17103580 Crecimiento Microbiano PARTE1

7/25/2019 17103580 Crecimiento Microbiano PARTE1

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UNFV/FIIS Crecimiento Microbiano

MICROBIOLOGA I 1

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

MTODOS DE ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO1ra. parte

1 DEFINICIONES

Una poblac in microbianaes definida por dos parmetros que suelen referirse a

unidad de volumen de medio, la Densidad Microbiana o masa celular y laConcentracin Celular o nmero de clulas. El aumento de estos dos

parmetros constituye el fenmeno del crecimiento.

La Densidad microbiana y la concentracin celularson parmetros esenciales

distintos a nivel celular, la masa aumenta de forma continua durante el

crecimiento, mientras que la multiplicacin es un proceso discontinuo.

Cualquier factor cuya falta determina la interrupcin del crecimiento recibe elnombre de Factor Limitante. El crecimiento por lo tanto puede quedar limitado

por agotamiento de cualquiera de las fuentes trficas esenciales (energa,

carbono, nitrgeno, sales minerales, o un factor de crecimiento en el caso

de organismos auxot rofos) o bien por un cambio en las condiciones fsicas o

fisicoqumicas, por lo tanto en los estudios cuantitativos del crecimiento es

fundamental que se identifiquen con exactitud el factor limitante.

2 MEDIDA DE LA DENSIDAD MICROBIANA

La Densidad Microbiana expresada en peso seco de clula por unidad de

volumen debe determinarse en principio pesando los organismos desecados

hasta un peso constante a 100-110, aunque este mtodo es exacto tiene el

inconveniente de ser largo y laborioso y de que hay que operar con masas

importantes de organismos.


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MICROBIOLOGA I 2

Por ello en la prctica es preferible determinar la densidad microbiana por

mtodos indirectos: valorando el nit rgeno proteico celular(microkjeldhal) o

midiendo la turbidez.

Las suspensiones microbianas cumplen cuantitativamente la Ley de Beer-

Lambert :

Densidad ptica (d.o) = Log Io = KdcI

Donde:

Io: Intensidad del rayo luminoso incidente.

I : Rayo luminoso transmitido.

d: Distancia recorrida por la luz a travs de la suspensin.

c: Densidad microbiana.

k: Constante

3 MEDIDA DE LA CONCENTRACIN CELULAR.

El nmero total de clulas puede determinarse con ayuda del microscopio

contando los organismos en un hemocitmetro o en una cmara de tomas,

mtodo laborioso por la pequeez de los microorganismos y sobre todo de las

bacterias, es necesario utilizar objetivos de gran aumento y por lo tanto de poca

profundidad de campo.

Existen dispositivos electrnicos de cuenta automtica, estos permiten no solo

contar con rapidez las clulas sino adems establecer una distribucin estadsticade los tamaos en la poblacin.

El mtodo ms utilizado es el cmputo mediante el cultivo en placas petr i.

Utilizando medios selectivos es posible aplicar este mtodo para contar un

determinado microorganismo en una poblacin mixta. Estos mtodos son el

empleo de colorantes vitales o colorantes no txicosque penetran solo en la

clulas vivas.


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MICROBIOLOGA I 3

Otra tcnica consiste en esparcir una muestra de la poblacin bacteriana, diluida

en una capa de vidrio con un medio slido extendido.

EXPRESIN Y ANLISIS MATEMTICO DEL CRECIMIENTO.

Una poblacin cuya densidad microbiana o concentracin celular inicial es X0

va creciendo por duplicaciones sucesivas del modo siguiente:

Despus de una duplicacin X1= 2 X0

Despus de dos duplicaciones X2= 2.2 X0= 2 X0

Despus de n duplicaciones Xn = 2 X0

Sea r la tasa de crecimiento, la poblacin se convierte en:

r TXT=2 X0

Forma logartmica de la ecuacin anterior.

Log2XT = rTX0

Log2XTLog 2X0= r

T

Log 2X = Log 10X = 3322 Log 10X

Log 102


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Representacin semilogaritmica del crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBACTERIANO.

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del

crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimientoes la

capacidad para multiplicarse que tiene las clulas individuales,esto es iniciar

y completar una div is in celular. De esta forma, se considera a los

microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como unaumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para

determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas.

Recuento electrnico de partculas.


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Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismoscapaces

de formar colonias debido a que slo se tiene en cuanta el nmero de

microorganismos viables, esto es, capaces de crecer indefinidamente.

Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias.

Mtodo del Nmero Ms Probable.

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida

del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis

macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los

componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin

celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya

que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para

utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinacin de peso hmedo

Determinacin de peso seco

Determinacin de nitrgeno

Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen

los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia

del incremento de la biomasa.


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Recuentos Directos.

Recuento Microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un

equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos

recuentos se utilizan generalmente Cmaras de Recu ento s, aunque tambin

pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y

transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (naranja de

acr idina).La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad

en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las

clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.

Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al

realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o

medios mnimos sin fuente de carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la Petroff-Hausser. La

primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin,

aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin

adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.


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MICROBIOLOGA I 7

Tipo de cuadro rea (cm) Volumen (ml)Factor

(1/ Volumen)

Cuadrado Total-2

1.00 x 10-5

2.00 x 104

5.00 x 10

CuadradoGrande

-4

4.00 x 10-7

8.00 x 106

1.25 x 10

CuadradoPequeo

-5

2.50 x 10-8

5.00 x 107

2.00 x 10

Nmero total de micro org anismos = Bacter ias con tadas. 1m l ______________________Dilucin_________

Nmero d e cuadrados. Volumen del cuadrado

1/ Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento.

Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se

utilizaron para contar el nmero de bacterias.Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la Cmara. Depende del

tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento.

-8

Por ejemplo, cada pequeo tiene un volumen de 5 x 10 ml4 3 -8

(50 m x 50 m x 20 m = 5 x 10 m = 5 x 10 ml).


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Recuento Electrnico:

Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias,

levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y

microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan

bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo

conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia

elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su

resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es

independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se

explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzado

a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un

muy breve intervalo de tiempo.

Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartiendo, la resistencia de ste

se incrementadebido a que la conductividad de la clula es menor que la del

medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y

contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas

bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que soncomparables al ruidogenerado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el

fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o

agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el

pasaje de ms de una clula en un breve periodo de tiempo va ser tomado como

una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos

muy grandes.

MEDIDA DE LA BIOMASA.

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada

frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica , o de

un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la

biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se buscala exactitud.


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DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin

bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinadocido nuc lei co

(generalmente DNA ) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin.

DETERMINACIN DE NITRGENO


bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgenoque contiene una muestra en relacin al compuesto que se quiera determinar.

Puede analizarse el nitrgeno no proteicomediante el NO2-, NO3-, NH4+, el

nitrgeno proteicomediante absorcin en UV. Reaccin de Biuret, Reaccin

de Lowry, o el nitrgeno total mediante la digestin de Kjeldahl.

INCORPORACIN DE PRECURSORES RADIACTIVOS


bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado

radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la

cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.

DISPERSIN DE LA LUZ

Cuando un haz de luz paralelo (colimado)golpea una partcula en suspensin,

parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es

transmitida. La Nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de

partculas. La Turbidimetra mide la luz como un decrecimiento de la luz

transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud de onda y al tamao


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MICROBIOLOGA I 11

de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin

de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los

cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados

errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido

macromolecular).

TURBIDIMETRIA.

La turbidimetria mide la reduccin de la transmisin de luz debido a

partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de

diferentes tipos de bacterias independientemente del tamao celular, tienen casi

la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco.

Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente

proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del

microorganismo. Sin embrago, se encuentran absorbancias muy diferentes porpartcula o por UFC (Unidad Form adora de Colonia)cuando los tamaos de las

clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de

microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una

suspensin bacteriana debe realizarse la curva de calibracincon cada tipo

de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia

(Densidad ptica) con el nmero de microorganismo totales o con UFC.


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MICROBIOLOGA I 12

K: Constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la

inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10

veces en el valor de la absorbancia (1/ Wo).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso

seco (g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para

suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una

absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la

Ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas

puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de

absorcin.


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MICROBIOLOGA I 13

Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos

microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma

absorbancia, mientras que para el mismo nmero de microorganismostotales la absorbancia de cada suspensin es distinta.


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MICROBIOLOGA I 14

CLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIN

Tiempo de generacin (G)es el tiempo requerido para que una clula se divida

o una poblacin se duplique.G = t

n

Si partimos de una clula al cabo de una generacin habr duplicado su nmero y

as sucesivamente en cada generacin. Como se puede comprobar el crecimiento

se produce en progresin geomtrica:

11 generacin 2 clulas = 2


3




Si partimos de N clulas (en microbiologa los estudios se realizan conpoblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un nmero de clulas

determinadas (Na).

En la primera generacin se duplicar el nmero de clulas (2Na) y asi

sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el nmero

de clulas determinadas ser Nb (Nb= 2n Na) donde n es el nmero de

generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta frmula (Nb = 2n Na)

conocemos todos los parmetros excepto el nmero n de generaciones

transcurridaspor lo que aplicando logaritmos ser posible calcularlo.

Una vez obtenido el nmero de generaciones n transcurridas en un tiempo t

podremos calcular el tiempo de generacin G para ese microorganismo.


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MICROBIOLOGA I 15

Ta Na1

1 generacin 2 Na = 2 Na2




5 generacin 32 Na = 2 Na

n generaciones (Tb) Nb = 2 Na

Nb = 2 Na

Lg Nb= n lg 2 + lg Na

n = lg Nblg Nalg2

n= lg Nb/ Nalg2

n= 3.3 lg NbNa

G= _____ t____3.3 lg Nb/ Na

El tiempo de generacin de la levaduraSaccharom yces cerevis iae es de 90

minutos y el de labacteriaEscher ich ia c ol ies de 20 minutos. Esta bacteria tiene

un crecimiento muy rpido de tal manera que a partir de de una sola clula se

obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480:20 = 24 generaciones;

224 = 2 x 106 clulas) 2 millones de clulas.

Esta misma bacteria al cabo de dos das se habra multiplicado hasta 2.2 x 1043

clulas. Una bacteria pesa aproximadamente 10-1510-11 gramos, por lo que el

peso de todas esta clulas es de aproximadamente 2.2 x 1030 gramos que

equivalen a 8 veces el peso de la tierra.


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MICROBIOLOGA I 16

CRECIMIENTO EN UN MEDIO NO RENOVADO

1 FASE DEL CRECIMIENTO

La grafica representa coordenadas ordinarias y semilogartmica. La evolucin de

la densidad microbiana en funcin del tiempo en un cultivo usual en el que el

crecimiento se inicia poco despus de la siembra y cesa cuando el medio se

agota, estas curvas constan de varias fases caracterizadas por el comportamiento

de la tasa de crecimiento:

1. Fase de latencia en la que la tasa de crecimiento es nula (r = 0).

2. Fase de crecimiento acelerado durante la cual la tasa de crecimiento

aumenta (r ).

3. Fase exponencial en la que la tasa de crecimiento es constante y mxima

(r = cte).

4. Fase de c. retardado durante la cual la tasa de c. disminuye (r ).

5. Fase estacionaria en la que la tasa de e. es nula (r = 0).

6. Fase de declive en la que la tasa de e. es negativa (r < 0).

Curva de crecimiento en medio no renovado.


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MICROBIOLOGA I 17

2 FASE DE LATENCIA Y FASE DE CRECIMIENTO ACELERADO.

El tiempo de latencia (Ti es el retraso del crecimiento real respecto al

crecimiento ideal), es decir, el crecimiento que habra observado de Tt se

determina grficamente las curvas de crecimiento Semilogaritmicas midiendo el

tiempo que media entre la fase exponencial observada y la recta paralela que

pasa por el origen.

La latencia se puede expresar tambin cuantitativamente determinado, por el

mtodo grafico que se indica en la figura de crecimiento real y el crecimiento

ideal (Monod, 1949).

Las fases de latencia y de aceleracin pueden faltar, y, cuando existen, se

pueden a la edad del inoculo o bien a una adaptacin enzimtica.

Fig. 82. Determinacin grfica de la latencia.

Los valores logartmicos de las densidades microbianas llevados a ordenadas corresponden al

inculo total (Xt), a la fraccin viable del inoculo (Xv), a la poblacin que se habra obtenido ene.

Mismo intervalo de tiempo en un crecimiento ideal, es decir, sino hubiese habido latencia (X 1). L

representa la diferencia del nmero de divisiones entre el crecimiento ideal y el real T1, es el

tiempo de latencia.


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a) Edad del inculo.

La latencia que se observa cuando se siembra un medio nuevo con organismos

procedentes de un medio de composicin idntica es tanto mas prologada cuando

mas viejo sea el cultivo de donde procede el inculo, es decir cuado mayor sea

el tiempo transcurrido desde que dicho cultivo dej de crecer.

Esta influencia de la edad del inculo se explica por dos motivos, por un lado, las

fases de latencia y de aceleracin expresan el tiempo necesario para reparar y

reconstruir sistemas enzimticos que han experimentado una alteracin

progresiva durante el tiempo que los microorganismos han permanecido sin

multiplicarse. Se ha demostrado que durante la fase estacionaria del

crecimiento disminuye el nmero de r ibosomas.

Por otra parte, un inculo (xt) procedente de un cultivo viejo contiene a veces

una cantidad muy grande de clulas no viables de tal forma que an cuando las

clulas visibles (Xr) empiecen inmediatamente ha desarrollarse

exponencialmente (fig.82), su proliferacin pasara inadvertida y no se reflejara

en la curva experimental hasta despus de varias divisiones.

b) Adaptacin enzimtica.

Las causas de la latencia que acaba de describirse se eliminan utilizando un

inculo procedente de un cultivo en fase exponencial. En este caso los

organismos transferidos a un medio nuevo de la misma composicin reanudan en

seguida su crecimiento exponencial. Pero si el inoculo procede de un medio de

distancia composicin, se puede observar una fase de latencia (fig.) que en este

se debe a una adaptacin enzimtica, es decir, a la sntesis de una o masenzimas necesarias para que las bacterias metabolizen el nuevo sustrato.


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Fig. 83 Adaptacin enzimtica y Fase de latencia. (Segn J. Monod. Am. Rev. Microbiol.

3, 371, 1949).Crecimiento de Escher iachia col i en medios sintticos sembrados con un precultivo en

crecimiento exponencial sobre arabinosa. El subcultivo sobre glucosa empieza inmediatamente,

mientras que sobre xi losa presenta un tiempo de latencia (T1)de unas dos horas y media.

3. FASE EXPONENCIAL

Durante esta fase, que en coordenadas semilogartmicas esta representada por

una recta, todas las clulas se dividen con una tasa de crecimiento constante

y mxima (Rmx), y la taza de de mortalidad es nula, y por tanto la

concentracin celular total es igual a la concentracin de clulas viables.

Conviene sealar que, en determinadas condiciones particulares, las bacterias

pueden no desarrollarse de modo exponencial, sino de forma lineal. Crecimientos

lineales prolongados se observan, sobre todo cuando se cultiva un organismo en


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presencia de anlogos estructurales de aminocidos, como la p-

Fluorofei lalanina o la B-Tielalanina(Fig. 84).

Tambin se han observado crecimiento lineales en mutantes que presentan un

bloqueo parcial de las sntesis de un aminocido usual, como un mutante

estreptomicin dependientes de Baci l lus subt i l is en ausencia de estreptocina.

Estos crecimientos lineales se atribuyen (Monod 1949)a que el desarrollo esta

limitado por una enzima cuya biosntesis esta inhibida especficamente, y por

tanto, su actividad permanece constante.

Fig. 84. Crecimientos lineales de Esch eriachia coli , en presencia de anlogos estructurales

de aminocidos (G.N . Cohen y R. Munier, Biophy s. Biochen. Acta, 31, 347, 1959.)

Cultivos en crecimiento exponencial sobre maltosa(0.2 por 100). En el tiempo cero se aade en

(A) DL-para-fluorofenilalanina (5.10 -4M) y en (B) DL, b-2 fenilalanina (10 -3M). Las curvas de

crecimiento exponencial de los cultivos testigo estn trazadas con lneas punteadas.

En A. aerogenes, la velocidad de crecimiento disminuye por encima de los 37 C

y se anula a los 42C. Dentro de esta gama de temperaturas , que varia de unas

bacterias a otras , la parte pendiente de la recta que representa el logaritmo de r

en funcin de 1/T indica la existencia de un proceso que tiene una elevada de

activacin y que al parecer consiste en la alteracin trmica de una

macromolcula (protena o cido nucleico).


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La disminucin de la tasa de crecimiento por encima de la temperatura ptima va

acompaada de un descenso de un rendimiento ponderal, mientras que este

rendimiento permanece constante en toda la zona de temperaturas en las que se

cumple la ley de Arrhenius.

4. FASE DE CRECIMIENTO RETARDADO

Esta fase se explica por lo dicho al tratar de la influencia de la concentracin del

factor limitante sobre la velocidad del crecimiento .Corresponde al periodo en que

el factor limitante esta a punto de agotarse, y su concentracin es inferior a lanecesaria para que r sea mxima.

5. FASE ESTACIONARIA

Rendimiento ponderal y molecular del crecimiento. Cuando el factor

limitante se ha agotado, el crecimiento se retiene (r = 0) y la poblacin

permanece estacionaria durante varias horas, hasta que se inicia la fase dedeclive. Ladiferencia entre poblacin inicial del medio recin sembrado yla

poblacin final (X-X0) es el crecimiento total (G).

Varios hechos indican que las enzimas que interviene en la degradacin de

protenas y la ARN (Ribonucleosa) preexisten durante el Crecimiento

Exponencial y que probablemente estn localizadas en los r ibosomas.

El hecho que durante la fase estacionaria halla una constante degradacin y

resntesis depro tenas, sin que apenas variara su masa total, es de gran

importancia para el estudio de la diferenciacin celular, y ms concretamente para

la b io sn tes isinducida de enzimas adaptativas en organismos no proliferantes.


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Fig. 89 Renovacin de protenas en Escheriach ia coli , en crecimiento exponencial (A) y en

suspensin no proliferante (B). (Segn J. M Mandelstam, Bac t. Revs , 24, 289, 1960).

La degradacin de las protenas se mide por la liberacin de leucina C 14 a partir de clulas

marcadas con este aminocido radiactivo. En trazo punteado: logaritmo de la densidad ptica

(curvas de crecimiento). Obsrvese que, en el caso de clulas en crecimiento, casi toda la

degradacin de las protenas precede a la fase exponencial.

6. FASE DE DECLIVE

Despus de un cierto tiempo, que vara segn los microorganismos y las

condiciones de cultivo, comienza la fase de declive, durante la poblacin decreta

(r


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realizado principalmente con Aerob acter aerogenes y otras bacterias Gram-

negat ivas.La curva de supervivencia se haba considerado siempre como una

curva exponencial que tenda sintomticamente a cero. Sin embargo, los citados

autores han observado que en diversas condiciones, y en especial cuando el

factor limitante es el sust rato de carbonado, la curva de supervivencia es lineal

al principio, hasta que se ha muerto 70-80 % de los organismos, y solo despus

se hace exponencial.

La prdida de viabilidad se acompaa de la liberacin de sustancias procedentes

de la degradacin de loscidos nuc leicos (Pentosas, fosfato, bases

nitrogenadas) y l a de las pr ot enas(amoniaco, cetocidos), que quedan en el

medio extracelular al alcance de los supervivientes, con lo que se produce el

fenmeno de crecimiento ctrico o de canibalismo Ryan (1955). La

duplicacin de un individuo superviviente corresponde a la utilizacin de

sustancias procedentes de 50 individuos muertos(Postgate y Honter, 1962).

La muerte en las bacterias se acelera en presencia de un su st rat o energtic o

(gl icerol , glucosa), lo que indica que el funcionamiento de las enzimas

metablicas aumenta la habilidad de las clulas. En cambio la muerte se retrasaen presencia de iones de Mg++ o cuando la concentracin celular es muy

elevada.

La existencia de crecimiento energticamente desacoplados demuestra que las

bacterias carecen de sistemas de regularizacin que permitan ajustar la velocidad

de la produccin de la energa es funcin de su utilizacin.


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CRECIMIENTO CONTINUO

1. FUNDAMENTOS:

La teora del crecimiento microbiano continuo en medio renovado fue establecida

por Monod (1959) y Sizilar (1950).

Fig. 92. Efecto de la adicin de fosfato sobre la actividad catablica de un cultivo bacteriano

(Zymomo nas mob i l is) limitado por el fosfato. (J.C Senez y J.P Belaich, les mecanismes de

rgu lation des activ is cellu laires ch ez les mi cro or gani sm es, pg. 357, CNRS, 1965.)

Experiencia realizada en un microcalormetro diferencial de Tian-Calvet. Ordenadas: velocidad de

produccin de calor (dQ/dt) a partir del sustrato energtico (glucosa). Abscisa: tiempo. La curva

muestra que el desarrollo exponencial del cultivo se detiene al agotarse el fosfato. La adicin de

un exceso de fosfato (0.5 mg/ml) provoca la reanudacin inmediata de la actividad catablica, a

una tasa superior, y esta diferencia permite calcular el control ejercido por la carencia de fosfato(21 por 100). El crecimiento continua entonces hasta el agotamiento de la glucosa.


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Monod ha demostrado que este valor es directa y linealmente proporcional

(fig.88) a la concentracin inicial (C)del factor limitante

G= KC

Esta relacin permite conocer de modo que experimentalmente la naturaleza del

factor limitante.

La constante K (K=G/C), expresada en gramos (peso seco) de bacterias

producidas por gramos de sustrato metabolizado, en el rendimiento ponderal del

crecimiento. Esta magnitud representa la asimilabilidad del sustrato por el

organismo considerado.

El rendimiento molecular se representa por la letra Y seguida de la

indicacin del sustrato(Y a para lagluco sa,Y gal parala galactos a, etc.).Es

evidente que Y es igual al producto de K por el peso molecular del sustrato.

2. RENOVACIN DE PROTENAS Y DE CIDOS NUCLEICOS.

La interrupcin del crecimiento lleva consigo un profundo reajuste de la estructura

celular y especialmente de una rpida renovacin (turnover)de las pro tenasy

del ARN(Mandelstam, 1960).

Esta renovacin se ha demostrado y medido de forma experimental en bacterias (

E. col i y A . aerogenes)previamente cultivadas en presencia dela leucina C 14

y d e or tofos fatoP 32 , a fin de marcar radiactivamente las pr ot enas y lo s

cidos nuc leicos, y despus resembrar en medios que contienen cantidades

relativamente elevadas de leucin a y fos fato fros. La cintica de la degradacin

de las pr otenas y de los cid os nu cleic osviene determinada por la velocidad

con que aparece la radiactividad en la leucinay el fosfatolibre extracelulares.


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RESUMEN DE LOS PARAMETROS Y CONSTANTES DEL CRECIMIENTO

Densidad microbiana: Masa (peso seco)de clulas por unidad de volumen.

Esta magnitud se suele determinar por nefe lometra(densidad ptica).

Concentracin Celular: Nmero de clulas por unidad de volumen. Esta

magnitud se mide casi siempre por cmputo de bacterias visible.

Factor Limitante: El componente del medio del cultivo o la condicin Fsico-

Qumicaque limita el crecimiento.

Tasa Horaria de Crecimiento (r): Nmero de divisiones por hora.

Tasa Mxima de Crecimiento Exponencial (r mx.): Tasa de crecimiento

independiente de la concentracin del factor limitante. Esta tasa de crecimiento es

la que se observa durante la fase exponencial de los cultivos en medio no

renovado.

Tiempo Medio de divisin o de Generacin (tg), inversa de la tasa de

crecimiento (tg=1/r).

Crecimiento Total (G): Peso seco de las clulas producidas en un cultivo. Esta

masa que se suele expresar en g/ml, poblacin final alcanzada al agotarse el

medio.

Rendimiento Ponderal (K): Crecimiento total por unidad de masa (g) de

sustrato metabolizado.

Rendimiento Molecular (Y): Crecimiento total por molcula/gramode sustrato

metabolizado.

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17103580 Crecimiento Microbiano PARTE1