3.1.-CINETICA-MICROBIANA

CINETICA MICROBIANA

VELOCIDAD DEL CRECIMIENTO MICROBIANO rx

VELOCIDAD DEL CONSUMO DE SUSTRATO rs

VELOCIDAD DE LA FORMACION DE PRODUCTOS rp

DR. BLGO. CARLOS E. VILLANUEVA AGUILAR

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Y BIOTECNOLOGIA MICROBIANA

CINETICA MICROBIANA : conceptos

¿Con qué velocidad se lleva a cabo el Bioproceso ?

Mecanismos de Reacciones Biológicas Básicasen un Proceso Fermentativo

VELOCIDAD CRECIMIENTO MICROBIANO rx ( REPRODUCCIÓN ),VELOCIDAD CONSUMO DE SUBSTRATO rs (ALIMENTACION)VELOCIDAD FORMACIÓN DE PRODUCTOS rp (EXCRETA DE SUSTANCIAS)

RESPECTO AL

TIEMPO O

CONDICIONES

QUE LO MODIFICAN

Velocidades volumetricas

Velocidades especificas (CÁLCULOS DE CONSTANTES DE

VELOCIDAD)

rx, rs, rp u , qp , qs

I. ESTUDIA LA:

LA CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN :

II. SE RELACIONA FUNDAMENTALMENTE CON LA MEDICION DE:

III. SE DESCRIBE LA CINÉTICA MICROBIANA EN CULTIVO BATCH.

CINETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

2.1. DESCRIPCION QUIMICA2.2. DESCRIPCION BIOLOGICA2.3. DESCRIPCION MATEMATICA2.4. TIPOS DE MODELOS MATEMATICOS

CRECIMIENTO MICROBIANO

DESCRIPCION QUIMICA

ACaHbOc + BO2 + DNH4OH E CH O N + FCO2 + GH2O

Se traduce en una reacción química estequiométrica generalizada para el crecimiento:

ACaHbOc + BO2 + DNH4OH E CH O N + FCO2 + GH2O

Fuente de Fuente de Fórmula bruta Carbono Nitrógeno de la materia y energía celular seca.

A, B, D, E, F y G: moles de los compuestos respectivos

Se aplica cuando la biomasa es el único producto formado

DEFINICIÓN QUÍMICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Serie de reacciones químicas en cadena que conducen a la síntesis de masa celular (biomasa) obtenida al final del proceso

Globalmente el bioproceso obedece al:

“ Principio de la conservación de la materia ”

BIOMASA MICROBIANA: C H O N

Deriva del análisis elemental de la MASA MICROBIANA producida Variable según: tipo de cepa microbiana y composición del medio de cultivo Fórmulas brutas propuestas:

Levaduras C6H11O3N ; C6H1OO3N ; C5H7O2N ; C6H10,9O3,6N1,03

Representa; 90% de la biomasa efectivamente producida en la reacción.

NO incluye cenizas, de aprox. 10% de la materia seca.

C6H11O3N Peso molecular (fracción orgánica ) = 145

Si la célula tiene 90% orgánica y 10% cenizasEl peso de la fórmula total de una unidad celular será:

145 / 0.9 = 161 .

De la relación estequiométrica

A CaHbOc + B O2 + D NH4OH E CH O N + F CO2 + G H2O

S O x

Se establece las relaciónes:

X / S = coeficiente rendimiento celular [ rendimiento de células sobre el sustrato carbonado ] x masa celular formada s masa de sustrato consumido

X / O = [ rendimiento de células sobre el requerimiento de oxígeno ]

O masa de oxigeno consumido


DESCRIPCION BIOLOGICA

Crecimiento a nivel de individuos

(Ciclo celular o Crecimiento celular)

Aumento en el tamaño de la célula, seguidode su división

Los microorganismosunicelulares aumentande tamaño y luego sedividen en dos por fisión binaria o gemación

En cualquier sistema biológico: es el aumento ordenado de todos los componentes químicos de un organismo

En los organismos unicelulares: es el aumento en el número de individuos en la población

La mayor parte del estudio sobre crecimiento microbiano se refiere a:crecimiento poblaciónal más que a crecimiento celular

Crecimiento a nivel de población

(Ciclo de crecimiento o Crecimiento poblacional)

Aumento en la cantidad de células

Los microorganismosunicelulares se desarrollan principalmentecomo poblaciones de células.

DEFINICIÓN BIOLOGICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Puede darse en:

1. Sistemas cerrados No se añade al cultivo nuevas sustancias nutritivas,ni se extrae para eliminar algún producto terminal del metabolismo.

Cultivo discontinuo (batch, estático, cultivo por lote o intermitente)

2. Sistemas abiertos

Cultivo lote alimentado Cultivo continuo

Crecimiento Poblacional

Ciclo de crecimiento y Curva de Crecimiento

Ciclo de crecimiento Secuencia de eventos característicos de la población microbiana Se inicia cuando una solución nutritiva se inocula con un microorganismo.

Curva de crecimiento

Gráfica que describe el ciclo de crecimiento

Se obtiene: graficando el peso celular seco (X, g L-1) o concentración celular viable (N, células L-1)

respecto al tiempo de incubación ( t, horas )

CRECIMIENTO POBLACIONAL EN SISTEMA CERRADO ( CULTIVO DISCONTINUO O BATCH )


DESCRIPCION MATEMATICA

La velocidad de aumento de microorganismos en un tiempo dado …… es proporcional a la masa de bacterias ( X ) o al número de bacterias ( N ) o a cualquier otro componente ( Z ) presentes en ese tiempo

DEFINICIÓN MATEMATICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

1. ¿ Como se define el crecimiento?Se define como un incremento en el número de células microbianas [dN ] en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana [dX ] .

2. ¿ Como se define la velocidad de crecimiento? Es el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo:

rx = dN/dt o rx = dX/dt

MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

¿ COMO PUEDE MEDIRSE EL CRECIMIENTO POBLACIONAL ?

MEDICION DEL CRECIMIENTO¿ COMO PUEDE MEDIRSE EL CRECIMIENTO POBLACIONAL ?

CAMBIO

PROCEDIMIENTO GENERAL:

2. Determinar: Numero de células N ( ufc/ml ) Masa celular X ( g/ml )

3. Determinar los parámetros

1. Tomar muestras del caldo de fermentación (suspensiones homogéneas de células)

Hay varios métodos para: contar células N o estimar su masa X

Métodos de Medición de Poblaciones Microbianas

¿CÓMO DETERMINAR EL NÚMERO DE CÉLULAS (N) O LA MASA CÉLULAR (X) ?

NÚMERO DE CÉLULAS

NUMERO TOTAL DE CELULAS

NUMERO DE CELULAS VIABLES

MASA CELULAR

METODOS DIRECTOS

METODOS INDIRECTOS

Métodos para contar células y estimar masa celular

RECUENTO TOTAL EN PLACA (ufc)

CONTEO DEL NUMERO DE COLONIAS (UFC)

METODO DE LA PLACA ESTRIADA

METODO DE LA PLACA VERTIDA

METODO DE LAS DILUCIONES

Parámetros de Medición de Poblaciones Microbianas

DEFINICIONES

Numero células(RECUENTO)

Masa celular(PESO SECO)

Por unidad de volumen (ml)

Concentración celular N

(no células / ml)

Densidad celular X

(g / ml)

Duplicaciones por unidad de tiempo

Tasa de División v

(horas -1)

Tasa de Crecimiento

(horas -1)

Intervalo de tiempoentre dos duplicaciones

Tiempo de generacióng

(horas)

Tiempo de duplicación td

(horas)

NATURALEZA Y EXPRESION CUANTITATIVA

DE LOS PARAMETROS DE MEDICION

Tasa de División (v) y Tiempo de Generación (g)

No N

n

N

v = log N - log No / log 2 (t - to) = log 109 - log 103 / 0.3010 (10) = 6 / 3 = 2 duplicaciones /hora g = 1 / v = 1 / 2 = 0.5 hora

EJERCICIO 1:

Si una suspensión celular pasa en 10 horas de crecimiento de 103 a 109 células, la tasa de división (v) y tiempo de generación (g) será:

Datos:

No = 103 célulasN = 109 célulast = 10 horas

EJERCICIO 2

Calcular el tiempo de generación de un microorganismo en un cultivo que pasa de 2 x 104 ufc/ml a 7 x 10 5 ufc/ml en 2.5 h.

v = log N - log No / log 2 (t - to) = log 7 x 10 5 - log 2 x 104 / 0.3010 (2.5 ) = 5.85 – 4.30 / 0.7525 = 1.52 / 0.7525 = 2 duplicaciones x hora g = 1 / v = 1 / 2 = 0.5 h

Datos:

No = 2 x 104 ufc/ml N = 7 x 105 ufc/ml t = 2.5 horasg = ?

EJERCICIO 3

Si partimos de 104 ufc/ml en un cultivo que tiene un tiempo de generación (g) de 2 h ¿cuántas células tendremos al cabo de 4, 24 y 48 h de cultivo ? Grafique la curva de crecimiento

Datos:

No = 104 ufc/ml g = 2 horasN = ?t = 4 , 24, 48 horas

Calculo de N a 4 horas

log N = log No / t / g (log 2) = 104 / 4/2 (log 2) = 4 / 2 (0.3010) = 4 / 0.602 = 6.65 N = antilog 6.65 N = 4.4 x 106 ufc/ml

Formula

log N = log No / n log 2 g = t / n

Reemplazando n por t / g : log N = log No / t / g (log 2)


log N = log No / t / g (log 2) = 104 / 24/2 (log 2) = 4 / 12 (0.3010) = 4 / 3.612 = 1.11 N = antilog 1.11 N = 12 x 106 ufc/ml


log N = log No / t / g (log 2) = 104 / 48/2 (log 2) = 4 / 24 (0.3010) = 4 / 7.224 = 0.546 N = antilog 0.546 N = 35 x 106 ufc/ml

TASA DE CRECIMIENTO () :

Esta ecuación es la forma diferencial de la ecuación de crecimiento Se puede usar para describir el crecimiento en cualquier etapa durante el ciclo de este.

La velocidad de crecimiento, rx es proporcional a la densidad celular X, ya presente y sigue la cinética de una reacción de primer orden.

rx = µ X

ECUACIÓN DIFERENCIAL

dx / dt = µ X

= dx/dt . 1 / x

La población microbiana en crecimiento es un sistema que se multiplica autocatalíticamente de modo que:

Describe la velocidad de crecimiento, rx durante la fase exponencial ( y fase de declinamiento)

Tasa de Crecimiento () y Tiempo de Duplicación (td)

Despejando µ :

ECUACIÓN INTEGRAL

dx/dt = x

Integrando:

dx / x = dt

dx / x = dt

ln X - ln Xo = ( t – to )

Despejando

= ln x - lnxo / (t - to )

Esta ecuación es la forma integral de la ecuación de crecimiento Solo se aplica en el crecimiento exponencial (donde es constante). Se adapta muy bien a los datos experimentales de la fase exponencial.

Antilogaritmo

x = xo . e t

ln X = ln Xo + ( t – to )

x

xo

x = xo . e t

velocidad específica de crecimiento rapidez de aumento de la densidad celular por unidad de tiempo (h-1)

TASA DE CRECIMIENTO () :

xo

x

to t

t

to

x = xo . e t

2 xo = xo . e td

2 = e td

x = 2 xo Para una duplicación de la masa celular inicial

logaritmo natural

ln 2 = td

td = ln 2 /

= ln 2 / td

TASA DE CRECIMIENTO

= 0.693 / td

= 2.303 log 2 / ( td )

= 0.693 / td

= 2.303 (0.301) / ( td )

Intervalo de tiempo entre dos duplicaciones de la densidad celular

Número de duplicaciones de densidad celular por hora

TIEMPO DE DUPLICACION (td) :

x = xo . e t

EJERCICIO 4

Deducir la relación que hay entre el tiempo de duplicación (td) y la tasa de crecimiento (μ) de un cultivo a partir del modelo matemático del crecimiento exponencial.microbiao

= Velocidad específica de crecimiento

• Se calcula a partir de las densidades Xo y X medidas en los tiempos to y t según la ecuación (1) o sus equivalencias (2) y (3):

(1) = ln x - ln xo / ( t – to )

(2) = log x - log xo / log e ( t – to ) (3) = ( log10 x - log10 xo ) 2.303 / ( t – to )

donde: log e = 0.43429.

Es una medida de la velocidad del crecimiento celular durante la fase de crecimiento exponencial.Para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la composición y concentración del medio de cultivo, inhibidores, temperatura y pH.

Calculo de la Tasa de Crecimiento ( )

EJERCICIO 5

Calcular la tasa de crecimiento (μ, expresada en h-1) de un cultivo bacteriano que pasa de producir 3.0 g/l de biomasa total a producir 10 g/l en 50 min.

Solución

Método Ecuaciones

= lnX - ln Xo / (t -to) = log X - log Xo / log e (t -to) = (log10X - log10Xo) 2.303/ (t -to)

= ln 10 - ln 3 / ( 0.833 ) = log 10 - log 3 / 0.434 (50 ) = (log10 10 - log10 3) 2.303/(50)

= 2.30 - 1.1 / (50) = - / 0.434 (50) = ( - ) 2.303 / (50)

= / 50 = / = ( ) 2.303 / 50

= h-1 = h-1 = h-1

También relaciona la velocidad de incremento de N y

cualquier componente celular dado (Z):

En términos matemáticos:

dN / dt = N

dZ / dt = Z

donde:

N numero de células / ml

Z Cantidad de cualquier componente dado / ml

EJERCICIO 6

El cultivo tiene 104 células/ml en el tiempo to y 108 células/ml 4 horas mas tarde en un sistema de cultivo ¨batch¨ con agitación. Determine la velocidad específica de crecimiento

Solución

Método Ecuaciones

= lnN - ln No / (t -to) log N - log No / log e (t -to) (log10N - log10No) 2.303/ (t -to)

= ln108- ln 104 / (4 h) log 108 - log 104 / 0.434 (4 h) (log10108 - log10104) 2.303/(4h)

= 20.7 - 11.5 / 4 9 - 5 / 0.434 (4 h) (8 - 4) 2.303 / 4

= 9.2 / 4 9.5 / 1.736 (4 ) 2.303 / 4

= 2.303 h -1 = 2.303 h -1 = 2.303 h -1

EJERCICIO 7

Relación Tasa de Crecimiento ( ) y Tasa de División ( v )

(1) g = 1 / v

(2) td = ln 2 /

g = td

Esto es: (1) = (2) 1 / v = ln 2 / Despejando : = ln2 . V

Al comparar la tasa de crecimiento con la tasa de división v el número de células (N) y la masa celular (X) no coinciden y la relación entre ambas

medidas se altera en el curso del crecimiento de un cultivo estático.

Sin embargo, si se determina X o N y se comparan en condiciones que el incremento de N sea exactamente igual al incremento de X (células estándar)) se tiene:

PROBLEMA

Deducir la relación que hay entre el tiempo de generación (g) y la tasa de crecimiento (μ) de un cultivo a partir de las ecuaciones de crecimiento.

(1) g = 1 / v

(2) td = ln 2 /

g = td

(1) y (2) 1 / v = ln 2 / Entonces : g = ln2 /

REPRESENTACION GRAFICA DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL

La Fase exponencial

constituye el periodo mas adecuado para determinar la tasa de división, (v) y la tasa

de crecimiento, ();debido a la constancia relativa

de la tasa de división.

Se le llama crecimiento exponencial o geométrico a aquella progresión que aumenta por multiplicación de una

cantidad constante llamada razón.

Representación Aritmética

Cuando en el eje de ordenadas se representa el número de células o la masa celular, y en el eje de abscisas el tiempo, expresadas ambas magnitudes en unidades aritméticas.

El crecimiento exponencial queda representado por una curva exponencial.

No es adecuada para expresar un numero grande de divisiones celulares, ya que según sea la medida elegida solo pueden reconocerse las primeras o solo las ultimas divisiones celulares.

X (g/L)

t (horas)

x

= x o

. e

t

Representación semi-logarítmica

Cuando en el eje de ordenadas se representa el logaritmo del número de células o de la masa celular y en el eje de abscisas el tiempo, este expresado en unidades aritméticasEl crecimiento exponencial queda representado por una línea recta.

La velocidad de crecimiento (u) viene dada por la pendiente de dicha recta; es tanto mayor cuanto mayor sea la pendiente de la recta.

Debido a que el crecimiento exponencial se caracteriza por la relación lineal entre el log del número de células y el tiempo se habla también de crecimiento logarítmico.

Grafico: Velocidades de crecimiento

representadas sobre escalas aritmética y logarítmica.

Ln xx

ln X = ln Xo + ( t

– to )

METODO GRAFICO PARA CALCULAR EL VALOR DE

1.Se calcula a partir de la ecuación: ln X - ln Xo = ( t – to ) 2.Reordenando a una línea recta: y = a x

Resulta: ln X / XO = ( t )3.Graficando ln X/ Xo Vs t (tiempo)

y

ln X / XO

= a = Pendiente

( t ) x Cuando es constante dará una línea recta de pendiente (h -1)En este caso la velocidad especifica de crecimiento será la pendiente (a) de la línea

recta obtenida según se observa en el grafico.El valor de es suficiente para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo .

Método Gráfico:

Grafique: ln N/No vs t

ln N/ No = ( t )

ln N/ No y = a x

= a = Pendiente

t

Para : ln N/ No = 9.21 t = 4 horas Aplicando la ecuación de línea recta ( y = a x) : ln N/ No = t = 9.21 / 4 = 2.30 h -1

La pendiente: es igual a 2.30 h -1

EJERCICIO 2:El cultivo tiene 104 células/ml en el tiempo to y 108 células/ml 4 horas mas tarde en un sistema de cultivo ¨batch¨ con agitación. Determine la velocidad específica de crecimiento

Solución:

Rendimiento

Rendimiento (X):

Es igual a la diferencia entre la biomasa máxima y la biomasa inicial:

X = X m - Xo (en gramos de peso seco/ L)

Coeficiente de rendimiento ( Y = X / S ) :

La relación entre el rendimiento y el consumo de sustrato (X / S) tiene un interés especial.

Si ambas magnitudes se expresan en unidades de peso, se denomina el cociente “coeficiente económico” o “coeficiente de rendimiento”

Y = X / S ( g masa celular / g sustrato consumido)

De los resultados experimentales del estudio del crecimiento se puede deducir el valor del “coeficiente de rendimiento celular” Yx/s.

Yx/s = Xm - Xo / So – S

S : Concentración residual de sustrato, casi siempre tiende a cero y despreciable con respecto a So

So : Cconcentración inicial de sustrato

Yx/s : Se expresa en gramos de masa celular producido /

por gramo de sustrato metabolizado (rendimiento ponderal) o por mol de sustrato metabolizado (rendimiento molecular)

Coeficiente de Rendimiento Molar ( Ym = g / mol )

Cuando el coeficiente de rendimiento se expresa en:

gramos de masa celular / moles de sustrato. Coeficiente de Rendimiento Energético (YATP = g /mol ATP)

Cuando el coeficiente de rendimiento se expresa en:

gramos de masa celular / moles de ATP

Puede calcularse cuando se conocen tanto la vía de degradación de un sustrato como la energía (ATP) obtenida de dicha degradación.

TIPOS DE MODELOS MATEMATICOS

DEL


Ks

S = concentración del sustrato limitante

max = velocidad de crecimiento especifica máxima

Ks = constante de saturación

TASA DE CRECIMIENTO VS CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES

Existen diversas expresiones para . La mas difundida es :

S

Cuando S Ks toma el valor de max y rx solo depende de X

El Valor de Ks esta inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato.

En general Ks tiene valores muy bajos (mgL-1) por tanto concentraciones bajas de S son suficientes para hacer que = max

Las bacterias poseen valores de max cercanos a 0.9 h-1Las levaduras 0.45 h-1 y los hongos filamentosos 0.25 h-

1;

De todos modos debe ser determinado experimentalmente para cada caso en particular.


Y SU

RELACION CON EL AMBIENTE

EFECTO DE TEMPERATURA

EFECTOS DEL PH

EFECTO DE ALTA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES

EFECTO DE NUTRIENTES INSOLUBLES EN AGUA

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