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2

3

A mi madre, por el amor.

A mi padre, por la ausencia.

AGRADECIMIENTOS A mi madre quien siempre crey en que podra alcanzar estas metas que me he trazado y que nunca me retir el apoyo, la confianza y sobre todo el amor. A mi sobrino Miguel ngel por su cario. Al profesor Carlos Ariel Cardona quien me hizo partcipe de este proyecto y me gui a lo largo de este proceso de aprendizaje. Al profesor Juan Carlos Higuita cuya insistencia y motivacin me permitieron desarrollar este trabajo de forma seria y profesional. Al profesor Javier Fontalvo cuyas palabras de aliento me impulsaron a seguir este camino tan fascinante y tan lleno de desafos. Al profesor Eric S. Fraga quin desde la distancia me ha impulsado y apoyado en darle continuidad a este trabajo. A la profesora Gloria Ins Giraldo por su colaboracin. Al Ing. Julin Andrs Quintero por colaborarme de forma incondicional en el desarrollo de esta tesis. A mis amigos y compaeros de trabajo Juan Pablo Mariscal y Mauricio Naranjo con quienes empec este proceso y con los que tuve el placer de trabajar. A la Ing. Natalia Salgado y al personal de la planta piloto de biotecnologa y agroindustria por su colaboracin. A la Universidad Nacional de Colombia por sus programa de becas de estudiantes sobresalientes de posgrado del cual me hicieron beneficiario. A la Gobernacin de Caldas por el apoyo econmico brindado a travs del proyecto ARCANO. A la DIMA por financiar parte de esta tesis. A Victor, mi parcero, mi hermano, quien inici este proceso conmigo y hoy concluimos con unas metas por alcanzar esperando que un da nuestros caminos se vuelvan a cruzar. A Alexa, quien me brind su amistad y su apoyo de forma incondicional y quien me ha mostrado el valor de la verdadera amistad.

5

A Sebas, quien ha sido un soporte y una persona con la que siempre he podido contar. A Adrian, por los momentos de alegra y de amistad. A todos mis compaeros y familiares que creyeron en mi y en que poda alcanzar esta meta.

6

TABLA DE CONTENIDO

NDICE DE TABLAS .............................................................................................. 11

NDICE DE FIGURAS ............................................................................................ 13

INTRODUCCIN ................................................................................................... 15

ABREVIATURAS ................................................................................................... 17

OBJETIVOS ........................................................................................................... 18

Objetivo general. .................................................................................................... 18

Objetivos especficos. ............................................................................................ 18

CAPITULO 1. BIOMASA LIGNOCELULSICA: CARACTERIZACIN DE LA

ZOCA DE CAF .................................................................................................... 19

Resumen ............................................................................................................... 19

Abstract .................................................................................................................. 19

1 INTRODUCCIN ............................................................................................ 20

2 TIPOS DE BIOMASAS LIGNOCELULSICAS .............................................. 20

2.1 Residuos agrcolas. .................................................................................. 21

2.2 Subproductos de procesos agrcolas. ....................................................... 21

2.3 Cultivos destinados a la generacin de energa. ...................................... 22

3 MTODOS DE CARACTERIZACIN DE MATERIAL LIGNOCELULSICO . 23

3.1 Determinacin de componentes extractivos orgnicos. ............................ 23

3.2 Determinacin de lignina insoluble en cido. ............................................ 23

3.3 Determinacin del contenido de holocelulosa. .......................................... 24

3.4 Determinacin de celulosa y hemicelulosa. .............................................. 24

3.5 Determinacin de Lignina soluble en cido. ............................................. 25

4 CARACTERIZACIN DE LA ZOCA DE CAF ............................................... 26

7

5 TCNICAS DE PRETRATAMIENTO DE MATERIALES

LIGNOCELULSICOS .......................................................................................... 29

6 REFERENCIAS .............................................................................................. 31

CAPITULO 2. BIOQUMICA DE LAS FERMENTACIONES A PARTIR DE

MATERIALES LIGNOCELULSICOS ................................................................... 33

Resumen ............................................................................................................... 33

Abstract .................................................................................................................. 33

1 INTRODUCCIN ............................................................................................ 34

2 HIDRLISIS ENZIMTICA ............................................................................. 35

2.1 Actividad enzimtica. ................................................................................ 35

2.2 Mecanismos de accin enzimtica. .......................................................... 37

3 BIOQUIMICA DE LOS MICROORGANISMOS FERMENTADORES ............. 39

3.1 Fermentacin de azcares simples por levaduras y bacterias. ................ 40

3.1.1 Levaduras. ......................................................................................... 40

3.1.2 Bacteria. ............................................................................................. 41

4 FACTORES QUE AFECTAN EL DESEMPEO DE LOS

MICROORGANISMOS EN LA PRODUCCIN DE BIOETANOL .......................... 45

4.1 Inhibicin por producto. ............................................................................. 45

4.2 Temperatura. ............................................................................................ 45

4.3 Condiciones de aireacin. ......................................................................... 46

5 MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCIN DE

ETANOL ................................................................................................................ 47

6 REFERENCIAS .............................................................................................. 49

CAPITULO 3. OBTENCIN EXPERIMENTAL DE ETANOL A PARTIR DE ZOCA

DE CAF ............................................................................................................... 52

8

Resumen ............................................................................................................... 52

Abstract .................................................................................................................. 52

1 INTRODUCCIN ............................................................................................ 53

2 MATERIALES Y REACTIVOS ........................................................................ 54

2.1 Materiales. ................................................................................................ 54

2.2 Reactivos. ................................................................................................. 54

3 MTODOS DE SEGUIMIENTO DE VARIABLES ........................................... 56

3.1 Mtodo de DNS. ....................................................................................... 56

3.1.1 Preparacin de solucin (stock) de glucosa (0.4%). .......................... 56

3.1.2 Preparacin del DNS. ......................................................................... 56

3.1.3 Determinacin de azcares en la muestra problema. ........................ 57

3.2 Cromatografa de gases. .......................................................................... 58

3.3 Conteo de clulas usando la cmara de Neubauer. ................................. 59

3.3.1 Procedimiento. ................................................................................... 61

3.4 Determinacin de biomasa por peso seco. ............................................... 63

4 MTODOS DE PRETRATAMIENTO .............................................................. 64

4.1 Hidrlisis con cido diluido. ....................................................................... 64

4.2 Hidrlisis alcalina. ..................................................................................... 64

4.3 Autoclave. ................................................................................................. 64

5 CARACTERIZACIN DE LA MATERIA PRIMA EMPLEADA ......................... 66

6 DESCRIPCIN DEL PROCESO DE OBTENCIN DE ETANOL ................... 67

6.1 Reduccin de tamao. .............................................................................. 68

6.2 Pretratamiento. ......................................................................................... 68

6.3 Detoxificacin y neutralizacin. ................................................................. 69

9

6.4 Lavado de slidos y preparacin de la solucin Buffer. ............................ 69

6.5 Hidrlisis enzimtica. ................................................................................ 70

6.6 Fermentacin. ........................................................................................... 72

6.6.1 Candida lusitaniae ATCC 34449. ....................................................... 72

6.6.2 Pichia stipitis NRRL Y-7124. .............................................................. 73

6.6.3 Zymomonas mobilis NRRL B-806. ..................................................... 74

6.6.4 Preparacin del preinculo. ................................................................ 75

7 CONCLUSIONES ........................................................................................... 82

8 REFERENCIAS .............................................................................................. 83

CAPITULO 4. EVALUACIN ECONMICA DEL PROCESO DE PRODUCCIN

DE ETANOL A PARTIR DE ZOCA DE CAF ........................................................ 84

Resumen ............................................................................................................... 84

Abstract .................................................................................................................. 84

1 INTRODUCCIN ............................................................................................ 85

2 DESCRIPCIN DEL PROCESO .................................................................... 86

3 MODELOS CINTICOS ................................................................................. 88

3.1 Pretratamientos DA y LHW. ...................................................................... 88

3.2 Detoxificacin. .......................................................................................... 89

3.3 Fermentacin de doble sustrato. .............................................................. 90

4 APROXIMACIN METODOLGICA .............................................................. 92

5 PROCEDIMIENTO DE SIMULACIN ............................................................ 92

6 RESULTADOS Y DISCUSIONES .................................................................. 96

6.1 Proceso de produccin de etanol. ............................................................ 96

6.2 Sistema de cogeneracin de energa. ...................................................... 98

10

6.3 Costo de produccin de etanol. ................................................................ 99

6.4 Costo de cogeneracin de energa. ........................................................ 100

7 ANLISIS DE IMPACTO AMBIENTAL ......................................................... 102

8 CONCLUSIONES ......................................................................................... 105

9 REFERENCIAS ............................................................................................ 107

CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................... 108

11

NDICE DE TABLAS Tabla 1. Contenido de Celulosa, Hemicelulosa y Lignina en algunos residuos

agrcolas (% p/p peso seco) ............................................................................................ 21

Tabla 2. Contenido de Celulosa, Hemicelulosa y Lignina en subproductos de

procesos agrcolas (% p/p peso seco). ......................................................................... 21

Tabla 3. Contenido de Celulosa, Hemicelulosa y Lignina en cultivos destinados a

la produccin de energa (% p/p peso seco). ............................................................. 22

Tabla 4. Resultados de la caracterizacin de la Zoca de caf obtenida por

Agudelo, R. A (2009) (% p/p peso seco Desviacin Estndar), [27]. .................... 27Tabla 5. Resultados de la caracterizacin de la Zoca de caf obtenida por

Rodrguez, N (2009) en el Centro Nacional de Investigaciones en Caf (Cenicaf)

(% p/p peso seco), [28]. .................................................................................................. 28

Tabla 6. Mtodos de pretratamiento para materiales lignocelulsicos. ................... 30

Tabla 7. Enzimas empleadas en la hidrlisis de celulosa. ......................................... 38

Tabla 8. Microorganismos productores de etanol. ....................................................... 39

Tabla 9. Soluciones patrn para la elaboracin de la curva de calibracin del

mtodo de DNS. ................................................................................................................ 57

Tabla 10. Curva de calibracin con glucosa anhidra para el mtodo DNS. ............ 58

Tabla 11. Mtodos de pretratamiento aplicados a CCS. ............................................ 65

Tabla 12. Composicin de CCS obtenida en este trabajo (% p/p peso seco). ....... 66

Tabla 13. Seguimiento hidrlisis enzimtica. ................................................................ 71

Tabla 14. Cantidad de nutrientes requeridos para la fermentacin con levaduras. 75

Tabla 15. Cantidad de nutrientes requeridos para la fermentacin con

Zymomonas mobilis. ......................................................................................................... 76

Tabla 16. Resultados obtenidos de la fermentacin de hidrolizados de CCS con

Candida lusitaniae ATCC 34449. ................................................................................... 77

Tabla 17. Resultados obtenidos de la fermentacin de hidrolizados de CCS con

Pichia stipitis NRRL Y-7124. ........................................................................................... 77

12

Tabla 18. Resultados obtenidos de la fermentacin de hidrolizados de CCS con

Zymomonas mobilis NRRL B-806. ................................................................................. 78

Tabla 19. Rendimientos de produccin de etanol. ....................................................... 81

Tabla 20. Parmetros cinticos usados en la etapa de pretratamiento. .................. 89

Tabla 21. Parmetros cinticos para el modelo matemtico de fermentacin de

glucosa/xilosa = 0.65. .................................................................................................... 91

Tabla 22. Principales datos para la simulacin del proceso de produccin de etanol

a partir de CCS. ................................................................................................................. 93

Tabla 23. Flujos y composiciones de algunas corrientes en la produccin de etanol

a partir CCS. ....................................................................................................................... 97

Tabla 24. Consumo de energa en la produccin de etanol a partir de CCS. ......... 98

Tabla 25. Principales emisiones atmosfricas provenientes del sistema de

cogeneracin. ..................................................................................................................... 99

Tabla 26. Costos de produccin de etanol a partir de CCS. ...................................... 99

Tabla 27. Costo de produccin de etanol a partir de CCS incluyendo el sistema de

cogeneracin. ................................................................................................................... 100

Tabla 28. Costo de produccin de etanol a partir de CCS incluyendo la

cogeneracin y considerando nicamente el costo de transporte de materia prima.

............................................................................................................................................ 100

Tabla 29. Costos de produccin de etanol a partir de CCS considerando el sistema

de cogeneracin. ............................................................................................................. 101

13

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Zoca de caf CCS sin moler. ...................................................................... 27

Figura 2. Estructura de la celulosa. Ntese que la cadena polimrica consiste de n

monmeros de glucosa, [6]. ............................................................................................ 36

Figura 3. Estructura de la hemicelulosa, [7]. ................................................................. 36

Figura 4. Estructura de la lignina. [8]. ............................................................................ 37

Figura 5. Ruta metablica de la produccin de etanol en S. cerevisiae. ................. 41

Figura 6. Ruta metablica de la produccin de etanol en la Z. mobilis. ................... 43

Figura 7. Curva de calibracin para el mtodo DNS. La lnea punteada representa

el ajuste lineal de los datos. ............................................................................................. 58

Figura 8. Curva de calibracin y lnea de tendencia cromatografa de gases. ....... 59

Figura 9. Zona de conteo de clulas en la cmara de Neubauer. ............................ 60

Figura 10. Vista de la zona de conteo de clulas en la cmara de Neubauer en

objetivo 4.x. ........................................................................................................................ 61

Figura 11. Vista de la zona de conteo de clulas en la cmara de Neubauer en

objetivo 40.x. ...................................................................................................................... 62

Figura 12. Orden sugerido de conteo. ........................................................................... 62

Figura 13. Diagrama de flujo del proceso de produccin experimental de etanol.. 67

Figura 14. Formacin de azcares reductores en la etapa de hidrlisis enzimtica.

.............................................................................................................................................. 71

Figura 15. Cultivo de Candida lusitaniae ATCC 34449. ............................................. 73

Figura 16. Cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124. ..................................................... 74

Figura 17. Cultivo de Zymomonas mobilis NRRL B-806. ........................................... 75

Figura 18. Distribucin de productos en la produccin de etanol a partir de

hidrolizados de CCS usando Candida lusitaniae ATCC 34449. ................................ 78

Figura 19. Distribucin de productos en la produccin de etanol a partir de

hidrolizados de CCS usando Pichia stipitis NRRL Y-7124. ........................................ 79

Figura 20. Distribucin de productos en la produccin de etanol a partir de

hidrolizados de CCS usando Zymomonas mobilis NRRL B-806. ............................. 79

14

Figura 21. Consumo del sustrato por cada una de las cepas empleadas en el

desarrollo de esta tesis. ................................................................................................... 80

Figura 22. Produccin de etanol por cada una de las cepas empleadas en el

desarrollo de esta tesis. ................................................................................................... 80

Figura 23. Diagrama del proceso de obtencin de etanol a partir de CCS usando

DA o LHW como pretratamiento. .................................................................................... 86

Figura 24. Modelo cintico de la despolimerizacin de la hemicelulosa en xilosa y

productos de degradacin. kf, ks y kx son las constantes cinticas de primer orden

para la hidrlisis rpida, lenta y la despolimerizacin de la xilosa en productos de

degradacin, respectivamente. ....................................................................................... 88

Figura 25. Energa requerida por cada etapa involucrada en el proceso de

obtencin de etanol a partir de CCS usando DA y LHW como pretratamiento. ..... 98

Figura 26. ndice PEI por unidad de masa de producto en el proceso de

produccin de etanol incluyendo el sistema de cogeneracin de energa. ........... 102

Figura 27. PEI que se genera del sistema por masa de producto por categoras.

............................................................................................................................................ 103

15

INTRODUCCIN La produccin de biocombustibles es una alternativa que se est investigando actualmente con la cual se busca reducir el uso de fuentes fsiles cuyas emisiones causan el efecto invernadero. La importancia de producir alcohol radica en que es una forma limpia de energa y ms all de esto que la produccin de este metabolito provenga de fuentes renovables que permitan que esta tecnologa sea autosostenible y en cierta manera inagotable. Actualmente en el mundo muchos pases se destacan por la produccin de etanol. De acuerdo con Balat, M et al. (2009) los principales productores de etanol en el mundo son: USA con 18.3 billones de litros en 2006 seguido por Brasil con 17.5 billones de litros y China con 1 billn de litros. La tendencia actual muestra que estos pases y otros ms estn mostrando un creciente inters en las tecnologas de produccin de etanol a partir de fuentes renovables. Las principales fuentes de produccin de etanol de estos pases de acuerdo con Escobar, J.C. et al. (2009) son caa de azcar y maz. Aunque si bien esto es algo positivo en cuanto al mejoramiento de la calidad de vida de los seres humanos y el cuidado del medio ambiente, no estamos viendo el cuadro completo. Las fuentes de produccin de etanol son tan vastas que van desde desechos slidos municipales, residuos agrcolas, material desechado como papelera, maderas, entre otras, y ninguna de estas est enfocada a la produccin de etanol, de hecho ninguna de estas materias primas tiene algn uso definido. Es por esta razn que la investigacin actual busca aprovechar estos materiales para optimizar la produccin de etanol y con esto solucionar no solo el problema de emisiones de gases a la atmosfera sino tambin tratar el manejo de desperdicios y residuos slidos producidos por el hombre. En este trabajo de tesis de maestra se busca implementar las tcnicas y metodologas para materiales lignocelulsicos desarrollados por muchos autores para la produccin de bioetanol a partir de la madera del rbol del caf, conocida comnmente como Zoca o CCS, la cual es un residuo agricola de la renovacin del cultivo de caf. En Colombia, segn el Centro de Investigaciones sobre el Caf (Cenicaf) la produccin de esta madera es de 3,2 toneladas/ao-hectrea, lo cual es una cantidad muy grande de materia prima. Los usos actuales de estos materiales van desde incineracin para la produccin de cenizas para la renovacin de suelos y para la generacin de energa por combustin. Como se mostrar ms adelante en este trabajo la combustin de esta materia prima lejos de ayudar al medio ambiente produce muchos gases de combustin nocivos. Otra prctica comn que hacen los caficultores con esta madera es la acumulacin en terrenos de relleno. Si bien este material no ha sido ampliamente investigado y actualmente no presenta una aplicacin inmediata a la industria, representa una alternativa viable dado su enorme potencial orgnico. En esta tesis se mostrar con ayuda de software especializado que la implementacin de la Zoca de caf en la industria

16

del etanol es rentable y segura para el medio ambiente. Tambin en esta tesis se mostrar a nivel experimental el desempeo de tres microorganismos especializados en la transformacin de los hidrolizados obtenidos de CCS y los rendimientos de produccin de etanol de cada uno de ellos. La justificacin de este tipo de trabajos es el de innovar y el de permitir que la industria colombiana se desarrolle perfilando al pas como un productor grande de etanol dado sus recursos naturales los cuales son tan grandes. Es importante fomentar este tipo de investigaciones ya que crea una conciencia de conservacin y de mejoramiento de la calidad de vida. Tambin cabe recalcar que estas propuestas buscan fomentar y apoyar a la industria en Colombia y as mismo probar que los procesos biotecnolgicos en los cuales se emplean residuos agroindustriales pueden llegar a ser competitivos frente a los combustibles tradicionales y que los costos de produccin son mucho ms bajos y causan un impacto negativo menor en el medio ambiente.

17

ABREVIATURAS ADH Enzima Alcohol Deshidrogenasa ATP Adenosin Trifosfato utilizado para suministrar energia a organismos vivos CCS Coffee Cut-Stems (Zoca de caf)

CCS-CP Precio de CCS asumiendo que el precio de la materia es US$0.045/kg CCS-TP Precio de CCS asumiendo nicamente costo de transporte por valor de US$0.005/kg.

DA Pretratamiento de cido Diluido DNS cido 3,5-Dinitrosalicilico ED Va metablica de produccin de Etanol para bacterias EntnerDoudoroff

EDA Enzima 2-Keto-3-Deoxy-Gluconato Aldolasa EDD 6-Fosfogluconato Deshidratasa EMP Va metablica de la levadura en la produccin de Etanol ENO Enzima Enolasa

FBPA Enzima Fructosa Bifosfato Aldolasa FK Enzima Fructoquinasa

GAPDH Enzima Gliceraldehdo-3-Fosfato Aldolasa GFOR Enzima Glucosa-Fructosa Oxidoreductasa

GK Enzima Glucoquinasa GNTK Enzima Gluconato Quinasa GPDH Enzima Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa

HA Pretratamiento de Hidrlisis Alcalina HK Enzima Hexoquinosa

HMF Hidroxi Metil Furfural INVB Enzima Invertasa KDPG Enzima 2-Keto-3-Deoxy-6-Fosfogluconato LEVU Enzima Levansacarasa LHW Pretratamiento con Agua Lquida Caliente (Liquid Hot Water) PDC Enzima Piruvato Descarboxilasa PFK Enzima Fosfofructoquinasa PGI Enzima Fosfoglugosiomerasa PGK Enzima Fosfoglicerato Quinasa PGL Enzima Fosfogluconolactonasa PGM Enzima Fosfogliceromutasa PYK Enzima Piruvato Quinasa TPI Enzima Triosa Fosfato Isomerasa

18

OBJETIVOS

Objetivo general. Evaluar experimental y econmicamente la produccin de bioetanol a partir de desechos lignocelulsicos tales como la Zoca de caf (CCS).

Objetivos especficos.

Caracterizar y estandarizar los residuos lignocelulsicos provenientes del cultivo de caf empleando las tcnicas de cuantificacin para cada uno de sus compuestos qumicos.

Seleccionar los microorganismos ms aptos para la produccin de etanol a partir de los hidrolizados producidos a partir de la Zoca de caf.

Adecuar y acondicionar el medio de cultivo y las condiciones de operacin necesarias para un mejor crecimiento de los microorganismos que han de ser empleados en el proceso de obtencin de etanol.

Evaluar el rendimiento del proceso de obtencin de etanol y efectuar un anlisis econmico empleando software especializado para determinar la viabilidad y rentabilidad de esta tecnologa.

19

CAPITULO 1. BIOMASA LIGNOCELULSICA: CARACTERIZACIN DE LA ZOCA DE CAF

Resumen Los materiales lignocelulsicos han sido motivo de una extensa investigacin en la produccin de etanol como una alternativa a los combustibles fsiles los cuales son altamente contaminantes y principales causantes del efecto invernadero. En este captulo, una definicin de materiales lignocelulsicos se presenta en trminos de los tres principales componentes qumicos que la conforman (Celulosa, Hemicelulosa y Lignina). Algunas tcnicas empleadas en la determinacin de dichos componentes son mostradas a lo largo de este captulo para los tallos de la planta de caf (CCS) y algunos resultados obtenidos por otros autores son mostrados.

Abstract Lignocellulosic biomass has been applied in ethanol production as an alternative to fossil fuels. In this chapter, the raw material is described in terms of chemical characterization which is an anticipated measure of the yield of further ethanol production. Three major components have been discriminated for these kinds of materials: Cellulose, Hemicellulose and Lignin. All the techniques employed in the determination of these components are described in this chapter and different results obtained by other authors are shown. Key words: CCS, Lignocellulosic, Biomass, Ethanol, Characterization, Cellulose, Hemicellulose, Lignin

20

1 INTRODUCCIN

En los ltimos aos, los materiales lignocelulsicos han sido ampliamente investigados para la produccin de etanol con el fin de cortar la dependencia sobre los combustibles convencionales los cuales generan muchos problemas de contaminacin ambiental. Algunos de los materiales son residuos generados por el hombre que no presentan un uso directo como son los desechos slidos urbanos, la pulpa de papel, maderas duras y maderas blandas. Algunos materiales son cultivos destinados nicamente a la produccin de energa como son los campos de maz y finalmente otras materias primas son resultado de procesos previos siendo un buen ejemplo el bagazo de caa de azcar. Cualquiera que sea el caso de inters, cualquier material lignocelulsico posee un gran potencial orgnico y representa una alternativa innovadora para la produccin de etanol. Los tres principales componentes de este tipo de materias primas (Celulosa, Hemicelulosa y Lignina) son caracterizados junto con otros componentes como por ejemplo las cenizas. En este captulo, se describen algunas de las tcnicas ms empleadas para este propsito son y se muestran resultados para la caracterizacin de la Zoca de caf (CCS). La celulosa es un polmero de glucosa que contiene cadenas lineales de unidades de (1,4) D glucopiranosa, las cuales estn unidas en una configuracin 1-4 con un peso molecular promedio de 100.000 g/mol. La hemicelulosa es un complejo de polisacridos que coexiste con la celulosa en la pared celular del material con un peso molecular promedio de 30.000 g/mol y la lignina es un polmero aromtico mononuclear altamente ramificado sustituido en la pared celular de algunos materiales y normalmente se encuentra muy cerca de las fibras de celulosa que forma complejos lignocelulsicos, [1]. La celulosa est atrapada en la ramificacin de la estructura de la lignina debido a su cristalinidad, la cual representa el obstculo ms grande en el proceso de hidrlisis de los polmeros de glucosa. La mayora de los pretratamientos son utilizados para romper la matriz de la pared celular, degradar la estructura de la lignina y liberar la celulosa y la hemicelulosa y as cuantificar los componentes principales del material lignocelulsico, [2].

2 TIPOS DE BIOMASAS LIGNOCELULSICAS

La clasificacin de los materiales lignocelulsicos es la siguiente:

Residuos agrcolas. Subproductos de procesos agrcolas.

21

Cultivos destinados a la generacin de energa.

2.1 Residuos agrcolas. Este tipo de materiales lignocelulsicos se generan como resultado de procesos de la agroindustria, como son por ejemplo frutos, cscaras, desechos de animales por mencionar solamente algunos. En pases como Colombia estos materiales son muy abundantes y no tienen una aplicacin directa en la industria de la manufactura de productos de alto valor agregado diferente al de abonos orgnicos. Estos materiales son generados en grades cantidades y son de fcil adquisicin y bajo costo por lo que los gastos de operacin del proceso de produccin de etanol disminuyen notablemente. Tambin se reduce la contaminacin causada por estos materiales al ser desechados, ya que se aprovecha toda la materia prima disponible en la generacin de otras formas de energa. Algunos materiales se muestran en la Tabla N 1:

Tabla 1. Contenido de Celulosa, Hemicelulosa y Lignina en algunos residuos agrcolas (%

p/p peso seco)

Material Celulosa Hemicelulosa Lignina Referencia Paja de cebada 36,8 17,2 12,3 [3] Restos de maz 36-39 21-22 19-20 [4, 5, 6] Paja de arroz 32-47 19-27 5-24 [4, 7, 8, 9] Paja de trigo 15-40 25-35

22

2.3 Cultivos destinados a la generacin de energa. Son cultivos de productos que se emplean nicamente en la generacin de biocombustibles. La Tabla N 3 muestra algunos ejemplos de estos materiales y la composicin qumica de los mismos:

Tabla 3. Contenido de Celulosa, Hemicelulosa y Lignina en cultivos destinados a la produccin de energa (% p/p peso seco).

Material Celulosa Hemicelulosa Lignina Referencia lamo hbrido 39-43 15-18 27-28 [4, 19]

Sauce 32-43 19-22 16-27 [4, 19, 20, 21] Heno 32-33 18-19 21-22 [22, 23]

23

3 MTODOS DE CARACTERIZACIN DE MATERIAL LIGNOCELULSICO Para poder lleva a cabo este objetivo, es necesario contar con el material lignocelulsico que se desea degradar, como en el caso de este trabajo, la zoca de caf CCS. Estos residuos han de ser adquiridos a travs de fincas cafeteras en el municipio de Chinchin, Caldas. Los mtodos de caracterizacin de los componentes qumicos de este material se encuentran descritos a lo largo de esta seccin. Estos mtodos permitirn cuantificar los componentes del material a fin de emitir criterios de trabajo y posteriormente, criterios de seleccin de microorganismos fermentadores. Antes de realizar cualquier anlisis de contenido qumico de CCS, el contenido de slidos totales debe ser determinado de acuerdo a las normas sugeridas por el Laboratorio Nacional de Energa Renovable (NREL) en la seccin (LP-001) y se denomina (Tfinal), [24]. 3.1 Determinacin de componentes extractivos orgnicos. La determinacin de extractivos solubles en etanol-benceno se lleva a cabo de acuerdo con la norma TAPPI 204 os-76. Aproximadamente 4 g de madera molida seca se depositan en un dedal de extraccin. El dedal se coloca en un equipo de extraccin tipo Soxhlet con 150 ml de una mezcla de alcohol-benceno (1:2 v/v) y se ajusta el calentador de tal forma que la velocidad de evaporacin recircule el solvente 6 veces por hora. Despus de 24 horas, el solvente se evapora a un volumen de 20 a 25 ml y se transfiere el extracto a un crisol de peso conocido, lavndolo con pequeas cantidades de solvente fresco. Despus se seca por 1 hora a 105 3 C. Una determinacin en blanco se llevo a cabo para conocer el peso del residuo del solvente.

e rs

m

(P -P )Extractivos (%) = P

Ec. (1)

Donde: Pe: Peso seco del extracto. Prs: Peso seco del residuo del solvente. Pm: Peso seco de la muestra de madera. 3.2 Determinacin de lignina insoluble en cido. Se determina usando la norma TAPPI T222 os-74. Se usan 200 mg de material libre de extractivos, se agregan 2 ml de H2SO4 al 72 % (p/p). Se mezcla durante

24

60 min a 30C. Luego se agregan 56 ml de agua destilada lo cual hace que la concentracin del cido disminuya hasta el 4% (p/p). Esta solucin se calienta en un autoclave a 121C durante 60 min. Luego se filtra y se lava con agua destilada para someterla finalmente a un proceso de secado en donde el peso final es la lignina cido insoluble.

Peso de ligninaLignina insoluble en acido (%) = .100 %Peso seco de la muestra

Ec. (2)

3.3 Determinacin del contenido de holocelulosa. Se determina usando el mtodo de clorinacin (ASTM D1104). Se usan 2.5 g de muestra libre de extractivos y se les agregan 80 ml de agua destilada caliente, 0.5 ml de cido actico y 1 g de clorito de sodio. La mezcla se calienta a 70C durante 60 min, luego de este tiempo se agrega nuevamente 0.5 ml de cido actico y 1 g de clorito de sodio y as sucesivamente cada hora. La adicin de estos dos reactivos se hace un total de 6 veces incluyendo la inicial. Luego de la adicin final se deja 24 h. Pasado este tiempo se filtra la holocelulosa y se lava con acetona para posteriormente secarla. El peso final es la holocelulosa y el porcentaje se define por la Ec. (3).

Peso de holocelulosaHolocelulosa (%) = .100 %Peso seco de la muestra sin extractivos

Ec. (3)

3.4 Determinacin de celulosa y hemicelulosa. El contenido de celulosa se determina usando la norma ASTM 1695-77. Se toman 2 g de holocelulosa libre de extractivos y se agregan 10 ml de NaOH al 17.5% a una temperatura constante de 20C en un bao termorregulador. Despus de 2 min se agregan 5 ml de la solucin de NaOH en intervalos de 5 min hasta completar 25 ml de NaOH en total incluyendo la cantidad inicial. Luego de esto se deja la mezcla a 20C durante 30 min, para un total de 45 min. Pasados los 45 min se agregan 33 ml de agua destilada a 20C y el slido se deja reposar por 1 hora antes de filtrar. Se usan crisoles GOOCH para llevar a cabo la filtracin, lavando con agua destilada. Luego a la celulosa recogida en el crisol se le agregan 15 ml de cido actico al 10%. El cido es retirado pero no en su totalidad, solo para que el slido celulsico quede ligeramente cubierto por 3 min. Posteriormente se retira el cido actico remanente por succin y se efectan lavados hasta que la concentracin de cido sea la mnima posible.

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Posteriormente se seca el crisol con la celulosa. El peso de celulosa se determina como la diferencia entre el peso del crisol con slidos y el peso del crisol vacio. La hemicelulosa se determina haciendo la diferencia entre la cantidad inicial de holocelulosa libre de extractivos y la cantidad de celulosa determinada aplicando la metodologa anterior. 3.5 Determinacin de Lignina soluble en cido. Finalmente, para la determinacin del contenido de lignina soluble en cido, el procedimiento propuesto por la NREL requiere de un espectrofotmetro a una longitud de onda de 250 nm. La celda de medicin debe tener 1 cm de longitud y una solucin al 4 % (p/p) de H2SO4 ser empleada como muestra en blanco. Los clculos requeridos son los siguientes, [24].

A . . .b.a 1000% (w/w) ASL= .100%.

100final

Ldf VmL

W T

Ec. (4)

Donde:

A: Absorbancia a 205 nm. df: Factor de dilucin. b: Longitud de la celda, 1 cm. a: Absortividad, igual a 110 L/g-cm a menos que la experimentacin

determine otro valor para otra materia prima diferente. V: Volumen del filtrado, este volumen ser de 87 mL. W: Masa inicial del material lignocelulsico (g).

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4 CARACTERIZACIN DE LA ZOCA DE CAF La Zoca CCS es un corte por encima del suelo donde se encuentra sembrada la planta de caf de alrededor de 15 a 20 cm. Este procedimiento es una prctica agrcola la cual permite mejorar la productividad de la planta de caf y es una de las tcnicas de renovacin de cultivos ms empleadas en pases cafeteros como Colombia. Este material es generado por temporadas en plantaciones de caf, siendo apilados en terrenos para ser quemados y en la mayora de los casos abandonados nicamente, [25]. Actualmente, la zoca de caf no tiene un uso definido a parte de servir como fertilizante, regenerador de suelos cuando es quemado, en la fabricacin de muebles y para incrementar la productividad de los suelos en forma de cenizas. Sin embargo, la prctica de incineracin tiene algunas implicaciones ambientales como polucin por CO2, contribuyendo al incremento de los gases de efecto invernadero en la atmosfera, [25]. En Colombia se generan aproximadamente 22.000 toneladas al ao, en base seca, de CCS y de otros materiales lignocelulsicos provenientes del caf y productos de la extraccin de solubles en 5 fbricas en el eje cafetero. A pesar de que estos residuos estn constituidos por compuestos que pueden tener inters comercial, este material vegetal no tiene un uso especifico definido. Las mismas fbricas lo utilizan como combustible en las calderas (13% de la produccin), otra parte es incinerada sin uso definido (27%) y el resto equivalente al 60%, se utiliza en rellenos sanitarios, [26]. En la Tabla N 4 se muestra la composicin qumica de este material lignocelulsico como resultado del trabajo que ha venido adelantado el grupo de investigacin en Procesos Qumicos, Catalticos y Biotecnolgicos de la ciudad de Manizales y en la Tabla N 5 por el Centro Nacional de Investigacin sobre el Caf (Cenicaf). En la Fig. N 1 se muestra el estado de la materia prima que se ha de emplear en el desarrollo de esta tesis previo al proceso de molienda y tamizado.

27

Figura 1. Zoca de caf CCS sin moler.

Trabajos desarrollados previamente dentro del marco de estudios que desarrolla el grupo de investigacin de Procesos Qumicos, Catalticos y Biotecnolgicos de la Universidad Nacional de Colombia en la sede Manizales ha permitido caracterizar esta materia prima, [27].

Tabla 4. Resultados de la caracterizacin de la Zoca de caf obtenida por Agudelo, R. A (2009) (% p/p peso seco Desviacin Estndar), [27].

Componente Composicin

-Celulosa 32.32 1.45 Hemicelulosa 13.80 1.02

Componentes extractivos 1.69 0.01 Lignina Insoluble en cido 46.6 0.12 Soluble en cido 0.01 0.00

Cenizas 0.92 0.01 Este trabajo desarrollado por el grupo de investigacin arroj resultados que podran ser comparados con los obtenidos por el Centro Nacional de Investigaciones en Caf (Cenicaf) en el ao 2009 (Tabla N 5), [28].

28

Tabla 5. Resultados de la caracterizacin de la Zoca de caf obtenida por Rodrguez, N (2009) en el Centro Nacional de Investigaciones en Caf (Cenicaf) (% p/p peso seco), [28].

Componente Composicin

-Celulosa 45-50 Hemicelulosa 24-40

Lignina 18-25 En las Tablas N 4 y 5 se muestran los resultados obtenidos sobre la caracterizacin de la materia prima empleada en este trabajo. Los resultados muestran una gran diferencia entre s, lo que permite suponer que la caracterizacin qumica de la zoca de caf CCS es una tcnica no estandarizada que el contenido qumico es una variable dependiente del lugar en el que el producto es desechado, la temporada de corte del rbol, el tiempo de exposicin del material al entorno y factores del medio ambiente como por ejemplo la degradacin por agentes como microorganismos animales, el desgaste de la madera por la humedad, acumulacin de material orgnico, entre otros.

29

5 TCNICAS DE PRETRATAMIENTO DE MATERIALES LIGNOCELULSICOS

Cada material lignocelulsico empleado en la produccin de alcohol etlico debe ser sometido a un pretratamiento con el fin de alcanzar altos rendimientos de conversin de sustrato. El propsito de estos mtodos es bsicamente producir grandes cantidades de azcares reductores (i.e Glucosa y Xilosa) a partir de los componentes principales de la materia prima que son la Celulosa y la Hemicelulosa. El pretratamiento de la materia prima debe cumplir con los siguientes requerimientos para garantizar altos rendimientos en la produccin de azcares reductores:

Aumentar la produccin de a azcares reductores o incrementar la formacin de estos azcares a travs de un proceso de hidrolisis enzimtica.

Evitar la degradacin o prdidas de carbohidratos. Evitar la formacin de subproductos que puedan convertirse en agentes

inhibidores de los microorganismos fermentadores. El proceso debe ser econmicamente rentable y ambientalmente seguro,

[4,29]. Durante la etapa de pretratamiento la matriz celular del material lignocelulsico se rompe liberando a la Celulosa y a la Hemicelulosa. Adicionalmente, la cristalinidad de la Celulosa disminuye, hacindola ms susceptible a un ataque enzimtico posterior. Al mismo tiempo y dependiendo de la tcnica de pretratamiento, la Hemicelulosa es hidrolizada parcialmente a pentosas (principalmente Xilosa) y a hexosas (principalmente Glucosa). En la Tabla N 6 se muestran algunos de los mtodos ms empleados en el pretratamiento y generacin de azcares reductores en materiales lignocelulsicos.

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Tabla 6. Mtodos de pretratamiento para materiales lignocelulsicos.

Pretratamiento Caractersticas Referencias

cido Concentrado El material se pone en contacto con cido sulfrico concentrado para hidrolizar la hemicelulosa en xilosa y otras pentosas a 121 C por 4 horas.

[1,29]

cido Diluido (DA) Una solucin al 2 % (w/w) de H2SO4 o HCl se mezcla con el material solido y es calentada a 121C por 3 a 4 horas. [1,30,31,32]

Hidrlisis Alcalina (HA)

EL mecanismo de hidrolisis alcalina es la saponificacin de estere intermoleculares que unen a la hemicelulosa en enlaces cruzados con otros componentes. La porosidad del material es un factor importante en la remocin de estos enlaces cruzados.

[1,29,32]

Explosin de Fibra por Amoniaco

La materia prima se pone en contacto con amoniaco en una relacin de 2 kg de NH3 por cada kg de material slido a 90 C por 30 min.

[1,33]

Ozonolisis El material se somete a una reaccin en presencia de ozono a temperatura y presin ambiente. [34,35]

Agua lquida caliente liquid hot water (LHW)

El material se calienta en agua en una relacin 1:10 a 220 C por 2 min. [36]

Explosin por Vapor El material slido se pone en contacto con vapor a altas presiones (5 10 bar) por tiempos que van desde 5 hasta 30 min. Se despresuriza rpidamente para que la expansin del vapor cause rompimiento de la matriz celular

[30,33]

Desde el punto de vista de tecnologas ms limpias, de todos los mtodos mostrados en la Tabla N 6 el que menos corrientes contaminantes produce es la explosin por vapor de agua. Sin embargo, todas estas tcnicas presentan dos dificultades que son: la produccin de agentes inhibidores (e.g. Furfural, cidos Orgnicos e Hidroxi-Metil Furfural (HMF)) y problemas de separacin que pueden traducirse en un incremento en los costos de operacin, [30,33]. A pesar de esto, la explosin de vapor con agua, entre otros mtodos, han sido implementados con xito en la produccin de hidrolizados con alta concentracin de azcares reductores a partir de este tipo de materias primas. En el siguiente captulo se abordar la produccin de sustratos asimilables a partir de procesos de degradacin enzimtica y tambin, la manera como dichos sustratos azucarados son asimilados por los microorganismos fermentadores a travs de vas metablicas especficas. Tambin se mostrarn los principales microorganismos productores de etanol y a partir de esto hacer una seleccin preliminar de las cepas que han de emplearse en la seccin de experimentacin de esta tesis, basndose principalmente en que estos agente microbiolgicos deben transformar tanto hexosas como pentosas simultneamente.

31

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CAPITULO 2. BIOQUMICA DE LAS FERMENTACIONES A PARTIR DE MATERIALES

LIGNOCELULSICOS

Resumen La generacin de azcares reductores a partir de diferentes mtodos de pretratamiento garantiza el alto rendimiento en los procesos de sacarificacin utilizando enzimas. En este captulo se trata la bioqumica de los procesos de hidrlisis enzimtica y las rutas metablicas de asimilacin de sustratos azucarados por levaduras y bacterias. Igualmente, en este captulo se muestran los rendimientos de las etapas antes mencionadas y los factores que afectan de forma directa el proceso de produccin de etanol va fermentativa.

Abstract The generation reducing sugars from different pretreatment techniques guarantees a high yield in the process of enzymatic saccharification. In this chapter, the biochemistry of enzymatic hydrolysis and the metabolic pathways of sugar assimilation by yeast and bacteria are shown. Also, in this chapter it is considered the yields of the above mentioned stages and the factors that affect directly the ethanol production process. Key words: Reducing sugars, Enzymatic Hydrolysis, Yeast, Bacteria, Yield

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1 INTRODUCCIN Los procesos fermentativos son la etapa ms importante de un proceso de produccin de un metabolito de alto valor agregado como es el etanol. En esta etapa, tres factores preponderantes han de ser considerados para garantizar la obtencin de altos rendimientos de producto y estos son: el sustrato, las condiciones de operacin y el microorganismo fermentador. El sustrato se describe como el resultado de un pretratamiento que se efecta sobre la materia prima original tal y como se mostr en el captulo 1. En esta etapa una alta cantidad de azcares asimilables son liberados de los componentes principales de la materia prima (i.e., Celulosa y Hemicelulosa) convirtindose en el sustrato que ha de consumir el microorganismo fermentador. Para materiales lignocelulsicos, este hidrolizado est compuesto principalmente por pentosas (en mayor medida xilosa) y por hexosas (en mayor medida glucosa). Las condiciones de operacin son de mucha importancia ya que aseguran la reproduccin del microorganismo de forma ms eficiente. Los factores importantes en esta parte del proceso son la temperatura, el medio de fermentacin, el pH y la velocidad de agitacin. A pesar de que en muchos casos las condiciones de operacin y de crecimiento microbiano son parecidas entre varias cepas, algunos microorganismos como los genticamente modificados pueden tolerar condiciones ms extremas que las cepas convencionales haciendo de estos casos excepcionales y mucho ms difciles de adquirir. Finalmente, en el desarrollo de este captulo se busca seleccionar los microorganismos ms eficientes para el proceso de fermentacin de azcares obtenidos a partir de la degradacin y posterior hidrlisis del material lignocelulsico. Esta seleccin inicialmente se basar en los referentes bibliogrficos, ya que como se ha planteado anteriormente, un criterio importantsimo en la seleccin de estos microorganismos es la capacidad de fermentar no solo hexosas sino tambin pentosas. Este tema ha sido trabajado bastante por muchos autores por lo tanto, es importante partir de estas experiencias previas para poder tener un juicio ms completo a la hora de seleccionar un microorganismo con el cual trabajar.

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2 HIDRLISIS ENZIMTICA En la generacin de sustrato asimilable por los microorganismos fermentadores una etapa que es muy importante en la produccin de etanol es la hidrlisis enzimtica. En el captulo 1 se mostraron diferentes tcnicas de pretratamiento de materiales lignocelulsicos. En muchos de estos mtodos de generacin de sustrato el grupo de azcares ms producido es el grupo de las pentosas a partir de la Hemicelulosa del material, siendo la xilosa el azcar que se encuentra en mayor proporcin. Como el material lignocelulsico consta tambin de Celulosa, este biopolmero no se descompone en sus unidades bsicas (Glucosa) a travs de estas tcnicas mencionadas anteriormente. Por lo tanto, se requiere de un tratamiento biolgico posterior que es mucho ms eficiente y que genera menos corrientes residuales contaminantes: la hidrlisis enzimtica. Esta ruta de produccin de azcares reductores es muy empleada a nivel industrial con reportes de altos rendimientos en produccin de glucosa. En esta seccin se muestra el mecanismo de accin de la enzima sobre el material, los modelos que se utilizan en la descripcin del proceso enzimtico, las enzimas comerciales empleadas en materiales lignocelulsicos y finalmente los rendimientos reportados para estas materias primas. 2.1 Actividad enzimtica. La degradacin microbiana de los residuos lignocelulsicos es alcanzada a travs de las enzimas, de las cuales una de las ms sobresalientes y ms empleadas a nivel industrial es la celulasa. Los dos principales tipos de actividades de las celulasas son los siguientes:

Endoglucanasas (1,4- -D-glucanohidrolasas). Exoglucanasas: Celodextrinasas (1,4-b-D-glucan glucanohidrolasas). Celobiohidrolasas (1-b-D-glucan celobiohidrolasas). -Glucosidasas ( -glucosido glucohidrolasas), [1,2,3].

Las Endogluconasas cortan de forma aleatoria en los sitios amorfos de la cadena de polisacridos de la celulosa produciendo oligosacridos de varias longitudes y consecuentemente nuevas terminaciones de cadenas. Las Exogluconasas actan de forma progresiva sobre las terminaciones reductoras o no reductoras de las cadenas de celulosa liberando Glucosa (Glucanhidrolasas) y Celobiosa (Celobiohidrolasas) como productos en mayor proporcin. Las enzimas Glucosidasas hidrolizan las celodextrinas en Glucosa, [4,5]. En las Figuras N 2, 3 y 4 se muestran las estructuras de la Celulosa, la Hemicelulosa y la Lignina en las cuales se pueden observar las unidades bsicas que las conforman.

36

Figura 2. Estructura de la celulosa. Ntese que la cadena polimrica consiste de n

monmeros de glucosa, [6].

Figura 3. Estructura de la hemicelulosa, [7].

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Figura 4. Estructura de la lignina. [8].

2.2 Mecanismos de accin enzimtica. La hidrlisis enzimtica de la Celulosa es de naturaleza tan compleja que involucra muchas ms etapas que cualquier reaccin qumica catalizada por enzimas. Los siguientes son los diferentes mecanismos de accin sobre el sustrato:

1. Adsorcin de la celulasa en el sustrato a travs del dominio de unin, [9]. 2. Ubicacin de un enlace susceptible a hidrlisis sobre la superficie del

sustrato (terminaciones de cadena si se trata de Celobiohidrolasas, divisin de enlaces si es Endogluconasas), [10].

3. Formacin del complejo Enzima-Sustrato, [11,12]. 4. Hidrlisis del enlace -glucosdico seguida por el deslizamiento simultneo

de la enzima a lo largo de la cadena de Celulosa, [11,12]. 5. Desorcin de las celulasas del sustrato, [11,12]. 6. Hidrlisis de la Celobiosa por la accin de las Glucosidasas e inhibicin

de la enzima por producto formado, [13,14,15,16]. En la Tabla N 7 se muestran algunas de las enzimas ms empleadas en la produccin de Glucosa a partir de celulosa.

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Tabla 7. Enzimas empleadas en la hidrlisis de celulosa.

Celulasas Rendimiento (g de Azcares Reductores por g de Residuos Slidos) Referencias

Celluclast 1,5L 0,11 - 0,26 [17,18,19] Mycotech 0,13 - 0,25 [17] Genencor 0,17 - 0.30 [17] Cellubrix 0,2-0,4 [20,21]

La enzima ms empleada a nivel industrial dado su fcil adquisicin y su precio es la Celluclast 1,5 L. Esta enzima requiere de condiciones muy especficas con el fin de garantizar un alto rendimiento de produccin de glucosa. Para esta etapa se requiere de una solucin buffer que mantenga el pH constante durante la sacarificacin y que evite la disminucin de la actividad enzimtica, [22,23]. Como este es un proceso posterior al pretratamiento, componentes generados tales como Furfural, HMF y cido Actico deben ser removidos mediante lavados con abundante agua a fin de que la hidrlisis sea lo ms eficiente posible. Los slidos pretratados son adicionados en la solucin buffer de Citrato de Sodio 0,05 M y pH 4,8 en una relacin que puede variar desde el 2% hasta el 30% (p/v). Algunos autores recomiendan el uso de Azida de Sodio como un agente inhibidor del crecimiento de cualquier microorganismo que perjudique el desempeo de la enzima, [18,22,23,24]. La enzima es aadida a la mezcla heterognea cuando esta ltima se encuentra a 50 C y el pH fijo en 4,8. Para maximizar el rendimiento de la hidrlisis algunos autores sugieren la adicin de una enzima adicional que consta de un complejo enzimtico de Glucosidasas junto con la Celluclast 1,5 L. La enzima Glucosidasa es muy efectiva en la produccin de Glucosa a partir de la Celobiosa que no se hidroliz por la celulasa, [18,19,26]. La relacin de masa (g) de Celulasa, de -Glucosidasa y de sustrato slido que se recomienda es 1.5:0.3:10 segn [22]. El tiempo de residencia va desde 72 hasta 160 horas, [18,19,32].

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3 BIOQUIMICA DE LOS MICROORGANISMOS FERMENTADORES

Las rutas convencionales de produccin de etanol con fines de generacin de energa involucran una hidrlisis cataltica del etileno en presencia de cido sulfrico. A pesar de ser un proceso ya bastante estudiado, la produccin de etanol a partir de etileno es costosa desde el punto de vista de condiciones de operacin y adquisicin de materia prima. En el caso biotecnolgico y agroindustrial de produccin de este alcohol, se busca que microorganismos (principalmente levaduras y bacterias) nativos o genticamente modificados permitan a travs de sus rutas metablicas convertir los diferentes sustratos en etanol. En la Tabla N 8 se muestran los diferentes microorganismos con sus respectivos rendimientos y sustratos. El rendimiento se define como la relacin entre los g de etanol producido por cada g de sustrato consumido y para la produccin de este alcohol el rendimiento terico, que sirve de referencia para cuantificar la eficiencia de un microorganismo, es de 0.511 g de etanol producido/g de sustrato consumido, [33].

Tabla 8. Microorganismos productores de etanol.

Microorganismo Tipo de microorganismo Sustratos asimilables Rendimiento (% del

Rendimiento Terico) Referencia

Saccharomyces cerevisiae Levadura

Glucosa, Galactosa, Maltosa, Sacarosa 43 87

[26, 27, 28,29]

Pichia stipitis Levadura Glucosa, Xilosa, Arabinosa, Manosa 83 92 [30,31,32]

Candida shehatae Levadura

Glucosa, Xilosa, Arabinosa, Manosa 75-90 [33,34]

Candida lusitaniae Levadura

Glucosa, Xilosa, Sacarosa, Celobiosa,

Sorbitol, Maltosa 70-85 [35,36]

Candida tropicalis Levadura

Glucosa, Xilosa, Sacarosa, Celobiosa,

Sorbitol, Maltosa 76-85 [37,38,39,40]

Escherichia coli Bacteria Glucosa, Glicerol 70-90 [40,41,42,43]Zymomonas

mobilis Bacteria Glucosa, Xilosa,

Fructosa, Sacarosa 80-92 [26,44,45,46]

Klebsiella oxytoca Bacteria

Glucosa, Fructosa, Sacarosa, Maltosa 80-90

[46,47,48]

Pachysolen tannophilus Levadura Glucosa, Xilosa, Glicerol 75-80 [49,50,51]

Clostridium thermocellum Bacteria Glucosa, Xilosa 60-80 [52]

Kluyveromyces marxianus Levadura Glucosa 70-80 [53]

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Una de las caractersticas que debe ser tenida en cuenta es el reconocimiento de las particularidades bioqumicas de la produccin de etanol a partir de sustratos asimilables. Esto permite conocer con cierto grado de detalle qu condiciones deben satisfacerse y los subproductos a obtener principalmente. 3.1 Fermentacin de azcares simples por levaduras y bacterias. En muchos procesos de fermentacin, la oxidacin de azcares simples bajo condiciones anaerobias involucra dos fases: la oxidacin de la glucosa y el metabolismo de piruvato. El metabolismo de la glucosa ocurre de la misma manera tanto en la respiracin aerobia como en la respiracin anaerobia y se da frecuentemente a travs de la va glucoltica de EmbdenMeyerhofParnas o EMP. Sin embargo, si el oxgeno no est disponible para su uso como aceptor externo de electrones (como ocurre en la respiracin aerobia) o el microorganismo no tiene la capacidad de utilizar componentes inorgnicos alternativos tales como nitratos o sulfatos, la molcula portadora de electrones NAD+ debe ser regenerada donando electrones hacia componentes orgnicos intermediarios, [55]. Teniendo en cuenta las diferentes alternativas bioqumicas para la fermentacin de los azcares, se presenta a continuacin una descripcin de la ruta de biosntesis de produccin de etanol de dos microorganismos modelos implementados y reportados en la literatura cientfica: Levaduras y Bacterias. 3.1.1 Levaduras. La principal va metablica de este tipo de microorganismo en la produccin de etanol es la gluclisis va EMP, a travs de la cual una molcula de glucosa es metabolizada y dos molculas de piruvato son producidas. Bajo condiciones anaerobias, el piruvato es posteriormente reducido a etanol con emisiones de CO2 obtenindose un rendimiento estequiomtrico terico de 0.511g de etanol y 0.489g de CO2 por 1g de glucosa metabolizada, [56]. En la gluclisis se producen dos molculas de ATP los cuales son empleados para llevar a cabo la biosntesis de las clulas de la levadura lo cual involucra una variedad de bioreacciones que requieren energa. Adems, la produccin de etanol est estrechamente ligada al crecimiento celular del microorganismo, lo que significa que la biomasa se obtiene como un subproducto. Sin el consumo continuo de ATP por parte del microorganismo que est en crecimiento, el metabolismo glucoltico se vera interrumpido inmediatamente, debido a la acumulacin intracelular de ATP, causando una inhibicin a la fosfofructoquinasa (PFK), una de las enzimas de regulacin ms importantes en la gluclisis. El mecanismo de produccin de etanol a partir de glucosa en las levaduras se presenta en la Figura N 5, [57].

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Figura 5. Ruta metablica de la produccin de etanol en S. cerevisiae.

HK: Hexoquinasa, PGI: Fosfoglugosiomerasa, PFK: Fosfofructoquinasa, FBPA: Fructosa bifosfato aldolasa, TPI: Triosa fosfato isomerasa, GAPDH: Gliceraldehdo-3-fosfato aldolasa,

PGK: Fosfoglicerato quinasa, PGM: Fosfogliceromutasa, ENO: Enolasa, PYK: Piruvato quinasa, PDC: Piruvato descarboxilasa, ADH: Alcohol deshidrogenasa.

Las bacterias son consideradas en los procesos fermentativos como los microorganismos ms efectivos en la produccin de alcohol, ya que estos crecen a velocidades mayores que la levadura Saccharomyces cerevisiae y generan mayores rendimientos, por lo tanto es de importancia conocer la ruta metablica de este microorganismo para la conversin de sustratos a etanol y otros subproductos, [55]. La bacteria ms estudiada en este tipo procesos es la bacteria Zymomonas mobilis que se presenta a continuacin. 3.1.2 Bacteria. La Zymomonas mobilis es un microorganismo anaerbico gram negativo que produce etanol a partir de glucosa por la va EntnerDoudoroff (ED) en conjunto con las enzimas piruvato descarboxilasa (PDC) y alcohol deshidrogenasa (ADH). Comparado con la va EMP de las levaduras en la cual la enzima PFK es clave y hermticamente regulada, en el mecanismo de produccin de etanol de la Z. mobilis esta enzima no interviene, produciendo solo una molcula de ATP por

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molcula de sustrato consumido, [55]. Esto demuestra que la produccin de etanol en esta bacteria est desligada de la generacin de energa, lo cual se traduce en una menor produccin de biomasa y una mayor produccin de etanol. Se ha reportado que el rendimiento de la Z. mobilis podra ser tan alto como 97 % del rendimiento terico estequiomtrico etanol/glucosa, mientras que nicamente el 87 95 % puede ser alcanzado por la S. cerevisiae. As, como una consecuencia del bajo rendimiento de ATP, la Z. mobilis mantienen un flux metablico de glucosa ms alto, y consecuentemente, garantiza una productividad de etanol ms alta, [33]. A pesar de poseer caractersticas mucho ms atrayentes que la S. cerevisiae, estas bacterias poseen las siguientes desventajas, [56].

Esta especie tiene un espectro de sustrato muy especfico. La fermentacin se hace inestable. Generacin de muchos subproductos. Altos costos de manipulacin.

En la Figura N 6 se muestra el mecanismo de reaccin enzimtico en la produccin de alcohol por la bacteria Z. mobilis, [56].

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Figura 6. Ruta metablica de la produccin de etanol en la Z. mobilis.

LEVU: Levansacarasa, INVB: Invertasa, GFOR: Glucosa-Fructosa oxidoreductasa, FK: Fructoquinasa, GK: Glucoquinasa, GPDH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, PGL:

Fosfogluconolactonasa, EDD: 6-Fosfogluconato deshidratasa, KDPG: 2-keto-3-deoxy-6-fosfogluconato, EDA: 2-keto-3-deoxy-gluconato aldolasa, GNTK: Gluconato quinasa.

Comparando el desempeo tanto de bacterias como de levaduras, se observa que la produccin de alcohol se ve ms beneficiada por el uso de bacterias. Pero hay que considerar que algunas especies de levaduras a ciertas condiciones de fermentacin mejoran su desempeo de forma notable. De esta manera, la pregunta de cul microorganismo se debe elegir por ser ms apto a nivel industrial (bacteria o levadura) tiene que ser respondida a la luz de su facilidad de manejo. La baja produccin de biomasa por parte de bacterias como la Z. mobilis hace necesaria la esterilizacin del medio de fermentacin, lo cual eleva los costos de produccin. Por lo tanto, se recomienda dar prioridad a un menor costo de manejo que al rendimiento de alcohol. Lo anterior conduce a que industrialmente se prefiere el uso de la S. cerevisiae sobre la Z. mobilis. Debido a su naturaleza procaritica, la manipulacin gentica en bacterias ha sido llevada a cabo con mucha ms facilidad que en las levaduras. Hoy en da, a travs

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de la ingeniera gentica se pueden obtener bacterias ms verstiles que pueden producir etanol a partir de materias primas menos costosas y as reducir considerablemente los costos de produccin de etanol hasta U$1.20/g. En 1993 en EE.UU. se comenz a desarrollar bacterias capaces de fermentar todos los azcares presentes en materiales tales como los lignocelulsicos. Estos materiales son conocidos por presentar tanto hexosas como pentosas, y el reto de la ingeniera gentica es desarrollar organismos que puedan asimilar ambos grupos de azcares y mejorar el rendimiento de produccin de etanol, [57].

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4 FACTORES QUE AFECTAN EL DESEMPEO DE LOS MICROORGANISMOS EN LA PRODUCCIN DE BIOETANOL

Los procesos fermentativos como se mencion al principio del captulo, requieren de condiciones de operacin que garanticen el buen desempeo de los microorganismos. A partir de esto, se ha visto que el manejo de estos microorganismos presenta ciertas dificultades, especficamente en las condiciones de medios de cultivos y del proceso de fermentacin a nivel industrial. En esta seccin se presentan tres de los factores ms importantes que afectan el desempeo de una cepa en un proceso de fermentacin, y la manera como a partir de estos fenmenos se generan criterios en la seleccin de microorganismos que optimicen la produccin de etanol. Estos factores son presentados a continuacin: 4.1 Inhibicin por producto. A raz del inters generado en la produccin de etanol a altas concentraciones, se ha visto como este factor afecta el desempeo de los microorganismos fermentadores causando inhibicin en el crecimiento microbiano y la reduccin en el rendimiento producto/sustrato. En general, una concentracin de etanol mayor al 6% (p/v) tiene un efecto inhibitorio sobre todos los microorganismos. La mayora de las cepas toleran una concentracin de 5.5 % de etanol en el medio de cultivo, [58]. 4.2 Temperatura. Algunos microorganismos tales como la Zymomonas mobilis crecen entre 25 y 40C, con un crecimiento optimo a 30C. La composicin y la estructura de la membrana plasmtica y la concentracin de fosfolpidos desmejora cuando la bacteria alcanza una temperatura de 40 C, lo cual conlleva a una prdida de la integridad de la membrana. Posteriormente, la elevada temperatura resulta en la acumulacin de etanol dentro de la clula, lo cual tiene un significativo efecto en la viabilidad de las clulas, [20]. En el caso de levaduras como las especies del gnero Saccharomyces la velocidad de produccin de alcohol incrementa de forma estable hasta los 30 C y de forma suave hasta los 36C, pero disminuye a temperaturas superiores a los 37 C. Algunas cepas son capaces de crecer a temperaturas por encima de los 37 C y son comnmente nombradas como termoflicas, mientras que otras tienen una temperatura mxima superior a los 45 C y son comnmente llamadas termotolerantes. [58].

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4.3 Condiciones de aireacin. Muchos microorganismos, tanto levaduras como bacterias, crecen en condiciones anaerbicas y el oxgeno en exceso tiene un efecto negativo sobre la produccin de etanol. En las bacterias, por ejemplo, la aireacin induce la produccin de subproductos incluyendo acetatos, acetaldehdos y lactatos y adems, el oxgeno tiene un efecto inhibitorio sobre el consumo de sustrato y el crecimiento microbiano. A bajas concentraciones de sustrato, las velocidades de crecimiento y el rendimiento de biomasa son independientes de la presencia de oxgeno. De forma opuesta, a altas concentraciones de sustrato, decrecen los parmetros de crecimiento, [57].

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5 MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCIN DE ETANOL

En la seccin anterior se presentaron tres de los factores que ms afectan el desarrollo de los microorganismos en la produccin de etanol. Un microorganismo ideal para ser utilizado a nivel industrial debe cumplir con una gran cantidad de requisitos generales y especficos, de acuerdo con las caractersticas propias del proceso de produccin de etanol a partir de diferentes materias primas, [59]. Algunos requisitos generales que debe cumplir una cepa industrial son:

Posibilidad de obtener cultivos puros. Genticamente estables. Fcil de conservar por periodos largos de tiempo. Tasa elevada de produccin de formas de propagacin. Tasa elevada de crecimiento en preinculo y en fermentador. Ausencia de problemas tecnolgicos durante el escalado. Produccin rpida de los metabolitos de inters. Fcil separacin entre el producto y el microorganismo. Produccin mayoritaria del metabolito de inters. Falta de produccin de sustancias txicas. Susceptible de mejoramiento gentico.

Para la produccin de etanol a partir de materiales azucarados, amilceos o lignocelulsicos, las cepas a utilizar deben cumplir con una serie de propiedades especficas, que pueden agruparse en las siguientes necesidades, [59]:

Consumir sustratos econmicos tales como residuos agroindustriales. Disminuir los costos de pretratamiento, consumiendo materias primas en su

forma natural. Reducir fenmenos de inhibicin y prdida de actividad durante la

fermentacin. Evitar la produccin de subproductos no deseados. Disminuir los costos y procesos para la separacin de biomasa.

Las caractersticas que se deben considerar en la seleccin del microorganismo ms apto para la produccin de etanol a partir de hidrolizados de CCS, tomando en cuenta todo lo mencionado a lo largo de este captulo, es que estas soluciones poseen una gran variedad de azcares asimilables y que estos deben ser aprovechados al mximo.

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Tambin debe considerarse que cualquier mejora que se pueda hacer sobre el metabolismo de cualquier cepa puede resultar en una forma de optimizacin del proceso de produccin de etanol, pero a su vez puede representar un gasto adicional en los costos de operacin. Todos estos factores se consideraran en los prximos captulos, en donde este proceso se evaluar experimentalmente, a nivel de ingeniera de proceso y a nivel econmico mediante el uso de software especializado.

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