El formolCon el nombre de formol puro se conoce la solución al 40 % de formaldehído enagua. El esta solución se diluye al 10 % en agua o buffer (9 partes del solvente y 1parte de formol puro) para su utilización, por lo que el formaldehído en ella seencuentra al 4 %. El formaldehído es bastante inestable en solución degenerando en ácido fórmico, el cual es muy mal fijador. Para evitar que el ácido fórmico deteriore los tejidos se lo neutraliza con carbonato de calcio o con soluciones buffer,constituyendo el formol neutro en el primer caso y el formol buffereado en elsegundo. La solución de formol al 10 % tiene un extraordinario poder de penetración a los tejidos, pudiendo fijarse con ella piezas relativamente grandes, pero su velocidad de penetración y de fijación son lentas, demorando para ello no menos de 8 horas y siendo lo óptimo entre 12 y 24 horas. El formaldehído reacciona con los grupos amino, carboxilo e indol de las proteínas, y produce entonces uniones de metileno no solo dentro de una misma proteína sino que además lo hace con otras moléculas proteicas adyacentes (efecto conocido como cross-linking o formación de puentes cruzados).

Este fenómeno sigue ocurriendo a lo largo del tiempo y deteriora progresivamente la estructura molecular de los tejidos, en especial de las proteínas, dificultando el acceso de los anticuerpos hacia sus epitopes blanco, fenómeno usualmente conocido como enmascaramiento antigénico. Esto es reversible en un comienzo a través de una corta digestión enzimática de las proteínas o con microondeado, que rompen parte de los puentes cruzados entre las proteínas. Si la fijación se prolonga a lo largo del tiempo más allá de las 36 horas comienzan los fenómenos de sobrefijación que son progresivamente irreversibles. Por otra parte el formaldehído reacciona con los hidratos de carbono formando hemiacetales inestables que pueden ser eliminados por lavado prolongado. Esto puede explicar porqué los epitopes ricos en polisacáridos son generalmente resistentes a la fijación en formol.

El formaldehído o metanal Es un compuesto químico, es un aldehído Es altamente vólátil y muy inflamableSu fórmula semidesarrollada es H2C=O. Fue descubierto en 1867 por el químico alemán August Wilhelm von Hofmann. Se obtiene por oxidación catalítica del alcohol metílico. A temperatura normal es un gas (en C.N.P.T) incoloro de un olor penetrante, muy soluble en agua y en ésteres. Las disoluciones acuosas al ≈ 40 % se conocen con el nombre de formol, que es un líquido incoloro de olor penetrantemente y sofocante. Estas disoluciones pueden contener alcohol metílico como estabilizante. Su punto de ebullición es -21 °C.El formaldehído se disuelve fácilmente en agua (400 l gas /l de agua a 20 °C). La disolución se degrada lentamente bajo formación de paraformaldehído, el polímero(proveniente de la polimerasa nucleica) del formaldehído. La oxidación del formaldehído da ácido fórmico y en una segunda etapa agua y dióxido de carbono.

Síntesis La síntesis industrial del metanal se basa en la oxidación catalítica y semiparcial del metanol (H3COH), óxidos de metales (habitualmente una mezcla de óxido de hierro, molibdeno y vanadio) o la conversión de metanol en hidrógeno elemental y formaldehído en presencia de plata elemental.Aplicaciones El formaldehído es uno de los compuestos orgánicos básicos más importantes de la industria química. Se utiliza en la producción de diversos productos, desde medicamentos hasta la melamina, la baquelita etc.Antiguamente se utilizaba una disolución del 35% de formaldehído en agua como desinfectante y en la conservación de muestras biológicas y cadáveres frescos.Aún se utiliza como conservante en la formulación de algunos cosméticos y productos de higiene personal como champúes, cremas para baño, sales iódicas para la higiene íntima femenina.Además se usa en síntesis orgánica, para producir abonos, papel, madera contrachapada, resinas de urea-formaldehído, colorantes y explosivos, y en la fabricación de extintores de incendio entre otros usos.

Toxicología y bioquímica En el cuerpo se producen pequeñas cantidades de formaldehído en forma natural. Sin embargo se trata de un compuesto tóxico que ha demostrado propiedades cancerígenas en diversos experimentos con animales. En ratas puede provocar cáncer si se aplica de forma prolongada en concentraciones superiores a 6 ppm en el aire respirado. En el hombre estas concentraciones provocan ya irritaciones en ojos y mucosidades en poco tiempo (10 a 15 min. luego de la exposición). Estudios epidemiológicos aún no han demostrado ninguna relación causa - efecto sobre los casos de cáncer estudiados. Igualmente cabe destacar que tratar pacientes con cáncer con derivados de formaldehído ha causado en pocos casos una disminución de las células cancerosas o en estado de metástasis.Niveles bajos de metanal pueden producir irritación a la piel, los ojos, la nariz y la garganta. La gente que sufre de asma es probablemente más susceptible a los efectos de inhalación de formaldehído.A partir de 30 ppm el formaldehído puede resultar letal o fatal.Una fuente importante de formaldehído en nuestras casas suelen ser los aglomerados de madera que liberan lentamente ciertas cantidades de este gas. Por esto se están cambiando los procesos de producción de estos materiales para disminuir la posible contaminación.

CH4 + H2O CO + 3 H2

3 CH4 + CO2 + 2 H2 4 CO + 8 H2

2 H2 + CO CH3OH

CH2OH + ½ O2 HCHO + H2O

CH3OH HCHO + H2

Es importante recordar:- En caso de no saber cual es el fijador ideal para una determinada muestra detejido, debe utilizarse formol.- Nunca debe emplearse el formol puro, sino diluido al 10 %.- El tiempo de fijación debe oscilar entre 12 y 36 horas.- Siempre debe emplearse abundante fijador (unas 10 veces mayor volumenque la pieza a fijar).- El recipiente en el que se realice la fijación debe tener boca ancha y debe serrotulado inmediatamente.

InclusiónPara la obtención de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido hayasido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del tejido, tanto más delgada resulta el corte histológico. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos métodos principales: la congelación o la inclusión.Para las técnicas más frecuentes se emplea el método de inclusión. El procedimiento es lento pero los preparados son de gran calidad. El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Para los cortes que deben observarse con el microscopio óptico se usa casi exclusivamente la parafina.

DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINADeshidrataciónLas piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente. Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración)Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol. Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de xilol no debe enturbiarlo.

Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.

Deshidratación en alcoholes sucesivos.

Penetración de la parafinaSe sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina. Penetración de la parafina a 56-58ºC.Inclusión definitiva o formación del bloqueEn moldes de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.

Penetración de la parafina a 56-58ºC.

ParafinaDado que ésta es una sustancia hidrofóbica los tejidos fijados se deshidratan enalcoholes de concentración creciente pasándolos después por solventesintermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (conocidos como agentesaclarantes), y luego son colocados en una estufa con parafina fundida entre 56 y 60°C, dado que está es sólida a temperatura ambiente. Luego de impregnar al tejido, se deja solidificar a la parafina con el tejido incluído, constituyendo los bloques o tacos histológicos.

En ocasiones el tejido se impregna con acrílicos de bajo peso molecular como elmetilmetacrilato, lo que permite obtener cortes más delgados, procedimientoconocido como microscopía óptica de alta resolución.

Para microscopía electrónica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi, y losbloques resultantes, de gran dureza, son seccionados por la navaja de diamante o de vidrio del ultramicrótomo.

Todas las parafinas son incoloras, «huelen a petróleo» y son insolubles en agua (debido a su marcado carácter no polar). Los cuatro primeros miembros de la serie homóloga n-parafinas son gases, desde el n-pentano hasta el n-hexadecano líquidos, y del n-heptadecano en adelante sólidos.

Barras de Leuckart

La Parafina es un alcano, que es un hidrocarburo, es decir que tienen sólo átomos de carbono e hidrógeno. La fórmula general para alcanos alifáticos (de cadena lineal) es CnH2n+2, y para cicloalcanos es CnH2n. También reciben el nombre de hidrocarburos saturados.Los alcanos son moléculas orgánicas formadas únicamente por átomos de carbono e hidrógeno, sin funcionalización alguna, es decir, sin la presencia de grupos funcionales como el carbonilo, carboxilo, amida, etc. Esto hace que su reactividad sea muy reducida en comparación con otros compuestos orgánicos, y es la causa de su nombre no sistemático: parafinas (del latín, poca afinidad). La relación C/H es de CnH2n+2 siendo n el número de átomos de carbono de la molécula. Todos los enlaces dentro de las moléculas de alcano son de tipo simple o sigma, es decir, covalentes por compartición de un par de electrones en un orbital s, por lo cual la estructura de un alcano sería de la forma:

CH4 y de la parafina sería: C17H36

ESPECIFICACIONES TÉCNICAS VALORES STANDARD

PUNTO DE FUSION 52-54ºC

CONTENIDO DE ACEITE 1.5 %

COLOR BLANCO PURO 25-28

RANGO DE PENETRACION 19 MAX.

OLOR INODORO

TRANSPARENCIA ALTO

ESTABILIDAD A LA LUZ 6 MAX.

Propiedades físicas y químicas Aspecto: Lentejas blancas.Olor: Inodoro.Punto de fusión : 52°CSolubilidad: Insoluble en agua

Estabilidad y reactividad Condiciones que deben evitarse: Temperaturas elevadas.Materias que deben evitarse: Agentes oxidantes fuertes. Agentes reductores.

Información toxicológica Toxicidad aguda: Test de sensibilización piel (conejos): 500 mg/24h: leve. Test irritación ojo (conejos): 100 mg/24h: leve.Efectos peligrosos para la salud: En contacto con la piel: Puede provocar Irritaciones.Por contacto ocular: Puede provocar Irritaciones.Por ingestión: transtornos gastro-intestinales.No se descartan otras características peligrosas. Observar las precauciones habituales en el manejo de productos químicos.

Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo.- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta. Corte en micrótomo tipo Minot.- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

Corte en micrótomo tipo Minot.