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Escuela Acadmica Profesional De Ingeniera Agroindustrial
TEMA
Asignatura : Biotecnologa
Docente : ing.
Estudiantes :
Yaneth Gonzales Elguera 092069
Mayumi Patio Condori 102084
Miguel Monzon Roque 102081
Dina Aybar Damian 081218
Maribel Pampaaupa Alvites 092085
Abancay-Apurmac
2015
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CINTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
I. INTRODUCCION El objetivo de la microbiologa predictiva en
sistemas de alimentos consiste en describir matemticamente el
crecimiento, sobrevivencia o muerte de microorganismos bajo
condiciones ambientales especficas. El comportamiento microbiano se
ve afectado por diversos factores intrnsecos y extrnsecos. Sin
embargo, generalmente los ms importantes y los que controlan o
definen el crecimiento o sobrevivencia son: temperatura, pH, y
actividad de agua. La evaluacin de la respuesta microbiana bajo la
combinacin de esos factores permite la descripcin, modelado y
prediccin de diferentes situaciones. Las expresiones matemticas
permiten predecir la respuesta microbiana ante condiciones no
evaluadas dentro del intervalo de los niveles de los factores o
variables estudiadas. Los modelos microbianos son una herramienta
de vital importancia ya que proveen de manera rpida, informacin
necesaria para la toma de decisiones, anlisis de riesgos,
aseguramiento de la calidad, desarrollo de productos y procesos,
anlisis de datos, planeacin de ensayos de laboratorio, entre otros
(la importancia de estos puntos se explica con detalle en la
revisin bibliogrfica). El modelado microbiano tiene sus inicios
hacia 1920 con el estudio cintico de los tratamientos trmicos. Con
la llegada de los computadores el inters por los modelos
microbianos creci ya que se facilit el manejo de los modelos
multifactoriales. La respuesta microbiana puede predecirse con base
en la respuesta que se obtiene a un solo factor presente.
Actualmente los modelos predictivos se han venido desarrollando con
mayor intensidad para microorganismos patgenos (especialmente
bacterias causantes de infecciones e intoxicaciones de origen
alimentario). Con este proyecto se pretende ampliar algo ms el
conocimiento que se tiene de los modelos microbianos respecto a la
flora deteriorativa, y predecir el comportamiento de la levadura en
productos alimenticios como jugos, mermeladas, compotas y dems
productos azucarados.
II. OBJETIVOS Obtener la ecuacin cintica del crecimiento del
microorganismo
(levadura), en las diferentes concentraciones con respecto al
tiempo.
III. REVISION BIBLIOGRAFICA
3.1. CRECIMIENTO MICROBIANO
El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del nmero
de
microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamao
de un
microorganismo. El aumento del nmero de microorganismos permite
la
formacin de colonias o de poblaciones. Es por eso que en
microbiologa el
crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos
individuales.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria. El
resultado de la
fisin binaria son dos clulas hijas por cada clula madre, as, una
clula se
divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y as
sucesivamente. Cuando se
siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los
mismos
comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que
le aporta el
-
medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este
proceso contina
hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante) y el
crecimiento se detiene. Tambin puede detenerse el crecimiento
por
acumulacin de alguna substancia inhibidora formada por los
mismos
microorganismos, pero supngase por ahora que ste no es el caso y
que la
primera alternativa es la vlida. Luego hay dos aspectos
claramente
diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno
estequiomtrico, por el
cual la concentracin final de microorganismos obtenidos depender
de la
concentracin y composicin del medio de cultivo, y el otro
cintico, el que dir
con qu velocidad se lleva a cabo el proceso. (Prescott y col
.,1999).
La microbiologa predictiva est relacionada con la compleja
dinmica del
comportamiento de la poblacin microbiana , tal como fue
observado por monod
(1949), el crecimiento de los cultivos bacterianos a pesar de la
inmensa
complejidad del fenmeno ,generalmente obedece a leyes
relativamente
sencillas, las cuales hacen posible definir ciertas
caractersticas cuantitativas del
ciclo del crecimiento, esencialmente las tres constantes del
crecimiento:
crecimiento total ,tasa del crecimiento exponencial y
crecimiento latente. Estas
definiciones no son puramente arbitrarias y corresponden a
elementos
fisiolgicos distintos del ciclo de crecimiento (McMeekin y ros,
2002).
3.2. CURVA DE CRECIMIENTO
La curva de crecimiento de un cultivo microbiano puede ser
subdividida en cuatro
partes distintas denominadas fase de latencia, fase exponencial,
fase
estacionaria y fase de muerte. De las cuatro fases de la curva
de crecimiento,
habitualmente la fase de crecimiento exponencial o logartmico es
la que
presenta mayor inters por ser la fase en la que el incremento
del nmero de
microorganismos es mximo. Durante esta fase el tiempo de
generacin (g) de
los microorganismos (el tiempo que la poblacin de microorganismo
necesita
para duplicar su nmero) se mantiene constante.
Grafico 1: curva de crecimiento microbiano
3.2.1. Fase de latencia
-
La fase de latencia, es el periodo de ajuste que las clulas
experimentan al ser transferidas de un medio al otro antes de
iniciar su crecimiento. En esta fase se producen las enzimas
necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente.
En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas, pero hay gran
actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas,
en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas. (Penfold
,1914). 3.2.2. Fase exponencial o fase logartmica
la fase exponencial o logartmica es aquella durante la cual los
microorganismos
crecen y se dividen hasta el nivel mximo posible, en funcin de
su potencial
gentico ,tipo de medio y condiciones en que crece .en este
periodo hay una
relacin lineal entre el logaritmo del nmero de clulas (o
cualquier otra
propiedad medible de la poblacin) y el tiempo .los
microorganismos se dividen
y duplican en nmero en intervalos regulares .como cada clula se
divide en un
momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento
aumenta
suavemente, en lugar de realizar discretos saltos.
(Robinson y col .,1998)
3.2.3. Fase estacionaria
La fase estacionaria es resultado del agotamiento de los
nutrientes disponibles
o del efecto de acumulacin de productos txicos de metabolismo
que tienen
como consecuencia la disminucin de la velocidad del crecimiento
.la transicin
entre la fase exponencial y la fase estacionaria se caracteriza
por un crecimiento
desequilibrado, durante el cual los diversos componentes
celulares son
sintetizados a diferentes velocidades (Buchanan y Solberg .,
1972).
3.2.4. Fase de muerte
La fase de muerte es consecuencia de diversos factores: uno
importante es el
agotamiento de las reservas celulares de energa. Al igual que el
crecimiento, la
muerte tambin asume una fusin exponencial que puede ser
representada por
una disminucin lineal del nmero de las clulas viables a loa
largo del tiempo
(Madigan y col ., 1999).
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3.3. CINTICA DE LA DEGRADACIN BIOLGICA
Grafico 2: cintica de la degradacin biolgica
La velocidad de acumulacin de biomasa es
=
X= (biomasa)
=velocidad especfica de crecimiento (generaciones t-1)
3.4. CINTICA DE MONOD (1942)
=
+
=
=
+
= velocidad especfica de crecimiento (generaciones t-1) max =
velocidad mxima de crecimiento (generaciones t-1) S = concentracin
de sustrato Ks = constante de velocidad media (velocidad esp. de
crecimiento) Constante de Monod
Posee limitaciones
-
1) A muy bajas concentraciones de sustratos no va bien (conc.
mn. de sust que
no contempla)
2) A muy altas concentraciones de sustratos Ks real es cte.
Y= coeficiente de rendimiento
=
+
=
=
/
/=
=
( )
=
+ =
+
Realmente la ecuacin es
=
+ ;
=
+
b=cte. de declive endgeno (t-1)
3.5. ADAPTABILIDAD Y VARIABILIDAD DE RESPUESTAS MICROBIANAS.
IMPLICACIONES SOBRE LA MICROBIOLOGA Y LA BIOTECNOLOGA
PREDICTIVA
El proceso de adaptacin de los microorganismos a las condiciones
del medio
en que se encuentran depende de varios factores como es el caso
de la
composicin del medio mismo o del estado fisiolgico de manera
distinta en la
prediccin de la cintica de los microorganismos. Dichas
respuestas de los
microorganismos a las condiciones de crecimiento pueden ser
evidenciadas a
travs de sus parmetros de crecimiento como son el tiempo de
latencia, tiempo
de generacin y la velocidad de crecimiento.
3.5.1. Tiempo de latencia
Un fenmeno inherente a la cintica micro0biena es latencia, la
cual es
tpicamente observada como la respuesta retarda de la poblacin
microbiana
anta (repentino) cambio en el ambiente. La fase de latencia
puede producir en
ambos procesos, de crecimiento y de inactivacin (Swinnen y col
., 2004).
En el caso de las condiciones de crecimiento, la fases de
latencia es el periodo
de ajuste durante el cual las clulas bacterianas se modifican
por si mismas con
el objetivo de sacar ventaja del nuevo ambiente e iniciar el
crecimiento
exponencial (Buchanan y Klawitter ,1991).por tanto, durante la
fase de latencia
-
las clulas se adaptan a su nuevo entorno induciendo o
reprimiendo la sntesis
y actividad de determinadas enzimas, iniciando la replicacin de
su material
gentico, y en el caso de las esporas , diferencindose en
clulas
vegetativas(Montville , 2000).
Dado que la tpica curva de crecimiento es de tipo sigmoildal, la
duracin de la
fase de latencia puede ser cuantificada como el tiempo obtenido
por la
extrapolacin de la tangente en la parte exponencial de la curva
de crecimiento,
hacia el nivel del inoculo. Esta definicin est actualmente ms
extendida
(Swinnen y col. ,2004).
La duracin del tiempo de latencia suele ser estimado
errneamente, esto es
usualmente atribuido al efecto de la historia previa de las
clulas.
Robinson y col .,(1998)formalizaron el concepto de tiempo de
latencia
dependiente de dos elementos
La cantidad de trabajo necesario por parte de las clulas para
adaptarse
al nuevo ambiente y/o reparar los daos debidos ese cambio.
La proporcin en la que estas reparaciones pueden hacerse.
Debido a la existencia de la multitud de factores anteriormente
mencionados que
afectan el comportamiento de la fase de latencia, es difcil
obtener predicciones
(Swinnen, 2004).
3.5.2. Tiempo de generacin
El tiempo de generacin es el tiempo necesario para duplicar la
poblacin
microbiana (Segn Stanier y col., 1989) se define como el tiempo
requerido
para que todo los componentes del cultivo aumenten en un factor
de 2.
Durante este periodo de generacin el nmero de clulas y la masa
celular se
duplica. El tiempo de generacin vara entre los distintos
microorganismos.
Muchas bacterias tienen tiempos de generacin de 1-3horas,
conocindose
pocos microorganismos que crezcan muy rpidamente dividindose en
menos
de 10minutos.otras tienen tiempos de generacin de varias horas o
incluso das
.el tiempo de generacin es til como indicador del estado
fisiolgico de una
poblacin celular, y es usado con frecuencia para comprobar el
efecto negativo
o positivo de un determinado tratamiento sobre un cultivo
microbiano ( Madigan
y col .,1997).
Este tiempo de generacin est directamente relacionado con la
velocidad de
crecimiento exponencial, que se define como la pendiente de la
curva de
crecimiento logartmico en la fase de crecimiento exponencial.
Generalmente,
estos dos parmetros son estimados por el ajuste de los modelos
primarios
(Delignette-Muller,1998).
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3.5.3. Velocidad de crecimiento
Como ya se ha indicado anteriormente, el crecimiento se define
como un
incremento en el nmero de clulas microbianas en una poblacin, lo
cal tambin
puede ser medido como un incremento en masa microbiana en este
contexto, la
velocidad de crecimiento se define como el cambio en nmero de
clulas o masa
celular por unidad de tiempo (Madigan y col .,1999).
Un cultivo microbiano creciendo en equilibrio imita una reaccin
autocatalitica de
primer orden, es decir, la velocidad del aumento de bacterias en
un tiempo dado
es proporcional al nmero o masa de bacterias presentes durante
ese tiempo
(Stanier y col.,1989).
La tasa del crecimiento exponencial se ve influenciada por las
condiciones
ambientales (temperatura, composicin del medio), as como por
las
caractersticas genticas del microorganismo (Madigan y col
.,1997).
3.6. INFLUENCIA DE LOS FACTORES FSICOS, QUMICOS Y
AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Los alimentos son ecosistemas complejos .los ecosistemas estn
constituidos
por el medio ambiente y los organismos que viven en l. El
ambiente de un
alimento est constituido por factores intrnsecos inherentes al
alimento (el pH,
la actividad de agua y los nutrientes) y factores extrensicos a
l (la temperatura,
la composicin del aire o la presencia de otras bacterias)
(Montville,2000).
El crecimiento bacteriano est influido notablemente por la
naturaleza qumica y
fsica de su ambiente. El conocimiento de estas influencias
ambientales permite
controlar el crecimiento microbiano y estudiar la distribucin
ecolgica de los
microorganismos. (Prescott y col .,1999).Numerosos factores
afectan el
crecimiento de los microorganismos en los alimentos, y , a
menudo ,sus
interacciones tienen un efecto significativo sinrgico o
antagnico sobre el
crecimiento . Estos interactivos pueden ser muy importantes en
los sistemas
alimentarios, en los cuales el crecimiento bacteriano puede
verse favorecido o
inhibido por los mltiples ingredientes, condiciones de
almacenamiento o
constituyentes alimentarios (Eifert y col .,1996).
3.6.1. Temperatura
El control de la temperatura se encuentra entre los factores ms
crticos precisos
para el logro de un suministro alimentario que rena las
propiedades sanitarias
y organolpticas correctas. Probablemente sea la temperatura el
ms importante
de los factores ambientales que afectan a la viabilidad y el
desarrollo microbiano
(ICMSF,1983). El factor que ms influye sobre el efecto de la
temperatura en el
crecimiento es la sensibilidad de las reacciones catalizadas por
enzimas a
-
determinadas temperaturas .en condiciones de baja temperatura ,
un aumento
eleva la velocidad de crecimiento , porque la velocidad de una
reaccin
catalizada por enzimas , como de cualquier reaccin qumica casi
se duplicara
por cada incremento de 10c.como la velocidad de cada reaccin
aumenta ,el
metabolismo en general es ms activo a temperatura altas , y el
microorganismo
crece ms rpidamente . a partir de cierto punto ,un mayor
incremento de la
temperatura disminuye la velocidad de crecimiento ocasionan daos
a los
microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las protenas
transportadoras y
otras protenas (Prescott y col ., 1999; Montville ,2000).
Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Si
consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento en
funcin de la
temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima
por debajo
de la cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce
un incremento
lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de
cultivo hasta que se
alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es mxima. Por
encima de
esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae
bruscamente y se
produce la muerte celular (Madigan y col .,1997).
3.6.2. Actividad de agua (aw)
La actividad de agua (aw) de una solucin es el 1% de su humedad
relativa
(cuando se expresa en %).equivale tambin a la relacin entre la
presin de
vapor de solucin (Psol) y la del agua pura (Pagua). La actividad
de agua de
una solucin o un slido puede establecerse aislando la muestra en
un cmara
y midiendo la humedad relativa despus de que el sistema haya
alcanzado el
equilibrio (Prescott y col .,1999).
La actividad de agua esta inversamente relacionada con la presin
osmtica. La
mayora de los microorganismos, incluyendo las bacterias
patgenas, crecen
ms rpidamente a niveles de aw de 0.995-0.980.la aw de la mayora
de los
medios de cultivo utilizados en el laboratorio es de
0.999-0.990. A valores de aw
inferiores a estos, la velocidad de crecimiento y la poblacin
estacionaria o la
masa celular final disminuye, y la fase de latencia. A una aw
suficientemente
baja, la cual es difcil de definir con precisin, la fase de
latencia se hace infinita,
es decir el crecimiento cesa (ICMSF, 1983).
La gran mayora de los microorganismos requiere valores de
actividad de agua
muy altos para poder crecer. Los valores mnimos de actividad
para diferentes
tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los
siguientes: bacterias
aw>0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos
aw>0.80.Como puede verse,
-
los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con
actividad de
agua menor (ms secos) de la que permite el crecimiento de
bacterias o de
levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro de
alimentos de baja
actividad de agua (por ejemplo, el queso o almbares) por mohos
(hongos
filamentosos) y no por bacterias. En funcin de su tolerancia a
ambientes con
baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas
condiciones se
clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilos segn toleren o
requieran
condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente (Prescott y
col ., 1999).
3.6.3. PH
El pH es una medida de la actividad de los iones de hidrogeno de
una solucin
que se define como el logaritmo negativo de la concentracin de
iones de
hidrogeno (expresado en moles). Es decir, cambio de una unidad
de PH
representa un cambio de 10 veces en la concentracin de iones de
hidrogeno
.por eso, por ejemplo el vinagre (con un pH aproximado a 2) y el
amoniaco
domstico (con un pH aproximado a 11) tienen una diferencia de
concentracin
de iones de hidrogeno aproximada a un billn de veces (Madigan y
col., 1997).
Cada especie tiene un intervalo definido de pH para su
crecimiento y un pH
ptimo para su crecimiento .Aunque los microorganismo crecen a
menudo en
medios en un amplio de intervalo pH, su tolerancia tiene un
lmite .variaciones
intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la
membrana
plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y protenas
transportadoras.
Los cambios en el pH externo pueden modificarse tambin la
ionizacin de las
molculas de nutrientes, disminuyendo, por ello, su
disponibilidad para el
organismo (Prescott y col.,1999).
El pH interno en la mayora de los microorganismos est en el
rango de 6,0 a
8,0. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de
microorganismos son,
tambin, distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden
vivir a pH=1.0 y
otros alcalfilos que toleran pH=10.0.
3.6.4. Potencial redox
Nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar.
Electrones, esto es:
sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores
que intervienen
en el potencial redox, aunque no el nico, es la concentracin de
oxgeno (O2).
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para
crecer, mientras
que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de
ambos tipos de
microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento
de condiciones
oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de
presencia o
ausencia de oxgeno para que se produzca el crecimiento (Prescott
y col .,
1999).
-
En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente
oxidante se dice
que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras
que los
microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos
oxidantes)
realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es
aerobio cuando
necesita oxgeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo
necesita
(anaerobios facultativos como las bacterias entricas, o como
Saccharomyces
cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias
lcticas) o cuando
muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los
clostridios)
(Prescott y col ., 1999).
3.6.5. Nutrientes
Los microorganismos requieren para su desarrollo los siguientes
elementos:
agua, fuentes de energa, fuente de nitrgeno, vitaminas y otros
factores de
crecimiento y minerales. Los hongos tienen las necesidades de
agua ms
reducidas, seguidos de las levaduras, bacterias gram negativas y
bacterias gram
positivas. Los microorganismos pueden utilizar azcares,
alcoholes y
aminocidos como fuente de energa. Algunos de ellos son capaces
de emplear
la energa de carbohidratos complejos, como almidones y celulosa,
ya que tienen
la capacidad de degradar estos compuestos hasta azcares
sencillos. Tambin
las grasas son utilizadas como fuentes de energa, aunque slo un
nmero
relativamente pequeo de los microorganismos de los alimentos son
capaces de
degradarlos. Los aminocidos constituyen la fuente primaria de
nitrgeno para
los organismos heterotrficos. Un gran nmero de otros
compuestos
nitrogenados tambin pueden cumplir esta funcin con relacin a las
diversas
clases de organismos. Por ejemplo, ciertos microorganismos son
capaces de
utilizar nucletidos y aminocidos libres, mientras que otros
emplean pptidos y
protenas (McMeekin y Ross, 2002).
En general, la mayora de los microorganismos utilizan compuestos
simples
como los aminocidos, antes de tener que desdoblar compuestos
ms
complejos, como las protenas de alto peso molecular. Ocurre lo
mismo con los
polisacridos y grasas.
3.6.6. Nitrgeno, Azufre y Fsforo
En la sntesis de su material celular los microorganismos
utilizan el nitrgeno
principalmente para formar el grupo amino de los aminocidos
constituyentes de
las protenas. En algunos casos de simbiosis el nitrgeno fijado
por bacterias se
comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual
permite
aumentar la fertilidad del suelo. El azufre se utiliza
generalmente para sintetizar
aminocidos y vitaminas como la timina y la biotina. El fsforo se
utiliza en
sntesis de cidos nucleicos y de los fosfolpidos de las membranas
celulares.
3.6.7. Oxgeno
-
Los microorganismos aerobios utilizan el oxgeno molecular con el
cual producen
ms energa a partir de los nutrientes. Sin embargo existen
microorganismos
anaerobios facultativos que utilizan el oxgeno disponible, pero
si no lo hay
pueden crecer mediante procesos de fermentacin o respiracin
anaerbica. La
bacteria Escherichia coli muchas levaduras son anaerobios
facultativos. Existen
adems los anaerobios obligados para los cuales el oxgeno es
perjudicial y por
consiguiente no lo utilizan. En este caso los tomos de oxgeno de
sus
componentes celulares los obtiene normalmente del agua. Es
comprensible
entonces el uso del in perxido para el control bacteriano ya que
en este caso
es una forma txica de oxgeno.
III. MATERIALES, EQUIPOS
Cuadro1: materiales y equipos utilizados para la determinacin de
la cintica de
crecimiento
4.1. MATERIALES 4.2. EQUIPO 4.3. MUESTRAS DE MEDIO
CULTIVO 863
2 Matraz Erlenmeyer de 250ml ,100ml
12 Tubos de ensayo
3 Pipetas de 10ml
Algodn
Gasa
Alcohol 96
Papel aluminio
Papel graff
Pabilo
Tejera
Mechero
Agua destilada 1000ml
Gradilla
Autoclave
Incubadora
Refrigeradora
Balanza analtica
Extracto de levadura 10g
Peptona 10g
Glucosa 20g
Sacarosa 30g
Agua destilada 1000ml
Fuente: Elaborado por estudiantes de la carrera profesional de
ingeniera agroindustrial ciclo
2014-II
Material biolgico: saccharomyces cerevisiae
V. METODOLOGA
5.1. Determinacin de biomasa, elaboracin de la curva de
crecimiento
1. Preparar los materiales listos para ser esterilizados en
autoclave
-
2. Pesar las muestras de glucosa de 10g, sacarosa 30g, peptona
de 10g.
3. preparar el precultivo inoculando levadura saccharomyces
cerevisiae
seca aproximadamente 0.5- 1g en 40ml de un medio 863 (glucosa al
2%)
como fuente de carbono.
4. incubar a una temperatura de 60c con agitacin por una
noche
5. inocular el 5% del pre cultivo en 150ml de un medio 863(3% de
sacarosa).
6. Tomar 5ml del cultivo de acuerdo a las horas indicadas por el
docente
encargado del curso por 3 das en los tubos de
ensayo(9.00am,10.00am,11.00am,12.00pm,3.00pm,6.00pm ;7.00am
,12.00pm,6.00pm;7.00am, 6.00pm)
7. Una vez terminada los once tubos contenidas cada una con 5ml
de cultivo
llevar a la centrifuga
8. centrifugar las muestras a 4000rpm por 15min, para separar
las clulas
de la levadura; el sobrenadante se guarda en tubos por
separado.
9. El precipitado que contena las clulas se re suspende en 5ml
de SSF
0.85% y se colocan en tubos tarados en una estufa al vaco de
80c
durante 24 horas hasta que alcanzo un peso constante.
10. Una vez pesadas las 24 horas se obtuvo por deferencia de
peso la
cantidad en gramos de la levadura precipitada , la cual se le
resto el valor
de un blanco en el cual fue preparado solo con solucin salina
fisiolgica
0.85%.
RESULTADOS
los resultados que se encontr en la practica se desarrollaran a
continuacin los
clculos son bsicamente para determinar los valores la velocidad
de crecimiento y la
constante de saturacin (constante de monod)
para locual se utilizara la siguiente ecuacin
partiendo la de la ecuacin de Michael Menten
=[]
+ []= =
[]
+ []
Donde
u= h-1
umax=h-1
Ks=g/l
Para determinacin de los valores de u y ks se trabajo con 4
concentraciones de
sacarosa utilizando como microorganismo sacharomyces
cerviseae
-
Cuadro 2: distribucin de la muestras con las respectivas
concentraciones
Muestra concentracin
A 30%
B 10%
C 40%
D 20%
Fuente: Elaborado por estudiantes de la carrera profesional de
ingeniera agroindustrial ciclo
2014-II
Resultados para la muestra A a 30% de concentracin de
sacarosa
Cuadro 3: resultados de la biomasa de la muestra A a las 48
horas
0 0,008
1 0,0094
2 0,0095
3 0,0095
4 0,0096
5 0,0097
6 0,0098
7 0,0099
8 0,01
9 0,015
10 0,019
12 0,02
14 0,03
18 0,08
22 0,12
24 0,13
26 0,15
30 0,18
40 0,25
48 0,26
-
Grafico 3: curva de crecimiento de la muestra A
Ecuacin para determinar la biomasa en un tiempo determinado
=
0
ln ln =
=
Encontrando el valor de u
Grafico 4: curva para determinar valor de u
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 10 20 30 40 50 60
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
curva de crecimiento muestra A
Series1
y = 0.0084x - 0.0755R = 0.988
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
-
Del grafico anterior obtenemos u que es igual a la pendiente
Donde =0,0084 remplazando este valor en la ecuacin anterior y
x0=0,008
= 0,0080,0084
Muestra B concentracin de 10%
Cuadro 4: resultados de la biomasa de muestra B a las 48
horas
0 0,002
1 0,003
2 0,003
3 0,0035
4 0,004
5 0,0046
6 0,008
7 0,01
8 0,014
9 0,014
10 0,016
12 0,022
14 0,03
18 0,044
22 0,064
24 0,076
26 0,088
30 0,11
40 0,164
48 0,168
Grafico 5: curva de crecimiento de la muestra B
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0 10 20 30 40 50 60
Ttu
lo d
el e
je
Ttulo del eje
Series1
-
=
Como se hizo en el caso anterior tambin se realizara lo mismo
para esta muestra
Determinando valor de u
Grafico 6: curva para determinar valor de u
Resultando el valor de u= 0,0015 h-1 y X0=0,002
Entonces la ecuacin para la biomasa quedara de la siguiente
manera
= 0,0020,0015
MUESTRA C CONCENTRACION 40%
Cuadro 5: resultados de la biomasa para muestra C a las 48
horas
0 0,001
1 0,002
2 0,003
3 0,004
4 0,005
5 0,006
6 0,01
7 0,012
8 0,015
9 0,016
10 0,019
12 0,02
14 0,031
18 0,11
22 0,175
y = 0.0051x - 0.0445R = 0.9945
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0 10 20 30 40 50
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
-
24 0,21
26 0,231
30 0,242
40 0,25
48 0,25
Grafico 7: curva de crecimiento para la muestra C
Grafico 8: curva para determinar valor de u
Resultando el valor de u= 0,017 h-1 y X0=0,001
Entonces la ecuacin para la biomasa quedara de la siguiente
manera
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 10 20 30 40 50 60
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
Series1
y = 0.0169x - 0.1992R = 0.9938
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 5 10 15 20 25 30
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
-
= 0,0010,017
MUESTRA D CONCENTRACION 20%
Cuadro 6: resultados de la biomasa para la muestra D a las 48
horas
0 0,0009
1 0,001
2 0,002
3 0,003
4 0,004
5 0,005
6 0,006
7 0,01
8 0,015
9 0,018
10 0,019
12 0,02
14 0,03
18 0,068
22 0,1
24 0,12
26 0,13
30 0,162
40 0,23
48 0,241
Grafico 9: curva de crecimiento para la muestra D
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 10 20 30 40 50 60
bio
mas
a(g/
l)
tiempo(min)
-
Grafico 10: curva para determinar valor de u
Resultando el valor de u= 0,007h-1 y X0=0,0009
Entonces la ecuacin para la biomasa quedara de la siguiente
manera
= 0,00090,007
encontrados los valores de u de cada concentracin ahora
determinaremos el
valor de umax y ks
cuadro 7: valores para graficar la curva para el clculo de umax
y ks
S u 1/S 1/u
B 10 0,0051 0,1 196,078
D 20 0,0077 0,05 129,87
A 30 0,0084 0,03 119,048
C 40 0,017 0,025 58,82
y = 0.0077x - 0.0706R = 0.9959
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 10 20 30 40 50
bio
mas
a(g/
L)
tiempo(min)
-
Grafico 11: curva para determinar umax y ks
Para encontrar estos valores se har uso de ecuacin de la
recta
=
.
+
= +
y = 1565,4x + 44,423
si x=0
y= 44,423=b
donde
=
= ,
max=0,023h-1
Y para el clculo de ks
=
0,023
= 1565,4
Ks=36 g/l
y = 1565.4x + 44.423R = 0.8745
0
50
100
150
200
250
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
1/
1/s
curva para determinar max y ks
Series1
Lineal (Series1)
-
DISCUSIONES
BULOCK, 1987 establece el valor de velocidad mxima de
crecimiento para la
saccharomyces cerevisiae 0,45 h-1, el valor encontrado es menor
a comparacin de
este resultando 0,0023 h-1
Marison, 1996 determino un valor para la constante de saturacin
(Ks) para la
saccharomyces cerevisiae de 25 mg/l (0,025g/l) resultando
nuestro valor muy superior
de lo encontrado por Marison resultando 36g/l
CONLUSIONES
Segn los resultados obtenidos en la prctica los valores
determinados tanto para la
umax y la constante de saturacin en el primer caso el valor de
la velocidad de
crecimiento es muy inferior a lo encontrado por la bibliografa
consultada y en el
segundo caso el valor de la constante de saturacin (Ks) resulto
muy elevado o
podemos afirmar que el valor determinado por Marison es igual a
25g/l valor que es
cercano al calculado.
Los resultados obtenidos para cada muestra se calcularon sus
respectivas ecuaciones
para determinar la biomasa en funcin al tiempo y la biomasa
inicial.
De la misma forma para cada concentracin se le realizo su
respectiva curva de
crecimiento microbiano observndose que para cada concentracin
exista un
crecimiento de biomasa mas que las otras concentraciones
BIBLIOGRAFA
C.G. Sinclair, 1987 department of chemical engineering,
university of Manchester
institute of science and technology. PO Box 88
Jhon bulock, 1987. Biotecnologa bsica. Editorial Acribia,
S.A
Crecimiento Microbiano (Prescott y col ., 1999). (McMeekin y
ros, 2002).
Curva de Crecimiento ; Microbiologa ((Penfold ,1914),(Buchanan
y
Solberg ., 1972)
Tiempo de Latencia(Swinnen y col ., 2004),(Montville , 2000),
(Swinnen
y col. ,2004).
Tiempo de Generacin (Segn Stanier y col., 1989) ( Madigan y
col
.,1997).
Velocidad de Crecimiento(Madigan y col .,1999),( Stanier y col.,
1989)
CUESTIONARIO
2. En las fases del crecimiento microbiano o celular . explique
la fase de latencia
obtenga una ecuacin para calcular el tiempo lag (tlag).
-
3. En que consiste la inhibicin del crecimiento microbiano por
sustrato, por
producto del metabolismo. Obtenga una ecuacin para calcular la
constante de
inhibicin del sustrato.
Efecto de una concentracin de sustrato o producto
Si se aumenta la concentracin inicial de sustrato a niveles
altos la velocidad de
crecimiento pueden disminuir debido a la inhibicin por sustrato.
Para sustratos como la
glucosa u otros carbohidratos, la mayora de los microorganismos
son capaces de
crecer a concentraciones de 100-150 g/lt, pero muy pocos crecern
a 300-500 g/lt. Es
decir, a altas concentraciones de azcar o sal se observa la
inhibicin por deshidratacin
de los microorganismos debido al fenmeno de osmosis que se da en
clulas. Existen
sustratos que a concentraciones bajas favorecen el crecimiento
de algunos
microorganismos pero que a altas concentraciones se vuelven
inhibidores para los
mismos tales como el fenol, formaldehido o el metanol.
La inhibicin por sustrato generalmente se expresa de la
siguiente forma
=
++(
)2
Inhibicin por producto
Los productos que alcancen una concentracin suficientemente alta
en el medio
pueden inhibir y eventualmente detener su propia produccin. Este
fenemo es bien
conocido en la produccin de etanol y limita el grado mximo que
puede ser alcanzado
por fermentacin en las bebidas alcohlicas.(C.G. Sinclair,
1987)
