Upload
nixie
View
44
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
A "programozott sejthalál" (apoptosis) in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid el ő állítása és jelzése 99m Tc-radionukliddal. Szemenyei Erzsébet 1 , Tóth Géza 1 , Környei József 2. 1 MTA SZBK , Biokémiai Intézet, Szeged, 2 Izotóp Intézet Kft. Budapest. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
A "programozott sejthalál" (apoptosis)
in vivo körülmények közötti kimutatását
célzó peptid előállítása és jelzése
99mTc-radionukliddal Szemenyei Erzsébet1, Tóth Géza1, Környei József 2
Őszi Radiokémiai NapokEger 2004
1MTA SZBK, Biokémiai Intézet, Szeged, 2Izotóp Intézet Kft. Budapest
Apoptózis: Programozott sejthalál. A természetes sejthalál egyik formája, a sejtek mindig ugyanazon a helyen és időben genetikailag meghatározott program szerint halnak el. Az elnevezés a régi görög nyelvből származik, ahol falevelek hullását jelentette.
Az elhaló sejtek felszínén, a kettős membrán külső odalán megjelennek ezen sejtek felismerését lehetővé tévő molekulák, pl. a foszfatidil-szerin lipid-molekula.
Bevezetés
BevezetésAnnexin V: • Ca2+ és foszfolipid kötő fehérjék családjának tagja, antikoaguláns tulajdonságokkal
• Nagyrészt a plazmamembrán citoszol felőli részén található
• Az érett annexin V 320 aminosavból áll, 35-36 kDa tömegű
• A fehérje négy ismétlődő rész, síkban ciklikus elrendeződésével alakul ki,
az ismétlődő részek öt alfa-helikális szegmenst tartalmaznak
Patrick Raynal, Harvey B. Pollard(1994) Biochimica et Biophysica Acta
1197, 63-93.
Annexin V fragmentum szintézise
A szintézis lépései:
1. Kapcsolás: 2 ekv. Boc-Xaa, 2 ekv. HOBt, 2 ekv. DCC, DCM 2. Védőcsoport eltávolítás: 50 % TFA/DCM, 10 % DIEA/DCM 3. A következő aminosav(ak) kapcsolása 4. Hasítás: HF(l), anizol, dimetil-szulfid, 0 ˚C
ANX13:1. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH
/AQVLRGTVTDFPG-OH/2. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2
/AQVLRGTVTDFPG-NH2/
Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis
Alkalmazott gyanták, szintézis módszerek:
1. Merrifield-gyanta, Boc-kémia 2. 4-metil-benzhidril-amin gyanta, Boc-kémia
Analitikai adatok Peptidek Mr MS HPLC
[M+H+] k` AQVLRGTVTDFPG -OH 1359,75 1360,75 4,35AQVLRGTVTDFPG -NH2 1358,68 1359,68 3,17
Tiszítás: (RP-HPLC, gradiens elúció) Vydac 218TP1010 (C18) oszlop,
Gradiens:15 %-40 % A /25 percA: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 4 cm3/perc
Analitikai tisztaság vizsgálata:
(RP-HPLC) Vydac 218TP54 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 percA: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 1 cm3/perc
Tömegspektrum adatok: Reflex III MALDI-TOF
Kitermelés: AQVLRGTVTDFPG -OH: 20,4 %AQVLRGTVTDFPG -NH2: 49,6 %
Stabilitás vizsgálatAla-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH, 12 hónap, -18 °C
A vizsgálat kezdete2003. 08. 11.
2003. 11. 14. 2004. 02. 16. 2004. 04. 19.
Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2, 12 hónap, -18 °C
2004. 04. 19. 2003. 11. 14. 2004. 02. 19.
Vydac 218TP54 (250 4.6 mm), 215 nm, gradiens: 15 %-40 % ACN/25 perc, injektálás: 50 μl
A vizsgálat kezdete2003. 08. 11.
CCANX13 szintézise, stabilitás vizsgálataCCANX13:Cys-Cys-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH
/CCAQVLRGTVTDFPG-OH/
Alkalmazott szintézis módszer, gyanta: Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis, Boc-kémia, Merrifield-gyanta
Analitikai adatok: Peptid Mr MS HPLC
[M+H+] k` CCAQVLRGTVTDFPG -OH 1565,92 1566,92 7,46Kitermelés = 59,1 %
Hővel szembeni stabilitás vizsgálata: 100 °C-on, fiziológiás sóoldatban
hőkezelés nélküli 20 perc 1 óra
„Nitrido-jelzés”1. N99mTc -intermedier előállítása
SnCl2
TcO4-
szobahőmérséklet keverés
-komplex előállítása
P
N
NN
trisz-(2-cianoetil)-foszfin (PCN)
(Oldás: hidroxpropil--cikodextrin jelenlétében)
S SCH2
NH2
O O
CH2
NH
Tc
P
N
NN
N
ANX13
99mTc-ANX13-PCN-komplex
CH2 CH2
C O
NH NH2
CO
NHNH2
borostyánkõsav-dihidrazid (SDH)
+
+ CCANX13
Tc N int.
Tc N int.
+ 100 °C
1 óra
15 perc
99mTc-ANX132.
Analitikai vizsgálatok
99mTc-ANX13-PCN-komplexET-31aceton
99mTc-ANX13-PCN-komplexKieselgel 60, F254
EtOH:víz 1:1
Vékonyréteg-kromatográfia
Rf érték: 0,03 100% Rf értékek: 0,02 4,22% 0,66 95,78%
Analitikai vizsgálatok
99mTc-ANX13-PCN-komplexKieselgel 60, F254
EtOH:víz 1:1
99mTcN-intermedierKieselgel 60, F254
EtOH:víz 1:1
99mTc-PCN-komplexKieselgel 60, F254
EtOH:víz 1:1
Rf érték:(3) 0,15 100%
Rf értékek:(4) 0,15 12,97% 0,71 87,03%
Rf értékek:(5) 0,15 8,72% 0,73 91,28%
4
5
3
Analitikai vizsgálatok
99mTcN-intermedierITLC-SA
0,3 M-os HCl-valtelített BuOH
99mTc-ANX13-PCN-komplexITLC-SA
0,3 M-os HCl-valtelített BuOH
99mTc-PCN-komplexITLC-SA
0,3 M-os HCl-valtelített BuOH
Rf értékek:(8) 0,14 11,81% 0,49 41,72% 0,52 31,73% 0,55 14,74%
Rf értékek:(7) 0,15 13,99% 0,38 19,91% 0,50 4,84% 0,61 14,22% 0,67 47,05%
Rf értékek:(6) 0,15 27,53% 0,22 48,59% 0,49 4,71% 0,66 19,17%
6 7
8
ÖsszefoglalásSikeresen előállítottuk a Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH
és Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2 peptideket.A stabiltás vizsgálatból kiderült, hogy az –OH végű forma stabilabb, ezért a további vizsgálatokat ezzel végeztük.
Elkészítettük a nitrido-jelzéshez szükséges, két ciszteinnel kiegészített ANX13-at, ennekhővel szembeni stabilitás eredménye azt mutatja, hogy a jelzésnél alkalmazhatjuk
az 1 órás reakcióidőt.
A jelzési reakció után vékonyréteg-kromatográfiával kimutattuk, hogy nincs szabad 99mTcO4-
a rendszerben. (ET-31, aceton)
A további vizsgálatok azt mutatták, hogy intermedier sincs jelen. (Kieselgel 60, EtOH: víz 1:1)Ugyanakkor, ebben a rendszerben nem válik el egyértelműen a 99mTc-PCN-komplexés a 99mTc-ANX13-PCN-komplex.
Egy újabb futtatórendszeren és lapon elvégzett vizsgálatokból egyértelműen látszik, hogy a jelzés sikeres volt. (ITLC-SA, 0,3 M HCl-val telített BuOH)
Célunkat elértük, sikerült előállítanunk a 99mTc-ANX13-komplexet, amely jelentős előrelépés egy tervezett radiogyógyszer kifejlesztésének következő fázisához, a preklinikai vizsgálatok megtervezéséhez.
Köszönetnyilvánítás
Köszönöm a figyelmüket!
Szeretnék köszönetet mondani munkatársaimnak:Tóthné Papp Évának és Papp Jánosné, Andreának
valamintRupert Anikónak és Paál Margitnak a hatékony segítségért.
Köszönjük a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség
támogatását.