proces alkoholne fermentacije ili vrenja nije tako jednostavan kako je
prikazan u formuli Gay-Lussac-a. Ovaj složeni biokemijski proces možemo podijeliti na
dvije faze: prvo ide razgradnja glukoze do pirogrožđane kiseline (piruvata), a taj skup
reakcija zovemo glikoliza, zatim slijedi alkoholna fermentacija.
Glikoliza (slika 1) je skup reakcija koje kataliziraju mnogobrojni enzimi: važan korak
je produkcija gliceraldehid-3-fosfata i to je endergoni proces, jer troši energiju u obliku 2
molekule ATP. Slijed reakcija nakon toga dovodi do produkcije pirogrožđane kiseline koji
je egzergoni proces jer daje energiju u obliku 4 molekule ATP. Kad je završen proces
stvaranja pirogrožđane kiseline, tj. glikoliza, do tog je stupnja, anaerobna razgradnja
šećera, jednaka aerobnoj razgradnji (disanju). U aerobnim uvjetima zatim dolazi do
dekarboksilacije piruvata i stvaranja acetila koji se, vezan na koenzimom A, dalje
razgrađuje u ciklusu limunske kiseline (Krebs-ovim ciklusom) i oksidativnoj fosforilaciji.
Konačni rezultat ovih oksidacijskih reakcija je stvaranje CO2, H2O i 38 ATP.
3
Trošenje i stvaranje ATP u glikolizi _________________________________________________________________
Reakcija Promjena ATP po glukozi _________________________________________________________________ Glukoza glukoza -6- fosfat - 1
Fruktoza -6 - fosfat fruktoza - 1,6- difosfat - 1
21,3 – difosfoglicerat 2,3 – fosfoglicerat + 2
2- fosfoenolpiruvat 2- piruvata + 2
_________________________________________________________________
neto + 2
Slika 1: Glikoliza.
4
Tek kad se glikolizom stvori veća količina pirogrožđane kiseline započinje „prava“
alkoholna fermentacija. Ona dakle kreće od pirogrožđane kiseline i to tako da najprije
dođe do dekarboksilacije pirogrožđane kiseline u acetaldehid, a zatim redukcijom
stvorenog acetaldehida nastaje alkohol etanol, uz istovremenu oksidaciju NADH2 u NAD,
kako je niže prikazano.
Pirogrožđana kiselina acetaldehid + CO2
Acetaldehid + NADH2 etanol + NAD+
Reakcija alkoholnog vrenja (slika 2), kvascu u stvari služi za oksidaciju NADH2 u
NAD+, tj. za obnavljanje ovog posljednjeg sastojka, kako bi se nesmetano mogla odvijati
glikoliza. Naime, NAD+ je akceptor vodika u transformaciji gliceraldehid-3-fosfata u 1,3
difosfoglicerat i daljnje reakcije glikolize ne teku ako se pojavi manjak ovog koenzima.
Etanol predstavlja zapravo krajnji nusproizvod vrenja i kao takav ne sudjeluje u daljnjem
metabolizmu. Obnavljanje NAD+ moguće je i preko alternativnog puta, redukcijom
dihidroksiaceton-fosfata i 1,3 difosfoglicerata.
Slika 2: Alkoholna fermentacija
Drugi oblik fermentacije se pojavljuje kada nema dovoljno na raspolaganju
acetaldehida za obnavljanje NAD+. To može biti posljedica endogenih i egzogenih faktora:
npr.SO2 koji se veže s dijelom acetaldehida i na taj način se reducira, odnosno sprečava
5
daljnje reakcije acetaldehida. U tom slučaju obnavljanje NAD je moguće reakcijama
prikazanim u lijevom dijelu slike br. 3, a konačni produkt je u tom slučaju glicerol. Ako se
SO2 nalazi u velikoj količini, proizvodnja etanola je potpuno blokirana i proizvodi
fermentacije su jedino glicerol, acetaldehid i CO2. SO2 može biti također proizveden, u
većoj ili manjoj količini ali sa istim efektima, pomoću kvasaca redukcijom sulfata. Ovo su
mehanizmi kojima se proizvodi acetaldehid (kao i glicerol) u vinu. Veća količina
acetaldehida vinu daje određenu notu oksidiranosti odnosno izvjetrenosti.
Glukoza
Glukoza-6-fosfat
Fruktoza-6-fosfat
Fruktoza-1,6-difosfat
Dihiroksiacetonfosfat Gliceraldehid-3-fosfat NADH2 NAD
NAD NADH2
Glicerol-fosfat 1,3 difosfoglicerat
Glicerol 3-fosfoglicerat
2-fosfoglicerat CO2 Fosfoenolpiruvat
Acetaldehid Piruvat
Slika 3: Drugi oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i acetaldehida.
Treći oblik fermentacije prikazuje slika 4, a predstavlja shemu formiranja etanola,
octene kiseline, glicerola i CO2. Biološka interpretacija ovog procesa je objašnjena
prisustvom jedne dehidrogenaze koja skreće transformaciju acetaldehida od njegovog
normalnog puta u alkoholnoj fermentaciji, izazivajući stvaranje etanola i octene kiseline.
6
Glukoza
Glukoza-6-fosfat
Fruktoza-6-fosfat
Fruktoza-1,6-difosfat
Dihiroksiacetonfosfat Gliceraldehid-3-fosfat
NADH2 NAD
NAD NADH2
Glicerol-fosfat 1,3 difosfoglicerat
Glicerol 3-fosfoglicerat
2-fosfoglicerat
Etanol octena kiselina CO2 NAD NADH2 Fosfoenolpiruvat
Acetaldehid Pirogrožđana
kiselina
Slika 4.: Treći oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i octene kiseline
Slika 5: Četvrti oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i piruvata.
7
Četvrti oblik fermentacije (gliceropiruvatno vrenje) prikazuje produkciju glicerola i
pirogrožđane kiseline. Do ove forme alkoholne fermentacije dolazi kada u sredini nema
dovoljno dušika (pomanjkanje dušika) ili kada se iz nekog razloga blokira piruvična
dekarboksilaza, koja katalizira pretposljednju reakciju. Do ovog oblika alkoholne
fermentacije obično dolazi na početku fermetacije, kada još nema dovoljne kolkičine
pirogrožđane kiseline. U tom slučaju pirogrožđana kiselina predstavlja ishodišni materijal
za formiranje sekundarnih sastojaka alkoholne fermentacije, kako je i prikazano na slici 5..
1.1 SEKUNDARNI PROIZVODI ALKOHOLNE FERMENTACIJE
Tijekom trajanja fermentacije kvasac producira osim etanola i CO2, (primarni
proizvodi) u malim količinama i druge sastojke koje nazivamo sekundarni proizvodi.
Fermentacijom 100 g glukoze nastaje:
Etanol - 48,4 g
CO2 - 46,6 g
Glicerin - 3,3 g
Jantarna kis. - 0,6 g
Suhi kvasac - 1,2 g
Octena kiselina
Acetaldehid
Piruvična kiselina
Aceton
Butandiol
Glavni sastojak među sekundarnim sastojcima je glicerol, tako da količina ovog
viševalentnog alkohola odgovara količini svih ostalih sekundarnih sastojaka, kako je i
prikazano sljedećim odnosom:
8
A- octena kiselina 2A + B + 2M + H + S = ∑ = G
B- butilenglikol
M- aceton
H- acetaldehid
S- jantarna kiselina
G- glicerol
Sekundarni produkti (slika 6) koji se javljaju kao posljedica gore navedenih reakcija
služe kao ishodište brojnih drugih spojeva koji također u manjoj mjeri nastaju tijekom
alkoholnog vrenja.
Jantarna kiselina nastaje oksidacijom glutaminske kiseline, preko α-keto glutaminske
kiseline kao intermedijarnim spojem. U anaerobnim uvjetima može nastati iz dvije
molekule octene kiseline, ili redukcijom pirogrožđane kiseline preko oksaloctene, jabučne i
fumarne kiseline.
9
Slika 6: Shema formiranja sekundarnih sastojaka.
10
1.2 OSTALI SASTOJCI
Ostali sastojci, među koje spadaju i viši alkoholi, nisu pravi proizvodi fermentacije jer
ne nastaju direktno od glukoze, već transformacijom različitih sastojaka u metabolizmu
kvasaca.
Formiraju se i drugi sastojci u malim količinama koji su produkt metaboličke aktivnosti
kvasaca, a ne kemijske transformacije sastojaka u moštu. Količina ovih sastojaka jako je
važna i značajno utječe na senzoriku vina, u prvom redu na miris vina. Radi toga stvaraju
se posebni sojevi selekcioniranih kvasaca koji proizvode veće količine ovih sastojaka.
Razvojem analitičkih metoda moguće je determinirati ove spojeve i tako istraživanja
usmjeriti prema njihovoj većoj produkciji. Među najznačajnije sastojke spadaju viši
alkoholi, hlapljivi esteri i više masne kiseline.
Viši alkoholi
Među tzv. ostalim sastojcima, viši alkoholi predstavljaju kvantitativno najzastupljeniju
grupu sastojaka. Nastaju aktivnošću kvasaca i to procesima deaminacije i dekarboksilacije,
iz aminokiselina u moštu - katabolički, kao i iz aminokiselina sintetiziranih od strane
kvasaca (anabolički). Imaju značajnu ulogu u formiranju arome vina, a količinski se kreću
u rasponu od 200 do 400 mg/L. Preko ove granice mogu stvarati nepoželjne karakteristike
vina.
Katabolički Anabolički
Aminokiseline Šećeri
Transaminacija Ferm. i biosinteza
Aminokiseline
Ketokiseline
Dekarboksilacija i redukcija
Viši alkoholi
11
1.3 FAKTORI O KOJI UTJEČU NA ALKOHOLNU FERMENTACIJU
Kvasac Kvasci su posebno obrađeni u kolegiju „Mikrobiologija mošta i vina“, a ovdje ćemo
pripomenut samo značaj pojedinih sojeva Saccharomyces koji imaju širok raspon
sposobnosti da svladavaju teške uvjete fermentacije (ekstremne temperature koje mogu biti
od 5 do 35 °C), visoke alkohole, niske pH vrijednosti, i dr.. O sojevima kvasaca u
mnogome ovisi aromatski profil i kvaliteta vina, pa izborom kvasca određujemo tijek
alkoholne fermentacije i konačnu kvalitetu vina. Alkoholna fermentacija je glavna
aktivnost kroz koju kvasci pozitivno doprinose aromi vina. Oni to čine raznim
mehanizmima:
• korištenjem sastojaka iz mošta,
• proizvodnjom etanola i drugih otapala koji doprinose ekstrakciji aroma iz krutih
dijelova grožđa,
• proizvodnjom enzima koji transformiraju neutralne sastojke iz grožđa u mirisne
sastojke,
• proizvodnjom više stotina aromatskih sastojaka (alkoholi, esteri i dr.), i
• autolizom mrtvih stanica kvasca (Cole i sur., 1997; Lambrechts i sur., 2000).
U vinima je do sada identificirano više od 1 000 hlapljivih spojeva, a više od 400 tih
spojeva produkt je aktivnosti kvasca u fermentaciji (Nykänen, 1986). Mnogobrojna su
istraživanja koja se odnose na ulogu različitih sojeva Saccharomyces cerevisiae i utjecaja
na varijabilnost proizvodnje sekundarnih sastojaka. Karakteristike sojeva su različita
produkcija estera, viših alkohola, acetona, acetaldehida, sumpornog dioksida i
sumporovodika (Fleet, 1993). Među najznačajnije sastojke koji su direktno produkt
alkoholne fermentacije, a vrlo su bitni u formiranju senzornih karakteristika vina, prema
Usseglio – Tomasset (1992), spadaju viši alkoholi, hlapljivi esteri i masne kiseline kratkog
lanca C6 do C10.
Temperatura
Temperatura je od velikog utjecaja na tijek, dinamiku i kemijske procese alkoholne
fermentacije. Previsoka, kao i preniska temperatura može biti jedan od razloga zastoja
12
fermentacije. Postoji sinergistički efekt između visoke temperature fermentacije i sadržaja
alkohola: slaba otpornost stanica na etanol vodi ka visokom mortalitetu. Mnogi sojevi
kvasaca Saccharomyces cerevisiae mogu fermentirati relativno dobro do l2°C, ali niže
temperature sprječavaju pravilno vođenje alkoholne fermentacije, jer je metabolička
aktivnost kvasaca usporena nižim temperaturama (Rosi, 2000). Poznato je da se pri višim
temperaturama fermentacije formiraju veće količine viših alkohola, koji su glavni
predstavnici tzv. sekundarnih aroma vina. Smatra se da količina do 400 mg/L pozitivno
utječe na aromu, dok iznad te količine mogu ispoljavati i negativne karakteristike vina
(miris na petrolej). S druge strane pri nižim temperaturama fermentacije (vidi Vinarstvo I i
III) stvaraju se finije aromatske karakteristike vina i formira veća količina hlapljivih estera
i viših masnih kiselina.
Kisik
Kisik ima važnu ulogu u alkoholnoj fermentaciji. Potreban je za pravilan razvoj
kvasaca i za održavanje dobre životnosti (viabilnosti) stanice, a što je preduvjet da se
fermentacija provede do kraja. Kisik je uključen u sintezu lipida, kao što su steroli i
nezasićene masne kiseline, od kojih je izgrađena stanična membrana kvasaca i koji joj
osiguravaju bolju otpornost na alkohol (Kirsop, 1978). Koncentracija sterola mora biti
optimalna kako bi se osigurala cjelovitost membrane i aktivnost transmembranskih enzima
kao što su permeaze. Ako ove permeaze ne funkcioniraju dolazi do acidifikacije i stanice
ugibaju (graf 1).
Graf 1: Funkcija stanične membrane kao omotača i regulatora intracelularnog pH.
Minimalne potrebe za O2 u cilju optimalnog provođenja fermentacije su između 5 -10
mg /L (Sablayrolles i sur., 1986). Na početku fermentacije, kisik se vrlo brzo potroši od
13
strane enzima (polifenoksidaza i ako je prisutna plijesan od lakaza ) i oksidativnih kvasaca.
Kvasci se također dosta razlikuju u pogledu potreba prema kisiku, i studije su pokazale
njihovu različitost u sposobnosti fermentiranja u nedostatku kisika. Njihove razlike se
iskazuju u:
- pogledu maksimalnog fermentativnog dijela, koji se direktno reflektira u
sposobnosti razvoja kvasaca u uvjetima ekstremnog nedostatka kisika.
- pogledu efekta dodavanja manje količine O2, nakon jedne trećine fermentacije, za
vrijeme trajanja fermentacije.
Sljedeći grafovi pokazuju efekt dodavanja kisika u mošt, za dva različita soja u pogledu
njihovog maksimalnog fermentativnog dijela i efektivnosti dodavanja:
Graf 2: Kontrola fermentacije – bez dodavanja O2 (S2 - produžena fermentacija)
Fermentacijska stopa (g/l.h)
Vrijeme (h)
Graf 3: Dodan 1 mg/L kisika.
14
Fermentacijska stopa (g/l.h)
Vrijeme (h)
Graf 4: Dodano 7 mg/L kisika
Dodatkom čak i manje količine kisika, kako vidimo iz grafa 3, poboljšana je
fermentacija za više od 10 % te se na taj način može spriječiti predugačka, otegnuta
fermentacija (Graf 2). Dodavanje 7 mg/L kisika, kako pokazuje graf 4 daje još učinkovitije
rezultate.
Ako je dodatak O2 pažljivo kontroliran, u smislu dodavanja u pravo vrijeme i u
optimalnoj količini, može se spriječiti produžena - predugačka fermentacija ili čak i zastoj
vrenja, neovisno o izboru soja kvasca.
Idealno vrijeme dodavanja kisika je u sredini fermentacije ili općenito kada je
specifična gustoća 1.050. To je faza kada je kvasac došao do kraja svoje faze
razmnožavanja i fermentativna aktivnost je najviša. Rizik od oksidacije mošta je
minimalan i korištenje kisika od strane enzima je zanemarivo. U ovom slučaju kvasac
profitira jer se u potpunosti snabdijeva s kisikom u usporedbi sa dodavanjem na početku. U
pogledu količine kisika, dodatak od 5 do 10 mg/L je dovoljan, za sve potrebe kvasca.
Da bi dodali oko 6 mg/L kisika, treba mošt pretakati 1,5 – 2 volumena fermentacijskog
tanka. Ova metoda dodavanja je jednostavna, ali se precizno ne može regulirati dodavanje
kisika jer ovisi o protočnosti pumpe, veličini tanka, vremenu zadržavanja mošta u tanku u
15
koji se prepumpava i o visini sa koje mošt pada u tank (Sablayrolles et al., 1998). Precizniji
način je dodavanjem O2 pomoću difuzera.
SO2
Moderna proizvodnja vina zahtjeva primjenu određene količine SO2, međutim to ne
predstavlja neki posebni problem u fermentaciji mošta, budući da su sojevi Saccharomyces
cerevisiae relativno otporni na SO2 (naravno ovisi o sojevima). Djelotvornost SO2 vezana
je za pH: viši pH, slabija aktivnost i obratno. Znači kod višeg pH, mošt je pogodniji za
kontaminaciju i razvoj štetnih sojeva. U tom slučaju doze SO2 moraju biti prilagođene
pojedinačnim slučajevima i zajedno sa kontroliranjem temperature, preventivno treba
sprječavati razvoj divlje mikrof1ore. Međutim ne treba niti pretjerivati s dozama SO2,
budući da, kako smo vidjeli u drugom obliku fermentacije, SO2 može utjecati na
akumulaciju veće količine acetaldehida u vinu.
Dušik Asimilacioni, pristupačni dušik, sastoji se od amonijačnog oblika dušika i α.-amino
dušika (slobodne amino kiseline, osim prolina kojeg kvasci u fermentaciji mošta ne
asimiliraju) i predstavlja hranu za kvasac, koja ima najveći utjecaj na brzinu alkoholne
fermentacije. (Agenbach, 1977; Bezenger i sur., 1987). Dušik je esencijalni element
potreban za sintezu proteina, pogotovo onih koje su odgovorni za transport šećera.
100 200 300 400 500
Asimilacioni dušik (mg/L)
Graf 5: Maximum fermentacijskog tempa izražen kao (dCO2/ dt) max, u odnosu na početni
sadržaj dušika u moštu (Lalemand).
16
Nedostatak dušika u moštu limitira razmnožavanje kvasaca i time brzinu fermentacije
(graf 5) (Bely i sur., 1990). Zbog niže koncentracije dušika u moštu, veći je rizik od
usporene fermentacije. Općenito, moštevi sadrže između 80 i 400 mg/L, a granica kada je
dušik u nedostatku je između 150-180 mg/L (Henschke i sur.,1993). Nedostatak dušika u
moštu također zaustavlja sintezu proteina koju provodi kvasac. Ova inaktivacija rezultira
smanjenom aktivnošću u transportu šećera, što povećava rizik od zastoja fermentacije
(Basturia i sur., 1986). Nedostatak dušika u moštu može, kako je prikazano na sljedećoj
slici, voditi u pojačanu tvorbu H2S-a, od strane kvasca.
Slika 7: Formiranje H2S (Lallemand).
Novija istraživanja pokazuju da su različiti sojevi kvasaca, testirani u moštevima u
kojima je nedostajalo dušika (100 mg/L asimilacijskog dušika) imali signifikantno različite
potrebe za dušikom (Jiranek et al.. 1991; Manginot et al.. 1998; Julien et al.. 2000). Radi
toga je važno odrediti koncentraciju asimilacijskog dušika, prije izbora soja za inokulaciju.
Formalin titracija je brza i točna metoda koja se može koristiti u podrumima (potreban je
samo pH-metar). Preporučljiva prosječna količina dušika kreće se oko 30 g/hl
asimilacijskog dušika, a količina koja se dodaje ovisna je o početnoj koncentraciji dušika u
moštu.
Mikrohranjiva
Riječ "mikrohranjiva" u enologiji podrazumijeva sve one tvari koje koriste
mikroorganizmi mošta i vina kao hranu, a prisutne su u manjim količinama. Medu njima
najvažniji su mineralna hranjiva i vitamini. Njihova uloga često je indirektna: za razliku od
17
dušika, ugljika, sumpora i fosfora koji su uključeni u strukturalne funkcije, mineralni
elementi i vitamini često djeluju kao ko-enzimi, čineći mogućim aktivnost proteina ili
imaju aktivnu ulogu u transportnom sistemu kroz membrane. Saznanja o stvarnoj
bioaktivnosti ovih elemenata za sada su nedovoljno istražena: ovi elementi često su vezani
na ostale spojeve u moštu, tako da ih mikroorganizmi ne mogu asimilirati.
Vitamini
Neki vitamini imaju posebno važnu ulogu u procesu alkoholne fermentacije.
Biotin - potiče stvaranje estera i viših alkohola i poboljšava životnost stanica pri kraju
fermentacije. Njegov nedostatak signifikantno smanjuje prirast stanica.
Pantotenat – sudjeluje u metabolizmu lipida, ima pozitivan efekt na organoleptička
svojstva smanjujući rizik od proizvodnje H2S-a i hlapivih kiselina.
Tiamin - čija je uloga bila predmetom mnogih studija, ima važnu ulogu i njegov
nedostatak može voditi zastoju vrenja. Njegov nedostatak često može biti uzrokovan
lošijim pred-fermentativnim tretmanom kao što su dodavanje SO2 i temperaturna kontrola
(Peynaud i sur., 1957; Oumac i sur., 1970). Tiamin ima svojstvo brzog vezanja sa SO2,
poslije kojeg više nije dostupan kvascima. Dokazano je da kvasci u normalnim
koncentracijama u moštu (106 stanica), mogu u roku 2-3 sata potrošiti sav tiamin, jer ga
mogu akumulirati u većim količinama. Osim toga, divlji ne-Saccharomyces kvasci,
ponekad iskoriste ovaj vitamin prije nego sami Saccharomyces cerevisiae kvasci.
Anorganske soli
Ostala hranjiva kao što su magnezij, cink i kalij imaju isto vrlo važnu ulogu u ishrani
kvasaca.
Magnezij - ima specifičnu ulogu i od naročite je važnosti u kontroliranju rasta stanica i
u metabolizmu kvasaca. On daje bolju otpornost na temperaturu i otpornost na viši
18
osmotski pritisak. Uključen je u održavanje stanične cjelovitosti stabilizirajući nukleinske
kiseline, polisaharide, lipide i proteine (Walker, 1994). Magnezij dodatno povećava
proizvodnju etanola (Qombek, 1986).
Magnezij ima središnju ulogu u metabolizmu fermentacije: on aktivira brojne encime
glikolize (npr. piruvat karboksilazu, fosfat transferazu i neke dekarboksilaze), stimulira
sintezu masnih kiselina, regulira asimilaciju drugih iona, aktivira ATP membrane koje su
odgovorne za aktivni transportni sistem (Jones i sur., 1984). U uvjetima nedostatka
magnezija, kvasac stvara više octene kiseline i manju količinu alkohola (slabija
iskoristivost kvalitete grožđa). Pored toga magnezij je uključen u regulaciju funkcije
membrane, u održavanju integriteta i permeabilnosti membrane, regulirajući transport
drugih kationa (K+/H+ i Na+/H+ transportni sistem). Magnezij ima glavnu ulogu u kontroli
rasta stanica, kao i u mehanizmu pupanja kvasca. Kvasac ima veliku potrebu za
magnezijem (10 x više nego za natrijem) i količina magnezija u plazmi membrane je 20 x
veća nego sadržaj kalcija. Magnezij za svoju normalnu funkcionalnost treba mangan.
Optimalna količina magnezija za kvasce je 50-100 mg/L, dok je minimalna količina 40
mg/L. Studije su pokazale da se sadržaj Mg ++ u moštu kreće od 40 do 160 mg/I, prosječno
90 mg/L (Cabanis i sur., 1999). Previsoke količine magnezija mogu imati i inhibirajući
efekt. Viši sadržaj magnezija osigurava sojevima Saccharomyces cerevisiae veću otpornost
na alkohol i na više temperature, povećava životnost (viabilnosti) za 20 pa do čak 60 i više
%, kod eventualnih stresnih situacija (npr. visoki sadržaj alkohola).
Nije značajan samo ukupni sadržaj Mg++, jako važan i postojeći odnos između
magnezija i ostalih kationa antagonista. Asimilacija magnezija smanjuje se sa povećanjem
koncentracije kalija, pa i manje količine K+ (manje od 800 mg/I) imaju inhibirajući efekt.
Pored toga značajna je i količina Ca++, čija koncentracija u groždanom - moštu varira od 30
do 200 ppm. Oni mogu reducirati dostupnost magnezija i na taj način utjecati na njegovu
biološku funkciju.
Cink - je isto vrlo važan, jer je koenzim mnogih enzima (alkohol dehidrogenaze i dr.) i
ko-faktor emzima glikolize. Njegov nedostatak nepovoljno djeluje na rast stanica, kao i na
fermentativnu aktivnost. Ima pozitivan utjecaj na sintezu riboflavina, na aktivaciju fosfata i
19
sintezu proteina. Daje kvascima bolju otpornost na alkohol i ima važnu ulogu u formiranju
estera.U nedostatku Mn++ čak i mala količina Zn++ je toksična za kvasce.
Kalij – ne spada u mikroelemente, jer mošt sadrži daleko veću količinu K+ od ostalih
elemenata, ali ima ključnu ulogu u protoku ostalih iona. Koncentracije kalija kreću se u
rasponu od 550 do 2 800 mg/L. Kod nižih pH vrijednosti, kvasci trebaju koncentraciju
kalija veću od 300 mg/L (Bison, 1998).
Mangan ima važnu ulogu u metabolizmu kvasca: kada ga ima dovoljno, sinteza
proteina ide nesmetano, sintetizira se tiamin i to rezultira povećanjem biomase. Uz
dovoljnu količinu pristupačnog Mn++, kvasac proizvodi enzim alkohol dehidrogenazu.
Asimilacija Mn++ ovisi o prisutnosti kalija i bakra u moštu. Istraživanja su pokazala da je
za razmnožavanje kvasaca najbola koncentracija Mn++ od 0.11 do 0.22 mg/L.
Ovi bivalentni kationi mogu se vezati i na različite spojeve u moštu, kao što su proteini
i polifenoli i tada ne mogu biti iskorišteni od strane kvasaca.
Rezidui pesticida
Isto imaju utjecaja na fermentativne probleme. Metholachlor i propanil su
komponente koje su se pokazale kao glavnim inhibitorima kvasaca, (Boscariol et al..
1991). Neki pesticidi kao što je dichlof1uanide mogu produžiti latentnu fazu, i samim time
odgoditi početak fermentacije (Palacios et al., 2000). Rezidui pesticida mogu djelovati
direktno (e.g. fungicidi), ili indirektno, no kvasci moraju detoksicirati fermentativni medij,
prije nego što mogu početi fermentaciju.
20
2 MALOLAKTIČNA FERMENTACIJA
Nekad nazivana i «sekundarna fermentacija», a danas «biološko odkiseljavanje»
predstavlja razgradnju jabučne kiseline putem mliječnih bakterija. Ranije kada upotreba
SO2 nije bila toliko raširena malolaktična fermentacija bila je česta ili gotovo redovita
pojava. Mensio i sur. (1914) navode da se «malolaktična fermentacija javlja u svim vinima
različitog inteziteta sa korisnim ili lošim posljedicama, ovisno o sastavu vina. Može se
govoriti o dvije fermentacije, alkoholnoj i malolaktičnoj».
Malolaktična fermentacija je vezana uz zonu sa umjerenom klimom kod koje dolazi do
nakupljanja veće količine jabučne kiseline i gdje se proizvode «velika vina» pa je ovaj
proces pozitivan npr. za Bordeaux, Borgogna-u, Piemonte, Valtelina i dr. Štetna je
nasuprot tome u toplim zonama gdje je mošt siromašan na kiselinama, zatim u proizvodnji
pjenušavih i frizante vina, koji moraju ostati „mladi“ dugo vremena. Štetna je, isto tako,
ako se javi kao posljedica bolesti, ili u već buteljiranim vinima.
Garvie, (1967) je publicirao fundamentalni rad, koji je predstavljao zaokret u poimanju
malolaktične fermentacije. Determinirao je soj, forme koki, koji fermentiraju jabučnu
kiselinu u sredini ispod pH 5, kao soj Leuoconostoc oenos. Kasnijim klasifikacijama je
Leuconostoc oenos nazvan Oenococcus oeni. Florenzo i Balloni, (1981) uspoređuju značaj
otkrića ovih bakterija sa značajem otkrića kvasaca Saccharomyces cerevisiae kod
alkoholne fermentacije. Oenococcus oeni je najznačajnija ali ne i jedina bakterija u
malolaktičnoj ferementaciji. Sposobne su fermentirati i druge vrste kao:
- Lactobacillus plantarum,
- Lactobacillus trichodes,
- Lactobacillus trevis i dr..
Ove bakterije se nalaze pojedinačno ili u skupini u vinu u kojem traje malolaktična
fermentacija. Lafon – Lafourcade, (1983), navode koje su bakterije prisutne u grožđu i
moštu: - Lactobacillus plantarum,
- Lactobacillus higlardi,
- Lactobacillus cosei i
- Oenococcus oeni (rjeđe od drugih).
21
Tijekom malolaktične fermentacije njihov broj se postepeno smanjuje i na kraju ostaje
samo Oenococcus oeni. Ova vrsta je jedino odgovorna za spontanu fermentaciju jer ove
druge nemaju tako važnu ulogu (moguće i zbog slabije tolerance na alkohol). Malolaktične
bakterije detaljnije su obrađene u kolegiju Mikrobiologija mošta i vina.
2.1 BIOKEMIZAM MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE
Biokemizam malolaktične fermentacije je prikazan u sljedećoj formuli. Iz molekule jabučne
kiseline, aktivnošću malolaktičnih bakterija, nastaje molekula mliječne kiseline i ugljičnog
dioksida.
COOH – CH2 – CHOH – COOH CH3 – CHOH – COOH + CO2
Sam proces malolaktične fermentacije odvija se u dvije etape. Najprije malatni enzim
katalizira reakciju između jabučne i pirogrožđane kiseline, a zatim iz pirogrožđane kiseline
posredstvom enzima laktat dehidrogenaze nastaje mliječna kiselina.
Malatni enzim
COOH – CH2 – CHOH – COOH CH3-CO-COOH + CO2 + 2 NADPH
L (-) jabučna kiselina Mg2+ Pirogrožđana kiselina
Međutim pored malatnog enzima, postoji još jedan enzim, malat dehidrogenaza koji je
puno rjeđi (potreban NAD+) i od manje važnosti za malolaktičnu fermentaciju.
Posredstvom ovog enzima iz jabučne kiseline stvara se oksaloctena kiselina, iz koje se
zatim pomoću enzima oksalacetat dekarboksilaze stvara pirogrožđana kiselina i CO2.
malat dehidrogenaza
COOH – CH2 – CHOH – COOH COOH-CH2-CO-COOH
L (-) jabučna kiselina oksaloctena kiselina
oksalacetat dekarboksilaze
COOH-CH2-CO-COOH CH3-CO-COOH + CO2 oksaloctena kiselina pirogrožđana kiselina
22
Kad je stvorena pirogrožđana kiselina, kao što je već rečeno, pomoću enzima mliječne
dehidrogenaze, pirogrožđana kiselina transformira se u mliječnu kiselinu.
Enzim laktat dehidrogenaza
CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH + NAD L - jabučna kiselina L-mliječna kiselina
Budući da je ovaj enzim, laktat dehidrogenaza koji je pronađen u malolaktičnim
bakterijama, odgovoran za produkciju D - mliječne kiseline, neki autori smatraju da je za
malolaktičnu fermentaciju zaslužan tzv. malolaktični enzim, koji bi u stvari bio odgovoran
za direktnu pretvorbu jabučne kiseline u L oblik mliječne kiseline, a koja je utvrđena kao
finalni produkt malolaktične fermentacije. Ova bi se transformacija odvijala dakle prema
sljedećoj shemi:
malolaktični enzim
COOH - CH2 - CHOH - COOH CH3-CHOH-COOH + CO2 L - jabučna kiselina L - mliječna kiselina
2.1.2 SEKUNDARNI PRODUKTI
Malolaktičnu fermentaciju prati i određena fermentacija šećera i stvaranje octene
kiseline. Diacetali i aceton povećavaju se 2-3 puta. Produkcija diacetala i acetona vezana je
za iskorištavanje limunske kiseline od strane bakterija. Ova kiselina nalazi se u vinu oko u
količini od oko 0,5 g/l i može biti djelomično ili potpuno metabolizirana od strane
bakterija. Količina diacetala i acetona ima direktan utjecaj na kvalitetu vina, jer diacetali
imaju neugodan miris na maslac.
2.2 POSLJEDICE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE
Vidljiva posljedica malolaktične fermentacije je značajno smanjenje ukupne kiselosti,
razgradanja grube jabučne kiseline i stvaranje blaže mliječne kiseline i produkcija CO2, što
izaziva zamućenje vina. Pojavljuju se i drugi sastojci kao octena kiselina, diacetal, aceton i
23
različiti esteri. Karakteristike mirisa i okusa se mijenjaju najčešće izazivajući poboljšanje
u kvaliteti vina, ali ponekad može i degradirati kvalitetu vina. Malolaktična fermentacija
prema Gnaegi (1984) može imati i neke negativne posljedice:
� ako zaostane manja količina jabučne kiseline, može se javiti naknadna malolaktična
fermentacija u boci, što izaziva zamućenje vina,
� trajanje malolaktične fermentacije ponekad može biti predugačko,
� rizik pojave Pediococcusa (zbog bakteriofaga na Oenococcus ili zbog niskog pH),
� efikasnost uniformnih sojeva može češće biti ugrožena sa bakteriofagima (virusi koji
napadaju bakterije).
Potreba za smanjenjem kiselosti je:
1. posljedica vremenskih prilika: veći sadržaj ukupnih kiselina-sjeverni krajevi i
2. povećanja kakvoće vina.
Smanjenje kiselosti može se izvesti i kemijskim putem, ali se neutralizira i određena
količina vinske kiseline, dok jabučne koju inače želimo odstraniti odstranjujemo samo
djelomično. Značajno smanjenje jabučne kiseline dolazi kod karbonske maceracije tzv.
enzimatskim putem, zbog prisutnosti potrebnih enzima (to je također biološko
odkiseljavanje). Biološko odkiseljavanje vrši se pomoću malolaktičnih bakterija kao i
pomoću specijalnih sojeva kvasaca Roda Scchizosaharomyces.
2.3 ČIMBENICI KOJI UTJEČU NA MALOLAKTIČNU FERMENTACIJU.
pH – jedan je od najznačajnijih faktora. Njegova uloga je višestruka. U spontanoj
fermentaciji pH vrijednost vrši selekciju prisutnih bakterija. Niže vrijednosti od pH 3,5 idu
u prilog Oenococcus oeni dok više vrijednosti pogoduju Lactobacillus i Pediococcus.
Međutim i Oenococcus oeni može biti blokiran ako je pH ispod 3,0, jer pH bitno utječe na
brzinu (dužinu) fermentacije. Tako neka istraživanja pokazuju da je kod pH 3,8
malolatična fermentacija trajala samo 14 dana, dok je kod pH 3,15 i na 12°C trajala čak
164 dana. Kod viših pH vrijednosti malolaktična fermentacija ide lakše međutim lakše
dolazi do povišenja hlapivih kiselina.
24
SO2 – usporava rad malolaktičnih bakterija i zajedno sa karbonatima djeluje na
bakterije. Vrijednost ukupnog SO2 trebala bi se kretati maksimalno između 50 – 100 mg/L
i do 10 mg/L slobodnog SO2. Kod niske pH vrijednosti i relativno niske doze SO2 mogu
stvarati velike probleme.
Kvasci – zadržavanje kvasaca u vinu nakon fermentacije, djeluje pozitivno na mliječne
bakterije. Ovo je povezano sa procesom autolize kvasaca, jer sastojci koji se oslobađaju
raspadom kvasaca predstavljaju najneophodnija hranjiva za bakterije (aminokiseline i
faktori rasta i razvoja).
Kisik – potpomaže razvoj bakterija.
Temperatura – malolaktične bakterije su mezofilne. Za Oenococcus oeni je
minimalna temperatura 10 °C, a optimalna 18 – 24 °C.
2.3.1 POSTUPCI ZA STIMULIRANJE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE
Sredina u kojoj je pH između 3,3 – 3,4 je optimalna za početak fermentacije. Međutim
pH nije jedini faktor o kojem ovisi aktivnost malolaktičnih bakterija. To ovisi o još puno
faktora koji su izvan naše kontrole (klimatski uvjeti, stanje grožđa i dr.). Fermentacija na
komini djeluje pozitivno posebno zbog inicijalnog pH, kakvog ovakva tehnologija daje,
kao i zbog bogatstva aditiva (hrane). Nasuprot tomu postupci bistrenja i odvajanja od
taloga utječu negativno, jer se mošt osiromašuje sa hranjivima koja su potrebna za rad
bakterija.
2.3.2 POSTUPCI ZA SPREČAVANJE MALOLAKTIČE FERMENTACIJE
Dodavanjem veće količine SO2 prije fermentacije kao i kasnije nakon fermentacije,
može se spriječiti malolaktična fermentacija. Sorbinska kiselina daje dobre rezultate kod
mirnih vina, međutim treba izbjegavati za vina koja su predviđena za refermentaciju, jer
inhibiraju rad kvasaca, kao i zbog moguće konverzacije (pretvaranja) u geraniol. Drugi
antiseptici nisu dozvoljeni odnosno zabranjeni su zbog štetnosti za ljude. Dobri rezultati
25
postižu se i filtriranjem kroz pore 0,22 – 0,45 µm (dovoljno fina filtracija, da se eliminiraju
skoro sve stanice bakterija). Pasterizacija također daje dobre rezultate samo treba
prilagoditi pojedinom soju, tako se soj Oenococcus oeni inaktivira na temperaturi od 55 °C
u trajanju 30 minuta.
Najefikasnija metoda za eliminiranje malolaktičnih bakterija je upotreba enzima
lizocima. Ovaj enzim otkrio je Fleming, 1921. godine kad i penicilin. Lizocim je jedan
hidrolitički enzim čijim posredstvom dolazi do razgradnje stanica bakterija, što izaziva
njihovo uginuće. Ovaj enzim prisutan je u prirodi, u suzama, u slini (životinje ližu rane za
dezinfekciju) i u bjelancetu jajeta odakle se i industrijski proizvodi (koristi se i u
mljekarstvu). Opsežna istraživanja primjene lizocima u vinarstvu obavio je Amati (1992).
On je ustanovio da ako vino nije jako kontaminirano malolaktičnim bakterijama dovoljna
je količina od 250 – 500 ppm ovog enzima. Ako je velika količina bakterija, potrebno je
povećati dozu.
2.3.3 STIMULIRANJE SPONTANE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE
Kako bi izazvali spontanu malolaktičnu fermentaciju moramo osigurati optimalnu
temperaturu i eliminirati sve one faktore koji usporavaju ili sprečavaju malolaktične
bakterije i nadati se da su bakterije Oenococcus oeni prisutne u vinu. Ovakvo se
odkiseljavanje vrši u nekim najpoznatijim vinskim regijama Evrope kao npr. u Bordeaux-
u, ali se često i dogodi da malolaktična fermentacija ne krene. U koliko u nekim bačvama
dođe do malolaktične fermentacije, tim vinom može se inokulirati (cca 5 % vina) druge
bačve (neki autori sugeriraju i više,15 pa čak 50%). Alternativna mogućnost je inokulacija
sa talogom ili izdvojenim stanicama putem centrifugiranja ili filtriranja. Izolirani sojevi
bakterija mogu se i čuvati u smrznutom stanju i po potrebi aktivirati.
2.4 ODABIR I SELEKCIJA BAKTERIJA
Malolaktičnih bakterija je puno ali značajne su samo Oenococcus oeni koje podnose
nisku vrijednost pH. Može se smatrati važnim i Lactobacillus plantarum koji je vrlo
26
snažan i otporan na nepovoljne uvjete. Poradi toga je ova vrsta idealna za početak
fermentacije. Kasnije je od značaja jedino Oenococcus oeni kojeg Balloni (1981), kako
smo već vidjeli, po značaju uspoređuje sa važnošću Saccharomyces cerevisiae kod
kvasaca.
U selekciji Oenococcus oeni postignute su sljedeće karakteristike:
� tolerantan na alkohol do 15 vol %,
� tolerantan na ukupan SO2 do preko 50 mg/l,
� aktivan i u sredini ispod pH 3,0,
� aktivan na temperaturi 10 – 15 °C,
� daje dobre organoleptičke karakteristike,
� otporan na bakteriofage i
� ne proizvodi smole i druge sastojke.
Osim ovoga Heinck i Kling (1992) dodaju:
� značajni su za pokretanje malolaktične fermentacije,
� ne producira strane mirise,
� aktivni su kod različitih tipova vina i
� podnose različite uvjete u minivinifikaciji.
2.5 PRIPRAVA PREDKULTURE
Prilagodba Oenococcus oeni u vinu je problematična jer nakon inokulacije velik broj
stanica ugiba. Zato treba dodati predkulturu razvijenu u sredini koja otprilike odgovara
sastavu vina. Priprava predkulture: pripremi se mošt razrijeđen sa 50 % vode, tako da se
pH kreće oko 4,5 i doda se 5g ekstrakta kvasca. Ovu sredinu se inokulira sa bakterijama na
temperaturi od 25°C. Nakon cca 7 dana doda se u mošt ili vino.
Razvijena (umnožena) kultura Oenococuus oeni u punom razvoju sadrži preko 1 milj. / ml.
Uzimajući to u obzir inokulacija sa tom predkulturom od 1 % odgovara dodatku 10 mil
stanica / ml. Prema mišljenju autora na ovaj način ostaje dio stanica živ. Kao što je rečeno
ugibanje bakterija je veliko, pogotovo ako je pH nizak. Prema autorima od inicijalnog
27
broja od 1 – 100 miliona stanica/mL, broj stanica može pasti na 10 – 1 000 stanica/mL, što
znači da se riskira gubitak kulture.
Predkulture Oenococcus oeni mogu se dodati u tri različita trenutka vinifikacije:
� u mošt prije fermentacije
� u mošt u punoj fermentaciji
� u vino nakon alkoholne fermentacije.
Po Beelman (1982) i Beelman i Kunkee (1985) inokulacia u mošt je dobra jer je
pogodna sredina za prilagodbu stanica bakterija (nema etanola i bogata sredina
hranjivima). Ovom postupku se protive neki autori (Lafon – Lafourcade, 1983) jer
malolaktične bakterije troše i šećer i produciraju osim mliječne i octenu kiselinu, što
povisuje hlapive kiseline. I Gallanger (1979) smatra da, s obzirom da malolaktične
bakterije ne možemo koristiti kada dodajemo SO2, ne može se prakticirati u ovo vrijeme.
Inokulacija u vrijeme alkoholne fermentacije prema (Davis, 1985) prakticira se u
proizvodnji kalifornijskih vina. Gallanger (1979) tvrdi da na ovaj način izbjegnut je utjecaj
negativnih faktora (alkohol i SO2 slobodni) i malolaktične bakterije imaju dobre uvjete za
adaptaciju i početak umnožavanja.
Najveći broj autora favorizira dodatak malolaktičnih bakterija nakon završetka
alkoholne fermentacije jer se tako dobivaju najbolji rezultati.
2.6 KOMERCIJALNI PREPARATI
Sve ovo ranije navedeno pokazuje kako u upotrebi selekcioniranih kultura Oenococcus
oeni nailazimo na mnogo problema. U rješavanju ovih problema nedavno su razvijeni
liofilizirani preparati Oenococcus oeni sa dehidriranom hranom za pokretanje. S ovim
preparatima moguće je riješiti prvu fazu razmnožavanja ali ostaju problemi pri dodatku u
vino. Svi autori su uvjereni da reaktivacija u vino je bolja i efikasnija i u pogledu
umnožavanja i u pogledu preživljavanja stanica nakon inokulacije. Dobri rezultati postižu
se i dodatkom u mošt.
28
Metode aktivacije liofiliziranih malolaktičnih bakterija
Aktivacija u vinu Aktivacija u moštu Aktivacija u moštu (Valde, 1987) (Valde i Laurent, 1987) (Gerbaux i Nault, 1994)
Rehidratacija: 50 g bakterija u 200 ml otopine u kojoj je otopljeno 50 g/l glukoze
Reaktivacija: 20 l razrijeđenog vina + 2,5 g ekstrakta kvasca
Privikavanje: 5 hl vina u kojem je završena fermentacija
Inokulacija:100 hl vina sa završenom fermentacijom
Rehidratacija: 50 g bakterija u 200 ml otopine u kojoj je otopljeno 50 g/l glukoze
Reaktivacija: 20 l razblaženog mošta + 10 g / hl suhog aktivnog kvasca
Privikavanje: 5 hl mošta u fermentaciji
Inokulacija:100 hl vina sa završenom fermentacijom
Reaktivacija: 10 l razrijeđenog mošta, 108 stanica / ml liofiliziranih bakterija + 2 g / l ekstrakta kvasca
Inokulacija: 100 hl mošta koji fermentira 48 sati.
29
2.7 BOLESTI IZAZVANE MLIJEČNIM BAKTERIJAMA
Mliječno-kiselo vrenje
Bolest koja se javlja u slatkim vinima, češće u crnim vinima i južnim krajevima. Vino
zaraženo ovom bolešću opalescira i postaje mutno. Miris postaje sladkast sa izraženom
aromom octene kiseline. Stvara se mliječna kiselina, octena kiselina (daje okus ljut-oštar) u
količini 2 – 3 g/l i alkohol manit (slatkast okus) do 10 g/l.
Fermentacija šećera mliječna kiselina + octena kiselina + CO2 + alkoholi
Glukoza etanol
Fruktoza manitol
Sluzavost
Zahvaća također slatka vina. Vina su sluzava i viskozna koja se prelijevaju kao ulje.
Izazivači su bakterije Leuconostoc. Aktivnošću ovih bakterija formiraju se polisaharidi
(dekstran i fruktozan) iz monosaharida, koji su konzistencije gume. Sluzavost može nestati
ali ostaje niži pH. Uzročnici mogu biti isti kao kod mliječno kiselog vrenja.
Prevrnutost
Javlja se nakon skidanja sa taloga. Manifestira se ponovnim vrenjem, mućenjem i
pojavom taloga. Fermentira prvenstveno vinsku kiselinu ali i određenu količinu jabučne
kiseline i glicerola. Posljedice su: značajna količina mliječne kiseline, hlapivih kiselina
(octena i propionska).
2.8 ODKISELJAVANJE – KOMENTAR
Malolaktična fermentacija uspijeva ako se primjenjuju svi postupci koji potpomažu
razvoj bakterija. Najbolja garancija je inokulacija sa laboratorijskim bakterijama ili
komercijalnim preparatima. Odkiseljavanje sa malolaktičnim bakterijama je složenije ako
je vino sastava koji sprečava rad bakterija. To se na primjer događa u sjevernim krajevima
(npr. berba 1984. godine). Te godine moštevi, odnosno vina, imali su inhibirajući sastav od
30
7 – 10 g/l jabučne kiseline i pH ispod 3,0. U takvim uvjetima kada malolaktične bakterije
ne mogu djelovati treba tražiti drugi put, a to je upotreba tzv. maloalkoholnih kvasaca
Schizosaccaromyces.
Za sprečavanje mnogih smetnji u malolaktičnoj fermentaciji nastoji se koristiti druge
postupke kao biološko odkiseljavanje sa enzimima i imobiliriziranim stanicama.
31
3 JABUČNO – ALKOHOLNA FERMENTACIJA
Kvasci roda Schizosaccharomyces posjeduju sposobnost da jabučnu kiselinu
transformiraju u etilni alkohol i CO2, pa se mogu koristi za biološko odkiseljavanje i
odstranjivanje kiselina. Sojevi koji se najviše koriste su Schizosaccharomyces pombe, jer
pored ove sposobnosti, imaju i druge potrebne osobine tj. da podnose alkohol (cca 10 vol
%) i uobičajene količine SO2. Također su interesantni Schizosaccharomyces japonicus
var. japonicus. Odkiseljavanje sa kvascima može se obavljati u fermentaciji ili u
refermentaciji.
Odkiseljavanje u fermentaciji:
Kvasci roda Schizosaccharomyces imaju dobre enološke karakteristike i mogu se
koristiti umjesto S. Cerevisiae.
1. Imaju određenu sposobnost fermentiranja i relativno su otporni na SO2, međutim ne
posjeduju kvalitetu Saccharomysec cerevisiae, tako da u sulfitiranom moštu često
ne uspijevaju nadmašiti prisutne divlje kvasce.
2. Snaga fermentacije Schizosaccharomyces prelazi malo preko 10 vol % alkohola i
često puta ovi kvasci imaju poteškoća pri završetku fermentacije. Potpuna
fermentacija dolazi jedino ako se koristi sa S. Cerevisiae (bayanus).
3. Količina proizvedenih sekundarnih spojeva je slična kao kod S. Cerevisiae.
32
4 OCTENA FERMENTACIJA
Octenu fermentaciju izazivaju bakterije octenog vrenja, koje su sposobne fermentirati
etilni alkohol u octenu kiselinu. Octene bakterije otkrio je Kützing 1837. godine i nazvao
ih Ulvina aceti. Pasteur je kasnije, 1864. godine utvrdio da su upravo ovi mikroorganizmi
odgovorni za oksidaciju etanola, te ih nazvao Mycoderma aceti. Godine 1898. uveden je
naziv Acetobacter koji je ostao do danas.
To je dosta ujednačena grupa bakterija kojima je zajedničko da su u stanju oksidirati
etanol u octenu kiselinu (kisela sredina), a razlikuju se po brzini produkcije ove kiseline i
po brzini pretvaranja octene kiseline u vodu i ugljični dioksid. Octene bakterije, zbog svoje
aktivnosti pri niskim pH vrijednostima, predstavljaju veliku opasnost u proizvodnji vina jer
se mogu javiti u svim fazama vinifikacije. U moštu su većinom prisutne bakterije
Gluconobacter, a u vinu Acetobacter.
4.1 KEMIZAM FERMENTACIJE
Transformacija etanola u octenu kiselinu (bioksidacija etanola) odvija se prema sljedećoj
jednadžbi:
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O
Do ove transformacije dolazi na sljedeći način. Najprije etanol transformira u acetaldehid
CH3CH2OH CH3CHO + 2H + O2
Acetaldehid se zatim hidratizira
H
CH3CHO + H2O CH3C OH
OH
33
Dehidratizirani acetaldehid se zatim transformira na dva načina:
(a) aerobnom dehidrogenacijom
(b) anaerobnom dismutacijom (formira se i etanol)
H
(a) CH3C OH CH3COOH + 2H i O H2O
OH
H
(b) CH3C OH + CH3CHO CH3COOH + CH3CH2OH
OH
Dismutacijom se proizvede 50 % octene kiseline i 50 % etanola. Ovaj etanol ponovo
podliježe octenoj fermentaciji, do potpunog pretvaranja u octenu kiselinu.
4.2 UVJETI ZA RAD OCTENIH BAKTERIJA
Kisik - Octene bakterije su aerobne i za njihov razvoj je potrebno prisustvo zraka.
Temperatura – octenim bakterijama u pravilu odgovara viša temperatura cca 30°C, ali
podnose i dosta niske temperature sve do 5 °C. Octena fermentacija najintenzivnija je na
temperaturi između 23 °C i 28 °C.
pH – aktivne su u kiseloj sredini. Optimalni pH je između 5,4 do 6,3, međutim većina
bakterija dobro se razvija i u pH vina. Dupy (1957) utvrdio je da se vrlo brzo razvijaju kod
pH 3,2 pa sve do pH 3,0.
Alkohol – njegov utjecaj ovisi o soju i o hranjivima u vinu. U pravilu povećanjem
alkohola smanjuje se aktivnost ovih bakterija ali ima i sojeva koji podnose i preko 14 vol
34
%. Ova osobina nije stabilna i ovisi o adaptaciji na sredinu. Verona i sur. (1938) su utvrdili
da su mutanti mnogo otporniji od originalnih kultura, te budući da se otpornost na alkohol
«stječe» možemo zaključiti da su za vino opasni upravo oni sojevi koji se nalaze u vinu ili
moštu, dakle «unutarnji» koji se postepeno privikavaju na alkohol tijekom vinifikacije.
SO2 - Vrlo su osjetljive na SO2 i to u normalnim dozama korištenja. Nisu međutim
osjetljive na K-sorbat koji se inače koristi kao antiseptik.
Hranjiva - octene bakterije ne traže posebno bogatu sredinu s hranjivima, već mogu
opstati i djelovati i u siromašnoj sredini.
35
5 NJEGA I ČUVANJE VINA
Po završetku alkoholne fermentacije nastaje nova etapa u kojoj se odigrava niz fizičko
- kemijskih transformacija s kojima vino postepeno stječe svojstva, koja mu daju određenu
kakvoću. Sa sve većim upoznavanjem prirode pojedinih promjena, ulaženjem u
mehanizam i kemizam procesa koji se pri tome dešavaju, u stanju smo da ove promjene
usmjerimo u pravcu kojim ćemo postići najbolju kakvoću, kojim će organoleptična
svojstva vina, njegov okus i buke doći do maksimalnog izražaja.
Njega i čuvanje vina obuhvaćaju niz raznovrsnih postupaka, koji imaju za cilj zaštitu
vina od kvarenja i mana, te osiguravanje takvih organoleptičnih osobina vina, s kojima
ono može izaći na tržište.
5.1 DOPUNJAVANJE SUDOVA
Prestankom alkoholne fermentacije smanjuje se volumen vina, a razloga ovoj pojavi
ima više. Uslijed razlaganja šećera prvobitni volumen mošta u tijeku alkoholne
fermentacije smanjuje se za cca. 1%. Smanjenja zapremine vina nakon završene
fermentacije dolazi i uslijed promjene njegove temperature. Osim toga stvoreni ugljični
dioksid kao novi produkt fermentacije lako isparava (povlačeći za sobom i određenu
količinu vode i alkohola), uzrokujući daljnje smanjenje volumena, koje po svršetku
alkoholne fermentacije može iznositi i do 3,4 %. Na ovaj način u posudama sa vinom
stvara se veći ili manji otpražnjeni prostor, u kojem vino dolazi u kontakt sa zrakom čime
se stvaraju povoljni uvjeti za oksidaciju i rad aerobnih mikroorganizama.
Budući se smanjenje volumena vina ne može u potpunosti izbjeći, to je potrebno
pravovremeno otkloniti nastali otpražnjeni prostor, što se najčešće postiže dopunjavanjem
bačava, još za vrijeme tihog vrenja, i dalje tijekom njegovog čuvanja.
36
Osim dopunjavanja sudova sa vinom što sličnijih karakteristika, zaštita vina u
otpražnjenom prostoru obavlja se i unošenjem sumpornog dioksida, inertnih plinova (dušik
ili ugljični dioksid), te inertnog ulja (npr. parafinsko ulje).
5.2 PRETAKANJE VINA
Ovo je jedna od radnji, koja se u toku čuvanja vina najčešće primjenjuje. Pored
odvajanja bistrog vina od njegova taloga, pretakanjem se podstiču i mnoge druge pojave
često veoma značajne za njegovu kakvoću.
Otvoreni pretok – u pravilu prvi pretok novog, mladog vina, te vina s nekim stranim
mirisom (npr. miris na H2S).
Pretakanjem mladog vina odstranjujemo iz njega grube čestice mutnoće radi bržeg
bistrenja. U prisustvu zračnog kisika mnogi sastojci vina prelaze u netopljivo stanje i talože
se, tako da vino postaje stabilnije. Apsorbiranjem izvjesne količine kisika u vinu se
odigrava niz oksido – redukcijskih reakcija važnih za formiranje njegovih organoleptičnih
osobina, naročito okusa i mirisa. Osim toga pretakanjem vina uz pristup zračnog kisika,
možemo se osloboditi i nekih stranih mirisa ukoliko ih ima u vinu.
Zatvoreni pretok – zatvoreno se pretaču vina s već formiranim bukeom, aromatična
vina.
Broj pretakanja i vrijeme njihovog izvođenja u prvoj godini u velikoj mjeri ovise o
vrsti i tipu vina, njihovom kemijskom sastavu i načinu čuvanja (obično 2 – 3). Prvi pretok
(studeni), drugi pretok (veljača/ožujak), eventualno treći pretok (rujan), da bi se u idućim
godinama pretok smanjio na jedan, ili tek jedan na dvije i više godina.
5.3 KUPAŽIRANJE (SLJUBLJIVANJE) VINA
Kupažiranje predstavlja postupak kojim se dva ili više vina mješaju u određenom
odnosu radi dobivanja vina sa izmijenjenim sastavom i organoleptičnim osobinama. Svrha
37
ovog postupka najčešće se svodi na tipiziranje (stvaranje tipova vina standardnih osobina),
popravak kakvoće, osvježavanje starih vina i otklanjanje nekih nedostataka vina. Prije
nego pristupimo kupažiranju vina moramo utvrditi sadržaj onih sastojaka koje u njemu
želimo popraviti, a to su : alkohol, aciditet, eksrtrakt, boja i miris, nakon čega treba odrediti
najpovoljniji odnos pojedinih vina za kupažu (putem kušanja ili računskim putem).
Metodu kušanja više koristimo u slučajevima kada u vinima želimo obaviti popravak
boje, okusa i mirisa, dok se za popravak sadržaja pojedinih sastojaka vina (alkohol i dr.)
služimo računskim putem (tzv. križni račun), s tim što i u ovim slučajevima po
obavljenom kupažiranju treba obaviti i kušanje vina.
Primjer križnog računa:
a = komponenta vina I
b = komponenta vina II
c = kupažirano vino
Primjer: a = vino od 9% alkohola
b = vino od 14 % alkohola
c = vino od 12 % alkohola
Iz gornjeg izračuna proizlazi da treba uzeti 2 dijela vina od 9 vol % i 3 dijela vina od
14 vol %, da bi dobili vino od 12 vol %. Sada ove vrijednosti stavimo u odnos (npr. za 2
000 L):
2 : 3 = 2000 : X
X = 6 000 : 2
X = 3 000 l vina od 14%.
npr. 2 000 L vina od 9 % alkohola, onda treba uzeti X= 3 000 L vina od 14 % alkohola i
dobit ćemo 5 000 L vina od 12 vol %.
a b – c c b a – c
9 2 12 14 3
38
6 TALOŽENJA U VINU
Po završetku alkoholne fermentacije, kada prestanu jaka konvencionalna strujanja
uslijed oslobađanja CO2, u vinu postepeno počinju procesi taloženja.
6.1 TALOŽENJE SOLI VINSKE KISELINE
Vinska kiselina je jedna od glavnih kiselina u vinu, a u njega dospijeva iz grožđa
odnosno iz mošta. U vinu se nalazi uglavnom u obliku soli kalija i kalcija, a malo u
slobodnom stanju. Najviše je zastupljena u obliku primarnog kalijumhidrotartarata (streš),
a u manjoj mjeri i kao sekundarni kalcijum tartarat.
CHOH COOH CHOH COO
Ca . 4H2O
CHOH COOK CHOH COO
Kalijum hidrotartarat Kalcijumtartarat
Taloženje ovih soli u vinu ovisno je o sadržaju alkohola, temperaturi, te pH.
6.2 TALOŽENJE SPOJEVA ŽELJEZA
Željezo dospijeva u vino preko mošta, odnosno preko grožđa, a dijelom i preko
strojeva i raznog materijala s kojima mošt i vino dolaze u dodir. Taloženje željeza u vinu
javljaju se u vidu lomova poznatih pod imenom sivi (bijeli) i plavi (crni) lom.
Sivi (bijeli) lom – javlja se uslijed taloženja ferifosfata, pa se zove i ferifosfatni lom.
Javlja se pretežno u bijelim vinima, mada ga može biti i u crnim, samo što je u njima
maskiran s crnim lomom. Vina sa sivim lomom su magličasto mutna, više sive nego bijele
boje, zbog čega i nose ovakav naziv. Do zamućenja dolazi kada vino dođe u jači dodir sa
zrakom (najčešće u vinima s 12 – 15 mg/l ukupnog željeza).
39
U talogu koji se pri lomu stvara u vinu, nalazi se trovalentno željezo, fosforna
kiselina, tragovi kalcija i organske tvari.
Željezo se u vinu nalazi u dvovalentnom i trovalentnom stanju, i to u vidu jednostavnih
i složenih spojeva. Od jednostavnih spojeva željeza značajnih za pojavu ovog loma u vinu
jesu njegovi spojevi s fosfornom kiselinom, na čijem obrazovanju i daljnjem ponašanju u
vinu se zapravo i zasniva mehanizam pojave sivog loma u vinu. Držanjem vina u odsustvu
zraka, željezo se nalazi u dvovalentnom stanju u obliku svojih ferospojeva. Pri aeraciji
vina, uslijed prisustva kisika, dvovalentno željezo se oksidira prelazeći pri tome u feri
oblik:
4 Fe ++ + O2 + 4H + 4 Fe +++ + 2 H2O
Budući se u vinu nalazi i fosforna kiselina kao redovit sastojak, to između nje i željeza
dolazi do sljedeće reakcije:
3 (H2PO4)- + Fe +++ Fe (H2PO4)3
Stvoreni ferifosfat se taloži kada dostigne određenu koncentraciju.
Pored jednostavnih spojeva, željezo (naročito trovalentno) u vinu obrazuje i složene,
kompleksne spojeve i to uglavnom s organskim kiselinama i fenolnim spojevima vina.
Organske kiseline angažiraju slobodne Fe +++ ione obrazujući dosta stabilne spojeve, koji
slabo disociraju, te nisu u stanju osigurati dovoljnu količinu slobodnih Fe +++ iona da bi se
stvorio ferifosfat u koncentraciji pri kojoj se taloži u vinu. Znači da organske kiseline štite
vino u izvjesnoj mjeri od pojave sivog loma. Uloga organskih kiselina i njihovih
kompleksnih spojeva sa željezom se ispoljava i pri upotrebi sredstava za eliminiranje Fe iz
vina (npr. kalijumferocijanid pri plavom bistrenju vina). Efikasno sredstvo protiv pojave
sivog loma u vinu jeste limunska kiselina.
U mehanizmu taloženja željeza i pojavi sivog loma u vinu sudjeluju i neke reakcije
koloidne prirode. Pri tome bjelančevine stimuliraju taloženje ferifosfata, a zaštitni koloidi
40
(npr. gumiarabika) ometaju ovaj proces. Što se tiče aciditeta vina primijećeno je da pH
manji od 3.3 stimulira, a pH veći od 3.3 ometa taloženje ferifosfata u vinu.
Plavi (crni lom) – javlja se u crnim vinima, i ispoljava se u promjeni boje ovih vina,
mućenjem i stvaranjem taloga. Boja vina prelazi iz crvene u plavu do zatvoreno plave
skoro crne nijanse, a takve je boje i talog, u kojem se nalaze željezo, tanini, te tvari boje.
Spojevi trovalentnog željeza sa fenolnim spojevima crnih vina su koloidne prirode s
negativnim električnim nabojem, a naročito je značajan feritanat, koji se u prisustvu tvari
s pozitivnim nabojem taloži i izaziva plavi prelom u vinu.
6.3 TALOŽENJE SPOJEVA BAKRA
U vino bakar dospijeva preko grožđa (iz tla putem ishrane trsa, tretiranjem vinove loze
protiv kriptogamnih bolesti), te preko bakrenih dijelova strojeva i uređaja koji se koriste pri
preradi grožđa i raznim manipulacijama s vinom. Prisustvo bakra u količinama većim od
0.5 mg/l može biti uzrok nestabilnosti vina, naročito bijelih, koja sadrže više slobodnog
sumpordioksida. Za razliku od spojeva željeza do taloženja bakra dolazi kad se vino drži u
odsustvu zraka. Najčešće se javlja u bocama u vidu zamućenja i obrazovanja taloga
mrko crvene boje. U talogu je utvrđeno prisustvo bakrovog sulfida u koloidnom stanju,
ili samo koloidnog oblika bakra (ili mješavina i jednog i drugog oblika).
Prema jednoj od teorija mehanizam bakrenog preloma se odigrava u nekoliko faza, a
shematski bi se mogao predstaviti na slijedeći način:
1. Cu ++ + RH Cu + + R + H + ;
2. 6 Cu + + 6 H + + SO2 6 Cu ++ + H2S + H2O ;
3. Cu ++ + H2S CuS + 2 H + ;
4. Flokulacija CuS u prisustvu kationa i proteina (pojava zamućenja i taloga u
vinu).
41
Osim sumpornog dioksida, kao izvor sumpora, koji sudjeluje u mehanizmu preloma
može biti cistein, (najviše u mraku). Tvari bjelančevinaste prirode puno su važnije za
samu pojavu taloženja stvorenog bakrovog sulfida. Faktori koji mogu ubrzati pojavu
preloma su: povišena temperatura i sunčeva svjetlost (koja ubrzava redukciju bakra), te
prisustvo željeza u vinu.
6.4 TALOŽENJE BJELANČEVINA
Bjelančevine se nalaze u većim ili manjim količinama u svim vinima, a naročito u
novim, bijelim vinima. U vino dospijevaju iz grožđa, te izumiranjem i autolizom kvaščevih
stanica, te čine koloidni sistem vrlo nestabilne prirode. Iako mućenja vina uslijed
nestabilnosti bjelančevinastih spojeva mogu biti izazvana različitim faktorima, ipak su
najčešća ona koja se javljaju pod utjecajem promjena temperature i sadržaja tanina u vinu.
Taloženje bjelančevina pod utjecajem temperature
Mehanizam taloženja bjelančevinastih tvari u vinu pod utjecajem visokih temperatura
je složen i odigrava se u dvije faze. Bjelančevine najprije gube vodu tj. denaturiraju se, a
tek nakon ove faze nastupa koagulacija za koju je neophodno prisustvo tanina i kationa.
Pored izrazito visokih temperatura (80oC), kojoj se bijela vina nekad izlažu radi
efikasnije stabilnosti, ona se talože i na nižim, ali ipak relativno visokim temperaturama
(do 30oC); ova su taloženja spontane prirode i duže traju.
Pored ponašanja bjelančevina u vinu na visokim temperaturama od interesa je i njihovo
ponašanje na niskim temperaturama. Tako se neka bijela vina mute i bez prethodnog
zagrijavanja ako se izlože niskoj temperaturi, do blizu njihove točke smrzavanja. Ima čak
slučajeva da se neka bijela vina ne mute na visokoj temperaturi, a na niskoj se mute, što se
dešava u vinima s nedovoljno tanina (koji je pri zagrijavanju krajnji izvršilac koagulacije
proteina). Znači da u nedostatku tanina u vinu koagulirajuću ulogu može imati niska
temperatura.
42
Taloženje bjelančevina pod utjecajem tanina
Na stabilnost bjelančevina u vinu osim temperature utjecaja ima i prisustvo tanina, u
što se možemo uvjeriti ako vinima bogatim u ovim tvarima (nova bijela vina) dodamo 1 –
2 g/l tanina (dolazi do zamućenja i stvaranja taloga).
Pri zagrijavanju vina ne mora uvijek doći do mućenja i taloženja, što može biti slučaj
kad se u vinu nađe višak želatine uslijed nepravilnog bistrenja, tzv. sirkolaža. Prema tome
za utvrđivanje sklonosti vina ka taloženju bjelančevina osim zagrijavanjem vina (30
minuta na 80oC) služimo se i dodatkom tanina, ili pak izlaganjem vina niskim
temperaturama (24 sata na OoC). Ako se u jednom ili drugom slučaju vino zamuti znak je
da sadrži nestabilne bjelančevine.
6.5 TALOŽENJE BOJENIH TVARI CRNIH VINA
Tijekom čuvanja crnih vina dolazi do taloženja tvari boje – antocijana, što nije
poželjno, jer se s jedne strane vino s talogom može zamutiti, a s druge strane izlučivanje
jednog dijela ovih tvari vodi smanjenju intenziteta njihove boje za 10 – 20%. Ovim
promjenama podliježu kako nova tako i stara vina. Za antocijane je karakteristično da se
u vinu nalaze dijelom u kristalnom, a dijelom u koloidnom stanju.
Koloidna frakcija je sa negativnim električnim nabojem i predstavlja nestabilno stanje
antocijana u vinu, a do njenog taloženja dolazi izlaganjem vina niskoj temperaturi (oko
OoC).
Ako vino tretiramo tako da iz njega eliminiramo koloidni dio (bistrenje npr. želatinom
ili bentonitom) ono će biti samo privremeno bistro. Naime poslije izvjesnog vremena ako
se čuva na povišenoj temperaturi (npr.ljeti), ili ako se kraće vrijeme izloži visokoj
temperaturi (oko 55oC), ono će se opet zamutiti kad se stavi na nisku temperaturu.
Djelovanje visoke temperature očituje se prevođenjem jednog dijela antocijana iz
kristalnog u koloidno stanje.
43
Za utvrđivanje podložnosti crnih vina taloženju antocijana koristimo se specijalnim
aparatom tzv. depozimetrom.
Za zaštitu crnih vina od taloženja tvari boje koriste se uglavnom dva načina:
� tretiranje vina sredstvima kojima se eliminira koloidna frakcija antocijana
(adsorptivna sredstva: želatina i bentonit).
� tretiranje vina sredstvima kojima se koloidna frakcija antocijana održava u
otopini čime se spriječava njeno taloženje (sredstva iz grupe zaštitnih koloida
(naročito gumiarabika).
44
7 STABILIZACIJA VINA
Vino predstavlja vrlo složen sistem u kojem se mnogobrojne tvari nalaze u više ili
manje otopljenom stanju. Neke od njih se nalaze u vidu pravih otopina, druge u koloidnom
stanju, treće samo u suspenziji; a slijedećih su dimenzija:
� molekulske i ionske čestice (prave otopine); < 0.002 µm
� koloidne čestice (pseudo otopine); 0.002 – 0.1 µm
� čestice u suspenziji > 0.1 µm
Ukoliko se stanje pojedinih tvari više bliži ka pravim otopinama, utoliko će vino biti
bistrije, a ukoliko je ono bliže stanju suspenzije biti će manje bistro, pa može biti čak i
mutno.
Mućenja vina i pojava taloga u njemu može biti posljedica poremećaja ravnoteže
fizičko – kemijskog stanja pojedinih sastojaka u njemu kao otopini, a mogu biti i biološke
prirode, kao posljedica rada mikroorganizama. U pripremi vina za tržište neophodno je
osigurati potrebnu stabilnost vina pri kojoj će ono ostati trajno bistro. S obzirom na prirodu
procesa koji se odigravaju pri stabilizaciji vina razlikujemo: fizičko kemijsku i biološku
stabilizaciju.
7.1 FIZIČKO – KEMIJSKA STABILIZACIJA VINA
U molekulskom stanju (prava otopina) nalazi se veliki broj sastojaka vina kao što su
voda i alkohol, razne kiseline i njihove soli, šećer, fenolni spojevi, esteri i dr.. Vino, kao
otopina ovih tvari, je stabilno sve dok ne dođe do poremećaja ravnoteže u otopini, kada
neke od ovih tvari djelomično izlaze iz otopine i prelaze u netopljivo stanje (zamućenje i
stvaranje taloga; npr. taloženje soli vinske kiseline).
45
Osim materija otopljenih u vidu molekula i iona u vinu se nalaze i spojevi koloidne
prirode, koji predstavljaju više molekula ili molekule velikih dimenzija – bjelančevine,
neki fenolni spojevi, sluzaste i smolaste tvari, kao i ferifosfat, feritanat, sulfid bakra i
dr.
U odnosu na spojeve u molekulskom i jonskom obliku spojevi koloidne prirode su
mnogo manje zastupljeni u vinu, ali su od velikog značaja za stabilnost vina, odnosno za
njegovu bistroću. Pri ovome je naročito važno da tvari koloidne prirode posjeduju određeni
električni potencijal, koji se ispoljava u vidu električnog naboja; pri čemu se čestice istog
naboja odbijaju, a suprotnog privlače. Na ovim svojstvima koloida mogu se objasniti
mnoge pojave u vezi sa stabilizacijom i destabilizacijom vina kao koloidne otopine.
Polazeći od toga da su čestice mutnoće vina veoma malih dimenzija, za brzinu njihove
sedimentacije možemo primijeniti Stockeov zakon koji se odnosi na čestice sferičnog
oblika, a predstavljen je sljedećom formulom:
2 r 2
V = ( D – d) g
9 v
V = brzina sedimentacije izražena u jedinici vremena,
D = specifična težina čestica,
r = poluprečnik čestica u suspenziji,
d = specifična težina tekućine,
v = viskozitet tekućine,
g = ubrzanje zemljine teže
Na brzinu sedimentacije čestica djeluju i razne difuzne sile, od kojih neke djeluju
odbojno i drže čestice u disperznom stanju (istoimeni naboj koloidnih čestica), dok druge
djeluju privlačno i dovode do spajanja makromolekula koloida u veće agregate (sile
kohezione prirode). Tijekom čuvanja vina može doći do opadanja električnog naboja, te
do opadanja odbojnih sila. Kad električni naboj padne na vrijednost od 0.03 volta
(tzv. kritični naboj) odbojne sile između koloidnih čestica toliko oslabe da prevladaju
privlačne sile koje dovode do okrupnjavanja i koagulacije koloida (početak okrupnjavanja
= prag koagulacije; maksimalna koagulacija = flokulacija), te njihove brže
46
sedimentacije uz istovremeno brže bistrenje vina. U elektrostatičkim odnosima koloida
velikog značaja ima i aciditet vina odnosno njegova pH vrijednost, a u procesima fizičko
– kemijske stabilizacije vina vrlo značajnu ulogu imaju i pojave apsorpcije između raznih
koloida, te prisustvo tzv. zaštitnih koloida u vinu.
7.1.1 BISTRENJE VINA
Za razliku od spontanog bistrenja (koji je normalan proces u vinu nakon alkoholne
fermentacije), primjena bistrenja vina, kao posebnog tretiranja, se sastoji u unošenju
određenih sredstava u vino sa kojima se putem kemijskih i fizičko – kemijskih reakcija
iz njega odstranjuje nestabilni dio sastojaka. Kod većine sredstava proces bistrenja se
odigrava na principu elektrostatičkih odnosa između sredstava koja se unose u vino i
sastojaka koji se u njemu nalaze.
Na efikasnost bistrenja utječe aciditet odnosno pH vina, temperatura, priprema i način
unošenja sredstva u vino, i dr. Postoje dvije velike grupe sredstava za bistrenje: organska i
mineralna.
7.1.1.2 Organska sredstva za bistrenje
Znatan broj organskih sredstava za bistrenje vina je bjelančevinaste prirode, kao što su
želatina, albumin, bjelance jajeta, mlijeko, kazein i dr.. Pored njih u ovu grupu ubrajamo
još i tanin, agar – agar, aferin ili kalcijfitat.
Želatina i tanin
Ova dva sredstva se mogu koristiti i pojedinačno, ali se u praksi najčešće primjenjuju
kombinirano. Ovo su sredstva koloidne prirode sa različitim izoelektričnim točkama, za
želatinu pri pH 4.7, a za tanin pri pH 2 – 2.5. U vinu želatina ima pozitivan, a tanin
negativan električni naboj, te bi se očekivalo da je njihovo međusobno djelovanje na
principu međusobne koagulacije. Međutim eksperimentalno je utvrđeno da je mehanizam
47
djelovanja između želatine i tanina drugačiji; najprije dolazi do adsorpcije želatine od
strane tanina, dehidratacije želatine i promjene električnog naboja (iz pozitivnog u
negativan). Koagulacija ovako izmijenjene želatine biva tek pod utjecajem kationa, K, Ca,
Mg i dr. koji su uvijek nazočni u vinu.
Da bismo, u bijelim vinima, izbjegli pojavu tzv. sirkolaže (višak želatine nakon
obavljenog bistrenja) bistrenje obavljamo dodatkom oba sredstva i to u količini 2 –3 g/hl.
Pri bistrenju crnih vina sa želatinom mogućnost pojave sirkolaže je znatno manja, jer su
ova vina bogatija u taninskim tvarima, koje ih štite od spomenute pojave. Zato se pri
bistrenju ovih vina dodaje samo želatina bez tanina, u količinama 10 – 15 g/hl, radi
eliminacije viška tanina, kako bi postala harmoničnija. S istim ciljem se upotrebljava i u
bijelim vinima dobivenim jakim tiještenjem masulja (preše s kontinuiranim radom).
Ukoliko se obavlja kombinirano bistrenje s taninom i želatinom, vinu najprije dodajemo
otopinu tanina, pa tek po obavljenom miješanju i otopinu želatine uz ponovno miješanje.
Tanin možemo koristiti i sam za eliminiranje bjelančevina iz bijelih vina.
Riblji mjehur - u vino se dodaje u vidu 1% otopine, u malim količinama najčešće 0.5
– 2,0 g / hl, a pri bistrenju se ponaša slično želatini. Pogodan je za bistrenje bijelih vina i to
bez upotrebe tanina (zbog relativno male količine s kojom se postiže uspješno bistrenje
mogućnost pojave sirkolaže svedena je na minimum), dok za crna vina nije preporučljiv.
Upotreba ribljeg mjehura i pored svih svojih dobrih osobina danas je malo zastupljena,
prije svega radi skupoće ovog sredstva.
Bjelance jajeta - primjena bjelanceta jajeta za bistrenje vina je većinom napuštena, a
zasniva se na prisustvu bjelančevinastih spojeva albumina i globulina, kojih u njemu ima
oko 12.5 %. Primjenjuje se za bistrenje crnih vina bogatih taninima, a nije pogodan za
bijela vina (osim za preševine), u količini od 1 – 3 jaja / hl vina. Za bistrenje crnih vina se
može upotrijebiti i čisti albumin u količini 10 – 15 g / hl (4 g albumina odgovara 1
bjelancetu).
Mlijeko i kazein - upotreba mlijeka za bistrenje vina (napušteno sredstvo) zasniva se
na djelovanju kazeina, koji kada se stavi u vino podliježe koagulaciji. Obično se
upotrebljava za odstranjivanje nekih stranih mirisa u količini 0.2 – 0.4 L mlijeka / hl vina.
48
Umjesto mlijeka za bistrenje bijelih vina može se upotrijebiti i čisti kazein u količini 5 –
20 g / hl, a njegovom primjenom može se odstraniti jedan dio željeza iz vina sklonih sivom
lomu, zatim spriječiti posmeđivanje bijelih vina. U crnim vinima djeluje slabije od
želatine.
Agar – agar - kada se unese u vino ponaša se kao koloidna tvar s negativnim
električnim nabojem, te je pogodan za vina sa sirkolažom, kao i sluzavih (tegljivih) vina.
Upotreba ovog sredstva za bistrenje vina pričinjava teškoće zbog toga što pri unošenju u
vino otopina agar – agara (1 %) mora imati najmanje temp. od 80 oC. Upotrebljava se u
količini od 5 – 30 g / hl.
7.1.1.3 Mineralna sredstva za bistrenje
Većina od ovih sredstava u vinu se ponaša kao koloidi sa više ili manje izraženim
adsorptivnim svojstvima (bentonit, španjolska zemlja i kaolin, kremična kiselina), dok se
samo kod nekih djelovanje ispoljava u vidu kemijskih reakcija sa sastojcima vina koje
želimo eliminirati (kalijferocijanid). U suvremenoj tehnologiji vina mineralna sredstva za
bistrenje su veoma zastupljena, a neka od njih su čak i potisnula i zamijenila organska
sredstva (npr. pojavom bentonita želatina i tanin izgubili su značaj koji su ranije imali).
Španjolska zemlja i kaolin
Ova dva sredstva su predstavnici gline, a njihova primjena za bistrenje vina se zasniva
na adsorptivnim svojstvima kaolinita (Al2O3 . 2 SiO2
. 2 H2O), kojeg ona sadrže u sebi.
Zbog mogućeg utjecaja na okus vina i smanjenje njegove kiselosti (jer sadrži Ca CO3),
španjolska zemlja hrvatskim važećim POV – u nije uvrštena među dopuštena sredstva i
odavna je i u nas i u svijetu zamijenjena boljima.
Iako je upotreba kaolina prema našem POV – u dopuštena, on se rijetko koristi s
obzirom da se odstranjivanje termolabilnih bjelančevina puno efikasnije provodi
bentonitom.
49
Bentonit
Po svom sastavu i bentonit je također vrsta gline, tzv. montmorilonit (tj. hidratizirani
alumosilikat). Primjena bentonita za bistrenje i stabilizaciju vina se zasniva na njegovim
adsorptivnim i elektrostatičkim svojstvima. Zahvaljujući svom negativnom
električnom naboju bentonit taloži termolabilni dio bjelančevina (na principu
međusobne koagulacije) i omogućuje proizvodnju stabilnog vina, smanjujući u stanovitoj
mjeri pojavu posmeđivanja. Naime bentonit odstranjuje i tirozinazu (endogenu
polifenoloksidazu iz grožđa). Eliminiranjem jednog dijela bjelančevina iz vina smanjuje se
i mogućnost taloženja ferifosfata i feritanata odnosno sulfida bakra (za čije je taloženje
potrebno prisustvo bjelačevina), i na taj način indirektno može u izvjesnoj mjeri umanjiti
mogućnost pojave prijeloma. Novijim istraživanjima ustanovljeno je da bentonit adsorbira
i neke ostatke pesticida, čime utječe na tijek vrenja i kakvoću budućeg vina.
Međutim ustanovljeno je i da bentonit djelomično blokira enzime, i na taj način
posredno smanjuje prelazak aromatskih tvari u mošt i vino, pa neki autori ne preporučuju
njegovu upotrebu u moštu, već samo u već prevrelim mladim vinima. Količina ovog
sredstva za bistrenje vina određuje se probom na malo, a najčešće iznosi 30 – 100 g / hl,
rjeđe i više. Na efekt bistrenja bentonitom utječe aciditet vina i sadržaj tanina, a u izvjesnoj
mjeri i temperatura.
Bentonit se prije dodavanja, u vino ili mošt, namače u vodi u omjeru 1 : 10 cca 12 sati.
Nakon toga dobro se promiješa da se razbiju grudice i dodaje vinu. Tijekom dodavanja
intenzivno se miješa s vinom kako bi se cijela masa dobro homogenizirala. Nakon 10 – 15
dana istalože se nečistoće i odvaja se bistro vino.
Kremična kiselina (silicijev dioksid)
Za bistrenje vina se upotrebljava u vidu 5 %, 10 % ili 15 % vodene otopine, u kojoj se
nalazi u koloidnom stanju s negativnim električnim nabojem. Upotrebljava se za bistrenje
vina siromašnih u taninu, zatim desertnih vina i vermuta, te sluzavih vina, i to u
kombinaciji sa želatinom (za bijela vina obično 2 – 3 g / hl želatine i 15 – 20 ml 15 %
otopine kremične kiseline).
50
Kalijferocijanid (plavo bistrenje)
Plavo bistrenje je naziv za postupak odstranjivanja teških metala (Fe, Cu, Zn i dr.) iz
vina primjenom kalijferocijanida, koji ih prevodi u netopljivo stanje. Ova sol nije otrovna
ali pod utjecajem kiselina u vinu se razlaže uz oslobađanje cijanovodične ili plave kiseline
(HCN), koja predstavlja jedan od najjačih otrova.
Mehanizam vezanja kalijferocijanida sa Fe u vinu je dosta složen, budući se željezo
nalazi u raznim oblicima (dvovalentno i trovalentno u vidu jednostavnih i složenih spojeva,
više ili manje disociranih). Shematski prikaz vezanja kalijferocijanida s ferifosfatom (koji
izaziva sivi prijelom u vinu):
1. K4Fe (CN)6 + FePO4 KFe . Fe (CN)6 + K3PO4
2. 3 KFe . Fe (CN)6 + FePO4 Fe4 [Fe(CN)6] 3 + K3PO4
Berlinsko plavetnilo, na ovaj način stvoreno, koloidne je prirode i negativnog je
električnog naboja, te je za njegovo taloženje potrebna nazočnost tvari s pozitivnim
nabojem (bjelančevine, kalij, kalcij). U odnosu na dvovalentni oblik, željezo u
trovalentnom obliku se sporije veže sa kalijfericijanidom uglavnom zato što se ono nalazi
u kompleksnim spojevima, koji su puno stabilniji od jednostavnih, slabo disociraju, tako da
u vinu ima relativno malo slobodnih Fe +++ jona koje bi kalijferocojanid mogao angažirati.
Količine potrebnog kalijferocijanida obvezno određuje ovlaštena stručna enološka
ustanova, a zbog opasnosti i složenosti djelovanja kalijferocijanida u vinu u nekim
zemljama nije dozvoljena primjena ovog postupka za bistrenje vina.
Primjena limunske kiseline - u zemljama u kojima je upotreba kalijferocijanida
zabranjena, korištenje limunske kiseline (u količini cca. 100 g / hl) predstavlja postupak
koji se primjenjuje za stabilizaciju vina sklonih sivom prijelomu. Ova kiselina u vinu s
trovalentnim Fe stvara kompleksne spojeve koji su vrlo stabilni i teško disociraju, te je
51
smanjena i mogućnost stvaranja slabo topljivog ferifosfata kao glavnog izazivača sivog
prijeloma u vinu.
Primjena fitinske kiseline - među sredstvima ove vrste od interesa su soli fitinske
kiseline poznate kao kalcij fitat i natrij fitat. Primjena ovih sredstava se zasniva na
svojstvima fitinske kiseline da sa trovalentnim željezom stvara netopljivi spoj ferifitat. Za
vina s normalnim sadržajem željeza uzima se 10 – 20 g / hl ovog sredstva (trgovačkog
naziva aferin), a za vina sa većim sadržajem Fe, dvaput veća količina preparata.
7.1.1.4 Primjena niskih i visokih temperatura za stabilizaciju vina
Mnogi sastojci vina ispoljavaju nestabilnost prema niskim i visokim temperaturama, pa
za njih kažemo da su termolabilni.
Stabilizacija vina hlađenjem: niskim temperaturama u stabilizaciji vina najefikasnije
možemo koristiti za taloženje soli vinske kiseline. Kristalizacija tartarata je potpunija
ukoliko je temperatura vina niža i bliža njegovoj točki smrzavanja (1 – 2 oC iznad te
točke). Prema Ribereau – Gayon i Peynaud (1961) do temperature hlađenja vina može se
doći po formuli:
% alkohola
T = - 1
2
Temperatura hlađenja vina općenito se kreće oko – 4 do – 5 °C, a dužina držanja vina u
izotermičkim cisternama iznosi obično 6 – 8 dana. Umjesto hlađenja, za zaštitu vina od
naknadnih taloženja tartarata može se upotrijebiti sredstvo poznato pod imenom
metavinska kiselina (do 10 g / hl), koja snagom adsorpcije koči stvaranje i taloženje
kristala soli vinske kiseline (striješa).
Primjena visokih temperatura (cca. 65 oC) – koristi se uglavnom za eliminiranje
spojeva koloidne prirode, a njome se može postići ne samo fizičko – kemijska, već i
biološka stabilnost vina. Međutim da bi se sačuvala aroma, bouqet i svježina vina postupci
pasterizacije vina uglavnom su napušteni, jer su ih uspješno zamijenili suvremeni načini
fine filtracije.
52
7.2 BIOLOŠKA STABILIZACIJA SLATKIH VINA
Po završetku alkoholnog vrenja u vinu ostaje najviše 1,5 – 2,5 g/l reducirajućeg šećera,
računajući u ovu vrijednost i pentoze koje ne podliježu fermentaciji. U zaostalom šećeru
najviše ima fruktoze, dok se eventualno prisustvo glukoze u vinu tumači kao rezultat
hidrolize glukozidnih oblika heterozida, naročito antocijana. Vina sa potpuno prevrelim
šećerom nazivaju se “suha” vina, a prema ZOV-u to su vina sa ostatkom neprevrelog
sladora do 4 g/l.
Pored ovih slučajeva u vinu može ostati više ili manje neprevrelog šećera. Izuzev
desertnih vina sa većim sadržajem šećera i alkohola, i vina uobičajenog sadržaja alkohola
mogu imati zaostalog šećera. Ovo su tzv. polusuha (4 – 12 g/l), poluslatka (12 – 50 g/l)
ili slatka vina ( > 50 g/l ostatka šećera). Kod ovih vina proces fermentacije namjerno ne
dovodimo do kraja, već ostavljamo da ostane neprevrio jedan dio šećera. Međutim
zadržavanje izvjesnih količina šećera za ova vina predstavlja stalnu opasnost od pojave
naknadne fermentacije (refermentacija). Kod vina sa ostatkom šećera moramo obaviti
odgovarajuće mjere biološke stabilizacije : tzv. “biološku sterilizaciju”; koja se zasniva na
osiromašenju mošta ili vina u tvarima neophodnim za ishranu kvasca (mineralne, naročito
dušične i vitaminske tvari), što se može postići na dva načina: višekratnom filtracijom ili
centrifugiranjem mošta na početku fermentacije (u stadiju intenzivnog razmnožavanja
kvasca) i primjenom izmjenjivača jonova. Ovaj se postupak primjenjuje u Italiji počev od
1865. godine pri proizvodnji poznatog pjenušavog i slatkog vina Asti spumante.
Umjesto reguliranjem režima ishrane kvasca, kao metode biološke prirode, zaštita
slatkih vina od naknadne fermentacije se može postići i primjenom sredstava sa
inhibitivnim djelovanjem na fermentacijsku aktivnost kvasca. To su razna kemijska
sredstva, kao što su: sumpordioksid (50 – 100 mg/l slobodnog SO2), sorbinska kiselina1
(do 200 mg/l).
1 Uporaba sorbata (koji djeluju fungicidno, što znači inhibiraju rad kvasca, ali ne i bakterija) smanjuje količinu potrebnog SO2, ali ga ne isključuje u cjelosti. Pod utjecajem bakterija mliječno kiselog vrenja, sorbati dodani vinu, ponekad se razgrađuju i daju vinu neugodan miris po pelargoniji, tzv. “geranium miris”. zato iz vina, kojima se dodaje sorbat moraju biti superfiltracijom u najvećoj mjeri odstranjeni kvasci, i navedene bakterije.
53
Osim bioloških i kemijskih metoda kojima se stvaraju nepovoljni uvjeti za aktivnost
kvasca u biološkoj stabilizaciji slatkih vina se primjenjuju i fizičke metode čija primjena
se zasniva na odstranjivanju kvasca iz vina putem EK – filtracije2 ili pasterizacije vina (40-
60 oC) neposredno prije punjenja u boce.
2 EK filtracija je postupak fine filtracije s celuloznim pločama, koje uz dubinsku i površinsku filtraciju, imaju i adsorpcijsku moć (zadržavaju mikroorganizme) pa se njome provodi hladna sterilizacija vina.
