UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOFacultad de Ingeniera Ambiental y
de Recursos Naturales
MICROBIOLOGIA GENERALGrupo Horario 02ASemana 9: CINETICA DE
CRECIMIENTO MICROBIANO
1. Sarmiento Gonzales Giannina 101315H2. Vasquez Huaman Rub
Dayan 100237C3. Gonzales Rojas Maryori093211H4. Salazar Aliaga
Kevin 101308A
Profesor: Blgo. Juan Jara ChumpitazSemestre Acadmico: 2012-B
CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
1. INTRODUCCIN AL CRECIMIENTO BACTERIANOSe suele definir el
crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento
ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual
implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a
la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha
multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo,
mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por
gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los
microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no
se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento
de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos
estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individual A escala
poblacionalLos eventos de crecimiento en el mbito individual hacen
referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los
siguientes temas: inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y
de plsmidos; segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas;
sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared
celular; seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin
celular.El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye
los siguientes tpicos: cintica del crecimiento; factores que
afectan al tiempo de generacin (g); factores ambientales que
limitan el crecimiento.En el presente captulo nos dedicaremos al
estudio en el crecimiento de poblaciones (que es el ms
frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos), con una
visin de algunos mtodos para obtener crecimientos balanceados.2.
CRECIMIENTO EN BACTERIAS A NIVEL DE POBLACIONES:En su mayora las
bacterias se reproducen mediante un mecanismo asexual en el cual la
clula crece, duplica su material gentico y luego se divide por la
mitad; este proceso da origen a dos clulas cada una de las cuales
repite el proceso. Este tipo de reproduccin se denomina fisin
binaria. (Vera Garca)El crecimiento bacteriano sigue tres fases.
Cuando una poblacin bacteriana se encuentra en un nuevo ambiente
con elevada concentracin de nutrientes que le permiten crecer
necesita un perodo de adaptacin a dicho ambiente. Esta primera fase
se denomina fase de adaptacin o fase lag y conlleva un lento
crecimiento, donde las clulas se preparan para comenzar un rpido
crecimiento, y una elevada tasa de biosntesis de las protenas
necesarias para ello, como ribosomas, protenas de membrana, etc. La
segunda fase de crecimiento se denomina fase exponencial, ya que se
caracteriza por el crecimiento exponencial de las clulas. La
velocidad de crecimiento durante esta fase se conoce como la tasa
de crecimiento k y el tiempo que tarda cada clula en dividirse como
el tiempo de generacin g. Durante esta fase, los nutrientes son
metabolizados a la mxima velocidad posible, hasta que dichos
nutrientes se agoten, dando paso a la siguiente fase. La ltima fase
de crecimiento se denomina fase estacionaria y se produce como
consecuencia del agotamiento de los nutrientes en el medio. En esta
fase las clulas reducen drsticamente su actividad metablica y
comienzan a utilizar como fuente energtica aquellas protenas
celulares no esenciales. La fase estacionaria es un perodo de
transicin desde el rpido crecimiento a un estado de respuesta a
estrs, en el cual se activa la expresin de genes involucrados en la
reparacin del ADN, en el metabolismo antioxidante y en el
transporte de nutrientes.
Basado en el concepto que una clula se divide dando dos clulas
hijas, y stas a su vez se vuelven a dividir dando dos clulas cada
una de ellas, se presenta en el siguiente cuadro la proliferacin de
una poblacin de clulas a partir de una sola, con un tiempo de
generacin de 30 minutos.
Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y
el nmero de clulas (ordenadas) se obtiene una grfica como la que se
muestra en el siguiente esquema:
3. MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE UNA POBLACIN
El crecimiento de una poblacin microbiana se puede medir
estimando el incremento de masa celular o el aumento del nmero de
clulas. En ambos casos se pueden emplear mtodos directos o mtodos
indirectos. Los ms utilizados son los siguientes:3.1. Mtodos de
medida de la MASA CELULAR
3.1.1 Determinacin del peso seco (directo)
Las clulas de un cultivo se recogen por centrifugacin de un
volumen determinado, se lavan, se secan y se pesan. Se admite que 1
mg contiene entre 5 y 10 clulas Mtodo laborioso y poco sensible
pero es vlido para hongos.
3.1.2 Determinacin del peso hmedo (directo)
Pasos a seguir:
Se tara un tubo centrfuga Se centrifuga el cultivo y se elimina
el sobrenadante Se determina el peso del sedimento
3.1.3. Determinacin de un componente caracterstico (directo)
Se debe encontrar componentes como el peptidoglucano, ADN, ARN,
protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc.
3.1.4. Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn
metabolito por unidad de tiempo (indirectos)
Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2),
determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos.
3.1.5. Mtodos Turbidimtricos (indirectos)
Se basan en la capacidad de las clulas para dispersar la luz que
incide sobre ellas. Dado que el tamao de las clulas en cultivo puro
permanece casi constante, el grado de dispersin es directamente
proporcional a la biomada presente. Se mide en trminos de TURBIDEZ,
disminucin de la luz transmitida a travs del tubo, lo que equivale
a mayor cantidad de luz absorvida. Al aumentar la masa microbiana,
aumenta la turbidez y aumenta la absorvancia Ambos parmetros se
miden con un espectofotmetro que mide unidades de densidad ptica
Tambin se puede medir la turbidez por comparacin con escalas
prefabricadas.
3.2. Mtodos directos de medida del nmero de clulas
3.2.1. Recuento en cmara de Petroff-Hausser
Las cmaras de recuento son portas excavados modificados sobre
cuya superficie esta marcada una rejilla con pequeos cuadros de rea
conocida. Se utilizan para contar el nmero de clulas por unidad de
volumen de suspenciones bacterianas. Para trabajar se cubre la
cmara con un portaobjetos y por capilaridad se introduce la
muestra.
La de Petroff-Hausser se utiliza para contar bacterias. La
excavacin mide 0.02 mm de profundidad y est dividida en 25 cuadros
grandes, subdivididos a su vez en 16 pequeos (hay 400 celdillas en
1mm2)
3.2.2. Recuento en placa. Diluciones seriadas
Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta
ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En
muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en
laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una
clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado,
es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de
lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de
un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con
agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus
del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles,
teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de
alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la
suspensin original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva,
y sobre todo, estate atento a la prctica correspondiente, que se
suele realizar en la 3 tanda).
3.2.3. Recuento sobre filtros de membrana
Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un
gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa
o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las
bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente,
el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo
slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las
clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la
concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin
que se hizo pasar por el filtro.
CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)Una poblacin de bacterias
que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen
constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece
de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa
celular, no de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor
constante y similar en cada caso:M/M = N/N = [ADN]/[ADN] =
[protenas]/[protenas] = ... = KAs pues, durante este crecimiento,
de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una
reaccin autocataltica de primer orden:Velocidad de aumento del
componente = K{cantidad del componente}Tambin se puede decir que el
no de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un
mismo lapso de tiempo determinado.Este tipo de crecimiento se
denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el
crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se
duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera:
aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente
por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el
coeficiente exponencial de crecimiento (), que es caracterstico
para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADOPara deducirla
vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por un
lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del
nmero de individuos.a) En funcin del aumento de masa celular:, y
por lo tanto, dM = MdtSi integramos, resulta: M/M0 =
e(t-t0)Aplicando logaritmos neperianos:
De aqu se puede deducir que el coeficiente es
b) En funcin del aumento del nmero de clulas. Supongamos que
partimos de una clula. Tras una divisin (generacin celular),
tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc: tenemos
una serie geomtrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es el nmero
de generaciones transcurridas). Si en vez de partir de una clula
partimos de N0 clulas iniciales, tenemos:N = N02n ; por lo
tanto:N/N0 = 2nPor otro lado, el nmero de generaciones se puede
calcular fcilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y
conociendo el tiempo medio de generacin (g):
Sustituyendo esta expresin en la frmula {12.3} tenemos:N/N0 =
2(t-t0)/gApliquemos logaritmos neperianos:
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos
expresiones matemticas {12.1} y {12.4} que hemos deducido (la de la
seccin A, basada en masa, y la de la seccin B, basada en nmero de
individuos) son equivalentes:, y por lo tanto: (t-t0) =
(t-t0)/gln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de
crecimiento exponencial:, expresado en h-1Esta es la expresin
matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del
tiempo medio de generacin (g).En un medio ideal, sin limitacin de
nutrientes, este coeficiente es = mx, o sea, el mximo valor posible
del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un
crecimiento balanceado no restringido.En un medio donde exista algn
nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est por debajo del
lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es
de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento
es inferior al mximo, segn la frmula emprica siguiente (ecuacin de
Monod):
Donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; KS es la
constante de saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente
para la que el coeficiente es semimximo. Como se puede ver, la tasa
de crecimiento (medida por ) es una funcin hiperblica de la
concentracin del sustratro (nutriente) limitante (ver grfico). Este
sustrato puede ser una fuente de C y/o de energa, fuente de N, de
P, un factor de crecimiento, etc.Ejemplos de KS: la KS para la
glucosa en E. coli es 110-6M
la KS para el triptfano en esta bacteria es 210--7 M
Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas
de membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptacin
evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos
en nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario, los
medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen
ser ms concentrados).
CRECIMIENTO DIAUXICOElcrecimiento diaxicoes un tipo
crecimientomicrobianobifsico que tiene lugar cuando hay presentes
dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente
decarbono. En este tipo decrecimiento microbianose observa una
curva de crecimiento bifsica debido a la utilizacin secuencial de
distintas fuentes de carbono. Elmetabolismodel organismo es
selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono
que permite un crecimiento ms rpido) y cuando la agota, comienza a
metabolizar el otro.Supongamos que inoculamos una bacteria en un
medio lquido provisto de dos fuentes de carbono (p. ej., glucosa y
lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada
preferencialmente. Si representamos la cintica del crecimiento
poblacional segn hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos
una curva como la de la figura siguiente:Obsrvese que se dandos
fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase
intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos
fases exponenciales se conoce con el nombre de
crecimientodiuxico.1. Bases del crecimiento diuxico:La bacteria usa
en primer lugar slo la fuente preferencial de C (en este caso, la
glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos
heterotrofos), sin "tocar" la otra fuente. Una vez que agota la
primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.: lactosa),
perotarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas
catablicosnecesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las
bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se
restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede
constatar en el grfico, con una pendiente menor (lo que significa
que esta fuente alternativa permite una tasammenor que la
preferencial).
CULTIVOS CONTINUOS. SISTEMAS ABIERTOSEs un cultivo balanceado
mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se
compone de: una cmara de cultivo de volumen constante,
a la que llega un suministro de nutrientes,
y de la que se eliminan o separan los productos txicos de
desecho (por un dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el nmero de clulas
y la concentracin de nutrientes en la cmara permanecen constantes,
y entonces se dice que el sistema est en estado estacionario, con
las clulas creciendo exponencialmente.Los parmetros a tener en
cuenta son: flujo (f), medido en ml/h
volumen de la cmara de cultivo (v, en ml)
densidad celular en la cmara (x)
factor de dilucin D = f/v (en h--1). El inverso de este factor
de dilucin es el tiempo medio de residencia (1/D= TMR)
Existe una prdida de clulas por el rebosadero: -dx/dt = xDEl
crecimiento bruto es dx/dt = xmPor lo tanto, el crecimiento neto es
dx/dt = xm- xD = x(m- D)Si logramos que el coeficiente de
crecimiento (m) se haga igual al factor de dilucin (D), entonces
dx/dt = 0, y por lo tanto la concentracin de clulas se hace
constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces enestado dinmico
de equilibrio. Las prdidas de clulas por drenaje se compensan con
las ganancias por crecimiento.Existen dos tipos de procedimientos
para obtener cultivos continuos:1.1. TurbidostatoPermite cultivos
continuos con un coeficientemcercano almmx, trabajando a valores
altos de D. Ello lo logra ajustando los valores de densidad celular
de modo que ningn factor nutricional se haga limitante.Se dice que
es un sistema de control interno porque es la misma concentracin de
bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio
de un mecanismo electrnico basado en la medicin y control de la
densidad ptica del cultivo).
Inconvenientes: es difcil de manejar y ajustar;
si las bacterias tienen tendencia a adherirse a superficies
(paredes internas del aparato), los resultados de medida de la D.O.
quedan falseados (infravalorados).
AplicacionesSe emplea bastante en el estudio de los factores que
incrementan o disminuyen la tasa de crecimiento.1.2.
QuimiostatoPara introducirnos al funcionamiento del quimiostato,
partamos de la observacin de lo que pasara en el turbidostato si
desconectamos el fotmetro y ajustamos la bomba 1 para que vierta
medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que
mantiene lamcercana a lammx:Las bacterias tenderan a crecer a mayor
velocidad que su dilucin debida a adicin de medio fresco; por lo
tanto, en un principio aumentara la concentracin de bacterias.Pero
este incremento no podra continuar indefinidamente. Pero el
crecimiento tampoco se detendra. De hecho, tras un cierto tiempo,
el cultivo alcanzara unnuevo estado estacionario de equilibrio, en
el que latasa de crecimiento se hace proporcional a la tasa de
adicin de medio fresco. En este caso, el cultivo
creceexponencialmente, pero a tasasm
