试管婴儿与分子生物学试管婴儿与分子生物学

试管婴儿的开始试管婴儿的开始试管婴儿技术试管婴儿技术分子生物学技术在试管婴儿中的应用分子生物学技术在试管婴儿中的应用展望展望

试管婴儿的开始试管婴儿的开始世界上第一个试管婴儿于世界上第一个试管婴儿于 19781978年年 77 月月 2525 日在英国的奥尔德姆日在英国的奥尔德姆市医院诞生，她的名字叫路易市医院诞生，她的名字叫路易丝丝 .. 布朗。布朗。 19881988 年北京医科大年北京医科大学第三医院诞生了我国内地第学第三医院诞生了我国内地第一位试管婴儿 一位试管婴儿 培养在恒温器中的受精卵。恒培养在恒温器中的受精卵。恒温器温度保持在与人体温度相温器温度保持在与人体温度相同的摄氏同的摄氏 3737 度度      44 岁岁 88 个月大的路易丝和她的个月大的路易丝和她的妹妹、同样是试管婴儿的妹妹、同样是试管婴儿的 99 个个月大的娜塔莉 月大的娜塔莉

试管婴儿技术试管婴儿技术第一代试管婴儿（第一代试管婴儿（ in vitroin vitro fertilization ,IVF fertilization ,IVF体外受精）体外受精）第二代试管婴儿第二代试管婴儿 (intracytoplasmic sperm i(intracytoplasmic sperm injection,ICSInjection,ICSI 单精子卵细胞浆内注射单精子卵细胞浆内注射 ))

第三代试管婴儿（第三代试管婴儿（ pre-implantation genetpre-implantation genetic diagnosis,PGDic diagnosis,PGD 胚胎植入前诊断胚胎植入前诊断 ))

Process of IVFProcess of IVF

1.1. Hyper ovulationHyper ovulation

2.2. Egg RetrievalEgg Retrieval

3.3. Artificial Artificial Insemination Insemination

4.4. Embryo TransferEmbryo Transfer

受精卵分裂受精卵分裂示意图示意图

单精子卵细胞浆内注射（单精子卵细胞浆内注射（ ICSICSII ））

示意图如下：示意图如下：

第三代试管婴儿与分子生物学的联系第三代试管婴儿与分子生物学的联系

植入前遗传诊断即植入前遗传诊断即 PGD:PGD: 指对配子或移入到指对配子或移入到子宫腔之前的胚胎进行遗传学分析，去除有子宫腔之前的胚胎进行遗传学分析，去除有遗传缺陷的配子或胚胎。 遗传缺陷的配子或胚胎。 19891989 年，英国年，英国 HandysideHandyside 成功地用聚合酶链成功地用聚合酶链反应（反应（ PCRPCR ）技术分析卵裂球的性别构成，）技术分析卵裂球的性别构成，完成了世界上第一例完成了世界上第一例 PGDPGD 诊断诊断 ,, 我国首例我国首例 19199898 年在中山医科大学生殖医学中心诞生。 年在中山医科大学生殖医学中心诞生。 PGDPGD 是辅助生育技术与分子生物学技术相结是辅助生育技术与分子生物学技术相结合而发展的产前诊断技术合而发展的产前诊断技术

PGDPGD 的取材的取材

极体细胞极体细胞

卵裂球细胞卵裂球细胞

囊胚期细胞囊胚期细胞

PGD: PGD: Genetic testing performed prior to embryo transferGenetic testing performed prior to embryo transfer

Viable and Desirable?Viable and Desirable?

“This information is helping parents choose which embryos they want--and which to reject as unhealthy, or merely undesirable.”

Undesirable EmbryosUndesirable Embryos

Disease Free EmbryosDisease Free Embryos

Frozen in storage Frozen in storage

Donated to infertile Donated to infertile couplescouples

Donated to stem cell Donated to stem cell research/usageresearch/usage

Disease Carrying Disease Carrying EmbryosEmbryos

Donated to researchDonated to research

DiscardedDiscarded

分子生物学技术在分子生物学技术在 PGDPGD 中的应中的应用用

　　 　　 PCRPCR 技术在技术在 PGDPGD 的应用（的应用（ 9090 年代后期开年代后期开始，荧光始，荧光 PCRPCR ，巢式，巢式 PCRPCR 技术 ）技术 ）

主要用于单基因缺陷遗传病的诊断主要用于单基因缺陷遗传病的诊断荧光原位杂交荧光原位杂交 (Florescence In-Situ Hybridi(Florescence In-Situ Hybridization,FISH)zation,FISH) 在在 PGDPGD 中的应用中的应用

主要用于染色体疾病的诊断主要用于染色体疾病的诊断

全基因组扩增（全基因组扩增（ whole genome amplificatiwhole genome amplificatioo ，， WGAWGA ））

PCRPCR 和和 FISHFISH 的局限性的局限性尽管尽管 PCRPCR 在在 PGDPGD 中起了重要的作用，但中起了重要的作用，但 PCRPCR对单个细胞扩增失败率高。由于获得细胞数目极对单个细胞扩增失败率高。由于获得细胞数目极少，而致使对单个细胞只能作一次分析，不能重少，而致使对单个细胞只能作一次分析，不能重复实验结果。等位基因脱失 复实验结果。等位基因脱失

对对 45XO45XO 或或 YOYO ，， 1818 单体核型的胚胎细胞，单体核型的胚胎细胞， FISFISHH 诊断可能存在错误，出现这一结果时有两种可诊断可能存在错误，出现这一结果时有两种可能，一是被检测的单个细胞就是单体核型的细胞；能，一是被检测的单个细胞就是单体核型的细胞；也可以是技术方法问题未能显示另一个杂交信号，也可以是技术方法问题未能显示另一个杂交信号，FISHFISH 信号尚缺乏统一的标准 信号尚缺乏统一的标准

可利用可利用 PGDPGD 进行检测的遗传病进行检测的遗传病

常染色体显性遗传常染色体显性遗传马凡氏综合征马凡氏综合征Huntington’sHuntington’s 综合征综合征强直性肌萎缩强直性肌萎缩家族性腺纤维囊肿家族性腺纤维囊肿常染色体隐性遗传常染色体隐性遗传囊性纤维瘤囊性纤维瘤TaU-SachsTaU-Sachs 病病Lesch-NyhanLesch-Nyhan 综合征综合征β—β— 地中海贫血地中海贫血　镰刀细胞病　镰刀细胞病　脊柱肌萎缩　脊柱肌萎缩

xx连锁遗传病连锁遗传病XX连锁隐性遗传病中鉴定连锁隐性遗传病中鉴定胎儿性别胎儿性别假性肥大型肌营养不良假性肥大型肌营养不良血友病血友病 AA　脆性　脆性 xx 综合征综合征严重的复合免疫缺陷严重的复合免疫缺陷白化病白化病非整倍体非整倍体平衡易位携带者平衡易位携带者　性腺嵌合型 　性腺嵌合型

PGDPGD 的应用前景的应用前景

遗传病的诊断（优生）遗传病的诊断（优生）疾病治疗（干细胞）疾病治疗（干细胞）拯救濒危珍稀动物拯救濒危珍稀动物研究人类基因在发育早期的研究人类基因在发育早期的表达（人类肿瘤易感综合征表达（人类肿瘤易感综合征的易感性分析 ）的易感性分析 ）

PGDPGD 展望展望多重突变分析 多重突变分析 多重多重 PCRPCR ，间期核转换，全基因组扩增（，间期核转换，全基因组扩增（ whole gwhole g

enome amplificatioenome amplificatio ，， WGAWGA ），基因芯片，微流），基因芯片，微流控控诊断标准化 诊断标准化 伦理学研究 伦理学研究 相关领域研究：相关领域研究： 11 、人类胚胎体外的有效培养和、人类胚胎体外的有效培养和定向诱导分化 定向诱导分化

22 、人体基因在胚胎早期的特异表、人体基因在胚胎早期的特异表达 达

谢 谢谢 谢

实时荧光实时荧光 PCRPCR 检测单个地贫基因突检测单个地贫基因突变变

分离已知基因型的外周血标本单个淋巴细胞，用分离已知基因型的外周血标本单个淋巴细胞，用巢式巢式 PCRPCR 外引物进行第一轮扩增，第二轮用外引物进行第一轮扩增，第二轮用 TaqTaqManMan探针进行相应基因型的实时探针进行相应基因型的实时 PCRPCR 检测，其检测，其中不同荧光报告基团标记的探针分别与正常、异中不同荧光报告基团标记的探针分别与正常、异常等位基因特异杂交，结合各荧光的终点变化及常等位基因特异杂交，结合各荧光的终点变化及其实时动力学曲线判断对应等位基因存在与否。其实时动力学曲线判断对应等位基因存在与否。使单个碱基突变更敏感地干扰不匹配的探针与等使单个碱基突变更敏感地干扰不匹配的探针与等位基因间的退火，更有效地检测出匹配的探针与位基因间的退火，更有效地检测出匹配的探针与等位基因间的结合等位基因间的结合优点：快速、有效防污染、灵敏性高优点：快速、有效防污染、灵敏性高