LOGO

PENCARIAN ZAT

ANTIMIKROBA BARU

SUMBER ZAT ANTIMIKROBA

1. Mikroorganisme yang diisolasi dari tanah, air atau udara, contoh : Streptomyces yang memproduksi streptomisin dan tetrasiklin.

2. Bakteriofaga

3. Metabolit sekunder dari tumbuhan atau hewan yang berkhasiat sebagai zat antimikroba

4. Semisintesis : molekul prekursor diproduksi melalui fermentasi mikroorganisme, lalu dimodifikasi secara kimia, contoh : penisilin dan sefalosporin

5. Sintesis, contoh : kloramfenikol

INFORMASI SUMBER ZAT

ANTIMIKROBA

Penggunaan secara empiris oleh

masyarakat

Buku/pustaka pengobatan tradisional

Media massa : cetak dan elektronik

Penelitian lanjutan yang disarankan

TAHAP PENCARIAN ZAT ANTIMIKROBA

BARU

SELEKSI ANTIMIKROBA

PEMISAHAN ANTIMIKROBA

PEMURNIAN ANTIMIKROBA

Seleksi Zat Antimikroba dari Tanah/Air/Udara

SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

suspensi tanah

+ NaCl fis

dekantasi

supernatan

encerkan

Supernatan

encer

inokulasi

Media agar

inkubasi

4x24 jam

Koloni bakteri

dicungkil

Uji aktivitas

antibakteri

Media+bakteri

uji

inkubasi

Zona hambat

isolasi

inokulasi

Media cair

inkubasi

Suspensi

bakteri

(Biakan murni)

Kultur Non

Patogen

SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

Sampel tanah disuspensikan dalam NaCl fis steril didekantasi ambil supernatannya.

Supernatan diencerkan diinokulasi pada medium padat inkubasi 4 x 24 jam pada suhu ttt spy memproduksi zat antimikroba tumbuh berbagai koloni

Dengan alat perforator, koloni & medium sekitarnya dicungkil dipindahkan ke medium + mikroba uji inkubasi amati koloni2 mana yang menghasilkan zone inhibisi tanam sebagai biakan murni

SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

Suspensi bakteri

(Biakan murni)Fermentasi

dlm media

cair

inokulasi

Ambil

sampel pd

interval

waktu ttt,

lalu

disentrifuga

si

supernatan

Saring dgn

bakteri filter

Uji aktivitas

Media uji

inkubasi

Zona hambat

terbesar

selama waktu

fermentasi

tertentu

positif

PEMISAHAN ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

Biakan murni difermentasi dalam medium cair

(fermentasi) tiap interval waktu ttt disampling

Sampel-sampel disentrifugasi, lalu

supernatannya disaring dengan filter bakteri

Tiap supernatan diuji aktivitas antimikrobanya

untuk menentukan supernatan mana yang

menghasilkan zona hambat terbesar waktu

panen zat antimikroba

PEMISAHAN ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

Suspensi bakteri

(Biakan murni)Fermentasi

dlm media

cair sampai

waktu

panen

inokulasi disentrifugasi

supernatan

Saring dgn

bakteri filter

Uji aktivitas

Media uji

inkubasi

Zona hambat

terbesar

ekstraksi

ekstrakEkstrak pekat evaporasi

SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

Biakan murni difermentasi dalam volume medium cair yang lebih banyak sampai titik maks fermentasi disentrifugasi

Supernatan diekstraksi dengan berbagai pelarut organik dalam corong pisah

Berbagai ekstrak diuji aktivitas antimikrobanya kembali

Setelah diperoleh pelarut yang cocok, supernatan diekstraksi dengan pelarut tersebut dipekatkan dengan rotary evaporator/freeze drying

Tumbuh-tumbuhan

Dan lain-lain….

SELEKSI ZAT ANTIMIROBA DARI TUMBUHAN

Tumbuhan dideterminasi, bagian tumbuhan diambil dan dibuat simplisia

Simplisia dihaluskan dan diayak sampai derajat kehalusan tertentu diekstraksi dengan pelarut organik

Ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator/freeze drying

Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrakkental untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak.

Ekstrak kental (konsentrasi 50%) diuji aktivitasnya terhadap mikroba tertentu

PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBA

Ekstrak pekat

KLT

K. kolom

fraksi2KLT Fraksi dgn Rf

sama digabung

evaporasi

Fraksi pekat

Uji aktivitas

Fraksi prospektif

KLT preparatifpita

kaca+penampak

bercak -> kerok

pelarut organik

Larutan2 dari

pita

Uji aktivitas,

evaporasi

Kristal

murni

KLT 2 dimensi

KLT prep 2

dimensi

konsentrat Zat murniUji aktivitas

kristalisasi

Uji kemurnian kristal

Penentuan struktur

PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA

Ekstrak kental ditutulkan pada KLT dipisahkan menggunakan berbagai pengembang disemprot penampak noda diperoleh pengembang yang dapat memisahkan berbagai noda pada ekstrak sbg pengelusi pada kromatografi kolom

Ekstrakkental dikromatografi kolom tiap fraksi ditampung KLT kembali fraksi2 dengan Rf sama digabungkan, dipekatkan dan diuji aktivitas antimikrobanya

Fraksi dengan aktivitas antimikroba terbaik di KLT preparatif

Tutup sebagian KLT dengan kaca, lalu bagian yg tampak disemprot dengan penampak noda pita-pita yang tertutup kaca dikerok & dimasukkan dalam vial tambah pelarut organik yang mengendapkan silika gel

Tiap larutan dari masing2 pita diuji aktivitas antimikrobanya yang terbaik dipekatkan

Konsentrat di KLT 2 dimensi untuk mengetahui kemurniannya jika belum murni (terbentuk ekor), dimurnikan dengan KLT preparatif 2 dimensi

PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA

Hasil pemurnian diuji aktivitas antimikrobanya

dipekatkan untuk memperoleh kristal

Kemurnian kristal diuji melalui penentuan TL

(titik lelehnya) jika rentang TL lebar, dilakukan

rekristalisasi

Kristal antimikroba di KLT bersama dengan zat-

zat antimiroba pembanding dilihat kesamaan

Rf nya

Jika tidak ada yang sama, dilakukan elusidasi

struktur

PEMURNIAN ZAT ANTIMIROBA

UJI AKTIVITAS ANTIMIROBA

Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri dan metode difusi agar caranya sama dengan penentuan potensi antibiotika, tetapi hanya 1 dosis, umumnya 50%.

Perbedaannya :

uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahan

Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama

UJI BANDING ANTIMIROBA

Untuk mendapatkan uji aktivitas mikroba yang bernilai semi kuantitatif, maka dilakukan uji banding fraksi atau kristal murni zat antimikroba terhadap antibiotika pembanding dari jenis berbeda cara yang sama dengan uji potensi antibiotika

Perbedaannya :

uji banding antimikroba bersifatsemi kuantitatif, artinya perhitungan matematis yang dihasilkan harus duji kebenarannya kembali secara mikrobiologi

Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentasi kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama

PROSEDUR UJI BANDING AKTIVITAS

Pengenceran konsentrasi zat uji dan antibiotik pembanding

Uji aktivitas

Pengukuran zona hambat

Pembuatan grafik dan persamaan garis (x = logaritma

konsentrasi (ppm); y = diameter hambat zat pembanding (mm))

Nilai banding aktivitas

CONTOH PERHITUNGAN

TETRASIKLIN

Y = 7,4561x – 2,1559

Pada x = 10 ppm, maka y = 5,3 mm

ZAT UJI

Y = 4,8588x – 12,99

Pada y = 5,3 mm, maka x = 3,764

Konsentrasi zat uji = antilog 3,764

= 5812 ppm

Untuk mendapatkan diameter hambat yang sama, berapa

konsentrasi zat uji ?

Nilai banding = konsentrasi zat uji

konsentrasi zat pembanding

= 5812 atau 1 : 0,00172

10

Artinya untuk menghasilkan derajat hambat yang sama,

1 ppm zat uji sebanding dengan 0,00172 ppm tetrasiklin

PENENTUAN MIC DAN MBC

MIC dan MBC digunakan untuk menghitung

dosis minimal/MEC zat antimikroba dalam suatu

sediaan

Penentuan MIC dan MBC sebaiknya dilakukan

terhadap fraksi atau kristal murni, setelah uji

aktivitas antimikroba

Variasi konsentrasi yang digunakan untuk

penentuan MIC dan MBC adalah pengenceran

konsentrasi yang dipakai untuk uji aktivitas

antimikroba.

UJI MIKROBILOGI LAIN PADA

SEDIAAN FARMASI

Uji stabilitas mikrobiologi perhitungan koloni

mikroba.Uji ini dilakukan pada rentang waktu

tertentu utk mengetahui pengaruh waktu

penyimpanan thd stabilitas mikrobiologi sediaan

atau mengetahui efektivitas zat pengawet dalam

sediaan

Uji aktivitas antimikroba dari sediaan aktivitas

antimikroba sediaan dibandingkan aktivitas zat

aktif saja utk mengetahui pengaruh formulasi

sediaan thd aktivitas antimikroba zat aktifnya

Penentuan koefisien fenol dilakukan terhadap

sediaan antiseptika atau desinfektan