真菌常用的体外药敏试验方法比较真菌常用的体外药敏试验方法比较

真菌药敏试验临床难以开展的原因

1. 按照 NCCLS 推荐的稀释法 , 操作繁琐 2. 有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定

3. 纸片法试验未得到 NCCLS 认可 4.E 试验价钱太贵 5. 药敏孵育时间因菌种而不同

体外敏感试验与临床治疗相关性 真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关

性好 对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临

床治疗的相关性还有待进一步证实 体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内

的动力学和复杂的生物学作用

真菌体外药物敏感试验方法

NCCLSM27-A ：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test 法 NCCLS M44-P 纸片扩散法 ( 仅限氟康唑 ) 丹麦 Rosco 纸片扩散法 (NCCLS 未认可 )

真菌体外药敏用培养基 常量肉汤和微量肉汤法 RPMI1640 液制备：

RPMI 10.4g MOPS （三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53 g 蒸馏水 900ml 溶解后，用 1M NaOH 调节 PH 至 7.0 （ 25℃ ）， 用蒸馏水溶至1000ml ，

高压灭菌后，冷却至 50 ℃ 加入 RPMI1640 用 0.22µm 滤膜抽滤除菌， 4℃ 保存。

真菌体外药敏用培养基 E-test 法 ： 在 RPMI 液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为 2% 。

NCCLS 纸片扩散法 ： Mueller-Hinton 琼脂 补充 2% 葡萄糖和 0.5μg/ml 美蓝

丹麦 ROSCO 纸片扩散法 ： 改良的 SHADOMY （ PH7.0 ）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。

菌液制备将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用 0.85% 的盐水制

成酵母菌悬液，调整其浊度达到 0.5 麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml ）。

常量稀释法：用 RPMI1640 液体稀释 2000 倍 接种浓度约为 0.5~2.5×103CFU/ml 微量稀释法：用 RPMI1640 液体稀释 1000 倍 接种浓度约为 1 ～ 5×103CFU/mlE-test 法和 NCCLS 纸片扩散法：用菌液浊度为 0.5 麦氏单位。Rosco 纸片扩散法： 1. 念珠菌： 0.5 麦氏浊度，生理盐水 1 ： 10 稀 (1~5×105CFU/ml)2. 隐球菌属： 1.0 麦氏浊度3. 其它酵母菌： 0.5 麦氏浊度，生理盐水 1 ： 1 稀释

常量肉汤法 (M27-A) 先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的 RPMI1640 液倍比稀

释，使其起始浓度为 640µg/ml, 终末浓度为 1.25µg/ml ，分装无菌洁净的 12mm×75mm 试管：

64 32 16 8 4 2 1 0.5 .25 .125 ＋ －

前 10 管： 0.2ml 氟康唑＋ 1.8ml 菌液

念珠菌属 35 ℃ 孵育 48 小时新型隐球菌 72 小时 读取 MIC 结果

2ml 菌液 1.8ml1640

常量稀释法 药敏结果判定

氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为 100% 抑制 其他唑类药物为 80% 抑制

（取 0.2ml 的生长对照菌液加入 0.8mlRPMI 液体培养基的菌液浓度）

质控株 克柔念珠菌 ATCC 6258 近平滑念珠菌 ATCC 22019 白念珠菌 ATCC 90028

白念珠菌 ATCC 24433

微量肉汤法 氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为 2× 常量法的浓度（即

128µg/ml ），终浓度为 0.25µg/ml 。

。 37℃。 37℃

64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ －

氟康唑： 1-10 孔分别为 100ul菌悬液： 1-10 孔分别为 100ul

200ulRPMI 汤200ul 菌悬液 35 ℃新型隐球菌 72 小时 ，

其余菌株 48 小时读取 MIC 结果

酵母菌的 NCCLS M27-A各药物折点粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌） 敏感： ≤ 8µg/ml 中介： － 耐药： ≥ 64µg/ml粘膜感染： 伊曲康唑 敏感： ≤ 0.125µg/ml 中介： － 耐药： ≥ 1µg/ml粘膜及系统性感染： 5- 氟嘧啶 敏感： ≤ 4µg/ml 中介： 8~16µg/ml 耐药： ≥ 32µg/ml

酵母菌酵母菌 E-test 法 瑞典 AB Biodisk

优点：有较好的重复性和稳定性

MIC

E-test 法 0.5 麦氏比浊液 （约为 1~5×106CFU/ml ）。菌悬液均匀涂布于药敏板上 35 ℃ 培养 24 小时读取结果 光滑念珠菌 新型隐球菌等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。

E-test 法评价 准确性高 ,且操作简便 E-test 法得到的 MIC值在某些菌种中要低于

NCCLS 推荐的常量肉汤稀释法测得的 MIC 20% 浓度 CO2 的环境中，可使此方法的结果更真

实反映药物对致病菌的敏感性

缺点： 1. 价格太高 每片 40-50 元 2. 吡咯类 MIC 终点不好确定

酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003

培养基： Mueller-Hinton 琼脂 补充 2 ％ Glucose

0.5ug/ml Methylene blue dye

PH7.2-7.4优点：有较好的重复性和稳定性

操作简便，价廉缺点：目前只限氟康唑

NCCLS 纸片扩散法 0.5 麦氏比浊标准（约为 1~5×106CFU/ml ）。 菌悬液均匀涂布于药敏板上 步骤同细菌敏感试验操作一致， 35 ～ 37℃ 孵育 18 ～ 24 小时， 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至

1 麦氏单位，孵育 48 小时， 光滑念珠菌也需孵育 48 小时读取抑菌环直径。

酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003

氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度抑菌环直径（ mm)

MIC

（ ug/ml)

敏感（ S) >=19 <=8

剂量依赖性敏感（ SDD)

15-18 16-32

耐药（ R) <=14 >=64

S ＝ Susceptible SDD=Susceptible － Dose Dependent R=Resistant

酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003氟康唑对标准菌株 24h 抑菌环直径（ mm) 的质控允许范围标准菌株 氟康唑 25ug 沃尔康唑 1ug

白念珠菌 ATCC90028 28-39 31-42近平滑念珠菌 ATCC22019 22-33 28-37热带念珠菌 ATCC750 26-37 －克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

ROSCO 纸片扩散法 ROSCO 纸片扩散法：1. 克柔念珠菌： 0.5 麦氏浊度，生理盐水 1 ： 10 稀释

菌液为 5×105CFU/ml2. 隐球菌属： 1 麦氏浊度3. 其它酵母菌： 0.5 麦氏浊度，生理盐水 1 ： 1 稀释

菌液为 2.5×106CFU/ml 将稀释好的菌液涂布在改良的 SHADOMY （ PH7.0 ）

培养基上

其它操作同细菌。

读取抑菌环直径近似到 mm 在大约 80% 抑制区为测量边界 在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落， <15

可忽略不计

Rosco 纸片扩散法药敏结果判定

两种纸片扩散法的比较 Rosco 纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 改良 SHADOMY 琼脂， PH7.0

试验药品及剂量 AMB 10µg ， IT 8µg ， FLA 15µg ， FC 1 ， 10µg ， FC 10µg ， KET15µg 等 接种的菌量： 5×105CFU/ml （克柔念珠菌先制成 0.5

麦氏浊度，再用生理盐水 1 ： 10 。 隐球菌属配 1.0 麦氏不稀释）其它菌种配 0.5 麦氏浊度， 1 ： 1 稀释

培养条件 念珠菌属 35℃ 培养 18~24 小时， 新型隐球菌 30℃ 培养 42~48 小时 结果判读 FC 及 AMB100%被抑制 唑类药物 80% 抑制 质控株 光滑念珠菌 2238NL 白念珠菌 ATCC64548

白念珠菌 ATCC64550

NCCLS 纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 Mueller-Hinton 琼脂中补充 2%

的 葡萄糖和 0.5μg/ml 的美蓝 试验药品及剂量 FLA 25µg 接种的菌量 1 ～ 5×106/mL 隐球菌 1.0 麦氏浊度

培养条件 35 ℃ 孵育 18 ～ 24 小时 新型隐球菌培养 42~48 小时 结果判读 FC 及 AMB100%被抑制， 唑类药物 80% 抑制 质控株 白念珠菌 ATCC90028 近平滑念珠菌 ATCC22019

Rosco 纸片扩散法各药物折点 粘膜酵母菌感染氟康唑 ，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶 1ug ，特比奈吩，咪

康唑等 敏感：≥ 20mm 中介 ： 12~19mm 耐药：≤ 11mm两性霉素 B ， 制霉菌素伊曲康唑 敏感：≥ 15mm 中介： 10~14mm 耐药：无抑菌环氟胞嘧啶 10ug 敏感： ≥ 30mm 用于黑曲霉 中介： 23~29mm 耐药：≤ 22mm灰黄霉素 敏感：≥ 10mm 中介：－ 耐药：无抑菌环

系统性酵母菌感染

氟康唑 15ug 18-24h 敏感：≥ 30mm ≤4 中介： 29~23mm 8-16 耐药：≤ 22mm ≥32

伊曲康唑 8ug 18-24h 敏感：≥ 20mm ≤0.06 中介： 19~12mm 0.125 耐药：≤ 11mm ≥0.25

这个MIC 标准为纸片法的相应值

Rosco 纸片扩散法各药物折点

系统性酵母菌感染

酮康唑 15ug 纸片和培养基广州乐通公司可供应 敏感：≥ 30mm ≤0.12 中介： 23-29 0.25 耐药： ≤ 22mm ≥ 0.5

两性霉素 10ug 敏感：≥ 15mm ≤1 中介： 14-10 2 耐药： ≤ 9mm ≥ 4

氟胞嘧啶 1ug 敏感：≥ 20mm ≤4 中介： 12-19 8-16 耐药： ≤ 11mm ≥ 32

氟胞嘧啶 10ug 用于黑曲霉 敏感：≥ 30mm ≤4 中介： 23-29 8-16 耐药： ≤ 22mm ≥ 32

Rosco 纸片扩散法各药物折点

氟孢嘧啶

氟康唑 -

制霉菌素

伊曲康唑

两性霉素 B

克霉唑 -

特比奈酚

结论 1. 常量稀释法难以推广 2. 微量板浪费 3.NCCLS 纸片法只做氟康唑 4.建议目前用 Rosco 纸片 5.寄希望将来推行 Etest 法