เอกสารวชาการฉบบท� ๕๗/๒๕๔๙

Technical Paper No. 57/2006

การยอมรบการตดเช/อทอราซนโดรมไวรสของกงกามกราม

Susceptibility of Macrobrachium rosenbergii De Man (1879)

to Taura Syndrome Virus (TSV)

จาร ผลชนะ Jaree Polchana

เตมดวง สมศร Temdoung Somsiri สรยนต สนทรวทย Suriyan Soontornwit

Gary Nash Gary Nash

สานกวจยและพฒนาประมงน/าจด Inland Fisheries Research and Development Bureau

กรมประมง Department of Fisheries

กระทรวงเกษตรและสหกรณ Ministry of Agriculture and Cooperatives

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

เอกสารวชาการฉบบท� ๕๗/๒๕๔๙

Technical Paper No. 57/2006

การยอมรบการตดเช/อทอราซนโดรมไวรสของกงกามกราม

Susceptibility of Macrobrachium rosenbergii De Man (1879)

to Taura Syndrome Virus (TSV)

จาร ผลชนะ Jaree Polchana

เตมดวง สมศร Temdoung Somsiri สรยนต สนทรวทย Suriyan Soontornwit

Gary Nash Gary Nash

สถาบนวจยสขภาพสตวน/าจด Inland Aquatic Animal Health Research Institute

สานกวจยและพฒนาประมงน/าจด Inland Fisheries Research and Development Bureau

กรมประมง Department of Fisheries

๒๕๔๙ 2549

รหสทะเบยนวจยเลขท� 47-0508-47054

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

สารบญ

หนา

บทคดยอ 1 Abstract 2 คานา 3 วตถประสงค 4 วธดาเนนการ 4 ผลการศกษา 6 สรปและวจารณผล 9 คาขอบคณ 10 เอกสารอางอง 11 ภาคผนวก 12

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

สารบญตาราง

ตารางท6 หนา

1 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในลกกงกามกรามท6เล9ยงใน น9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนานานตาง ๆ กน

8

2 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในลกกงกามกรามท6ทดลองใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

8

3 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในกงกามกรามขนาดใหญท6 ทดลองใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

8

4 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในกงกามกรามท6ฉดดวยเช9อ TSV

9

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

สารบญภาพ

ภาพท6 หนา

1 ลกษณะอนภาคของเช9อ TSV ท6แยกจากกงขาวปวย 7 2 พยาธสภาพของเน9อเย6อลกกงกามกรามแชเช9อ TSV 7

ภาพผนวกท6

1 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในลกกงกามกรามท6เล9ยง ในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลาตาง ๆ กน

12

2 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในลกกงกามกรามท6ใหกน เน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

14

3 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในกงกามกรามขนาดใหญท6 ใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

15

4 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในกงกามกรามท6ฉดดวยเช9อ TSV

16

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

การยอมรบการตดเช/อทอราซนโดรมไวรสของกงกามกราม

จาร ผลชนะ๑* เตมดวง สมศร๑ สรยนต สนทรวทย๒ และ Gary Nash๓

๑สถาบนวจยสขภาพสตวน9าจด กรมประมง ๒สวนประมงกรงเทพมหานคร กรมประมง

๓ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต สานกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต

บทคดยอ

ทอราซนโดรมไวรส (Taura Syndrome Virus: TSV) เปนเช9อไวรสท6ทาความเสยหายใหแก

เกษตรกรผเล9 ยงกงขาว (Penaeus vannamei) เปนอยางมาก และเม6อเกดการระบาดของโรคข9นในฟารมเล9ยงกงขาวในเขตพ9นท6ความเคมต6า เกษตรกรมกเปล6ยนมาเล9 ยงกงกามกรามแทนโดยมไดเกบซากกงออกและบาบดฆาเช9อในน9 าแตอยางใด จงเปนท6มาของการศกษาการยอมรบการตดเช9อ TSV ของกงกามกรามท9งในลกกงและกงโตเตมวย โดยวธการแช กน และฉดเช9อ TSV ท6แยกไดจากกงขาวท6เปนโรคจากฟารมเล9ยงกงขาวในจงหวดนครปฐม ผลการศกษาพบวาเช9อ TSV สามารถคงสภาพในน9 าจดและคงความสามารถในการถายทอดเช9อไดนาน 5 วน นอกจากน9 จากการทดสอบโดยทาใหกงกามกรามไดรบเช9อท9ง 3 วธ พบวาเช9อ TSV หรอยนของเช9อ TSV มโอกาสฝงตวอยในกงกามกรามได เน6องจากสามารถตรวจพบโดยวธ RT-PCR แตเช9อน9 ไมสามารถทาใหกงกามกรามเปนโรค เพราะไมพบอตราการตายท6แตกตางจากชดควบคมและการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพของเน9อเย6อในกงกามกรามท6ไดรบเช9อตลอดเวลาท6ทดลองเปนเวลา 15 วน แตอยางไรกตามยงไมไดทาการทดสอบวาเช9อท6ตรวจพบในกงทดลองจะสามารถถายทอดและกอใหเกดโรคในกงขาวไดหรอไม ซ6 งจะไดดาเนนการทดสอบตอไป ผลการศกษาในคร9 งน9 ไดขอสงเกตวาการกกน9 าท6ปนเป9 อนจากบอกงปวยดวยโรคทอราซนโดรมเปนเวลานานอยางนอย 7 วน อาจทาใหเช9อไวรสหมดสภาพหรอสามารถระงบการแพรกระจายของเช9อไวรสได คาสาคญ: กงกามกราม ทอราซนโดรมไวรส *เขตจตจกร กรงเทพ ฯ ๑o๙๐๐ โทร. o ๒๕๗๙ ๔๑๒๒ e-mail : jareep@fisheries.go.th

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

Susceptibility of Macrobrachium rosenbergii de Man (1879)

to Taura Syndrome Virus (TSV)

Jaree Polchana1* Temdoung Somsiri1 Suriyan Soontornwit2 and Gary Nash3 1Inland Aquatic Animal Health Research Institute, Department of Fisheries

2Bangkok Fisheries Section, Department of Fisheries 3National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Science and Technology

Development Agency

Abstract

Taura Syndrome Virus (TSV) is the most important pathogen of farmed Pacific white shrimp, Penaeus vannamei. When a disease outbreak and losses occurred in the low salinity culture area, the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, was often stocked in the same ponds without removal of the infected/dead shrimp and without any water treatment. Studies to determine the susceptibility of M. rosenbergii to TSV were conducted by immersion, feeding or injection of TSV that extracted from infected P. vannamei from Nakornpathom province. M. rosenbergii were subsequently tested for TSV infection using RT-PCR. The results showed that TSV could survive in fresh water for up to five days. TSV was detected by RT-PCR in M. rosenbergii that have been infected by all three methods. However M.

rosenbergii were resistant to the virus as there were no distinctive histopathological changes detected and no significant mortalities occurred during the 15-day study period. There is a need to investigate the transmission of the TSV in P. vannamei using the RT-PCR positive M. rosenbergii. Finding from this study may suggest that the TSV can not spread or can be degraded by holding of the contaminated water from diseased ponds for at least 7 days.

Keywords: Macrobrachium rosenbergii, Taura Syndrome Virus, TSV

Chatuchuk, Bangkok, 10900 Tel. 0 2579 4122 e-mail : jareep@fisheries.go.th

2

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

คานา

กงกามกราม (Macrobrachium rosenbergii de Man, 1879) เปนสตวน9 าเศรษฐกจท6สาคญชนด

หน6งของประเทศไทย เน6องจากมราคาสงและเปนท6ตองการของตลาดท9งภายในและตางประเทศ กงชนดน9 มการเล9ยงกนอยางแพรหลายโดยเฉพาะในแถบภาคกลาง เชนจงหวดสพรรณบร พระนครศรอยธยา นครปฐม และราชบร เปนตน แตเม6อป พ.ศ. 2545 ไดมการนากงขาว (Pacific White Shrimp; Penaeus vannamei) ซ6 งเปนกงทะเลท6มถ6นฐานเดมอยในอเมรกากลางและอเมรกาใตเขามาเล9 ยงในประเทศไทย และสามารถเล9ยงในพ9นท6ความเคมต6าได เกษตรกรจงหนมาเล9ยงกงขาวกนมากข9น การนาเขากงขาวถงแมจะมหนงสอรบรองจากประเทศตนทางวาปลอดโรค แตกยงมเช9อ Taura Syndrome Virus (TSV) หลดรอดเขามา ประกอบกบกอนหนาน9 ไดมการลกลอบนาลกกงชนดน9 จากตางประเทศเขามามาก ซ6 งลกกงเหลาน9 ไมไดมการตรวจสอบวามเช9อไวรสตดมาดวยหรอไม ทาใหเกดการระบาดของโรคทอราซนโดรมในประเทศไทย

ทอราซนโดรม เปนโรคระบาดรนแรงชนดหน6งท6ตองรายงาน (Notifiable Disease) ตอองคกร โรคระบาดสตวระหวางประเทศ หรอ OIE โดยดวนในกรณตรวจพบคร9 งแรก โรคน9 เกดจากเช9อไวรสในครอบครว Picornaviridae มขนาดของอนภาคประมาณ 32 นาโนเมตร รปรางแบบ Icosahedral ไมม Envelope มสารพนธกรรมชนดอารเอนเอสายเด6ยว พบคร9 งแรกในกงขาวท6เล9ยงในประเทศเอกวาดอรเม6อป ค.ศ. 1992 (OIE, 2003) ทาใหผลผลตในประเทศลดลงถงรอยละ 30 (จาก 100,000 ตน) โดยกอใหเกดความสญเสยประมาณ 400 ลานเหรยญสหรฐฯ (Lightner, 1996a) เช9อ TSV ไดแพรกระจายไปอยางรวดเรวท9งในแถบอเมรกา และประเทศอ6น ๆ ท6เล9ยงกงขาว ซ6 งในป ค.ศ. 1993-1994 เช9อ TSV ไดสรางความเสยหายใหแกผลผลตกงขาวในทวปอเมรกาประมาณรอยละ 90 (132,000 ตน) หรอประมาณรอยละ 15-20 ของกงขาวท6วโลก (Rosenberry, 1993, 1995) กงขาวท6ไดรบผลกระทบจากเช9อ TSV สวนใหญเปนกงท6ปลอยลงบอเล9ยงไดประมาณ 25-60 วน อาการท6พบคอ กงมลาตวสชมพถงแดง ปลายแพนหางและขาวายน9ามสแดงเขม ลาตวออนนม มกวายน9าเขาหาขอบบอ ความรนแรงของเช9อ TSV ในบอเล9ยงทาใหกงตายประมาณ 50-80 เปอรเซนต การศกษาทางพยาธสภาพของเน9อเย6อพบวากงขาวท6ปวยเปนโรคทอราซนโดรมเกดการตายของเซลลหรอกลมเซลลท6เย6อบผวลาตว ระยางค เหงอก ลาไส กระเพาะ และทางเดนอาหารสวนตน (Brock et

al., 1995; Lightner, 1996b) กงท6รอดตายแมหายจากอาการปวยแตยงเปนพาหะนาโรคตอไปได (Brock, 1995) สภาพการเล9ยงกงขาวในเขตพ9นท6ความเคมต6าในปจจบน เม6อเกดปญหาการระบาดของโรค เกษตรกรบางรายจะเปล6ยนมาเล9ยงกงกามกรามแทนหรอมการเปล6ยนถายน9าโดยท6ไมไดบาบดฆาเช9อแตอยางใด การปฏบตเชนน9อาจทาใหเกดการแพรกระจายของเช9อ TSV ได ดงน9นจงควรศกษาถงความเปนไปไดในถายทอดเช9อ TSV ท6ปนเป9 อนอยในน9าหรอในซากกงขาวปวยไปสกงกามกรามท6เล9ยงในพ9นท6ใกลเคยง เพ6อจะไดหาแนวทางปองกนไมใหกงพ9นเมองของไทยไดรบผลกระทบจากเช9อไวรสชนดน9 ตอไป

3

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

วตถประสงค

1. ศกษาระยะเวลาการคงสภาพของเช9อ TSV ในน9าจด 2. ศกษาการถายทอดเช9อ TSV จากกงขาวปวยไปสกงกามกราม

วธดาเนนการ

1. การเตรยมเช/อ TSV

รวบรวมตวอยางกงขาวปวยท6มอาการของโรคทอราซนโดรมจากฟารมเล9 ยงกงในจงหวด

นครปฐมมาทดสอบยนยนการตดเช9อ TSV ดวยเทคนค Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) รวมท9งทดสอบวาเปนกงท6ปลอดจากเช9อ White Spot Syndrome Virus (WSSV), Yellow Head Virus (YHV) และ Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) หลงจากน9นจงแยกเช9อ TSV จากกงปวยโดยใชสวนของเน9อเย6อใตเปลอก เหงอก ขาวายน9า และลมฟอยดออรแกน มาบดใน TN-Buffer (0.02 M Tris-HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4) อตราสวน 1: 20 แลวนามาป6นท6ความเรว 1,000 x g เปนระยะเวลา 15 นาท นาสวนใสมากรองผานกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมครอน นาของเหลวท6ผานการกรองไปฉดกลบเขากลามเน9อของกงขาวปกต เพ6อเพ6มจานวนไวรส แลวนามาแยกเช9อไวรสตามวธดงกลาว นาสารละลายเช9อท6กรองไดมาแบงใสหลอดทดลองขนาดเลก เกบไวท6อณหภม –80 องศาเซลเซยส เพ6อใชในการทดลองข9นตอไป

2. การศกษาขนาดและรปรางอนภาคของเช/อ TSV

นาสารละลายเช9อท6เตรยมไวในขอ 1 มาป6นท6ความเรว 100,000 x g นาน 1 ช6วโมง ละลายตะกอนไวรสดวยสารละลาย Phosphate Buffer Saline (PBS) เพ6อนาไปศกษาขนาดและรปรางอนภาคของเช9อไวรสดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนชนดสองผาน (Transmission Electron Microscope; TEM)

3. การศกษาการถายทอดเช/อ TSV จากกงขาวไปยงกงกามกราม

3.1 การศกษาระยะเวลาการคงสภาพของเช9อ TSV ในน9 าจดและการถายทอดเช9อไปสกง

กามกรามโดยวธการแช นาสารละลายเช9อ TSV ท6เตรยมไวในขอ 1 มาเตมลงในตกระจกท6บรรจน9 า 10 ลตร ใหไดความ

เขมขนสดทาย 1: 10,000 พกไวเปนระยะเวลาตาง ๆ กนคอ 0, 1, 3, 5, 7 และ 14 วน แลวจงนาลกกงกามกราม

4

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

คว 6าแลว อาย 37 วนมาใสตละ 75 ตว ชดการทดลองละ 3 ซ9 า หลงจากน9น 2 วน แยกลกกงแตละตออกมาตละ 25 ตว นาไปเล9ยงในตใหมเพ6อใชศกษาการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพ และทดสอบเช9อ TSV ดวยเทคนค RT-PCR สวนลกกงท6เหลอ 50 ตว ในตเดมใชสาหรบศกษาอตราการตายในระยะเวลา 15 วน ใหอากาศตลอดเวลา และใหอาหารผงสาเรจรปสาหรบกงกามกรามตลอดระยะเวลาการทดลอง

- การศกษาพยาธสภาพของเน9อเย6อ สมตวอยางลกกงจากทกชดการทดลอง การทดลองละ 3 ซ9 า ตามท6กลาวมาแลวซ9 า

ละ 5 ตว ดองในน9 ายา Davidson อตราสวน 1:20 ข9นไป เปนระยะเวลา 24 ช6วโมง แลวเปล6ยนน9 ายาเปน Ethanol 70 เปอรเซนต เปนระยะเวลาอยางนอย 24 ช6วโมง หลงจากน9นจงนาตวอยางลกกงไปผานขบวนการ Embedding ในพาราฟน และตดดวย Microtome ใหเน9อเย6อมความหนาประมาณ 5 ไมครอน แลวยอมดวยส Hematoxylin และ Eosin และศกษาพยาธสภาพของเน9อเย6อภายใตกลองจลทรรศน

- การตรวจสอบเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR สมตวอยางลกกงจากทกชดการทดลอง การทดลองละ 3 ซ9 า ๆ ละ 10 ตว เพ6อตรวจสอบเช9อ TSV ดวยเทคนค RT-PCR (IQ2000TM TSV Detection and Prevention System Kit) โดยนาตวอยางลกกงมาลางดวยน9ากล6นประมาณ 15 มลลลตร ในหลอดทดลอง จากน9นจงนามาสกดอารเอนเอ และทาปฏกรยา RT-PCR แลวตรวจสอบผลผลต PCR ใน Agarose Gel 1.5 เปอรเซนต ซ6 งช9นสวนยนของเช9อ TSV ท6เพ6มจานวนโดยใชชดตรวจสอบน9 มขนาด 284 bp

3.2 การศกษาการถายทอดเช9อ TSV ไปสกงกามกรามโดยวธการกน 3.2.1 การศกษาในลกกงกามกราม นาลกกงกามกรามอายประมาณ 45 วน มาเล9ยงในตกระจกท6บรรจน9า 15 ลตร ตละ

75 ตว ชดการทดลองละ 3 ซ9 า ทดลองใหกนเน9อกงขาวท6ถกทาใหปวยเปนโรคทอราซนโดรมสบละเอยดปรมาณตางกนคอ 1 และ 3 ม9อ ม9อละประมาณ 0.5 กรมหลงจากน9นแยกลกกงแตละตออกมาตละ 25 ตว นาไปเล9ยงในตใหมเพ6อใชศกษาการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพจานวน 5 ตว และตรวจสอบเช9อ TSV ดวยเทคนค RT-PCR จานวน 10 ตว สวนลกกงท6เหลอ 50 ตวในตเดมใชสาหรบศกษาอตราการตายในระยะเวลา 15 วน โดยใหอาหารผงสาเรจรปสาหรบกงกามกรามตอไปตลอดระยะเวลาการทดลอง และใหอากาศตลอดเวลา สาหรบชดควบคมใหอาหารผงสาเรจรปตลอดระยะเวลาการทดลอง

3.2.2 การศกษาในกงกามกรามขนาดใหญ นากงกามกรามขนาดประมาณ 35 กรม อายประมาณ 6 เดอน มาเล9 ยงในตกระจก

ท6บรรจน9 า 150 ลตร ตละ 15 ตว ชดการทดลองละ 3 ซ9 า ทดลองใหกนเน9อกงขาวท6ปวยเปนโรคทอรา ซนโดรมสบละเอยดปรมาณตางกน คอ 1 และ 3 ม9อ ม9อละประมาณ 15 กรม หลงจากน9นแยกกงแตละตออกมาตละ 5 ตว นาไปเล9 ยงในตใหมเพ6อใชศกษาการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพจานวน 2 ตว และตรวจสอบเช9อ TSV ดวยเทคนค RT-PCR โดยตดเหงอกกงท9ง 5 ตว มารวมกนใหมน9 าหนกประมาณ 50 มลลกรม สวนกงท6เหลอ 10 ตวในตเดมจะใชสาหรบศกษาอตราการตายเปนระยะเวลา 15 วน โดยให

5

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

อาหารเมดสาเรจรปสาหรบกงกามกรามตอไปตลอดระยะเวลาการทดลอง และมการใหอากาศตลอดเวลา สาหรบชดควบคมใหอาหารเมดสาเรจรปตลอดระยะเวลาการทดลอง

3.3 การศกษาการถายทอดเช9อ TSV ไปสกงกามกรามโดยวธการฉด นากงกามกรามขนาดประมาณ 35 กรม มาเล9 ยงในตกระจกท6บรรจน9 า 150 ลตร ตละ 15 ตว ฉด

สารละลายเช9อ TSV ท6สกดไวในขอ 1 เขากลามเน9อระหวางขาวายน9 าคท6 2 และ 3 ตวละ 0.1 มลลลตร สมตวอยางมาศกษาการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพ และตรวจสอบเช9อ TSV ดวยเทคนค RT-PCR พรอมท9งสงเกตอาการผดปกตและบนทกอตราการตายของกงในระยะเวลา 15 วน ซ6 งแตละชดการทดลองแบงออกเปน 3 ซ9 า ใหอากาศตลอดเวลา สาหรบชดควบคมฉดดวย TN-Buffer ในปรมาณเทากน

ผลการศกษา

1. การศกษาขนาดและรปรางอนภาคของเช/อ TSV

สารละลายเช9อ TSV ท6ใหผลบวกเม6อทดสอบดวยเทคนค RT-PCR เม6อนาไปศกษาขนาดและรปรางอนภาคของเช9อไวรส พบวา เปนไวรสท6มรปรางแบบ Icosahedron ขนาดเสนผานศนยกลางของอนภาคประมาณ 32 นาโนเมตร ดงแสดงในภาพท6 1

2. การศกษาการถายทอดเช/อ TSV จากกงขาวไปยงกงกามกราม

2.1 การศกษาระยะเวลาการคงสภาพของเช9อ TSV ในน9าจดและการถายทอดเช9อไปสกง กามกรามโดยวธการแช

หลงจากนาสารละลายเช9อ TSV ท6สกดไดจากกงขาวปวยมาเตมลงในน9 าในระยะเวลาตาง ๆ กน แลวจงนาลกกงมาเล9 ยง พบวาเช9อ TSV สามารถคงสภาพอยในน9 าจดไดนานถง 5 วนโดยสามารถตรวจพบเช9อเม6อทดสอบดวยเทคนค RT-PCR สวนลกกงท6เล9 ยงในน9 าท6เตมเช9อ TSV ไวลวงหนาเปนระยะเวลา 7 วนข9นไปรวมท9งชดควบคมผลการตรวจไมพบเช9อไวรส เม6อศกษาอตราการตายสะสมเปนระยะเวลา 15 วน และลกษณะทางพยาธสภาพของเน9อเย6อลกกงกามกรามท6แชในน9าท6เตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลานานตาง ๆ กน เม6อเปรยบเทยบอตราการตายของลกกงกลมทดลองกบกลมควบคมแลวพบวาไมมความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญ ดงแสดงในตารางท6 1 และไมพบการเปล6ยนแปลงของเน9อเย6ออนเน6องมาจากการทาลายของเช9อ TSV

6

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาพท� 1 ลกษณะอนภาคของเช9อ TSV ท6แยกจากกงขาวปวย เม6อตรวจดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอน

ก ข

2.2 การศกษาการถายทอดเช9อ TSV ไปสกงกามกรามโดยการกนซากกงขาวปวย และการฉดเช9อ TSV ท6สกดจากกงขาวปวย

การศกษาการถายทอดเช9อ TSV ไปสกงกามกรามท9งโดยวธใหกนเน9อกงขาวปวย และการฉดดวยเช9อท6สกดจากกงขาวปวย พบวาท9งในลกกงและกงขนาดใหญเม6อใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม เพยง 1 ม9อ จะตรวจพบเช9อโดยเทคนค RT-PCR เพยง 1 ใน 3 ซ9 าเทาน9น แตเม6อใหกนเพ6มข9นเปน 3 ม9อพบวาท9งลกกงและกงขนาดใหญมการตรวจพบเช9อท9ง 3 ซ9 า อยางไรกดกงทดลองทกชดไมไดแสดงอาการ

ภาพท� 2 พยาธสภาพของเน9อเย6อลกกงกามกรามแชเช9อ TSV ( ก = เหงอก; ข = ขาวายน9 า)

7

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ของโรคทอราซนโดรมตลอดระยะเวลาท6ทาการทดลอง 15 วน อกท9งผลการตรวจทางพยาธวทยาไมพบการเปล6ยนแปลงของเน9อเย6ออนเกดจากการทาลายของเช9อ TSV และอตราการตายของกงทดลองเม6อเปรยบเทยบกบกลมควบคมแลวพบวาไมมความแตกตางกนทางสถตอยางมนยสาคญ ดงแสดงในตารางท6 2, 3 และ 4 ตารางท� 1 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6ม การเตมเช9อ TSV ลวงหนานานตาง ๆ กน

ระยะเวลาเตมเช9อลวงหนา (วน) จานวนซ9 าท6ตรวจพบเช9อ อตราการตายเฉล6ย (%) + คาเบ6ยงเบนมาตรฐาน

0 3/3 60.00 + 5.29

1 3/3 62.66 + 5.03

3 3/3 62.00 + 2.00

5 2/3 55.33 + 5.03

7 0/3 63.33 + 5.03

14 0/3 62.00 + 5.29

ชดควบคม 0/3 60.00 + 4.00

ตารางท� 2 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในลกกงกามกรามท6ทดลองใหกน เน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

จานวนม9อท6ไดรบ จานวนซ9 าท6ตรวจพบเช9อ อตราการตายเฉล6ย (%) + คาเบ6ยงเบนมาตรฐาน

1 1/3 52.00 + 6.92

3 3/3 49.33 + 4.61

ชดควบคม 0/3 50.00 + 10.00

ตารางท� 3 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในกงกามกรามขนาดใหญท6 ทดลองใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม

จานวนม9อท6ไดรบ จานวนซ9 าท6ตรวจพบเช9อ อตราการตายเฉล6ย (%) + คาเบ6ยงเบนมาตรฐาน

1 1/3 13.33 + 11.54

3 3/3 13.33 + 5.77

ชดควบคม 0/3 10.00 + 10.00

8

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ตารางท� 4 อตราการตายและผลการตรวจเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR ในกงกามกรามท6ฉดดวยเช9อ TSV

กลมทดลอง จานวนซ9 าท6ตรวจพบเช9อ อตราการตายเฉล6ย (%) +คาเบ6ยงเบนมาตรฐาน

ฉดดวยเช9อ TSV 3/3 13.33 + 11.54

ฉดดวย TN-Buffer (ชดควบคม) 0/3 16.66 + 5.77

สรปและวจารณผล

TSV สามารถกอใหเกดการตดเช9อในกงหลายชนดท9งในสภาพธรรมชาต ไดแก P. vannamei,

P. stylirostris และ P. setiferus และในระบบการทดลอง ไดแก P. aztecus, P. chinensis, P . duorarum, และ P. setiferus โดยเช9อชนดน9สามารถทาใหเกดการตายในกง P. vannamei, P. setiferus และ P. chinensis สวนกง P. aztecus และ P. duorarum ถงแมไมแสดงอาการปวยหรอตายหลงจากไดรบเช9อ แตพบวากงเหลาน9สามารถเปนพาหะนาโรคทอราซนโดรมได (Lightner, 1996b; Overstreet et al., 1997) สาหรบการศกษาในกงกามกรามคร9 งน9 ไดทดลองนาเช9อ TSV ซ6 งยนยนแลววาเปนอนภาคไวรสท6มรปรางแบบ Icosahedron ขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 32 นาโนเมตร เชนเดยวกบการศกษาของ Brock et al. (1997) มาเตมลงในน9าเปนระยะเวลาตาง ๆ กนกอนท6จะนาลกกงกามกรามมาเล9ยง แลวตรวจสอบเช9อโดยเทคนค RT-PCR พบวากงจากชดการทดลองท6เตมเช9อไวเปนระยะเวลา 5 วน ยงใหผลเปนบวก แสดงวาเช9อ TSV มแนวโนมท6จะคงสภาพอยในน9 าจดโดยไมมเจาบานและคงความสามารถในการถายทอดเช9อไดนานเปนระยะเวลา 5 วน ถงแมวาการศกษาคร9 งน9 เปนการทดลองในตกระจก ซ6 งมปจจยตาง ๆ แตกตางจากสภาพในบอเล9 ยงจรง แตจากผลการทดลองเบ9องตน เกษตรกรผเล9 ยงกงไมควรระบายน9 าออกจากบอท6กงเปนโรคโดยตรง ควรกกเกบน9 าไวเปนเวลาไมนอยกวา 7 วน หรอทาการฆาเช9อโดยใชสารเคม เชน แคลเซยมไฮโปคลอไรท กอนระบายท9ง

การศกษาการถายทอดเช9อ TSV ไปสกงกามกรามท9งโดยวธการใหกนเน9อกงขาวท6ปวยเปนโรคทอราซนโดรม การแช และการฉดดวยเช9อ TSV ท6สกดจากกงขาวปวย เม6อตรวจสอบเช9อไวรสดวยเทคนค RT-PCR พบวาไดผลเปนบวกท9งในลกกงกามกรามและกงกามกรามขนาดใหญ แตเช9อ TSV ไมสามารถทาใหกงกามกรามเปนโรค เพราะไมพบการเปล6ยนแปลงทางพยาธสภาพของเน9อเย6อ และไมพบอตราการตายท6แตกตางจากชดควบคม ท6เปนเชนน9อาจเน6องมาจากการตรวจโรคโดยเทคนค RT-PCR เปนการตรวจสอบยนของเช9อเทาน9น และการตรวจสอบโดยเทคนคน9 มความไวสงกวาการตรวจสอบทางพยาธสภาพของเน9อเย6อมาก ซ6 งหากจานวนเช9อ TSV ในตวกงมนอย หรอกงกามกรามสามารถตานทานไวรสชนดน9 ได ทาใหตรวจไมพบการเปล6ยนแปลงของเน9อเย6อกงกามกราม จากผลการทดลองยงไมสามารถบงช9 ไดวาเช9อ TSV ท6ตรวจพบโดยเทคนค RT-PCR ท6ฝงตวอยในกงกามกรามน9น อยในสภาพเปนเช9อไวรสท6สมบรณหรอเปนซากยนของเช9อไวรสท6หมดสภาพในการกอโรคแลว แตจากการศกษาของ Nunan et al. (1998) พบวากง

9

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

P. stylirostris ท6ไดรบการฉดเช9อ TSV เม6อทาการตรวจสอบเช9อโดยเทคนค RT-PCR แลวใหผลเปนบวก ในขณะท6การตรวจสอบทางพยาธสภาพของเน9อเย6อ และ in situ Hybridization ใหผลลบ แตเม6อตรวจสอบดวยวธชววเคราะห (Bioassay) แลวพบวากง P. stylirostris สามารถเปนพาหะนาโรคไปสกงขาวได ดงน9นควรมการทดสอบเพ6อพสจนวาตวอยางกงกามกรามท6พบเช9อ TSV โดยเทคนค RT-PCR น9นยงคงตดเช9อไวรสท6สมบรณและมความสามารถในการแพรเช9อไปสกงขาวไดหรอไมโดยวธชววเคราะห เพ6อเปนขอมลทางดานระบาดวทยาของเช9อ TSV และการควบคมโรคตอไป

คาขอบคณ

ผวจยขอขอบคณ ดร.พรเลศ จนทรรชชกล ท6ไดใหคาปรกษาแนะนาในการศกษาวจยในคร9 งน9

10

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

เอกสารอางอง

Brock, J.A. 1995. A historical perspective on the etiology of Taura syndrome: from the toxic to the infectious hypotheses. In: Abstracts III Congreso Ecuatoriano de Acuicultura. 25 October – 1 November 1995. Guayaquil, Ecuador. 20 pp. Brock, J.A., R.B. Gose, D.V. Lightner and K. Hasson. 1995. An overview on taura syndrome, an important

disease of farmed Penaeus vannamei. In: Browdy, C.L. and J.S. Hopkins (eds) Swimming through Troubled Waters, Proceeding of the Special Session on Shrimp Farming, Aquaculture’95. World Aquaculture Society, Baton Rouge. p. 84-94.

Brock, J.A., R.B. Gose, D.V. Lightner and K. Hasson. 1997. Recent developments and an overview of taura syndrome of farmed shrimp in the Americas. In: Flegel, T.W. and I.H. MacRae (eds) Diseases in Asian Aquaculture III. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila. p. 275-283.

Lightner, D.V. 1996a. Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas. Revue cientifique et Technique Office International des Epizooties 15(2): 579-601.

Lightner, D.V. 1996b. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA. 304 pp.

Nunan, L.M., B.T. Poulos and D.V. Lightner. 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR) used for the detection of Taura syndrome virus (TSV) in experimentally infected shrimp. Dis. Aquat. Org. 34: 87-91.

Office International des Epizooties (OIE). 2003. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Paris, France. 358 pp.

Overstreet, R.M., D.V. Lightner, K.W. Hasson, S. McIlwain and J.M. Lotz. 1997. Susceptibility to taura syndrome virus of some penaeid shrimp species native to the Gulf of Mexico and the Southeastern United States. J. Invertebr. Pathol. 69(2): 165-176.

Rosenberry, B. 1993. Taura syndrome hits farm in Ecuador again. Shrimp News International. 18(3): 6. Rosenberry, B. 1995. Ecuadorian white shrimp prices January to November 1994. Shrimp News

International. 20(1): 24.

11

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาคผนวก

ภาพผนวกท� 1.1 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในลกกงกามกรามท6เล9ยง ในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลาตาง ๆ กน 1 : Molecular marker 2 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 0 วน ซ9 าท6 1 3 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 0 วน ซ9 าท6 2 4 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 0 วน ซ9 าท6 3 5 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 1 วน ซ9 าท6 1 6 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 1 วน ซ9 าท6 2 7 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 1 วน ซ9 าท6 3 8 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 3 วน ซ9 าท6 1 9 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 3 วน ซ9 าท6 2 10 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 3 วน ซ9 าท6 3 11 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 5 วน ซ9 าท6 1 12 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 5 วน ซ9 าท6 2 13 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 5 วน ซ9 าท6 3 14 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 7 วน ซ9 าท6 1 15 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 7 วน ซ9 าท6 2 16 : Negative control 17 : Positive control

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

333 bp

284 bp

630 bp

848 bp

12

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาพผนวกท� 1.2 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในลกกงกามกรามท6เล9ยง ในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา ตาง ๆ กน 1 : Molecular marker 2 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 7 วน ซ9 าท6 3 3 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 14 วน ซ9 าท6 1 4 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 14 วน ซ9 าท6 2 5 : ลกกงกามกรามท6เล9ยงในน9าท6มการเตมเช9อ TSV ลวงหนาเปนระยะเวลา 14 วน ซ9 าท6 3 6 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 1 7 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 2 8 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 3 9 : Negative control 10 : Positive control

630 bp

333 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

284 bp

848 bp

13

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาพผนวกท� 2 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในลกกงกามกรามท6ใหกน เน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม 1 : Molecular marker 2 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 1 3 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 2 4 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 3 5 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 1 6 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 2 7 : ลกกงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 3 8 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 1 9 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 2 10 : ลกกงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 3 11 : Negative control 12 : Positive control

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

333 bp

284 bp

630 bp

848 bp

14

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาพผนวกท� 3 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในกงกามกรามขนาดใหญท6 ใหกนเน9อกงขาวปวยเปนโรคทอราซนโดรม 1 : Molecular marker 2 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 1 3 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 2 4 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 1 ม9อ ซ9 าท6 3 5 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 1 6 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 2 7 : กงกามกรามท6ใหกนเน9อกงขาวปวย จานวน 3 ม9อ ซ9 าท6 3 8 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 1 9 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 2 10 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 3 11 : Negative control 12 : Positive control

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

284 bp

333 bp

630 bp 848 bp

15

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด

ภาพผนวกท� 4 ผลการตรวจเช9อ TSV โดยวธ RT-PCR ดวย 1.5 % Agarose ในกงกามกรามท6ฉดดวยเช9อ TSV 1 : Molecular marker 2 : กงกามกรามท6ฉดเช9อ TSV ซ9 าท6 1 3 : กงกามกรามท6ฉดเช9อ TSV ซ9 าท6 2 4 : กงกามกรามท6ฉดเช9อ TSV ซ9 าท6 3 5 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 1 6 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 2 7 : กงกามกรามชดควบคม ซ9 าท6 3 8 : Positive control 9 : Negative control

1 2 3 4 5 6 7 8 9

333 bp

284 bp

630 bp 848 bp

16

สานกวจยและพฒ

นาประมงน�าจด