TEMA-22. ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico

Mejor conocimiento molecular metabolismo

Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas

2. Herramientas analíticas Purificación de enzimas

3. Terapia enzimática Industria Biotecnológica

8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)

Conocimiento estructural y funcional

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico

a) La enzima debe estar presente en fluido biológico

b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida

c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlación con los valores patológicos.d) La enzima debe ser estable

Tipos de fluidos: Suero (Más común) y Orina

LCF, Pleura, Sinovial, etc

SUERO

1. Enzimas específicas

2. Enzimas no específicas

Enzimas su función radica en el plasma

Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc

Enzimas que son secretadas por los tejidos.

Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc.

Enzimas intracelulares. Daño Tisular Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo. Proliferación Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente

DIAGNOSTICOEnzima específica de tejidos (Raro)-Abundancia relativa Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)

- Patrón de enzimas característico- Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..

Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.

ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO

Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía

Creatina QuinasaAspartato aminotransferasaLactato deshidrogenasa

Valor en plasmaConcentración en tejidoVelocidad del vertidoGrado de degradación

Vida media 10 –130 horas

Test depende del tiempo del infartoCreatina Quinasa mas específicaLDH se puede diferenciar por electroforesis

Músculo esqueléticoMúsculo cardiaco (Mayor concentración)CerebroNo en el hígadoProteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B Músculo M-M (99%) y M-B (1%)Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%)Cerebro B-B (100%)

Pequeño Infarto M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)

Creatina quinasa

Lactato deshidrogenasa

Hígado, Corazón Inmunoblotting LDH-1Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.85 Normal >1 Enfermo

Transaminasas (ALT y AST)

Se utilizan poco actualmenteHígado AST/ALT (3-5)Corazón AST/ALT (20-25)

ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICASAspartato aminotransferasa (AST ó GOT)Alanina aminotransferasa (AST ó GPT)Fosfatasa alcalinaγ-Glutamil transferasa

Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etcTransaminasas

Fosfatasa alcalinaγ-Glutamil transferasa

4-nitrofenil fosfato Visible

Enfermedades hepáticas HepatitisCirrosisTumoresObstrucción del conducto biliar

CrónicasAgúdas Intermitentes

USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS

-Diagnóstico de enfermedades-Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas)-Seguimiento de operaciones hepáticas

TRANSAMINASASNo específicas del plasma

Células parenquimales Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Vertido al plasma

Hepatitis, cirrosis Progreso de la enfermedad

FOSFATASA ALCALINANo específicas del plasma

Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos ISOENZIMAS

Daños en las células del conducto biliar

Ratio Fosf.Alc/TransaminasasHepatitis 0,2-0,6Obstrucción del 10-20conducto biliar

γ-GLUTAMIL TRANSFERASA

Cataliza reacciones de destoxificaciónutilizando glutation

CarcinogénicosAgentes de quimioterapiaParacetamolXenobióticosContenido alto 5%

Vida media corta 90 minMarcador muy rápido y sensible de daño hepático

GLUTATION TRANSFERASA

Alcoholismo crónico

Incremento síntesis y en la secreción

Cirrosis

Tiempo de la ProtrombinaFunción hepáticaTiempo requerido para la activación de la protrombina en TrombinaIndica grado de funcionamiento hepáticoFactores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la sangre

Trombina Cataliza el proceso de coagulación

OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO

α-AMILASAPáncreasGlándulas salivares

Suero normal Baja actividadSuero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)

Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)

Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular

CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASAIndicadores de desordenes en la musculatura esquelética

Músculo esquelético, cardiaco, CerebroCreatina quinasa

Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso, infarto de miocardio, daño cerebral, etcISOENZIMAS

Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos)Significado clínico menor Precaución (contaminación Glb rojos)

FOSFATASA ALCALINADiagnóstico de obstrucción del conducto biliar Enfermedades de huesosIncremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos)

Osteomalacia RaquitismoHiperparatiroidismoEnfermedad denominada hipofosfatasia Actividad

Pirofosfatos inorgánico (substrato) Crecimiento cristales de hidroxiapatitoNo estrictamente Isoenzimas Osteoblastos, Hígado, Intestino, Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciación Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores, Calor

FOSFATASA ACIDALocalización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc Diagnostico de carcinoma de PróstataPrecaución en el muestreo - Lábil - Contaminación con FA de eritrocitos

Diferenciación isoformas - Sensibilidad sustratos - Uso de inhibidores específicos: Formaldehido eritrocitos

2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN

DE METABOLITOSUso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analíticamente

VentajasLa enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de otras sustancias Evita la purificación necesaria en un análisis químico

Sustancias lábiles

InconvenientesEl costo de la enzimas Inmovilización Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo

Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc

Puntos importantes para utilizar una enzima1. La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido

Equilibrio no favorablea) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática

b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa

2. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km.

3. La especificidad de la enzima debe ser conocida

4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)

Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosaDeterminación de glucosa

Métodos enzimáticos1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa

NADPH Cambio 340 nmEspecificidad segundo paso

Visible (Más utilizado)Más interferencias productos

sangre3. Glucosa deshidrogenasa

Determinación de ácido úrico

Diagnóstico de la gotaMétodo químico y enzimático

Actualmente sólo se utiliza el enzimáticoAbsorbancia (293 nm) Alantoina; Consumo de O2Acoplado a peroxidasa (H2O2)

Falta especificidad

Determinación de urea

Determinación de colesterol y trigliceridos

Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardioMétodo químico (colorimétrico) No específico, contaminante

EsteresaColesterol oxidasaPeroxidasa

Absorción a 500 nmTrigliceridos

Colesterol

Test de la función renal: Suero y orina Capacidad de filtración glomerular

UREA Carbonato amónico. NH4 Acoplado con glutamato DH NADH

Ureasa

Seguimiento: Diabetes Mellitus, Nefrosis, obstrucción biliar, etc

Otros metabolitosCreatinaCreatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa

Amonio Glutamato deshidrogenasa

Tiamina difosfato en eritrocitosEnsayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminasEnsayo diagnostica deficiencia en vitaminas

MalnutriciónEncefalopatía de Wernicke´sTransquetolasa Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina Enfermos : Actividad al añadir Tiamina

ENZIMA INMUNOENSAYO

Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal

Hormonas, drogas,proteínas, etc Identifican con un anticuerpo.

Anticuerpos son unidos a una enzima: Fácilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. etc

Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,

3. Terapia enzimática

Principales áreas de trabajo - Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre - Enfermedades genéticas - Cáncer

Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina, Bromelaina, Hialuronidasa).

Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.

Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas

Forma de administración Eliminación de metabolitos (sangre) Endógena: Estreptoquinasa

Exógena: Ureasa Bilirrubina oxidasaPosibilidad de usar enzimas inmovilizadas

Tratamiento de Enfermedades genéticas

Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas Enfermedad de Gauchers GlucosilceramidasaAcumula un glucocerebrosido en los macrófagos Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes

Pancreatitis Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan

Fibrosis císticaDefecto genético proteína transmembrana (1/2000).Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etcConducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitisTubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).

Xeroderma pigmentosoDefecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UVDefecto mecanismo reparador del ADNTratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas

Cáncer

Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica Leucemia aguda granulocítica

Tumores Necesitan asparraginaEnzima en plantas, animales y bacteriasAusente del suero de los mamiferosTratamiento en combinación con quimioterapia

Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.

Glutaminasa

Serina hidratasa

Fenilalanino amonio liasa

Leucina dehidrogenasa

Experimentación posibles agentes anticancerígenos

Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero

Activación de prodrogas

Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta que son específicamente activadas.Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicasMetrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN

EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS

Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT

Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPTLa enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector

4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS

Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticosMás de 400 deficiencias

Identificación de un metabolito Ej. Fenilcetonuria FenilpiruvatoBiopsia del tejido y medida de la actividadPruebas en el ADN

FENILCETONURIADéficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa

Retraso mental Prevención dieta

Detección precoz es muy importante

INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)

Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa

Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre

Inhibición de la xantina oxidasaGota Niveles de ácido úrico Metabolismo de las Purinas

Xantina Ácido úrico

Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa

Inhibidores antiretrovirales

nhibidores de la proteasa.

Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.Enzima proteasa cataliza la ruptura de la poliproteína que encápsula el virus.

Necesarios para completar su proceso de replicación dando lugar a nuevos virus

Dimero de 99 aminoacidos

Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa

Centro activo en el centro de la molécula

Inhibidores análogos del substrato Cambio en el enlace peptídico por un isoester

Conclusiones

Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico

Enzimas estimación de metabolitos

Equipamiento más sofisticado gran automatización Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN

Procesos tecnológicos:

Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc

Estudios estructurales Diseño de inhibidores

Terapia enzimática Tecnología de ADN