黑龙江生物科技职业学院

生物制药技术

生物分离技术

主讲人：张爱华

实训三、锌盐沉析法提取胰岛素

实验原理 2

材料用具 3

操作方法 4

目的要求 211

555 注意事项

目的要求

了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理。了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理。

掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。

原理 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。 其等电点为 5.30 ～ 5.35 ，在 pH4.5 ～ 6.5 范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在 80％以下乙醇或丙酮中溶解；在 90％以上乙醇或 80％以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。

胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。 其等电点为 5.30 ～ 5.35 ，在 pH4.5 ～ 6.5 范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在 80％以下乙醇或丙酮中溶解；在 90％以上乙醇或 80％以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。

胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。

胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。

材料用具

冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况下用液氮或干冰速冻）冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况下用液氮或干冰速冻）

氯化钠溶液、柠檬酸溶液、硫酸、氯化锌 、丙酮、硅藻土、五氧化二磷、 20％醋酸锌等。氯化钠溶液、柠檬酸溶液、硫酸、氯化锌 、丙酮、硅藻土、五氧化二磷、 20％醋酸锌等。

离心机、布氏漏斗（ 8cm ）、抽滤瓶、分液漏斗、酸度计、搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。离心机、布氏漏斗（ 8cm ）、抽滤瓶、分液漏斗、酸度计、搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。

预处理

将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。

提

取

将冻胰片 100g 置于不锈钢锅中，加入 300m L 82 ％乙醇（ W/W ），在 10～ 13℃加入 12 mol ／ L硫酸，调节 pH 2.8 ～ 3.0 ，搅拌提取 40min 。加入 6mol ／ L盐酸调 pH至2.0 ，继续搅拌提取 2.5 h ，离心（ 3000r/min ） 15 min ，残渣加入 65％乙醇 150mL ，用 6 mol ／ L盐酸调 pH至 2.0 ， 10 ～ 13℃搅拌提取 2 h ，离心（ 3000r/min ） 15 min 分离残渣。合并两次提取液。

碱

化

将提取液置于搪瓷桶中，然后冷至0 ～ 5℃ ，用浓氨水调 pH 7.8 ～ 8.0 ，加入硅藻土（每 100g 胰脏加 6 g ），抽滤，滤液随即用混合酸（盐酸 4 mL 、硫酸 1 mL 、水 4 mL ）酸化至 pH 2.5 ，待沉淀完全后虹吸清液，用尼龙布（或纱布）过滤，弃去沉淀，温度控制在 0 ～ 3℃ 。

锌沉析

将碱化液置于不锈钢锅中，然后在搅拌的条件下加入氯化锌溶液（每 100 g胰脏加 3 g 氯化锌，先配成 30 ％～ 50％溶液，用 6 mol ／ L 盐酸调至 pH 2.5 后加入），温度 2 ～ 4℃ ，待沉淀完全后，虹吸上清液，用尼龙布（或纱布）过滤除去沉淀，清液用液氨水调 pH 至 6.8 ～ 7.0 ，于 5℃ 过夜。

脱

脂

虹吸除去清液，沉淀过滤收集，溶于 5 倍量蒸馏水，用 6 mol ／L 盐酸调 pH 2.7 ～ 2.8 ， 12 ～15℃ 放置。次日放出下层清液（上层脂肪再用 5 倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，作下批锌沉淀溶解用）。

丙酮、锌沉析

将盐析物置于搪瓷桶中，然后在搅拌的条件下加入 7 倍量水、 3 倍量丙酮，用 4 mol ／ L 氨水调 pH 至 4.5 ，冷至 0 ～ 5℃ 过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用 4 mol ／ L 氨水调pH 至 6.0 ，加入 20 ％醋酸锌（按每100 g 投料加入 0.03 mL ），析出白色沉淀。

结晶干燥

过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按每 100 g 投料所得沉淀物计）： 2 ％柠檬酸 0.5 mL ， 20 ％醋酸锌 0.0065 mL ，丙酮 0.16 mL ，蒸馏水稀释至 1 mL 。结晶液冷却至0 ～ 5℃ ，用 4 mol ／ L 氨水碱化至 pH 8.O ，过滤除去沉淀。用 10 ％柠檬酸调至 pH 6.0 ，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集结晶，用蒸馏水洗 2 次，丙酮洗 2次，以五氧化二磷真空干燥，得成品。

注意事项

1.采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。要立即深冻，–15℃保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率 10％。

1.采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。要立即深冻，–15℃保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率 10％。

2. 胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。超声波能引起其非专一性降解。

2. 胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。超声波能引起其非专一性降解。

3.还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素 c及多数重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。 3.还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素 c及多数重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。

思考 题

1 ．为何在胰岛素的制备中溶液的 pH值不能超过 8.0 ? 1 ．为何在胰岛素的制备中溶液的 pH值不能超过 8.0 ?

2 ．碱化过滤时为何加硅藻土？ 2．碱化过滤时为何加硅藻土？