2.8 Cultivo y conservación de los microorganismos

M. en C. Sandra Ruiloba de León y FrescasDepartamento de Microbiología

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN

Cultivo de microorganismos

• Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto solo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados. Además, los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar el agua y los alimentos, en la microbiología industrial y en muchas otras actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural.

Composición de los microorganismos• La célula debe obtener la mayoría de las pequeñas

moléculas que requiere del ambiente ya que las macromoléculas son sintetizadas en el interior de la célula. Sin embargo es conveniente hacer hincapié en que también dentro de la célula se sintetizan moléculas pequeñas de las sustancias obtenidas del ambiente. Existen muchos elementos naturales presentes en una célula, sin embargo, la masa total está formada de 4 tipos de átomos: carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Se tiene además otros elementos cuantitativamente menos importantes pero funcionalmente indispensables. Entre estos se incluye al fósforo, calcio, magnesio, azufre, fierro, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, cobalto y tungsteno.

Principales componentes celulares

• El agua constituye aproximadamente el 94-98% del peso de una célula y las macromoléculas constituyen el porcentaje mas alto en el peso seco siendo las proteínas la clase de macromoléculas mas abundante, seguido de los ácidos nucleicos(DNA y RNA), los lípidos y por último los carbohidratos.

Composición química de una célula procariótica a

100Total

~2,5001,850

2c

4d

1~650~350~100~50~200

18

24,610,0002,350,000

4,30022,000,000

2.1255,500

96555

9.13.120.53.50.52

0.51

Total de macromoléculasProteínasPolisacáridosLípidosDNARNA

Total de monómerosAminoácidos y precursoresAzúcares y precursoresNucleótidos y precursoresIones inorgánicos

Clases diferentes

Moléculas por célula

Peso seco (%)b

Molécula

• a Los datos son de Neidhardt, F.C. y col (eds).1996. Escherichia coli y Salmonella typhimurium-Cellular and Molecular Biology, 2a, ed, ASM; b Peso seco de una célula de E. coli creciendo activamente (2.8 x 10-13 g); c

Asumiendo que la peptidoglicana y el glucógeno son los polisacáridos mayoritarios presentes; d Existen diversas clases de fosfolípidos; de cada uno de ellos se presentan muchas formas debido a la variabilidad de los ácidos grasos entre las especies y las condiciones de crecimiento.

Requerimientos nutricionales• Las sustancias en el ambiente utilizadas por los organismos para

el anabolismo y el catabolismo se denominan nutrientes. Nutriente. Sustancia requerida por los organismos para la síntesis de materiales celulares y para la generación de energía y que es obtenida del ambiente

• Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: 1. Macronutrientes, los que se requieren en grandes cantidades.

• 2. Micronutrientes, aquellos que se necesitan en pequeñas cantidades.

• Algunos nutrientes constituyen la base sobre la cual la célula sintetiza macromoléculas u otras importantes estructuras mientras que otros nutrientes sirven solo como generadores de energía sin ser directamente incorporados al material celular; algunos nutrientes pueden jugar los dos papeles.

Macronutrientes en la naturaleza y en los medios de cultivo

Glucosa, malato, acetato, piruvato, extracto de levadura, peptona, etc.

H2O, Compuestos orgánicos Inorgánicos: NH4CL, (NH4) SO4, KNO3, N2

Orgánicos: aminoácidos, bases nitrogenadas de nucleótidos, compuestos con nitrógeno

KH2PO4, Na2HPO4

Na2SO4, Na2S2O7 Na2S, Compuestos orgánicos azufrados

KCl, KH2PO4

MgCl2, MgSO4

NaClCaCl2

FeCl2, FeSO4, soluciones de Fe quelado con EDTA o citrato

CO2, Compuestos orgánicos

H2O, Compuestos orgánicosNH3, NO3

-, N2, Compuestos orgánicos nitrogenadosCompuestos orgánicos

PO43-

H2S, SO42-, Compuestos

orgánicos azufrados, sulfuros metálicos (FeS, CuS, ZnS, NiS,

etc.)K+ en solución o como sal

Mg2+ en solución o como salNa+ en solución o como salCa+ en solución o como sal

Fe2+ o Fe3+ en solución o como FeS, Fe(OH)3, u otras sales

Carbono

OxígenoNitrógeno

FósforoAzufre

PotasioMagnesio

SodioCalcioHierro

Forma química utilizada en medios de cultivo

Forma habitual del nutriente en el ambiente

Elemento

Micronutrientes necesarios para los microorganismos

Requerido por los mamíferos en el metabolismo de la glucosa, no se conoce algún microorganismo que lo requieraVitamina B12, Transcarboxilasa (bacterias del ácido láctico)Lo requieren como cofactor algunas proteínas implicadas en la respiración (citocromo c oxidasa), la fotosíntesis (plastocianina) y las destoxificación de radicales libres (superóxido dismutasa)Varias enzimas lo requieren como cofactor. Por ejemplo, la superóxido dismutasa, la fotoliasa del fotosistema II. Presente en enzimas que contienen flavina. También presente en la nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO reductasas, formato deshidrogenasas, etc.La mayoría de las hidrogenasas, coenzima F430 de las metanógenas, deshidrogenasa de monóxido de carbono, ureasa, etc.Formato deshidrogenasa, selenocisteínaFormato deshidrogenasas, oxotransferasas de termofílicosVanadio nitrogenasa, bromoperoxidasaAnhidrasa carbónica, alcohol deshidrogenasa, DNA y RNA polimerasas y proteínas que se unen al DNA Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas con hierro y azufre (ferredoxina), oxigenasas, nitrogenasas

Cromo

CobaltoCobre

Manganeso

Molibdeno

Níquel

SelenioTungstenoVanadioZinc

Hierro

Función CelularElemento

Constituyentes de los microorganismos

• Las cuatro principales macromoléculas que constituyen a los microorganismos son entonces:

• 1. Proteínas• 2. Acidos nucleicos• 3. Lípidos • 4. Carbohidratos

Definición de medio de cultivo

• Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en donde se cultivan microorganismos en un laboratorio. Es la imitación de las condiciones favorables para el desarrollo de los microorganismos.

Requerimientos de un medio de cultivo

• 1. Fuente de carbono• 2. Fuente de nitrógeno• 3. Fuente de energía • 4. Agua• 5. Sales minerales• 6. Factores de crecimiento

Tipos de medios de cultivo por su composición química

• En microbiología se usan dos grandes grupos de medios de cultivo:• 1. Los químicamente definidos• 2. Los indefinidos o complejos• Los químicamente definidos se preparan añadiendo agua destilada a

cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Por ello se conoce la composición química exacta.

• Los medios complejos emplean lisados de caseína, de carne, de soya, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva(químicamente indefinida) como por ejemplo la sangre, el suero, jugos de verduras, frutas etc. Entonces los medios complejos no se conoce con precisión la composición química ni la cantidad exacta de cada uno de los nutrientes.

Ejemplos de medios de cultivo por su composición química

• Medios complejos o indefinidos

• BHI• Gelosa sangre• Caldo nutritivo• Medio PDA• Medio Luria Bertani• Medio Baird Parker

• Medios definidos

• Medio E de Vogel y Bonner.

• Medio de Knop• Medio de Fowell para

ascosporas

Tipos de medios de cultivo por su consistencia

• Los medios de cultivo pueden ser:• 1. Líquidos• 2. Sólidos o semisólidos• Los medios sólidos o semisólidos pueden contener los mismos ingredientes que

los medios líquidos, pero poseen además agentes solidificantes que pueden ser agar, gelatina ó sílica gel.

• El agar proviene de las algas rojas Gelidium, Gracilaria, Acanthopeltis, Ceramium y Pterocladia y químicamente es un polímero de azúcares que posee interesantes propiedades que lo hacen ideal para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Se funde a altas temperaturas (87oC) y solidifica a 40-45oC. Además no es degradado por la mayoría de las bacterias. Se usa a una concentración del 1.5-2%

• La gelatina tiene el inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas y muchos microorganismos la utilizan como fuente de carbono y nitrógeno. Se utiliza a una concentración del 5-10%.

• La sílica gel se emplea para algunos microorganismos que se inhiben en presencia de agar.

Tipos de medios de cultivo por su uso

• Los medios de cultivo dependiendo de su uso pueden ser:

• 1. Simples• 2. Enriquecidos• 3. Selectivos• 4. Diferenciales• 5. De enriquecimiento• 6. De transporte

Medios Simples

• Los medios simples son medios comunes, que sólo tienen un tipo de infusión o extracto además de otros componentes. Son medios para fines generales porque mantienen el crecimiento de muchos microorganismos que no son muy exigentes.

• Ejemplo de estos tipos de medio son la gelosa nutritiva, el PDA, el caldo simple o caldo nutritivo.

Medios Enriquecidos• Los medios enriquecidos están constituidos por algunas

sustancias que lo hacen más nutritivo. En estos medios puede crecer una gran variedad de microorganismos. Como son medios complejos no se conocen las cantidades exactas de sus componentes.

• Se pueden incorporar sangre, suero, plasma y diversos extractos nutritivos a un medio simple haciéndolo adecuado para el crecimiento de microorganismos exigentes.

• Ejemplos de estos medios de cultivo son el BHI, gelosa sangre, medio Eugon, gelosa chocolate, agar Columbia, medio Infusión de hígado, etc.

Ejemplos de medios enriquecidos

• Gelosa sangre

Medios Selectivos• Los medios selectivos favorecen el crecimiento de

microorganismos particulares debido a que entre sus ingredientes poseen un inhibidor que nos permite escogerlos o seleccionarlos.

• Las sales biliares o los colorantes como la fucsina básica, el cristal violeta, la eosina o el verde brillante permiten el crecimiento de las bacterias Gram negativas, mientras que inhiben el crecimiento de las Gram positivas.

• También se pueden aislar microorganismos incubándolos con nutrientes que puedan utilizar de forma específica. Un medio quecontenga celulosa será muy efectivo para aislar bacterias que digieran celulosa o bien la adición de sustancias tales como el NaCl o la sacarosa a concentraciones relativamente altas logrará el propósito de aislar microorganismos definidos.

• Ejemplos de medios selectivos son el agar EMB (Eosina Azul de Metileno), agar ENDO, agar MacConkey, S-110, SS, gelosa Rosa de Bengala, agar Biggy, agar Verde Brillante, etc.

Medio selectivo

• En esta imagen se observan colonias de Legionella pneumophilacreciendo en el medio de carbón extracto de levadura.

MacConkey, ejemplo de un medio selectivo y diferencial

• Este medio de cultivo tiene entre sus ingredientes sustancias que lo hacen selectivo (rojo neutro y cristal violeta) que permitirán el crecimiento de bacterias Gram -y diferencial (lactosa) que definirá entre aquellos microorganismos que fermentan la lactosa (colonias rojas) de los que no pueden utilizar este azúcar (colonias incoloras, amarillas o blancas).

Medios selectivos y diferenciales

Agar Sal manitol (ASM), ejemplo de medio selectivo y diferencial

• Este medio de cultivo permite el desarrollo de microorganismos capaces de crecer en concentraciones de NaCl del 7.5%, además diferencia a aquellos que fermentan el manitol provocando el vire del indicador de pH (rojo de fenol) de rojo a amarillo.

• Son medios que distinguen, separan, diferencian grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de los microorganismos según sus características metabólicas.

• La gelosa sangre es tanto un medio diferencial como un medio enriquecido. Sirve para distinguir entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas. La bacterias hemolíticas producen zonas claras alrededor de sus colonias debido a la utilización de los eritrocitos. El agar MacConkey también es un medio diferencial ya que contiene lactosa y rojo neutro de tal forma que las bacterias fermentadoras del azúcar aparecerán de color rosa a rojo y son fácilmente distinguibles de las colonias no fermentadoras.

• Ejemplos de medios diferenciales son el Gelosa sangre, SS (Salmonella-Shigella), agar MacConkey, agar Baird-Parker, agar XLD, agar Vogel Johnson, Citrato de Simmons, LIA, Kligler, Verde Brillante, etc. Nótese que algunos de estos medios son además selectivos.

Medios diferenciales

Medio de gelosa sangre: enriquecido y diferencial

Gelosa sangre, medio de cultivo enriquecido y diferencial

• El medio de gelosa sangre es un medio enriqucido que estimula el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, sobre todo de aquellos denominados “fastidiosos”, además permite diferenciar la capacidad de las bacterias de utilizar los eritrocitos observándose entonces tres tipos de hemólisis, la parcial llamada alfa (α), hemólisis total o beta (β) y por último aquellos micrrorganismos que no utilizan a los eritrocitos y que no provocan ningun cambio en el medio y se conoce como hemólisis gamma (γ).

Gelosa sangre tipos de hemólisisAlfa Beta Gamma

SS ejemplo de un medio selectivo y diferencial

• En esta imagen se observa el desarrollo de tres tipos de colonias crecidas en medio SS (Shigella-Salmonella). Las colonias rojas pertenecen a bacterias capaces de fermentar la lactosa (Lac+), las incoloras son bacterias que no fermentan este azúcar (Lac-) y las negras son las que producen ácido sulfhídrico (H2S).

Cromoagar, ejemplo de medio selectivo y diferencial

• El cromoagar es un medio de cultivo desarrollado por BiomeriauxTM que permite selccionar y diferenciar diversas especies microbianas en función del color que presentan las colonias.

Diversos medios de cultivo

Medios de enriquecimiento• Enriquecer significa, en este caso, proporcionar al

microorganismo que se desea aislar todos los elementos nutritivos necesarios para que alcance su óptimo crecimiento.

• Las aplicaciones de esta metodología están sujetas a la pericia e ingenio del investigador. Los medios de enriquecimiento se usan para aumentar el número relativo de organismos de un tipo en relación al total. Por ejemplo, enriquecer un patógeno minoritario particular presente en una muestra altamente contaminada con otros microorganismos irrelevantes desde el punto de vista médico pero que se encuentran en franca mayoría.

• Ejemplos de estos medios son: caldo tetrationato de Müeller, caldo selenito de sodio, medio de Stuart, caldo Müeller-Hinton, caldo urea, caldo tioglicolato, agua peptonada, Monsur, etc.

Medios de transporte

• Estos medios se utilizan para el transporte de diversas muestras biológicas evitando la muerte de los microorganismos de interés.

• La característica de estos medios es que su composición permite la viabilidad de los microorganismos pero no permite su multiplicación

• Ejemplos de estos medios son los medios de Stuart, de agua peptonada para Vibrio, Cary y Blair, Glicerol-Solución Salina, Amies y Douglas, Hajna, Caldo de Fildes etc.

Bibliografía• Baron J. E, y S. M. Finegold. 1990. Bailey and Scott Diagnostic

Microbiology. 8a. Ed. The C.V. Mosby Co.• Barrow G. I. y R. K. A. Feltham. 1993. Cowan and Steel´s Manual for the

Identification of Medical Bacteria. 3a. Ed. Cambridge University Press.• Gerhardt, P. 1993. Molecular Biology, Genetics Methods for General and

Molecular Bacteriology. ASM Press, Washington, USA.• Hurst, C. J., R. L. Crawford, G. R. Knudsen, M. J. McInerney, & L. D.

Stetzenbach. 2002. Environmental Manual of Environmental Microbiology. ASM Press, Washington, USA

• MacFaddin F. J. 1991. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Bacterias de Importancia Médica. Editorial Médica Panamericana.

• Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock. Biología de los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.

• Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiología. 4a. Ed. McGraw Hill-Interamericana.

• Wistreich, G. 1999. Microbiology perspectives. Prentice-Hall Inc.

2.9 Aislamiento• En los hábitats naturales, los microorganismos crecen en

poblaciones mixtas y complejas que contienen varias especies. Esto representa un problema para el microbiólogo porque no se puede estudiar adecuadamente un único tipo de microorganismo en un cultivo mixto. Se necesita un cultivo puro o axénico, población de células que procede de una única célula. La obtención de cultivos puros ha sido vital para el desarrollo y transformación de la microbiología. Fue el bacteriólogo alemán Robert Koch el iniciador de las importantes técnicas de aislamiento utilizando la superficie de una papa, gelatina y mas tarde agar.

• En casi 20 años, se ha aislado a la mayoría de los agentes patógenos responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.

• Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios métodos, los mas usados son el método de la estría cruzada y el método de las diluciones

Objetivo del aislamiento: separar a los microorganismos a partir de una mezcla

Métodos de Aislamiento

• Método de las diluciones• a) Dispersión con varilla • b) Vaciado en placa

• Método de la estría cruzada

Método de las diluciones• El método de las diluciones consiste en mezclar una

serie de volúmenes definidos, de los cuales se toman alícuotas que se siembran en medio de cultivo sólidos ya sea depositando la alícuota en la superficie y dispersándola uniformemente con una varilla de metal o de vidrio acodada o bien mezclando la alícuota con medio de cultivo fundido en un tubo enfriado a 45oC y vertiendo inmediatamente en una caja de Petri estéril o bien haciendo una variante en donde la alícuota se deposita directamente en la base de una caja de Petri y se le adiciona el agar previamente enfriado, procediendo a mezclar suavemente.

Método de las diluciones

• La muestra original se diluye varias veces para reducir suficientemente la población bacteriana. Luego se mezclan las muestras más diluidas con agar fundido y se vierte en placas de Petri. Las células aisladas crecen formando colonias que se pueden utilizar para desarrollar cultivos puros. Las colonias de la superficie son generalmente circulares, las situadas dentro del agar serán lenticulares.

Método de las diluciones

Método de las diluciones dispersión con varilla

• Si se extiende una mezcla de células en una superficie de agar, de manera que cada célula crece formando una colonia independiente, cada colonia representa un cultivo puro o axénico. La siembra por dispersión con una varilla acodada de vidrio o metal es una forma directa y fácil de conseguir este resultado. Se deposita un volumen pequeño de una mezcla microbiana diluida conteniendo entre 100 y 200 células, o menos, en el centro de una placa de agar y se extiende uniformemente sobre la superficie con la varilla previamente esterilizada. Las células dispersas desarrollarán colonias aisladas. Como el número de colonias debería ser igual al número de organismos en la muestra, este tipo de aislamiento se utiliza para contar una población microbiana.

Método de las diluciones: vaciado en placa• La siembra por vaciado en placa que se emplea ampliamente con

bacterias y hongos, genera también colonias aisladas. La muestraoriginal se diluye varias veces para reducir la población mirobiana lo suficiente, con el fin de obtener colonias separadas cuando se depositen en un medio de cultivo apropiado. El método consiste en mezclar volúmenes pequeños de varias muestras diluidas con agar líquido que se ha enfriado a aproximadamente 45oC y la mezcla se deposita en cajas de Petri estériles, o bien se deposita la alicuota en la base de una caja de Petri estéril y se adiciona el agar fundido. La mayoría de las bacterias y de los hongos no se destruyen con una exposición breve al agar caliente. Una vez que el agar se ha solidificado, cada célula forma una colonia individual. El número total de colonias equivale al número de organismos viables en la muestra diluida. Las coloniasque crecen obre la superficie se pueden utilizar también para inocular un medio fresco y preparar cultivos puros.

Dispersión con varilla y vaciado en placa

Técnicas de siembra con varilla de vidrio y vaciado en placa

Método de la estría cruzada

• El método de la estría cruzada consiste en depositar en una área de la placa de medio de cultivo sólido una asada de la muestra o cultivo mixto que sirve de inóculo, el cual se extiende con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente a una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa, se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías. Se gira la caja de Petri un quinto de vuelta y con el asa estéril, se hace una serie de nuevas estrías que deben extender una pequeña porción de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orillahacia el centro. La operación se repite dos veces mas y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas que termine en o cerca delcentro, cuidando que no se toquen las estrías anteriores.

Método de la estría cruzada

Aislamiento por estría cruzada

Toma de inóculo y siembra por estría cruzada

Métodos de aislamiento: diluciones y estría cruzada

Las cajas de Petri y el cuentacolonias• Las técnicas anteriores precisan de placas especiales de cultivo, denominadas

placas o cajas de Petri, en memoria de su inventor, Julius Richard Petri, miembro del laboratorio de Robert Koch. Petri diseñó estas placas hacia 1887, están formadas por dos mitades circulares; la parte superior (tapa) se superpone sobre la inferior. Son muy fáciles de usar y pueden apilarse para ahorrar espacio y constituyen uno de los materiales más comunes de los laboratorios de microbiología.

• El cuentacolonias como su nombre lo dice permite la cuantificación precisa de las colonias que aparecen en la superficie de un medio de cultivo.

¿Se pueden cultivar todas las bacterias?

• No todas las bacterias viables presentes en una muestra pueden cultivarse in vitro, dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en los diferentes medios de cultivo entre un 20-50% de las especies presentes. Incluso a partir de muestras de suelo y marinas se pueden cultivar sólo el 1% de las especies presentes. Esto es debido a que algunas de ellas viven en simbiosis obligada, o son inhibidas por los componentes del medio de cultivo, tienen requerimientos nutricionales o condiciones de incubación y tensión de oxígeno y bióxido de carbono muy particulares y estrechas, que el medio de cultivo y condiciones de incubación no les proporcionan.

Bibliografía• Black, J. G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

Prentice Hall, Inc. • Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock Biología de

los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.• Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of

Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.• Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiología. 4a.

Ed. McGraw Hill-Interamericana.

2.11 Conceptos de microorganismos aerobio, facultativo, anaerobio, microaerofílico, aerotolerante y capnéico.

• Los microorganismos varían en sus necesidades o tolerancia de oxígeno. De hecho los microorganismos pueden ser divididos en diversos grupos dependiendo del efecto del oxígeno.

Clasificación de los microorganismos dependiendo del efecto del oxígeno

• Aerobios obligados• Facultativos• Microaerofílicos• Aerotolerantes• Anaerobios

AEROBIOS OBLIGADOS• Los aerobios son capaces de crecer con

tensión de oxígeno que se encuentra en la atmósfera (21%) y muchos pueden soportar incluso concentraciones mas altas.

• Estos microorganismos poseen enzimas como catalasa, peroxidasa, superóxido dismutasa(SOD) que descomponen los productos tóxicos derivados del metabolismo del oxígeno.

• Ej. Bacillus spp., Pseudomonas spp, Mycobacterium spp., Micrococcus spp., Streptomyces spp.

ANAEROBIOS• Son organismos que carecen de sistemas

respiratorios y no pueden utilizar el oxígeno como aceptor final de electrones. Estos microorganismos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia y deben utilizarvías de fermentación o respiración anaerobiapara este objetivo. Mueren además en su presencia porque son incapaces de eliminar los productos tóxicos derivados del metabolismo del oxígeno (H2O2, O-

2, OH- ).• Ej. Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium,

Methanococcus.

FACULTATIVOS

• Son microorganismos que pueden crecer en ausencia o en presencia de oxígeno.

• No lo requieren para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia llevando a cabo un metabolismo aeróbico. Cuando no hay oxígeno, fermentan o realizan una respiración anaeróbica.

• Ej. Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Shigella.

MICROAEROFÍLICOS

• Los microaerofílicos son aerobios que pueden utilizar el oxígeno cuando su tensión es mas baja que la del aire (2-10%), usualmente por su limitada capacidad de respirar o porque poseen algunas enzimas sensibles al oxígeno.

• Ej. Campylobacter

AEROTOLERANTES

• Son microorganismos que pueden tolerar o soportar el oxígeno y crecer en su presencia aún cuando no lo utilizan.

• Utilizan vías fermentativas o respiración anaerobia para la producción de energía.

• Ej, Enterococcus, Streptococcus.

Relación de los microorganismos con el oxígeno

Grupo Relación con elO2

Tipo demetabolismo

Ejemplo Habitat

AEROBIOSObligados Lo requieren Respiración aeróbica Micrococcus luteus Piel

Facultativos No lo requieren perocrecen mejor en supresencia.

Respiración aeróbica,anaeróbica yfermentación

Escherichia coli Instestino delgado demamíferos.

Microaerofílico Lo requieren pero aniveles menores queel atmosférico

Respiración aeróbica Spirillum volutans Lagos

ANAEROBIOSAerotolerantesS No lo requieren y no

crecen mejor en supresencia

Fermentación orespiración anaeróbica

Streptococcuspyogenes

Tracto respiratoriosuperior

Obligados Dañino o letal Respiraciónanaeróbica ofermentación

Clostridiumbotulinum

Suelo, fango.

Crecimiento aeróbico, anaeróbico, facultativo, microaerofílico y aerotolerante.

• (a) El oxígeno sólo penetra un poco en el medio, así los aerobios obligados crecen solo en la superficie.

• (b) Los anaerobios, como son sensibles al oxígeno, crecen en el fondo, lejos de la superficie.

• (c) Los facultativos crecen en todo el tubo.

• (d) Los microaerofílicos tienden a crecer cercanos a la superficie.

• (e) Los aerotolerantes crecen en todo el tubo.

• Se ha añadido una pequeña cantidad de agar al medio así como resazurina, indicador de potencial redox (rosa en estado oxidado e incoloro en estado reducido).

Microorganismos capnéicos

• Este grupo de microorganismos requieren para su crecimiento una atmósfera de CO2y por lo tanto deben incubarse en estufas especiales que proporcionen este ambiente.

• Ejemplos: Listeria, Brucella,

Bibliografía• Black, J. G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed.

Prentice Hall, Inc. • Madigan M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 1999. Brock Biología de

los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc.• Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of

Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc.• Prescott L. M., J. P. Harley y D. A. Klein. 1999. Microbiología. 4a.

Ed. McGraw Hill-Interamericana

2.13 METODOS DE CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS A CORTO, MEDIANO

Y LARGO PLAZO.• La conservación de organismos de referencia es

el punto central sobre el que se basan la adecuada nomenclatura y clasificación.

• Objetivos• 1. Que el microorganismo se mantenga vivo• 2. Que se mantenga puro, es decir sin

contaminación.• 3. Que la células se mantengan genéticamente

estables.

Métodos de conservación de microorganismos

• Corto plazo• 1. Subcultivos o resiembras periódicas• 2. Suspensión en agua destilada o en agua de mar

estéril.• Mediano plazo

• 1. Inmersión en aceite mineral• 2. Congelación• 3. Desecación

• Largo plazo• 1. Liofilización• 2. Ultracongelación

Métodos de conservación a corto plazo• 1. Subcultivos o resiembras periódicas• Es el método más común para conservar a las bacterias y consiste en

transferencias periódicas a medios nuevos. El intervalo entre las resiembras varía de acuerdo al microorganismos, el medio empleado y a las condiciones externas.

• Se deben determinar las siguientes condiciones cuando se utiliza este método: un medio adecuado de mantenimiento, una temperatura ideal de almacenamiento y establecer la frecuencia adecuada de las transferencias

• 2. Suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril• Es un método muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos

microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y bacterias. En el caso de microorganismos marinos se utiliza agua de mar diluida. La concentración celular no debe de ser superior a 104-105 células/mL en el caso de bacterias y levaduras y para los hongos se suspenden trocitos de agar con el crecimiento del hongo.

Desventajas de los métodos a corto plazo

• 1. Riesgos de contaminación• 2. Equivocaciones al etiquetar• 3. Selección de variantes o mutantes• 4. Posible pérdida del cultivo por un medio

de mantenimiento inadecuado, temperatura de conservación incorrecta o un intervalo de transferencia equivocado

• 5. Espacio requerido para el almacenamiento

Métodos de conservación a mediano plazo

• 1. Inmersión en aceite mineral• Muchas especies bacterianas pueden ser exitosamente conservadas por

meses o aún años utilizando este método sencillo y barato que consiste en inocular aceite mineral o aceite de parafina con los microorganismos que deseamos mantener.

• El aceite se esteriliza en un horno a 180oC de 1.5 a 2 horas. • Con este método se minimiza la deshidratación y se reduce la actividad

metabólica.• El cultivo que se encuentra bajo el aceite se transfiere utilizando el asa

a un medio fresco y el crecimiento se reanudará.

• Desventajas• Las desventajas son similares a las de resiembra periódica pero además

el trabajar con aceite no siempre es agradable

Métodos de conservación a mediano plazo

• 2. Congelación• La conservación de bacterias en el congelador común con una

temperatura de 0 a -20oC produce resultados muy variables y su éxito depende del tipo de bacteria. Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector. El agua se congela a estas bajas temperaturas por lo que las células detienen su crecimiento.

• Existen factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método

• a) Edad de las células• b) Velocidad en la congelación y descongelación• c) Temperatura de almacenamiento• d) Uso de agentes crioprotectores

Métodos de conservación a mediano plazo

• 3. Desecación• La mayoría de los cultivos mueren si se dejan secar en el laboratorio,

sin embargo aquellas células capaces de formar estructuras de resistencia pueden ser conservadas por años.

• Desecación en papel filtro• Desecación en suelo, arena o silicagel• Desecación en gelatina• Desecación en bolitas de alginato• Desecación en sal gorda para halobacterias• Todos los métodos son sencillos y baratos y consisten en añadir

suspensiones densas de células al sustrato estéril seleccionado, dejar

secar y almacenar.

Métodos de conservación a largo plazo

• 1. Liofilización• La liofilización involucra la remoción de agua de una suspensión

celular congelada por medio de una sublimación bajo presión reducida, esto es, el agua se evapora sin pasar por el estado líquido. Las células secas pueden almacenarse por largos períodos si se mantienen alejadas del oxígeno, la humedad y la luz. Y podemos en cualquier momento rehidratarlas y restaurar su estado original.

• Para una buena liofilización es conveniente considerar: la velocidad de la congelación, la selección de agentes crioprotectores, el tipo de organismo, la concentración celular, la temperatura durante la sublimación, el grado de deshidratación alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo de liofilización y las condiciones de almacenamiento.

Equipo de liofilización• Equipos de liofilización en donde se observan las charolas que se utilizan para

eliminar la humedad. Una vez que el proceso de liofilización ha terminado, este equipo tapa de manera automática los recipientes.

• El equipo que se muestra a la derecha tiene muestras precongeladas en recipientes de diferentes tamaños que se unen a la desecadora la cual proporciona el vacío que permite remover el agua. La muestra estará seca en 4-20 horas.

Métodos de conservación a largo plazo

• 2. Ultracongelación• Una conservación a largo plazo puede también lograse

almacenando los cultivos a la temperatura del nitrógeno líquido (-196oC). La American Type Culture Collection (ATCC) ha conservado por 25 años bacterias “fastidiosas” sin pérdida alguna de sus propiedades fenotípicas y fenotípicas.

• La conservación también puede hacerse utilizando un Revco que es un ultracongelador con temperatura de -70oC.

• El uso de nitrógeno líquido se considera un método caro, pero lahistoria reciente indica que es un método muy exitoso. Existe una amplia variedad de refrigeradores de nitrógeno líquido cuya capacidad permite almacenar de 300 a 40,000 ampolletas.

Agentes Crioprotectores• Las células que se van a conservar por congelación,

ultracongelación o liofilización deben suspenderse en un agente crioprotector.

• Se tienen dos tipos de agentes crioprotectores, los que protegendesde el interior de la célula y los que actúan desde el exterior. Entre los del primer tipo están el glicerol y el dimetil sulfóxido(DMSO) que son capaces de atravesar la membrana citoplásmica y proporcionar protección por dentro y por fuera de la célula durante el drástico proceso de congelación. Entre las sustancias que protegen desde el exterior se encuentran la sacarosa, lactosa, glucosa, manitol, sorbitol, dextrana, polivinilpirrolidona (PVP)y el poliglicol.

• Los agentes mas afectivos han sido el DMSO y el glicerol que se utilizan de rutina a una concentración del 5-10% (vol/vol). Sin embargo la selección del mejor agente dependerá de la especie bacteriana.

Bibliografía• Day J,G y M.R. McLellan (eds). Cryopreservation and freeze-drying

protocols. Humana Press. New Jersey. 1995.• Hatt, H. (ed). American Type Culture Collection Methods: I.

Laboratory manual on preservation, freezing and freeze-drying. American Type Culture Collection. Rockville. 1980.

• Heckly R.J. Preservation of microorganisms. Advances in Applied Microbiology, 24:1-53 , Academic Press. 1978.

• Kirsop, B.E. y A. Doyle (ed). Maintenance of microorganisms and culture cells. Academic Press. London. 1991.

• Lapage, S.P., J. E. Shelton, T.G. Mitchell y A.R. Mackenzie. Culture collection and the preservation of bacteria. Methods in Microbiology. Vol 3. Academic Press. London 1970