รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์ · 2018-10-31 · รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์. ฤทธิ์ของสารสกัดจากสมุนไพรในการต้านโรคซึมเศร้า:

รายงานการวจยฉบบสมบรณ

ฤทธของสารสกดจากสมนไพรในการตานโรคซมเศรา: กลไกในระดบโมเลกลผานตวขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนชนดตางๆ

Antidepressant effect of medicinal herbal extracts: molecular

mechanism via various monoamine neurotransmitter

ransporters

โดย

ผศ. ดร. เทวน เทนค าเนาว และคณะ

ไดรบทนอดหนนการวจยจากทนงบประมาณแผนดน 2557 (ปท 2)

กตตกรรมประกาศ

ความส าเรจของโครงการวจยน เกดขนได เพราะคณะผวจยไดรบทนอดหนนการวจยจาก

ทนงบประมาณแผนดน ป 2557 (ปท 2) นอกจากน คณะผวจย ยงไดรบการสนบสนนดานวสด

อปกรณ ครภณฑวจย และอาคารสถานทท าวจย จากคณะสหเวชศาสตร จฬาลงกรณ

มหาวทยาลย

คณะผ วจย ขอขอบพระคณหลกสตรวทยาศาสตรบณฑต สาขาวชาเทคนคการแพทย

หลกสตรบณฑตศกษา สาขาวชาชวเคมคลนกและอณทางการแพทย ทเปนองคประกอบส าคญใน

การผลกดนใหการด าเนนโครงการวจยน ส าเรจลลวงอยางมประสทธภาพ โครงการพฒนาศนย

ความเปนเลศดานโอมกส-นาโน เมดคล เทคโนโลย (Center for Excellence in Omics-Nano

Medical Technology Project) และโครงการศนยนวตกรรมเพอการวจยและพฒนาเทคโนโลย

วนจฉย ทางหองปฏบตการทางการแพทย ทกรณาเออเฟอใหใชเครองมอในการวจย สดทายน

ขอขอบพระคณฝายวจยคณะสหเวชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ทสนบสนนใหการด าเนน

โครงนประสบความส าเรจ และเปนรากฐานส าหรบโครงการตอไป ในศาสตรทเกยวของกบการ

ประยกตใชสารสกดจากสมนไพรไทยส าหรบงานวจยในสาขาประสาทวทยาศาสตร

ii

ชอโครงการวจย

ฤทธของสารสกดจากสมนไพรในการตานโรคซมเศรา: กลไกในระดบโมเลกลผานตวขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนชนดตางๆ

Antidepressant effect of medicinal herbal extracts: molecular mechanism via various

monoamine neurotransmitter transporters

ชอคณะผวจย

หวหนาโครงการ ผชวยศาสตราจารย ดร. เทวน เทนค าเนาว

ภาควชาเคมคลนก คณะสหเวชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

โทรศพท 02-2181081 ตอ 313 โทรสาร 02-2181082

นสตชวยงานวจย 1. นสตหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาชวเคมคลนกและอณ

ทางการแพทย คณะสหเวชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ไดแก

นางสาววาลกา พลายงาม

นางสาววราพร รกขตะวฒนา

นางสาวอญชล ประสารสขลาภ

2. นสตหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาชวเคมคลนกและอณ

ทางการแพทย คณะสหเวชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ไดแก

นางสาวลกขกา ธเนศผาตสข

ไดรบทนอดหนนการวจย ประจ าป 2557 จ านวนเงน 1,800,000 บาท

ระยะเวลาการท าวจย 1.5 ป ตงแต 1 ตลาคม 2556 ถง 31 มนาคม 2558

iii

บทคดยอ

โรคซมเศราเปนโรคทเกดจากพหปจจย รวมไปถงความผดปกตของระบบประสาท

โมโนเอมเนอรจก ในปจจบน โรคซมเศราเปนปญหาสาธารณสขทงในประเทศไทย และระดบโลก

สงผลมหาศาลตอคณภาพชวตของผ ปวย และครอบครว โดยผ ปวยตองกนยาตานโรคซมเศราเปน

ระยะเวลานาน ซงนอกจากมราคาแพงแลว ยงมผลขางเคยงของยา และมสทธภาพไมดนก

ดงนน คณะผวจยจงศกษาหาสารตานโรคซมเศราชนดใหม ทใหผลขางเคยงต า มประสทธภาพสง

และราคาไมแพง ทงน ไดศกษากลไกการออกฤทธของสารสกดสมนไพร ไดแก ใบสะระแหน

(Mentha cordifolia Opiz ex Fresen) ใบขเหลก (Senna siamea (Lam.)) และบวบก (Centella

asiatica (L.)) ทสกดดวยสารละลายเอทานอล และน า ตอการตานโรคซมเศราโดยใชเซลล

ประสาทเพาะเลยงชนด LAN-5 เปนแบบในการทดลอง โดยมงวเคราะหผลของสารสกดตอสอง

กลไก คอ การแสดงออกของยน hDAT, hSERT และ hNET ในระดบ mRNA โดยใชเทคนค

RT-PCR และการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน โดพามน และ

นอรอพเนฟรน โดยใชเทคนค uptake assay ดวยชดน ายา Neurotransmitter transporter

uptake assay kit และใชยาตานโรคซมเศรา fluoxetine, desipramine และ GBR12935 เปนยา

อางองในการทดสอบ นอกจากนยงทดสอบความเปนพษของสารสกดสมนไพรตอเซลลประสาท

เพาะเลยง LAN-5 โดยใชเทคนค MTT assay จากการศกษาพบวา สารสกดสมนไพรทง 3 ชนด

ทงทสกดดวยเอทานอล และน า มฤทธยบยงการแสดงออกของยน hSERT, hDAT และ hNET

ไดในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 อยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) สารสกดใบสะระแหน

มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน และซโรโทนนไดอยางม

นยส าคญทางสถต (P<0.05) โดยสารสกดสมนไพรทศกษาน ไมมความเปนพษตอเซลลประสาท

เพาะเลยง LAN-5 นอกจากน คณะผวจย ไดพฒนาเทคนค HPLC เพอวเคราะหหาปรมาณของ

สารสอประสาทชนดโมโนเอมน ในสมองหนสวน hippocampus เพอศกษาผลของสารสกดจาก

เหงากระชายด าและจนทนเทศ

iv

Abstract

Major depressive disorder (MDD) is a multifactorial disease including the abnormalities of monoaminergic neuronal system. At present, MDD is a public health problem nationwide and worldwide, which enormously leads to the quality of life of patients and their families. MDD patients have to be treated for a long period using anti-depressants, which are not only expensive, but cause unfavorable side effects and ineffective. Therefore, our research group has attempted to study potential anti-depressants with low side effects, high efficiency and reasonable price. In this study, we investigated the mechanisms of action of medicinal extracts, leaves of Mentha cordifolia Opiz ex Fresen and Senna siamea (Lam.) and whole plants of Centella asiatica (Lam.), using LAN-5 neuroblastoma cell line as a model. Extractions were done using ethanol and water. We focused our study on inhibitory effects of herb extracts on two mechanisms, mRNA expression of human dopamine transporter (hDAT), human serotonin transporter (hSERT) and human norepinephrine transporter (hNET) and activity of all three neurotransmitter transporters by uptake assay using neurotransmitter transporter uptake assay kit with the utilization of fluoxetine, desipramine and GBR12935 as the reference drugs. In addition, MTT assay was employed for toxicity study. We discovered that all of the extracts significantly reduced the expression of hDAT, hSERT and hNET genes in LAN-5 (P<0.05). The extract derived from M. cordifolia significantly inhibited the activity of DAT and SERT in LAN-5 (P<0.05) and all of extracts were not toxic to LAN-5. In addition, we developed the HPLC approach to measure the levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of Sprague Dawley rats orally aministed the extracts derived from Kaempferia parviflora) and Myristica fragrans for 2 weeks daily.

v

สารบญเรอง

หนา

กตตกรรมประกาศ...................................................................................................... ii

บทคดยอภาษาไทย………………………………………………………………………… iv

บทคดยอภาษาองกฤษ................................................................................................ v

สารบญเรอง................................................................................................................ vi

สารบญตาราง............................................................................................................ xi

สารบญภาพ............................................................................................................... xii

บทท 1 บทน า 1

1.1 ความเปนมาและความส าคญของปญหา 1

1.2 วตถประสงค 2

1.3 ขอบเขตของงานวจย 2

1.4 ขอจ ากดของการวจย 3

1.5 ประโยชนทคาดวาจะไดรบจากการวจย 3

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ 4

2.1 โรคซมเศรา 4

2.2 ลกษณะอาการของโรคซมเศรา 4

vi

หนา

2.3 สาเหตของโรคซมเศรา 5

2.3.1 สาเหตทางดานพนธกรรม 5

2.3.2 สาเหตจากความผดปกตของสารชวเคมภายในรางกาย 6

2.3.3 สาเหตจากสงคม และสภาวะแวดลอม 6

2.3.4 สาเหตอนๆทท าใหเกดโรคซมเศรา 7

2.4 การวนจฉยโรคซมเศรา 7

2.5 การรกษาโรคซมเศรา 9

2.6 สารสอประสาทชนดโมโนเอมน 11

2.6.1 ซโรโทนน 12

2.6.2 โดพามน 14

2.6.3 นอรอพเนฟรน 17

2.7 โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน 19

2.7.1 โปรตนขนสงสารสอประสาทซโรโทนน 22

2.7.2 โปรตนขนสงสารสอประสาทโดพามน 22

2.7.3 โปรตนขนสงสารสอประสาทนอรอพเนฟรน 22

2.8 สมนไพรทใชในงานวจย 23

2.8.1 สะระแหน 25

2.8.2 บวบก 26

vii

หนา

2.8.3 ขเหลก 27

บทท 3 วธด าเนนการวจย 28

3.1 เครองมอ อปกรณ และสารเคมทใชในการทดลอง 28

3.2 กลมตวอยางทเกยวของในงานวจย 34

3.2.1 ตวอยางเซลลเพาะเลยง 34

3.2.2 ตวอยางของสมนไพร 35

3.2.3 ตวอยางของยาตานโรคซมเศรา 35

3.3 การเตรยมสารสกดสมนไพรและสารละลายยาตานโรคซมเศราทใชในการศกษา

วจย 36

3.3.1 การสกดสมนไพรดวยตวท าละลายเอทานอลโดยวธมาเซอเรชน 36

3.3.2 การสกดสมนไพรดวยตวท าละลายน าโดยวธตม 36

3.3.3 การเตรยมยาตานโรคซมเศรา 37

3.4 การทดสอบฤทธทางชวภาพในการตานโรคซมเศราของสารสกดจากสมนไพร 37

3.4.1 การทดสอบความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ของ

สารสกดจากสมนไพร และยาตานโรคซมเศราดวยวธ MTT assay 37

3.4.2 การทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการแสดงออก ในระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ดวยวธ Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) 38

3.4.3 การทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศราทมผลตอ

viii

หนา

อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโดพามน, นอรอพเนฟรน และซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดยใชชด น ายา Neurotransmitter transporter uptake assay kit..............................44

3.4.4 การทดสอบความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ของสาร ทดสอบทใชในการทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาท

โดพามน, นอรอพเนฟรนและ ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5

ดวยวธ MTT Assay 45

3.5 การรวบรวมและวเคราะหขอมล 48 บทท 4 ผลการวจย 49

4.1 ผลการพสจนชนดของสมนไพร 49

4.2 ผลการสกดสมนไพรดวยเอทานอลโดยวธมาเซอเรชน 49

4.3 ผลการสกดสมนไพรดวยน าโดยวธการตม 49

4.4 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ของสารสกด

จากสมนไพร และยาตานโรคซมเศราดวยวธ MTT assay 50

4.5 ผลการทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการแสดงออก ในระดบ mRNA ของ ยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ดวยวธ Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) 55

4.6 ผลการทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศรา ทมผลตออตรา

การท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโดพามน, นอรอพเนฟรน และ

ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดยใชชดน ายา Neurotransmitter transporters uptake assay kit…………………………………………………..60

ix

หนา

4.7 ผลการทดสอบวดความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ของสาร

ทดสอบทใชในการทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาท

โดพามน, นอรอพเนฟรนและ ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5

ดวยวธ MTT Assay 70

4.8 ผลของสารสกดจากเหงากระชายด า (Kaempferia parviflora) และลกจนทนเทศ (Myristica fragrans) ตอระดบของ monoamine neurotransmitters ในสมอง หนสวน hippocampus………………………………….…………………..……….75

บทท 5 สรป อภปราย และวจารณผลการทดลอง 78

5.1 สรปผลการวจย และอภปรายผลการวจย 78

5.2 สรป และขอเสนอแนะ 83

รายการอางอง 84

ภาคผนวก 96

ประวตหวหนาโครงการวจย..................................................................................................100

x

สารบญตาราง

หนา

ตารางท 3.1 ขนตอนการเตมน ายาเพอก าจดดเอนเอปนเปอนออกจากตวอยางอารเอนเอ 40

ตารางท 3.2 ขนตอนการเตมน ายาเพอสราง cDNA จากอารเอนเอ 41

ตารางท 3.3 ขนตอนการเตมน ายาเพอเพมจ านวนชนสวนดเอนเอของยนทสนใจศกษา 42

ตารางท 3.4 Primers จ าเพาะส าหรบตรวจสอบการแสดงออกของยนและขนาดของ

ผลตภณฑ 43

ตารางท 3.5 ปฏกรยาและอณหภมทใชในการเพมจ านวนดเอนเอของยน hDAT, hNET,

hSERT และ GAPDH 43

ตารางท 3.6 สารทดสอบทใชในการทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศรา

ทมผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน,

นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 46

ตารางท 3.7 การแบงกลมทดสอบเพอทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศรา

ทมผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน,

นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 47

ตารางท 4.1 ผลการพสจนชนดของสมนไพร 49

ตารางท 4.2 ผลการสกดสมนไพรดวยตวท าละลายเอทานอล และน า 50

ตารางท 4.3 แสดงผลการเปรยบเทยบระดบสาร monoamine neurotransmitters…………..77

ตารางท 5.1 โปรตนไคเนสทมความเกยวของกบระบบประสาท monoaminergic 82

ตารางท 5.2 สารประกอบในสารสกดสมนไพรทมฤทธตานโรคซมเศรา 83

xi

สารบญภาพ

หนา

ภาพท 2.1 โครงสรางทางเคมของซโรโทนน (Serotonin) ซงเปนหนงในสารสอประสาท

ชนดโมโนเอมน 12

ภาพท 2.2 กลไกการสงเคราะห และสลายของซโรโทนนภายในกลมเซลลทสรางซโรโทนน 14

ภาพท 2.3 กลไกการสงเคราะหโดพามนภายในระบบประสาทของรางกาย 15 ภาพท 2.4 กระบวนการสลายของโดพามนในเซลลประสาทโดยอาศยเอนไซม MAO และ

COMT 16

ภาพท 2.5 กระบวนการสงเคราะหนอรอพเนฟรนจากกรดอะมโนชนด Tyrosine ภายในรางกาย

18

ภาพท 2.6 กระบวนการสลายของนอรอพเนฟรนโดยอาศยเอนไซมชนดตางๆทเกดขน

ภายในรางกาย 19

ภาพท 2.7 ลกษณะโครงสรางของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนทอยบรเวณเยอ

หมเซลลของเซลลประสาทประกอบดวยโดเมน 12 โดเมน และปลายทง 2 ดาน

ของสายโปรตนอยภายในเซลล 20

ภาพท 2.8 รปแสดงกลไกการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporter) 21

ภาพท 2.9 กลไกการขนสง Monoamine เขาสเซลลผาน MATs 23

ภาพท 2.10 ลกษณะโครงสรางของตนสะระแหน 25

ภาพท 2.11 ลกษณะโครงสรางของตนบวบก 26

ภาพท 2.12 ลกษณะโครงสรางของตนขเหลก 27

ภาพท 3.1 โครงสรางโมเลกลของยา fluoxetine hydrochloride 35

xii

หนา

ภาพท 3.2 โครงสรางโมเลกลของยา GBR12935 dihydrochloride 35

ภาพท 3.3 โครงสรางโมเลกลของยา desipramine hydrochloride 36

ภาพท 3.4 ปฏกรยารดกชน (Reduction reaction) ของวธ MTT assay 37 ภาพท 3.5 หลกการของชดน ายา Neurotransmitter Transporter Uptake Assay Kit 44 ภาพท 3.6 กราฟความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงฟลออเรสเซนต (RFU)

และระยะเวลา (min) 47 ภาพท 4.1 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากใบสะระแหน ทสกดจากเอทานอล

และ น า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL 51 ภาพท 4.2 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากใบขเหลก ทสกดจากเอทานอล และ

น า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL 52

ภาพท 4.3 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากบวบก ทสกดจากเอทานอล และ

น า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL 53

ภาพท 4.4 ผลการทดสอบความเปนพษของสารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด

ทความเขมขน 0.1, 1, 10, 100 และ 1000 µM 54

ภาพท 4.5 ผลการตรวจสอบการแสดงออกของยนในเซลล LAN-5 ดวยวธ

Gel electrophoresis เมอทดสอบดวยสารสกดใบขเหลก, ใบสะระแหน และ

บวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL

เปนเวลา 24 ชวโมง 56

ภาพท 4.6 ผลการแสดงออกของยน hDAT ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบ

สารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และ

น าทความเขมขน 25 และ100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง 57

xiii

หนา

ภาพท 4.7 ผลการแสดงออกของยน hNET ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกด

ใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า

ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง 58

ภาพท 4.8 ผลการแสดงออกของยน hSERT ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบ

สารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และ

น าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง 59

ภาพท 4.9 ผลอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนในเซลล

LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบสะระแหน และบวบก ดวยตวท าละลาย

เอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท 61

ภาพท 4.10 ผลอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนในเซลล



ภาพท 4.11 ผลอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนในเซลล



ภาพท 4.12 ผลอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนนในเซลล



ภาพท 4.13 ผลอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนทง 3 ชนด

ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบขเหลก ดวยตวท าละลาย


ภาพท 4.14 ลกษณะโครงสรางโมเลกลของสารประกอบ Barakol 66

ภาพท 4.15 Fluorescent spectrum สารสกดใบสะระแหน ใบขเหลก และบวบก สกดจากเอทานอลทความยาวคลน excitation 450 nm และemission 480-600 nm 67

xiv

หนา

ภาพท 4.16 Fluorescent spectrum ของสารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกด

จากน า ทความยาวคลน excitation 450 nm และ emission 480-600 nm 68

ภาพท 4.17 Fluorescent spectrum ของสารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกด

จากเอทานอล และน า ทความยาวคลน excitation 450 nm และ emission

520 nm 69

ภาพท 4.18 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของโปรตน

ขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา

30 นาท 71

ภาพท 4.19 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของ

โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา

30 นาท 72


ขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา

30 นาท 73


ขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา

30 นาท 74

ภาพท 4.22 แสดงลกษณะและองคประกอบส าคญของเหงากระชายด า (Kaempferia parviflora) และลกจนทนเทศ(Myristica fragrans)............................................75

ภาพท 4.23 แสดงโครมาโตแกรมในการวเคราะหปรมาณ norepinephrine (NE), sertotonin

(5-HT) และ dopamine ดวยเทคนค HPLC ในสมองหนสวน hippocampus.........76

xiv

1

บทท1

บทน ำ

1.1 ควำมเปนมำและควำมส ำคญของปญหำ

สงคมทวโลกในปจจบนตลอดจนสงคมในประเทศไทยมปญหาตาง ๆ เพมมากขนจากเดม ท าใหสภาพความเปนอยของประชากรเปลยนแปลงไป จงสงผลกระทบตอสภาพรางกาย และ สภาพจตใจ โดยเฉพาะอยางยงปญหาทางดานสขภาพจต ซงจากสภาพสงคมปจจบน ทมแตความวนวาย และการแกงแยงแขงขนกน ท าใหอตราของผ ปวยทมอาการทางระบบประสาทเพมมากขน โดยโรคทางระบบประสาททนาสนใจและมแนวโนมวาจะมประชากรปวยเพมมากขนในอนาคต คอ โรคซมเศรา (Major Depressive disorder) ส าหรบผ ทปวยเปนโรคซมเศรา จะมความผดปกตของอารมณ โดยทผ ปวยจะรสกหดห ไมมชวตชวา จะคดถงแตเรองรายๆ อยตลอด คดวาตนเองไรคา ไมสามารถท าประโยชนใหแกใครได และท างานตางๆไดอยาง ไมเตมประสทธภาพ โดยสาเหตอาจเกดจากการไดรบผลกระทบจากการสญเสย เชน สญเสยงาน สญเสยคนทรก หรอเกดจากความผดปกตภายในรางกายของผ ปวยเอง ซงโรคนเปนสาเหตส าคญทท าใหเกดความคดทจะฆาตวตายในผ ปวยได ดงนนโรคซมเศราจงเปนโรคทท าใหมอตราการตายของประชากรเพมมากขน นอกจากนยงพบวาผ ปวยโรคซมเศราจะไมมความสามารถ ในการท างานใดๆไดอกดวย ซงจะสงผลกระทบตอสงคมทจะน าก าลงคนมาพฒนาสงคม ท าใหขาดแคลนบคคลากรทจะมาพฒนาสงคมนนๆได โดยจากขอมลขององคการอนามยโลกในป ค.ศ. 2010 ไดระบไววา ประชาชนทวโลกประมาณ 121 ลานคนนนปวยเปนโรคซมเศรา และ มแนวโนมวาจะมผ ปวยเปนโรคซมเศราเพมสงขนเปนอนดบสองรองจากโรคหวใจในป ค.ศ. 2020 (1) ส าหรบในประเทศไทยจากการส ารวจขอมลของผ ปวยโรคซมเศราในป พ.ศ. 2553 พบวามผ ปวยโรคซมเศราประมาณรอยละ 2 ของประชากรทงหมด ซงคดเปนตวเลขแลวมผ ปวย ถง 150,000 ราย (2) ถงแมวาในปจจบนนนโรคซมเศราจะสามารถวนจฉยโรคไดงาย มยาทสามารถรกษา และ ระงบอาการของโรคได แตกยงมผ ปวยทเขารบการรกษาเพยง 25% ของผ ปวยทงหมด เนองจากผ ปวยโรคซมเศรานนจะไมยอมรบวาตนเองปวยเปนโรคซมเศราจงไมไป พบแพทยเพอรบการรกษา (1) นอกจากนยาทใชรกษาโรคซมเศรามราคาแพง มผลขางเคยง จากการทานยาคอนขางมาก ซงอาจเปนอนตรายตอผ ปวย และการรกษาผ ทปวยเปนโรคนจะตองทานยาอยตลอดจนกวาจะมอาการดขน ซงใชเวลาประมาณ 4-9 เดอน โดยระหวางนไมสามารถ

2

หยดยาได (3) จงท าใหผ ปวยตองสญเสยคาใชจายในการรกษาโรคนเปนจ านวนมาก และ มผลขางเคยงของยาเกดขนรวมดวย

ดงนน คณะผ วจยจงมความประสงคทจะน าสารสกดสมนไพรมาศกษาฤทธในการรกษาหรอปองกนโรคซมเศรา โดยศกษาผานทางกลไกการยบยงการท างาน และ การแสดงออกของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporters, MATs) ภายในเซลลประสาทเพาะเลยง ซงท าใหปรมาณของสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine) บรเวณชองวางไซแนปสเพมมากขน สงผลใหบรรเทาอาการของผ ปวยได โดยจะท าการศกษาเปรยบเทยบกบฤทธของยารกษาโรคซมเศราทใชในปจจบนวาฤทธของสารสกดสมนไพรใหผลออกฤทธไดใกลเคยงกบฤทธของยา นอกจากนยงน าสารสกดสมนไพรมาทดสอบดวยวามความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยงหรอไม โดยผลการวจยทไดจะมประโยชนในแงของ การรกษา และ การปองกนการเกดโรคซมเศราโดยใชสารสกดสมนไพร เพอลดผลขางเคยงทเกดขนจากการใชยา เนองจากสารสกดสมนไพรอาจไมมสารทเปนพษเทากบสารเคมในยา และยงชวยลดคาใชจายในการรกษาโรคซมเศรา ท าใหผ ปวยโรคซมเศราไมตองสญเสยทรพยสนในการรกษามากเกนก าลง นอกจากนบคคลทวไปยงสามารถน าสารสกดสมนไพรมาใชในการปองกนอาการของโรคซมเศราดวยตนเองไดอกดวย

1.2 วตถประสงค

1.2.1 เพอศกษาความเปนพษของสารสกดจากสมนไพรตอเซลลประสาทเพาะเลยงชนด LAN-5

1.2.2 เพอศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศรา ผานกลไกการยบยง การแสดงออกของยน hSERT, hDAT และ hNET ในระดบ mRNA

1.2.3 เพอศกษาฤทธของสารสกดจากสมนไพรในการตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยง การท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน

1.3 ขอบเขตของงำนวจย

งานวจยนเปนงานวจยทท าการศกษากบเซลลประสาทเพาะเลยง คอ LAN-5 โดยเปนการศกษาประเภท In vitro Study และยารกษาโรคซมเศราทใชในงานวจยเปนยาทออกฤทธในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนเทานน

3

1.4 ขอจ ำกดของกำรวจย

1.4.1 การศกษาวจยครงนเปนการทดสอบในเซลลประสาทเพาะเลยงซงอาจไดผลการทดสอบทคลาดเคลอนจากความเปนจรง เนองจากเซลลประสาทเพาะเลยงนนไมมระบบการท างานทซบซอนเหมอนกบระบบการท างานตางๆภายในรางกายของมนษย โดยงานวจยนเปนเพยงการศกษาเบองตนกอนทจะน าไปศกษาในสตวทดลองเพอน าไปพฒนาตอไปในอนาคต

1.4.2 ยาตานโรคซมเศราทใชในงานวจยมทงหมด 3 ชนด ไดแก fluoxethine hydrochloride ม ฤท ธ ยบย ง ก า รท า ง านของ โปร ตนขนส ง สา ร ส อประสาทชน ด ซ โ ร โทน น , desipramine hydrochloride มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน และ GBR12935 dihydrochloride มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน

1.5 ประโยชนทคำดวำจะไดรบจำกกำรวจย

1.5.1 เขาใจถงสาเหต อาการ และการรกษาโรคซมเศราทมการศกษาอยในปจจบน 1.5.2 องคความรใหมทเกดขนสามารถน าไปตอยอดการวจย เพอพฒนาเปนยาสมนไพรส าหรบ

การรกษา หรอ ปองกนการเกดโรคซมเศราทไมมผลขางเคยง หรอ ใหผลขางเคยง นอยกวายารกษาโรคซมเศราทใชอยในปจจบน และสามารถลดคาใชจายของผ ปวยในการรกษาได อกทงยงน าไปสการศกษาวจยเพอพฒนาแนวทางการรกษาอาการของผ ปวยโรคซมเศราใหมประสทธภาพมากยงขน

1.5.3 คาดวาจะตพมพผลงานของโครงการวจยนในวารสารวชาการระดบนานาชาตทเกยวของไดอยางนอย 1 เรอง

4

บทท 2

เอกสำรและงำนวจยทเกยวของ

2.1 โรคซมเศรำ (Major Depressive Disorder)

โรคซมเศรา เปนโรคทางระบบประสาทชนดหนงทผ ปวยจะมอาการผดปกตทางดานจตใจ ความรสก และอารมณ นอกจากน ผ ปวยยงมอาการนอนไมหลบ และไมอยากอาหารรวมอยดวย ซงจากอาการผดปกตดงกลาวนนจะท าใหผ ทปวยไดรบผลกระทบตอการด าเนนชวตประจ าวน ไมมจตใจในการกระท าใด ๆ เนองจากผ ปวยจะคดเพยงวาตนเองนนไรคา ไมมประโยชน ตอบคคลอน มความรสกหดห และมความรสกเศราอยตลอดเวลา ถาผ ปวยมความรสกดงกลาวอยตลอด และไมสามารถรกษาได กจะเปนสาเหตทท าใหผ ปวยมความคดทจะฆาตวตาย ซงจากการส ารวจผ ปวยโรคซมเศราในประเทศอเมรกานนพบวา ผ ปวยรอยละ 3.4 จะฆาตวตาย และรอยละ 60 ของบคคลทฆาตวตายส าเรจนนปวยเปนโรคซมเศรา (4)

2.2 ลกษณะอำกำรของโรคซมเศรำ

อาการของผ ปวยทเปนโรคซมเศรานน จะมการเปลยนแปลงตางๆเกดขน โดยสามารถ แบงอาการการเปลยนแปลงตางๆเหลานนไดดงน (5)

- การเปลยนแปลงทางดานอารมณ โดยผ ปวยจะมความรสกซมเศรา กงวลอยตลอดเวลา (Depress) มอารมณหงดหงด ฉนเฉยว โกรธงาย หรอ มอาการอยไมสข และกระวนกระวายตลอดเวลา (Mania)

- การเปลยนแปลงทางดานความคด ผ ปวยจะมความรสกสนหวง ทอแท มองโลกใน แง ราย รสกผด ไรคา มความคดทจะท ารายตวเอง หรอมความพยายามทจะ ฆาตวตาย

- การเปลยนแปลงทางดานการเรยนร หรอการท างาน ผ ปวยจะไมรสกสนกกบสงตางๆ รอบตว ไมวาจะเปนการท างาน การท ากจกรรมทเพมความสนกรวมทงกจกรรม ทางเพศ ผ ปวยจะรสกออนเพลยไมมพลงงานท าใหท างานไดแยลง นอกจากนผ ปวยยงมอาการสมาธสน ความจ าเสอม และการตดสนใจในเรองตางๆไดแยลง

5

- การเปลยนแปลงทางดานพฤตกรรม ผ ปวยจะมอาการนอนไมหลบ ตนเ รว หรอในบางรายจะมอาการนอนหลบมากเกนไป เบออาหาร หรอทานอาหารมากเกนไป ในบางรายท าใหมการเปลยนแปลงของน าหนกตว มอาการปวดศรษะ แนนทอง ปวดเรอรงโดยจะรกษาดวยยาไมหาย และสดทายคอมความสมพนธ กบบคคลอนแยลง ท าใหไมมสงคม หรอไมเปนทตองการของสงคม

และส าหรบผ สงอายทปวยเปนโรคซมเศรานนจะมอาการ หลงลมในระยะแรก (6) และจะมอาการเซองซมรวมดวย (7) นอกจากนอาจมอาการของโรคอนๆแทรกซอนรวมอยดวย เชน โรคเสนเลอดในสมองแตก (Stroke) โรคหลอดเลอดหวใจ (Cardiovascular disease) และ โรคพารกนสน (Parkinson’s disease) (8)

2.3 สำเหตของโรคซมเศรำ

ส าหรบสาเหตของโรคซมเศรานน พบวาโรคซมเศราเปนโรคทเกดจากปจจยหลายๆอยางรวมกน หรอทเรยกวา Multifactorial Disease โดยผ ปวยโรคซมเศรานนจะปวยเปนโรคซมเศราได จะตองมปจจยหลายอยางทท าใหเกดอาการของโรคซมเศราขน โดยปจจยเหลานนไดแก พนธกรรม สภาวะแวดลอม สารชวเคมภายในรางกาย และ ปจจยทางดานสขภาพของผ ปวย โดยจะตองมปจจยเหลานเกดรวมกนจงท าใหผ ปวยเกดอาการของโรคซมเศราได (9)

2.3.1 สำเหตทำงดำนพนธกรรม

จากการศกษาทผานมาพบวา ผ ทปวยเปนโรคซมเศราโดยสวนใหญจะมความผดปกต ในการแสดงออกของยนเมอมสภาวะแวดลอมภายนอกเปนตวกระต น หรอทเรยกวา Gene–environment interaction รวมอยดวย โดยในผ ปวยบางรายจะมอาการเกดข น เมอมภาวะเครยดเขามากระตน ส าหรบยนทมความผดปกต คอ ยนทเกยวของกบการสรางโปรตนขนสงซโรโทนน (Serotonin transporter) ซงจะเกดขนบรเวณ Promoter (Serotonin-transporter linked promoter region, 5-HTTLPR) ของยนน (10) นอกจากนยงพบวาความหลากหลายของยน Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) นนยงมอทธพลตอการ คดฆาตวตายในผ ปวยโรคซมเศรา (5) และนกวทยาศาสตรยงเชอวา BDNF นนมกลไกการท างานรวมกบ Serotonin transporter โดยท BDNF จะไปยบยงใหการท างานของ Serotonin transporter ลดลง (11)

6

2.3.2 สำเหตจำกควำมผดปกตของสำรชวเคมภำยในรำงกำย

ในระยะเรมแรกทมการใชยารกษาโรคซมเศรานน นกวทยาศาตรพบวายารกษา โ ร คซ ม เ ศ ร า จ ะ ไปออกฤท ธ ท า ใ ห สา ร ส อป ร ะสาทชน ด โม โน เ อ ม น (Monoamine Neurotransmitter) เพมสงขน โดยเฉพาะซโรโทนน ดงนนจงไดตงสมมตฐานขน (Monoamine Hypothesis) วาสารสอประสาทชนดโมโนเอมนมสวนเกยวของกบการเกดโรคซมเศรา ซงขนอยกบปรมาณของสารสอประสาทชนดนในบรเวณชองวางไซแนปส (Synaptic cleft) ถาหาก สารสอประสาทมปรมาณนอยจะท าใหผ ปวยมโอกาสสงในการเกดโรคซมเศราแตถามปรมาณมากจะท าใหอาการของผ ปวยทเลาลง และจากการศกษาตางๆ ทเกยวกบความผดปกตของสารชวเคมภายในรางกาย พบวาผ ปวยโรคซมเศราจะมระดบของสารสอประสาทชนด โมโนเอมนบรเวณชองวางไซแนปสทอยระหวางเซลลประสาทลดลง (9) โดยเกดจากการท างานทผดปกตของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporter) ทบรเวณเซลลกอนชองวางไซแนปส (Pre-synaptic cell) ซงอาจเกดจากความผดปกตของยนทเกยวของกบการแสดงออกของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน สงผลใหเกดการดดสารสอประสาทกลบคนเขาสเซลลกอนชองวางไซแนปสมากขน ท าใหสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปสลดลง (10) นอกจากน ยงพบวาผ ปวยโรคซมเศรามความผดปกตของเอนไซมโมโนเอมนออกซเดส (Monoamine oxidase, MAO) ซงเปนเอนไซมทใชในการท าลายสาร สอประสาทชนดโมโนเอมน โดยพบวาการท างานของเอนไซมทมากเกนไปท าใหเกดการท าลายสารสอประสาทเพมมากขนเปนเหตใหสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปสลดลงจงท าใหเกดอาการซมเศราขนมาได (12)

2.3.3 สำเหตจำกสงคมและสภำวะแวดลอม

จากสภาพสงคมทวโลกในปจจบนทมความวนวายตางๆเกดขนมากมาย มการแขงขนกนมากขน สภาพเศรษฐกจทย าแย ท าใหมจ านวนคนวางงานเพมมากขน ผคนสวนใหญจงมความยากจนเพมมากขน โดยสงทกลาวมานเปนสาเหตทท าใหมผ ปวยปวยเปนโรคซมเศรา เพมมากขน ส าหรบในเดกทมปญหาทางครอบครว ไมวาจะเปนการถกเลยงมาอยางผดวธ ผปกครองไมใหความเอาใจใส ผปกครองหยาราง หรอสญเสยบดา หรอมารดาไป กจะท าใหเดกมความเสยงทจะเปนโรคซมเศราเพมมากขน (13) สวนในผ ใหญนนความเครยดจากการ

7

ท างาน หรอสภาพสงคมทมปญหาจะเปนปจจยหลกทกระตนใหเกดโรคซมเศราได (14) ดงนน สงคมและสภาวะแวดลอมทไมดจงเปนสาเหตใหอตราของผ ปวยโรคซมเศราเพมมากขน (15)

2.3.4 สำเหตอนๆทท ำใหเกดโรคซมเศรำ

ในระยะหลงทผานมาน นกวทยาศาสตรไดท าการศกษาหาสาเหตอนๆทไมเกยวของกบสารสอประสาทชนดโมโนเอมน โดยไดท าการสแกนสมองของผ ปวยโรคซมเศราโดยใชเทคนค Magnetic Resonance Imaging (MRI) พบวาสมองสวนฮปโปแคมปส (Hippocampus) ทเปนสวนควบคมอารมณ และ ความทรงจ า ในผ ปวยโรคซมเศรานนมปรมาตร หรอขนาดทเลกกวาสมองสวนฮปโปแคมปสในคนปกต และจากการศกษาน เอง นกวทยาศาสตรจงตงสมมตฐานขนวา สมองสวนฮปโปแคมปสนนมความสมพนธกบการท าใหเกดโรคซมเศ รา นอกจากนยงมการศกษาพบวา การท างานของ Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis (HPA axis) ทมากเกนไปจะท าใหมการหลงฮอรโมนทกระตนใหเกดความเครยด จงสงผลใหเกดอาการของโรคซมเศราไดเชนกน

2.4 กำรวนจฉยโรคซมเศรำ

ส าหรบการวนจฉยโรคซมเศรานน แพทยจะท าการวนจฉยโดยซกถามประวตของผ ปวย วามอาการเปนอยางไรบางในชวงทผานมา มคนในครอบครวเคยเปนโรคนหรอไม และจ าเปนตองแยกโรคซมเศราออกจากโรคอนๆ โดยการตรวจเลอดเชนการตรวจหา Thyroid Stimulating Hormone (TSH) และ Thyroxine (T4) เพอแยกผ ปวยออกจากโรค Hypothyroidism การตรวจ อเลกโตรไลท (Electrolyte) และแคลเซยมในพลาสมาเพอแยกโรคทางเมทาบอลก รวมถงการตรวจ Erythrocyte sedimentation rate (ESR) และ Complete blood count (CBC) เพอแยกการตดเชอ และ โรคเรอรงออกไป (16) นอกจากนยงมแบบสอบถามเพอใชประกอบการวนจฉยโรคดวย โดยแบบสอบถามมลกษณะดงน (6)

ในชวง 2 สปดำหทผำนมำคณมอำกำรเกดขนตลอดเวลำไมใชนำนๆครงและเปลยนแปลงไปจำกเดม

1. คณมอารมณซมเศราหรอทอแทใจ

□ ใช □ ไมใช 2. คณขาดความสนใจหรอไมมความสขในสงตางๆทคณเคยชอบหรอท าอยประจ า

□ ใช □ ไมใช

8

3. น าหนกของคณเปลยนแปลงไปจากเดมเกนกวา 2 กโลกรม (ไมไดเกยวกบความตองการลดน าหนก)

□ ใช □ ไมใช 4. ในชวงกลางคนคณนอนไมหลบหรอหลบมากไป (ไมไดเกยวกบการทานยาและการนอนหลบกลางวนมากเกนไป)

□ ใช □ ไมใช 5. ออนเพลย ไมมแรง เชองชา

□ ใช □ ไมใช 6. คณรสกกระวนกระวายใจ นงไมตด

□ ใช □ ไมใช 7. คณรสกวาตนเองไมมคา

□ ใช □ ไมใช 8. คณรสกผดและโทษตวเอง

□ ใช □ ไมใช 9. คณไมมสมาธทจะท างาน

□ ใช □ ไมใช 10. คณหมกมนกบความคดตนเองโดยทหยดความคดไมได

□ ใช □ ไมใช 11. คณไมมนใจในการตดสนใจหรอตดสนใจอะไรไมได

□ ใช □ ไมใช 12. คณคดเกยวกบเรองความตายบอยๆ คดอยากตาย มแผนการทจะท าหรอเคยฆาตวตาย

□ ใช □ ไมใช กำรใหคะแนนแบบทดสอบภำวะโรคซมเศรำ ขอ 1–6 ตอบวาใช ได 1 คะแนน ขอ 7,8 ตอบวาใชขอใดขอหนงได 1 คะแนน ขอ 9,10,11 ตอบวาใชขอใดขอหนงได 1 คะแนน ขอ 12 ตอบวาใชได 1 คะแนน โดยถาคะแนนรวมมากกวาหรอเทากบ 5 คะแนน แสดงวามภาวะโรคซมเศรา

9

ซงถาแพทยวนจฉยพบวาผ ปวยมอาการของโรคซมเศราแพทยจะท าการประเมนระดบความรนแรงของอาการ เพอวางแผนการรกษาใหผ ปวยหายจากอาการของโรคซมเศรา โดยระดบความรนแรงของโรคซมเศราสามารถแบงเปน 3 ประเภทไดแก Mild ผ ปวยจะมอาการนอย แตมอาการตรงตามเงอนไขการวนจฉยทกประการ, Moderate และ Severe ผ ปวยจะมอาการรนแรงซงสงผลตอสถานะทางสงคม และ หนาทการงาน โดยถาหากมอาการทางจตอยางอนรวมดวยจะเรยกวา Psychotic depression ซงจะจดอยในกลมอาการ Severe และถาหากมอาการ Mania รวมดวยนนจะถกวนจฉยวาเปนโรค Bipolar Disorder (17)

2.5 กำรรกษำโรคซมเศรำ

ส าหรบการรกษาอาการของโรคซมเศรานน ขนแรกแพทยจะรกษาโดยการใชยา โดยจะรกษาในผ ปวยทมอาการไมรนแรงมากนก ซงผ ปวยจะตองทานยาตดตอกนตลอด และ ทานตามขนาดทแพทยสง ผ ปวยจะมอาการดขนหลงจากทานยาไปแลวประมาณ 1-2 สปดาห หลงจากนนแพทยจะลดขนาดยาลงและใหทานตอไปอกประมาณ 4-9 เดอน จนกระทงผ ปวยหายขาดจากอาการซมเศรา แตส าหรบผ ปวยทมอาการรนแรงและไมตอบสนองตอการรกษา ดวยยา แพทยจะใชการรกษาโดยการใชวธชอคไฟฟาแทน (Electroconvulsive therapy) (18)

วงการสาธารณสขทวโลกในปจจบนไดมแนวทางในการรกษาอาการของโรคซมเศรา ซงสวนใหญไดใชยาตานโรคซมเศรา (Antidepressant Drug) ในการรกษา โดยยาชนดนจะออกฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนหรอยบยงการท างานของเอนไซมโมโนเอมนออกซเดส ซงจะสงผลใหปรมาณของสารสอประสาทชนดโมโนเอมนบรเวณชองวางไซแนปสมเพมมากขน ท าใหผ ปวยมอาการของโรคลดลง (19) ยาทใชในการรกษา โรคซมเศรามอยหลายชนดดวยกน โดยสามารถแบงเปนกลมตามลกษณะการออกฤทธของยา ดงน

1. Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) เปนยามาตรฐานในปจจบนทใชรกษาอาการของโรคซมเศรา ซงผลขางเคยงของยาในกลมนจะมนอยกวายาในกลม Tricyclic antidepressant และ Monoamine oxidase inhibitor (MAOIs) ซงยากลมนจะออกฤทธไปยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน (Serotonin transporter) ยาในกลมน ไดแก

- Citalopram (Celexa, Cipramil)

10

- Escitalopram (Lexapro, Cipralex, Seroplex, Lexamil) - Fluoxetine (Prozac, Sarafem, Symbyax)

- Fluvoxamine (Luvox)

- Paroxetine (Paxil, Aropax) - Sertraline (Zoloft)

จากการศกษาตางๆ ทผานมาพบวา ยาในกลมนถาใชผดวธจะท าใหเกดการเสพตดได และ อาจท าใหเกดภาวะโรคอวนไดเชนกน (20)

2. Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs) เปนยาทไปออกฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาททงชนดซโรโทนน และ นอรอพเนฟรน ซงจะมผลขางเคยงคลายกบยาในกลม SSRIs ยาในกลมน ไดแก

- Desvenlafaxine (Pristiq) - Duloxetine (Cymbalta)

- Milnacipran (Ixel)

- Venlafaxine (Effexor) 3. Noradrenergic and specific serotonergic antidepressants (NaSSAs) ยาในกลมน

จะออกฤทธยบยงการท างานของ presynaptic alpha-2 adrenergic receptors และ serotonin receptors สงผลใหปรมาณของซโรโทนนบรเวณชองวางไซแนปสมเพมมากขน ส าหรบผลขางเคยงของยาในกลมนคอ ท าใหเกดอาการงวงนอน หวงาย และ มน าหนกตวเพมมากขน (21) ตวอยางยาในกลมน ไดแก

- Mianserin (Tolvon)

- Mirtazapine (Remeron, Avanza, Zispin) 4. Tricyclic antidepressants (TCAs) ยากลมนเปนยากลมแรกๆ ทใชรกษาอาการของ

โรคซมเศรา โดยสาร Tricyclic จะไปยบยงการดดกลบสารสอประสาทของโปรตนขนสงสารสอประสาทตางๆ แตยาในกลมนจะสงผลขางเคยงเมอมการใชยามากเกนไป ท าใหผ ปวยมอาการหวใจเตนเรว งวงนอน ปากแหง ทองผก มนงง มความผดปกตของไต และ สมรรถภาพทางเพศลดลง ตลอดจนกอใหเกดอนตรายถงแกชวตได จากสาเหตดงกลาว ในปจจบนจงไมนยมน ายากลมนมาใชรกษาอาการของโรคซมเศราแตจะใชรกษาผ ปวย ในกรณทมอาการของโรคซมเศราอยางรนแรง (22) ตวอยางยาในกลมน ไดแก

11

- Amitriptyline (Elavil, Endep) - Clomipramine (Anafranil)

- Doxepin (Adapin, Sinequan)

- Imipramine (Tofranil) - Trimipramine (Surmontil)

5. Monoamine oxidase inhibitor (MAOIs) กลไกการรกษาอาการโรคซมเศราของยาชนดน คอ ไปยบยงการท าลายสารสอประสาทชนดโมโนเอมนจากเอนไซมโมโนเอมนออกซเดสโดยยาจะออกฤทธกดการท างานของเอนไซมชนดน (1) ท าใหเอนไซมไมสามารถท าลายสารสอประสาทได สงผลใหมปรมาณสารสอประสาทเพมมากขน อยางไรกตามเนองจากยาชนดนมผลขางเคยงทคอนขางจะรนแรง ดงนน แพทยจงไมคอยน ายาชนดนมาใชรกษาอาการโรคซมเศราใหกบผ ปวย แตจะใชยาชนดนในกรณทใชยาชนดอนรกษาแลวไมไดผล (23) ส าหรบตวอยางยาในกลมน ไดแก

- Isocarboxazid (Marplan) - Moclobemide (Aurorix, Manerix)

- Phenelzine (Nardil) - Selegiline (Eldepryl, Emsam)

- Tranylcypromine (Parnate) 2.6 สำรสอประสำทชนดโมโนเอมน (Monoamine Neurotransmitter)

สารสอประสาทชนดโมโนเอมน คอ กลมของสารสอประสาททมสวนประกอบของ หมอะมโน (Amino group) 1 หม เชอมตอกบวงแหวนอะโรมาตก (Aromatic ring) ดวยสาย ของคารบอน 2 อะตอม (ภาพท 2.1) โดยสารสอประสาทชนดนจะถกสรางขนจากกรดอะมโนชนด ทมลกษณะเปนวงแหวนอะโรมาตก (Aromatic ring amino acid) ไดแก Tryptophan และ Tyrosine ส าหรบสารสอประสาทชนดโมโนเอมนทมความส าคญตอการควบคมอารมณของรางกาย ไดแก ซโรโทนน (Serotonin, 5-Hydroxytryptophan, 5-HT), โดพามน (Dopamine, DA) และ นอ ร อพ เ นฟ รน (Norepinephrine, NE) ห ร อ นอ รอะด รนาล น (Noradrenalin, Na) เมอรางกายขาดสารสอประสาทเหลานหรอมการสรางสารสอประสาทออกมาในปรมาณนอย จะท าใหเกดอาการเกยวกบโรคทางจตประสาทขนมาได เชน โรคซมเศรา

12

ภำพท 2.1 โครงสรางทางเคมของซโรโทนน (Serotonin) ซงเปนหนงในสารสอประสาทชนด โมโนเอมน

2.6.1 ซโรโทนน (Serotonin, 5-hydroxytrptamine, 5-HT)

ซโรโทนนเปนสารสอประสาทโมโนเอมนชนดหนง พบอยมากบรเวณล าไสภายใน Enterochromaffin cells ซงในบรเวณนซโรโทนนจะท าหนาทในการควบคมการเคลอนไหวของผนงล าไส (24) แตส าหรบความส าคญในระบบประสาทสวนกลาง (Central Nervous System, CNS) ซโรโทนนจะถกหลงมาจาก Raphe Nuclei ภายในสมอง โดยจะมหนาทในการควบคมอารมณความกาวราว, ความอยากอาหาร, ความตองการทางเพศ และการนอนหลบ นอกจากนยงชวยควบคมเกยวกบระบบการรบร (Cognitive) ของรางกาย โดยเปนสาร สอประสาททชวยในการเรยนร (Learning) และการจดจ า (Memory) (25, 26) สวนซโรโทนน ทถกหลงออกมาจาก enterochromaffin cells มายงกระแสเลอดจะมหนาทในการชวย สมานแผล โดยซโรโทนนทถกหลงออกมาจะไปจบกบเกรดเลอด (Platelet) เมอมบาดแผลเกดขนเกรดเลอดทถกพาไปยงบรเวณบาดแผลกจะปลอยซโรโทนนออกมา ซโรโทนนจะไปกระตนใหเกดการหดตวของหลอดเลอด และ กระตนใหเกดการสรางเนอเยอขนใหมจงท าใหเกดการสมานแผลเกดขน (27)

การสงเคราะหซโรโทนนภายในรางกายจะสามารถสงเคราะหไดเพยงบางกลมเซลลเทานน เชน กลมเซลลสมอง (28) โดยกลไกการสงเคราะหนนสามารถแบงออกไดเปน 3 ขนตอน (ภาพท 2.2) ดงน

13

ขนท1 กรดอะมโน L-tryptophan จากอาหารจ าพวกโปรตนตางๆ จะถกดดซมเขาส กระแสเลอด และเขาสเซลลสมองโดยวธ facilitated diffusion โดยอาศยตวน า (Carrier) ชนดเดยวกบกรดอะมโนชนดอนๆ ไดแก Phenylalanine, Leucine และ Methionine ดงนนปรมาณของซโรโทนนในสมองนน จงขนอยกบปรมาณ Tryptophan ทรางกายไดรบ

ขนท 2 จดเปนขนก าหนดอตราการเกดปฏกรยา (Rate-Limiting Step) โดยกลมเซลลทสราง ซโรโทนนจะมองคประกอบของเอนไซม L-tryptophan-5-monooxygenase หรอ tryptophan hydroxylase (TPH) ซงมอย 2 ชนด แตทพบในสมองนนจะเปนชนด TPH2 โดยจะท าหนาทเปลยน Tryptophan ใหเปน 5-hydroxy-L-tryptophan (5-HTP) โดยเอนไซมชนดนจะท างานไดนนจะตองมกาซออกซเจน (O2) และpteridine cofactor คอ L-erythro-tetrahydrobiopterin (BH4) ในปฏกรยา ซงออกซเจน 1 อะตอมจะถกใชในการสราง 5-HTP และอก 1 อะตอมจะถกรดวซ (reduce) ใหเปนน า ส าหรบ pteridine cofactor นนจะเปนตวใหอเลคตรอน (electron) ท าใหไดสารกงกลางทไมเสถยร คอ quinonoid dihydrobiopterin แลวเปลยนเปน quinonoid tetrahydrobiopterin (quinonoid BH4)

ขนท 3 5-HTP จะถกเปลยนเปน serotonin (5-HT) โดยอาศยการท างานของเอนไซม aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) โดยเอนไซมชนดนไมไดพบเฉพาะในกลมเซลลทสรางซโรโทนนเทานน แตยงพบในกลมเซลลทสราง catecholamine ดวย เชน กลมเซลลทสรางโดพามน (Dopamine) เปนตน ซงเอนไซมชนดนจะท าหนาทเปลยน 5-HTP เปน 5-HT หรอซโรโทนน ส าหรบปรมาณของซโรโทนนในสมองจะขนอยกบปรมาณความเขมขนของ 5-HTP ซงเปนสารตงตนในปฏกรยา รวมถงโคแฟคเตอร (Cofactor) และระดบ pH นอกจากน การทเอนไซม ADCC ท าหนาทในกลมเซลลทสราง catecholamine มากกวาปกต จงท าใหสรางซโรโทนนออกมาไดนอยเกนไป ท าใหปรมาณของซโรโทนนในสมองเกดความผดปกต

การสลายซโรโทนนนนเกดจากเอนไซม Monoamine oxidase (MAO) จะท าการเปลยนซโรโทนนใหเปน 5-hydroxy indoleacetaldehyde หลงจากนนจะถก Oxidize ตอโดยเอนไซม Aldehyde dehydrogenase และ NAD+ และไดผลผลตเปน 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) ซงเปนรป metabolite ของซโรโทนน และสามารถตรวจพบไดในปสสาวะ

14

ทมา: Own work, copyleft: Multi-license with GFDL and Creative Commons CC-BY-SA-2.5 and older versions (2.0 and 1.0)

ภำพท 2.2 กลไกการสงเคราะห และสลายของซโรโทนนภายในกลมเซลลทสรางซโรโทนน

2.6.2 โดพำมน (Dopamine)

โดพามนเปนสารสอประสาทชนดโมโนเอมน ทถกสงเคราะหมาจากกรดอะมโนชนด Tyrosine โดยจะมความส าคญตอระบบประสาทสวนกลางของสตวตางๆ รวมถงมนษย โดพามนทอยในสมองจะถกสรางบรเวณ Substantia nigra และ Ventral tegmental area (29) ซงจะถกหลงออกมาโดย Hypothalamus เพอน าไปใชในการควบคมการหลงฮอรโมน Prolactin จากตอมใตสมอง (Pituitary gland) (30) นอกจากน ยงมความส าคญในการท างานของสมองทเกยวกบการเขาใจ (Cognition) การสรางแรงจงใจ(Motivation) การตอบสนอง

15

ตอสงเรา (Reflect) ความพงพอใจ (Reward) ควบคมการนอนหลบ อารมณ ความสนใจ และการเรยนรจดจ าสงตางๆในการท างาน (31-33) ซงถามปรมาณของโดพามนในระบบประสาทนอยเกนไปจะท าใหเกดความผดปกตตอระบบประสาท และสงผลตอการด าเนนชวตประจ าวนไดอกดวย (34) ส าหรบหนาทโดพามนในระบบประสาทซมพาเทตก (Sympathetic nervous system) จะท าหนาทในการกระตนการเตนของหวใจและเพม ความดนของเลอด เปนตน (35) กลไกการสงเคราะหโดพามนในสมองนนสามารถอธบายเปนขนตอนได ดงน (ภาพท 2.3) (36)

ขนท 1 เอนไซม Tyrosine 3-monooxygenase (Tyrosine hydroxylase) มาท าการเตมหม ไฮดรอกซล (OH) ใหกบ L-Tyrosine กลายเปน L-DOPA ขนท2 เกดการน าหมคารบอกซล (COOH) ออกจาก L-DOPA โดยอาศยเอนไซม Aromatic L-amino acid decarboxylase กลายเปนโดพามนในทสด

ทมา: Own work, copyleft: Multi-license with GFDL and Creative Commons CC-BY-SA-2.5 and older versions (2.0 and 1.0) ภำพท 2.3 กลไกการสงเคราะหโดพามนภายในระบบประสาทของรางกาย

16

ส าหรบการสลายโดพามนภายในเซลลประสาทจะอาศยการท างานของเอนไซม 2 ชนด คอ โมโนเอมนออกซเดส (Monoamine oxidase, MAO) และCatechol-O-methyl transferase (COMT) โดยมกระบวนการสลายผาน 2 กลไก คอ MAO จะท าการสลายโดพามนทถกน ากลบเขาสเซลลผานโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน (Dopamine Transporter, DAT) โดยเปลยนโดพามนใหกลายเปน 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) หลงจากนนเอนไซม COMT จะเปลยน DOPAC ใหกลายเปน Homovanillic acid (HVA) และอกกลไกคอเอนไซม COMT จะท าการสลายโดพามนทถกพากลบเขาสเซลลประสาทผานทางโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน (Norepinephrine Transporter, NET) โดยเปลยนโดพามนใหกลายเปน 3-methoxytyramine (3-MT) หลงจากนน เอนไซม MAO หรอ Aldehyde dehydrogenase จะท าการเปลยน 3-MT ใหกลายเปน HVA เชนกน (36) (ภาพท 2.4)


ภำพท 2.4 กระบวนการสลายของโดพามนในเซลลประสาทโดยอาศยเอนไซม MAO และ COMT

17

2.6.3 นอรอพเนฟรน หรอ นอรอะดรนำลน (Norepinephrine, Noradrenalin)

นอรอพเนฟรน เปนสารสอประสาทอกชนดหนงทสงเคราะหมาจากกรดอะมโนชนด Tyrosine โดยจะถกสงเคราะหภายในสมอง และถกหลงออกมาจากเซลลประสาท Noradrenergic ทอยใน Locus Coerulus ซงอยบรเวณกานสมอง (Brain stem) (37) เมอนอรอพเนฟรนถกกระตนใหหลงออกมาภายในสมองจะท าใหเกดผลตอสมองในวงกวาง โดยจะท าใหเกดการตนตว (Alertness) เกดอาการตนเตน (Arousal) และสงผลตอระบบควบคมความพงพอใจของรางกาย (Reward system) (38, 39) นอกจากจะท าหนาทเปน สารสอประสาทแลว นอรอพเนฟรนยงท าหนาทเปนฮอรโมนไดอกดวย (40) โดยนอรอพเนฟรนทท าหนาทเปนฮอรโมนจะถกสงเคราะหบรเวณตอมหมวกไต (Adrenal medulla) การท างานของฮอรโมนนจะมผลตอสมองสวน Amygdala ท าใหเกดการควบคมการตอบสนองตอสงเรา ชวยกระตนอตราการเตนของหวใจ และท าใหรางกายน ากลโคส (Glucose) ทเกบเอาไวไปใชเปนแหลงพลงงานเมอถกกระตนจากสภาวะแวดลอม และยงท าใหเกดการตอบสนองแบบ Fight-or-Flight ไดอกดวย (41)

กระบวนการสง เคราะหนอรอพ เนฟรนนนจะเกดขนภายในเซลลประสาทชนด Noradrenergic และกลมเซลลบรเวณ Adrenal Medulla ในตอมหมวกไต ซงถกสงเคราะหตอมาจากกระบวนการสงเคราะหโดพามน โดยจะมเอนไซม Dopamine-beta-hydroxylase มาเตมหมไฮดรอกซล (OH) ท าใหเปลยนจากโดพามนเปนนอรอพเนฟรน (42) (ภาพท 2.5)

18


ภำพท 2.5 กระบวนการสงเคราะหนอรอพเนฟรนจากกรดอะมโนชนด Tyrosine ภายในรางกาย

ส าหรบกระบวนการสลายนอรอพเนฟรนนนจะเ กดขนหลงจากทนอรอพเนฟรนถก พากลบเขาสเซลลประสาทโดยผานโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน โดยจะถกเอนไซมยอยเปนสารเมทาบอไลท (Metabolites) ตางๆ ดงน (38) (ภาพท 2.6)

1. Normetanephrine ถกสรางจากนอรอพเนฟรนผานทางเอนไซม COMT 2. 3,4-Dihydroxymandelic acid ถกสรางจากนอรอพเนฟรนผานทางเอนไซม MAO 3. Vanillymandelic acid (VMA) ถกสรางจากนอรอพเนฟรนผานทางเอนไซม MAO 4. 3-Methoxy-4-hydroxyphenylethylene glycol (MHPG/MOPEG) ถ ก ส ร า ง จ า ก

นอรอพเนฟรนผานทางเอนไซม MAO

19

5. Epinephrine ถกสรางจากนอรอพเนฟรนผานทางเอนไซม PNMT

การสลายตวของนอรอพเนฟรนโดยอาศยเอนไซมตางๆ สวนใหญจะไดผลตภณฑ คอ VMA ซงจะอยในรปอสระไมจบกบโปรตนอนๆ และสามารถตรวจพบไดในปสสาวะ รองลงมา คอ MHPG ซงเปนผลตภณฑทเกดจากการสลายนอรอพเนฟรนภายในระบบประสาทสวนกลาง โดยจะมบางสวนทจบกบซลเฟต (Sulfate) หรอ กลโคโรไนด (Glucuronide) ซงจะถกขบออกมาในปสสาวะดวยเชนเดยวกน (38)

ทมา: Rod Flower; Humphrey P. Rang; Maureen M. Dale; Ritter, James M. (2007). Rang & Dale's pharmacology. Edinburgh: Churchill Livingstone.

ภำพท 2.6 กระบวนการสลายของนอรอพเนฟรนโดยอาศยเอนไซมชนดตางๆทเกดขนภายในรางกาย

2.7 โปรตนขนสงสำรสอประสำทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporter, MATs)

โดยปกตแลวในเซลลประสาทจะมโปรตนชนดหนงท าหนาทในการควบคมปรมาณของสารสอประสาทใหมปรมาณคงท โปรตนชนดนนคอ โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporters, MATs) โดยจะท าหนาทน าสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปส

20

(Synaptic cleft) กลบไปยงเซลลประสาทบรเวณกอนถงชองวางไซแนปส (Pre-Synaptic cell) ท าใหสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปสลดลง (43, 44) ซงยารกษาโรคซมเศราสวนใหญ จะออกฤทธกดการท างานของโปรตนชนดนท าใหสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปสไมถกพากลบเขาไปปรมาณของสารสอประสาทบรเวณชองวางไซแนปสจงเพมมากขน ท าใหชวยลดอาการแปรปรวนทางอารมณได (44-46)

MATs คอ โปรตนทอยในกลม 12 transmembrane (TM) domain neurotransmitter: sodium symporter (NSS) family ซงอยบรเวณเยอหมเซลล (Plasma Transmembrane protein) ของเซลลประสาทบรเวณ Pre-Synaptic cell โดยสายโปรตนจะแทรกตวอยระหวางชนของเยอหมเซลล ประกอบดวยโดเมน 12 โดเมน (12 transmembrane domains) มทงสวนทอยภายนอกเซลล และภายในเซลล สวนปลายของสายโปรตนทง 2 ขาง (NH2, COOH) จะอยภายในเซลล (47) (ภาพท 2.7) โดยโปรตนทงสายทงภายนอกเซลล และภายในเซลลจะมสวนทไวส าหรบเตมหมฟอสเฟต (phosphorylation) ด วยโปรตนไคเนส (protein kinase) ตา งๆ เชน cAMP-dependent protein kinase, protein kinase C (PKC) แ ล ะ Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (48-51) ซงกลไกการควบคมการท างานของ MATs จะควบคมผานกระบวนการ Phosphorylation และ Post-translational modification

ทมา: SLC6 Neurotransmitter Transporters: Structure, Function, and Regulation Anders S. Kristensen, Jacob Andersen, Trine N. Jørgensen, et al. ภำพท 2.7 ลกษณะโครงสรางของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนทอยบรเวณเยอหมเซลลของเซลลประสาทประกอบดวยโดเมน 12 โดเมน และปลายทง 2 ดานของสายโปรตนอยภายในเซลล

21

MATs จะท าหนาทควบคมปรมาณสารสอประสาทชนดโมโนเอมนทอยบรเวณชองวางไซแนปสใหมปรมาณทเหมาะสม โดยจะน าพาสารสอประสาทชนดโมโนเอมนทอยบรเวณชองวางไซแนปสกลบเขาไปยง Pre-Synaptic cell โดยอาศยกลไกการขนสงโซเดยม และคลอไรด (Na+/Cl- Transportation) เมอถกพาเขาสเซลล สารสอประสาทเหลานนจะเกบอยในรปของถง (Vesicle) และจะถกท าลายโดยเอนไซมโมโนเอมนออกซเดส หรอถกน ากลบไปใชใหมอกครงหนง แตโดยสวนใหญแลวเซลลประสาทจะน าสารสอประสาทเหลานนกลบมาใชใหมอกครงหนง (52) MATs ในรางกายมนษยมอยหลายชนด แต MATs ทเกยวของกบงานวจยนมอย 3 ชนด คอ Serotonin Transporter (SERT) ซงท าหนาทขนสงสารสอประสาทชนด Serotonin, Dopamine Transporter (DAT) ท าหนาทขนสงสารสอประสาทชนด Dopamine และ Norepinephrine Transporter (NET) ท าหนาทขนสงสารสอประสาทชนด Norepinephrine (ภาพท 2.8)

ทมา: PLASMA MEMBRANE MONOAMINE TRANSPORTERS: STRUCTURE, REGULATION AND FUNCTION Gonzalo E. Torres, Raul R. Gainetdinov and Marc G. Caron

ภำพท 2.8 รปแสดงกลไกการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน (Monoamine Transporter)

22

2.7.1 โปรตนขนสงสำรสอประสำทซโรโทนน (Serotonin Transporter, SERT, 5-HTT)

โปรตนขนสงสารสอประสาทซโรโทนน (Serotonin Transporter, SERT, 5-HTT) เปนโปรตนทท าหนาทขนสง 5-HT บรเวณ Synaptic cleft กลบเขาส Pre-synaptic cells ซงมความจ าเพาะตอ 5-HT สงมาก (specific transporter protein) โดยในระบบประสาทสวนกลางจะพบวา SERT อยบรเวณ cerebal cortex, hippocampus และ raphe nuclei ส าหรบระบบประสาทสวนนอก (peripheral nervous system, PNS) จะพบ SERT ไดใน enterochromaffin cells ในระบบทางเดนอาหาร, ตอมหมวกไต, รก, ปอด และเกรดเลอด (53-57) SERT เปนโปรตนทถกสงเคราะหมาจากยนในกลม SLC6 โดย SERT จะสงเคราะหมาจากยน SLC6A4 (hSERT) ทอยบรเวณโครโมโซมท 17 (17 q11.2) โดยจะสงเคราะหไดเปน กรดอะมโน (Amino acid) ทงหมด 630 ตว (47) กลไกการพา 5-HT เขาสเซลลประสาทผาน SERT จะอาศยผานกลไกการขนสงโซเดยม/คลอไรด โดยโซเดยม, คลอไรดทอยภายนอกเซลล และโพแทสเซยมทอยภายในเซลลอยางละ 1 โมเลกลจะเปนสารตงตน (substrate) ในการพา 5-HT 1 โมเลกลเขาสเซลล (58) (ภาพท 2.9) ส าหรบกลไกควบคมการท างานของ SERT จะควบคมผานกระบวนการ Phosphorylation โดยอาศย protein kinase ตางๆ เชน CaMKII, Src, p38 MAP kinase และ PKC นอกจากนปรมาณของแคลเซยม และโซเดยมอออน ภายในเซลลกมสวนควบคมการท างานของ SERT ไดเชนกน (59-66)

2.7.2 โปรตนขนสงสำรสอประสำทโดพำมน (Dopamine Transporter, DAT)

โปรตนขนสงสารสอประสาทโดพามน (Dopamine Transpoter, DAT) เปนโปรตนท ท าหนาทขนสง DA หรอ NE บรเวณ Synaptic cleft กลบเขาส Pre-synaptic cells โดยจะพบ DAT ในระบบประสาทสวนกลางบรเวณ substantia nigra และ ventral tegmental area (VTA) นอกจากนยงพบ DAT ในระบบประสาทสวนนอกไดในระบบทางเดนอาหาร, ตบออน และ เซลลเมดเลอดขาว (32, 33) DAT เปนโปรตนทถกสงเคราะหมาจากยนในกลม SLC6 เชนเดยวกบ SERT ซงจะถกสงเคราะหจากยน SLC6A3 (hDAT) ทอยบรเวณโครโมโซมท 5 (5p15.3) โดยจะสงเคราะหไดเปนกรดอะมโน (Amino acid) ทงหมด 620 ตว (47) กลไก การพา DA เขาสเซลลประสาทผาน DAT จะอาศยผานกลไกการขนสงโซเดยม/คลอไรด โดยโซเดยม 2 โมเลกล และคลอไรด 1 โมเลกลทอยภายนอกเซลล จะเปนสารตงตน (substrate) ในการพา DA 1 โม เลกล เ ข าส เ ซล ล ( 67 ) (ภาพ ท 2.9) ก ระบวนการ phosphorylation ภายในเซลลจะเปนกระบวนการทควบคมการท างานของ DAT โดยอาศย protein kinase ตางๆ ไดแก PKA, PKC, PI-3K, ERK1, ERK2, Akt, CaMKII, CDK5 และ MAPK (68-71)

2.7.3 โปรตนขนสงสำรสอประสำทนอรอพเนฟรน (Norepinephrine Transporter, NET)

โปรตนขนสงสารสอประสาทนอรอพเนฟรน (Norepinephrine Transporter, NET) เปนโปรตนทท าหนาทขนสง NE บรเวณ Synaptic cleft กลบเ ขาส Pre-synaptic cells

23

โดยจะพบ NET ในระบบประสาทสวนกลางบรเวณ hippocampus และ cortex นอกจากนยงพบ NET ในระบบประสาทสวนนอกไดในตอมหมวกไตชนใน , รก และปอด (72-76) NET เปนโปรตนทถกสงเคราะหมาจากยนในกลม SLC6 เชนเดยวกน ซงจะถกสงเคราะหจากยน SLC6A2 (hNET) ทอยบรเวณโครโมโซมท 16 (16q12.2) โดยจะสงเคราะหไดเปน กรดอะมโน (Amino acid) ทงหมด 617 ตว (47) กลไกการพา NE เขาสเซลลประสาทผาน NET จะอาศยผานกลไกการขนสงโซเดยม/คลอไรด โดยโซเดยม 1 โมเลกล และคลอไรด 1 โมเลกล ทอยภายนอกเซลล เปนสารตงตน (substrate) ในการพา NE 1 โมเลกลเขาสเซลล (77) (ภาพท 2.9) กระบวนการ phosphorylation ภายในเซลลจะเปนกระบวนการทควบคมการท างานของ NET เชนกน โดยผาน protein kinase ชนด MAPK และ PKC นอกจากนฮอรโมนอนซลน และ angiotensin II ยงมสวนควบคมการท างานของ NET บรเวณระบบประสาทสวนนอกไดเชนกน (78, 79)

ทมา: SLC6 Neurotransmitter Transporters: Structure, Function, and Regulation Anders S. Kristensen, Jacob Andersen, Trine N. Jørgensen, et al.

ภำพท 2.9 กลไกการขนสง Monoamine เขาสเซลลผาน MATs

2.8 สมนไพรทใชในงำนวจย

เนองจากยาทใชรกษาอาการของโรคซมเศราในปจจบนมผลขางเคยงตอผ ใชมาก กอปรกบปจจบนผคนสวนใหญไมวาในประเทศ หรอตางประเทศ ไดใหความสนใจในการบรโภคสมนไพรทไดจากธรรมชาตเพอรกษาอาการปวยตางๆ หรอปองกน ไมใหเกดโรคตางๆ ขน

24

ดงนนจงมการศกษาวจยเกยวกบสมนไพรตางๆ เพอใชในการรกษาโรคและปองกนโรคเกดขนมากมายรวมไปถงการศกษาวจยเ กยวกบสมนไพรทใชในการรกษาโรคซมเศราอกดวย จากงานวจย ทผานมาทท าการศกษาเ กยวกบสมนไพรตานโรคซมเศรา มรายงานวา St. john’s wort (Hypericum perforatum L.) เปนพชสมนไพรทมฤทธสามารรกษาโรคซมเศราได โดยในประเทศเยอรมนไดมการน าสารสกดจากสมนไพรชนดนมาใชในการรกษาโรคซมเศรา มาเปนเวลานานแลว และจากการน าสารสกดจาก St. john’s wort มาทดสอบกบผ ปวย โรคซมเศรา โดยมการใชยาชนด SSRIs เปนตวควบคม พบวาสมนไพรชนดนสามารถบรรเทาอาการของโรคซมเศราไดคลายกบยาชนดน (80-83) นอกจากน ยงมงานวจยทศกษาฤทธ ของสมนไพรชนดอนๆ ทมฤทธในการตานโรคซมเศรา ไดแก การศกษาของ Shahin และคณะ โดยศกษาฤทธของหญาฝรน (Crocus sativus L.) เปรยบเทยบกบยา Imipramine ซงเปน ยารกษาโรคซมเศราในผ ปวยทปวยเปนโรคซมเศราปานกลาง พบวายา Imipramine กอใหเกดผลขางเคยงในการใชยามากกวาการรกษาดวยหญาฝรน (84) หลงจากนนไดมการศกษาเพมเตม พบวาหญาฝรนมฤทธในการรกษาโรคซมเศราคลายกบการออกฤทธของยาชนด SSRIs (85) และยงมการศกษาฤทธการตานโรคซมเศราจากสารสกด ใบกระเพรา (Ocimum tenuiflorum.) โดยศกษากบสตวทดลอง พบวาสารสกดใบกระเพรานนมฤทธชวยในการรกษาอาการซมเศราไดเชนกน (86)

ส าหรบสมนไพรทน ามาใชศกษาในงานวจยน ไดแก สะระแหน (Mentha cordifolia Opiz ex Fresen) (ภาพท 2.10) บวบก (Centella asiatica L.) (ภาพท 2.11) และ ขเหลก (Senna siamea Lam.) (ภาพท 2.12) ซงเปนสมนไพรพนบานในประเทศไทยและมการศกษาเกยวกบสรรพคณทชวยในการบ ารงสมองในวารสารตางๆ และเปนสมนไพรทน ามาใชในการรกษาโรคตางๆในอดต

25

ทมา: http://jitty12.multiply.com/photos/album/77/77#photo=6

ภำพท 2.10 ลกษณะโครงสรางของตนสะระแหน

2.8.1 สะระแหน (Kitchen mint)

สะระแหน หรอ สะระแหนสวน ชอวทยาศาสตร คอ Mentha cordifolia Opiz ex Fresen เปนพชลมลก ล าตนมลกษณะเปนสเหลยมสเขยวแกมมวงน าตาล ใบเลยงเดยว เรยงตรงขามรปวงรคอนขางกวาง ผวใบยน ขอบใบหยกเปนฟนเลอย มกลนเฉพาะ ดอกชอออกเปนกระจกทซอกใบ ผลแหงไมแตก (87) สะระแหนเปนพชสมนไพรทใชในการรกษาโรคตางๆในสมยโบราณ และน ามาใชเปนสมนไพรพนบานเพอรกษา และบ ารงรางกายมาจนถงปจจบน โดยมการบนทกในคมภรอายรเวท (Ayurveda) วา สะระแหน มฤทธในการผอนคลายความเครยด และชวยในการฟนฟการท างานของสมอง และระบบประสาท นอกจากน สะระแหนยงมฤทธชวย ในการขบลม ขบเสมหะ แกผนแพจากแมลง แกวงเวยนศรษะ และ แกปวดตางๆ ไมวาจะปวดขอ ปวดหว หรอปวดกลามเนอ (88) จากการศกษาทผานมาพบวา ในสะระแหนมสารประกอบหลายชนดดวยกน เชน cadinene, cavone, p-cymene, limonene, menthol (89) และจากการศกษาของ McKemy และคณะในป ค.ศ. 2002 พบวา สาร menthol มฤทธกระตนการท างานของ Transient receptor potential (TRP) Channels ชนด TRPM8 ซงเปนโปรตนขนสงอออนชนดนงในระบบประสาท โดยการท างานจะมความสมพนธกบการรบรความรสกเยนของรางกาย โดยโปรตน TRPM8 จะถกกระตนใหท างานเมอสภาพแวดลอมมอณหภมต ากวา 25 องศาเซลเซยส (90) นอกจากนจากการศกษาของ Irene และคณะในป ค.ศ. 2002 พบวาสารสกดจากใบสะระแหนดวยเอทานอลมฤทธในการตานการกลายพนธของสารพนธกรรม (antimutagenic) ไดอกดวย (91)

http://jitty12.multiply.com/photos/album/77/77#photo=6

26

ทมา: http://www.n3k.in.th/สมนไพร/ใบบวบก ภำพท 2.11 ลกษณะโครงสรางของตนบวบก

2.8.2 บวบก (Gotu kola)

บวบก หรอ ผกแวน ผกหนอก ชอวทยาศาสตร คอ Centella asiatica L. (Umb.) มลกษณะเปนไมลมลกอายหลายป เลอยแผไปตามพนดน ชอบทชนแฉะ แตกรากฝอยตามขอ ไหลทแผไปจะงอกใบจากขอชขน 3-5 ใบ ใบเดยว เรยงสลบ รปไตเสนผาศนยกลางประมาณ 2-5 เซนตเมตร ขอบใบหยก กานใบยาว ดอกชอออกทซอกใบ ขนาดเลก 2-3 ดอก กลบดอก สมวง ผล เปนผลแหง แตกได (87) เปนพชสมนไพรอกชนดหนงทมการบนทกไวในคมภรอายรเวทวามสรรพคณชวยในการบ ารงสมอง ฟนฟเซลลสมองทมการเสอมสภาพ ซงท าให มความจ าทดขน และจากงานวจยของ Wijeweera และคณะ ศกษาพบวาบวบกนนมฤทธในการยบยงการท างานของเอนไซม GABA transaminase ซงเปนเอนไซมทใชในการสลาย สารสอประสาท Gamma-aminobuteric acid (GABA) เปนเหตใหสารสอประสาทชนดนลดนอยลง โดยสารสอประสาท GABA เปนสารสอประสาททชวยในการท าใหระบบประสาทสวนกลางเกดการผอนคลาย (Relax) และท าใหมการฟนฟและซอมแซมเซลลประสาททมความเสยหาย ท าใหปองกนการเสอมสภาพของเซลลประสาท ดงนนถาสารสอประสาท GABA ถกท าลายโดยเอนไซม GABA transaminase มากเกนไป จะท าใหระบบประสาทสญเสย เซลลประสาทไปท าใหเกดความผดปกตของระบบประสาทขนได เชน ความสามารถในการจดจ าลดลงเปนเหตใหเกดโรคอลไซเมอร (Alzheimer disease) (92) โดยสารประกอบทสามารถพบไดในบวบก ไดแก สารประกอบจ าพวก monoterpenes (bornyl acetate, pinene) เ ปนสาร ทสามารถยบย ง การท า งานของ เอนไซม Acehylcholine esterase (AChE),

27

สารประกอบ alkaloids, สารประกอบ atropine เปนสารทมฤทธกดประสาท, สารประกอบ Asiatic acid และสารประกอบ brahmoside ทมฤทธชวยในการจดจ า และแกอาการปวดหวขางเดยว (antiamnestic) เปนตน (92-96)

ทมา: http://www.tratcc.ac.th/wwwstd/14samoonpai/page_pa_04.html

ภำพท 2.12 ลกษณะโครงสรางของตนขเหลก

2.8.3 ขเหลก (Cassod tree)

ขเหลก หรอ ขเหลกใหญ (ภาคกลาง) ขเหลกแกน (ราชบร) ขเหลกหลวง (ภาคเหนอ) ขเหลกบาน (ล าปาง, สราษฎรธาน) ผกจล (เงยว-แมฮองสอน) แมะขแหละพะโด (กะเหรยง-แมฮองสอน) ยะหา (มลาย-ปตตาน) ชอวทยาศาสตร คอ Senna siamea Lam. มลกษณะเปนไมยนตน สง 10-15 เมตร แตกกงกานเปนพมแคบ เปลอกตนสน าตาล แตกเปนรองตนๆ ตามยาว ใบ เปนใบประกอบแบบขนนกออกเรยงสลบกน มใบยอย 13-19 ใบรปรดอกออกเปนชอแบบชอแยกแขนงทปลายกง ดอกสเหลอง ปลายมน โคนเรยว หลดรวงงาย (87) ขเหลกเปนสมนไพรพนบานทชาวบานน ามาใชในการรกษาอาการนอนไมหลบ (Insomnia) มาแตโบราณ และจากการศกษาสวนประกอบในสารสกดจากใบขเหลกพบวาในสารสกดมสวนประกอบของสารชนดหนง โดยนกวทยาศาสตรไดตงชอสารชนดนวา บาราคอล (Barakol) โดยสารชนดนมฤทธชวยในการระงบประสาท และกดประสาทได และยงชวยในการผอนคลายความวตกกงวล (Anxiety) ไดอกดวย แตอยางไรกตามมการศกษาพบวาสารชนดนมพษตอตบถาทานในปรมาณมากอาจท าใหเกดอาการตบอกเสบขนได (97)

28

บทท 3

วธด ำเนนกำรวจย

3.1. เครองมอ อปกรณ และสำรเคมทใชในกำรทดลอง

3.1.1 เครองมอ บรษทผผลต ประเทศ

1. เครองวดคาการดดกลนแสง Synergy Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader

BioTek

Instruments, Inc.

สหรฐอเมรกา

2. เครองวดการดดกลนแสง Nanodrop 1000 Thermo

Scientific, Inc


3. กลองจลทรรศนชนดหวกลบ (inverted

microscope) รน Olympus CK30

Olympus ญป น

4. เครอง thermal cycler รน DNA Engine PTC-200 BIO-RAD สหรฐอเมรกา

5. เครอง thermal cycler รน Mastercycler EP Eppendorf AG เยอรมน

6. ชดถายภาพเจล (Transilluminator และ Doc-Print) VILBER

LOURMAT

ฝรงเศส

7. เครองถายภาพเจล Gel Documentation (Gel Doc)

systems

Syngene องกฤษ

8. เครอง Micro High Speed Refrigerated

Centrifuge รน VS-15000CFNII

Vision Scientific

Co.,Ltd

เกาหลใต

9. เครองเขยาผสม (vortex mixer) รน FINE VORTEX FINEPCR เกาหลใต

29

10. เครอง vacuum concentrator (DNA

speedVacs) รน DNA110-230

Thermo

Scientific, Inc.


11. เครอง suction รน Pumpe 4010 Boehringer

Mannheim

เยอรมน

12. เครอง cryocentrifuge รน Biofuge Stratos Kendro

Laboratory

Products

เยอรมน

13. เครอง Evaporation รน miVAC Genevac องกฤษ

14. เครอง Lyophilizer รน MODULYOD Thermo Electron

CORP.


15. เครองชงแบบละเอยด รน AB204-S CLASSIC METTLER

TOLEDO

สวสเซอรแลนด

16. ตอบ (incubator shaker) Minitron Appropriate

Technical

Resources, Inc.


17. ตอบเพาะเลยง CO2 (CO2 incubator) Sheldon

Manufacturing

Inc


18. ตอบ (incubator) Memmert เยอรมน

30

19. ตปลอดเชอ (class II biosafety cabinet)รน

NapFLOW (Napco)

Thermo

Scientific, Inc.


20. ตปลอดเชอ (larminar flow cabinet) E.S.I.

FLUFRANCE

ฝรงเศส

21. อางน าควบคมอณหภม (waterbath) Memmert เยอรมน

22. ตแชแขง -20 °C (Top Open Chest Freezer) SANYO Electric

Co.,Ltd

ญป น

23. ตแชแขง -80 °C (ULT Deep Freezer) รน

DF8524

ilShin Lab

Co.,ltd.

เกาหลใต

24. เครองท าน า Milli-Q MERCK

Millipore


25. ถง liquid nitrogen รน XT20 TAYLOR-

WHARTON


26. SUB CELL รน Mini-Sub Cell GT BIO-RAD สหรฐอเมรกา

27. SUB CELL รน Wide Mini-Sub Cell GT BIO-RAD สหรฐอเมรกา

28. เครอง power supply รน POWER PAC 200 BIO-RAD สหรฐอเมรกา

29. เครอง power supply รน SX250 MightySlim

PSU.

Hoefer, Inc. สหรฐอเมรกา

30. เครอง Gel electrophoresis tank รน i-MyRun Cosmo Bio สหรฐอเมรกา

31

3.1.2 อปกรณ บรษทผผลต ประเทศ

1. Auto pipette (ขนาด 20, 200, 1000 µL) GILSON ฝรงเศส

2. Auto pipette (ขนาด 10, 20, 200, 1000 µL) Eppendorf AG เยอรมน

3. Pipette aid รน Portable XP Drummond

Scientific


4. Pipette tips (ขนาด 10, 200, 1000 µL) Corning Inc. สหรฐอเมรกา

5. Barriertips (ขนาด 10, 20, 200, 1000 µL) Thermo Fisher

Scientific Inc.


6. Microcentrifuge tube (ขนาด 0.5 mL และ 1.5

mL) และ PCR tube

Continental Lab

Products, Inc.


7. Centrifuge tube (ขนาด 15 mL และ 50 mL) Corning, Inc. สหรฐอเมรกา

8. 96-well cell culture cluster, flat bottom with lid Corning Inc. สหรฐอเมรกา

9. 96-well black with clear flat bottom tissue

culture treated with lid

Corning Inc. สหรฐอเมรกา

10. 6-well cell culture cluster, flat bottom with lid Corning Inc. สหรฐอเมรกา

11. Cell culture dish (ขนาด 100mm × 20mm) Corning Inc. สหรฐอเมรกา

12. Cell culture flask (ขนาด 25 cm2 และ 75 cm2) Corning Inc. สหรฐอเมรกา

13. Disposable serological pipette (ขนาด 5 mL,

10 mL และ 25 mL)

Corning Inc. สหรฐอเมรกา

32

14. Pasteur pipette COPAN

innovation


15. Cryovial tube (ขนาด 2 mL) Simport plastics แคนาดา

16. Filter Paper NO.3 Whatman

International Ltd.

องกฤษ

17. Syringe Filter Corning Inc. สหรฐอเมรกา

3.1.3 สำรเคม บรษทผผลต ประเทศ

1. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)

powder low glucose with 4.00 mM/L Glutamine,

1000 mg/L Glucose and 110 mg/L Sodium

Pyruvate

Gibco สหรฐอเมรกา

2. Sodium hydrogen carbonate Merck เยอรมน

3. Fetal bovine serum (FBS) Hyclone สหรฐอเมรกา

4. HyQ trypsin 0.25 % with EDTA with 2.5 g

porcine trypsin without calcium, magnesium

Hyclone สหรฐอเมรกา

5. Phosphate buffered saline Hyclone สหรฐอเมรกา

6. 100x Antibiotic-Antimycotic solution 10,000

units/mL Penicillin, 10,000 µg/mL Streptomycin

Amphotericin B 250 µg/mL

Hyclone สหรฐอเมรกา

7. Thiazoyl blue tetrazolium bromide (MTT) Bio Basic Inc. แคนาดา

33

8. Dimethyl sulfoxide (DMSO) MERCK เยอรมน

9. Dimethyl sulfoxide (DMSO), for molecular

biology

Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

10. TRIzol® RNA Isolation Reagents Invitrogen สหรฐอเมรกา

11. Chloroform Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

12. 2-propanol Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

13. Absolute ethanol MERCK เยอรมน

14. Absolute ethanol RCI Labscan ไทย

15. ชดน ายา Taq DNA polymerase New England

biolab (NEB)

องกฤษ

16. Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) Fermentas แคนาดา

17. ชดน ายา SuperScript III reverse transcriptase Invitrogen สหรฐอเมรกา

18. RNase AWAY (for RNase decontamination) Continental Lab

Products, Inc.


19. เอนไซม Deoxyribonuclease I, Amplification

Grade

Promega สหรฐอเมรกา

20. RiboLockTM RNase Inhibitor Fermentas แคนาดา

21. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

22. GenePure LE Agarose ISC BioExpress สหรฐอเมรกา

34

23. gene ruler 100-3000 bp DNA ladder Fermentas แคนาดา

24. Ethidium bromide Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

25. Tris base Biobasic แคนาดา

26. Glacial acetic acid J.T. Baker ไทย

27. Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt BDH องกฤษ

28. ชดน ายา Neurotransmitter transporter uptake

assay kit

Molecular

device


29. 10X Hanks’ Balance Salt Solution Gibco สหรฐอเมรกา

30. HEPES Free acid Hyclone สหรฐอเมรกา

31. Fluoxetine hydrochloride Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

32. GBR 12935 dihydrochloride Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

33. Desipramine hydrochloride Sigma-Aldrich สหรฐอเมรกา

3.2 กลมตวอยำงทเกยวของในงำนวจย

3.2.1 ตวอยำงเซลลเพำะเลยง

เซลล เพาะ เ ล ย ง ท ใ ช ในงานวจย น คอ เซลลประสาทเพาะเ ล ยงชนด LAN-5 ซงเปนเซลลมะเรงประสาทมนษยทน ามาจากไขกระดกของเดกผ ชายอาย 5 ป โดยอาหาร ทใชเลยงเซลลชนดนคอ Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low glucose (DMEM/ Low glucose) ทม fetal bovine serum อย 10 เปอรเซนต (v/v) และยาปฏชวนะคอ 100x Antibiotic-Antimycotic solution 10,000 units/mL Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin Amphotericin B 250 µg/mL ซงจะเลยงอยในสภาวะคารบอนไดออกไซด 5 เปอรเซนต อณหภม 37 องศาเซลเซยส

35

3.2.2 ตวอยำงของสมนไพร ส าหรบสมนไพรทน ามาใชทดสอบในงานวจยนมทงหมด 3 ชนด ดงน - สะระแหน สวนทใช ใบ แหลงทมา กรงเทพมหานคร

- บวบก สวนทใช ทงตน แหลงทมา ชลบร

- ขเหลก สวนทใช ใบ แหลงทมา กรงเทพมหานคร โดยสมนไพรทง 3 ชนด น ามาจากสวนผกภายในกรงเทพมหานคร และ จงหวดชลบร

ประเทศไทย โดยมการพสจนชนดของสมนไพรทใชในการศกษาวจยโดย ศ.ดร.ทวศกด บญเกด ภาควชาพฤกษศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย และเกบตวอยางของสมนไพรไทยในพพธภณฑพช (herbarium) ณ พพธภณฑพช ศ.กสน สวตะพนธ ภาควชาพฤกษศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

3.2.3 ตวอยำงของยำตำนโรคซมเศรำ (Antidepressant drug) ส าหรบยาตานโรคซมเศราทน ามาใชทดสอบในงานวจยนมทงหมด 3 ชนด ดงน

- Fluoxetine hydrochloride ใชเปนยาอางองในการทดสอบการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน (ภาพท 3.1)

ภำพท 3.1 โครงสรางโมเลกลของยา fluoxetine hydrochloride

- GBR 12935 dihydrochloride ใชเปนยาอางองในการทดสอบการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน (ภาพท 3.2)

ภำพท 3.2 โครงสรางโมเลกลของยา GBR12935 dihydrochloride

- Desipramine hydrochloride ใชเปนยาอางองในการทดสอบการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน (ภาพท 3.3)

36

ภำพท 3.3 โครงสรางโมเลกลของยา desipramine hydrochloride โดยงานวจยของ Gang Zhao และคณะไดใชยาทง 3 ชนด เปนยาอางองทใชในการ

ทดสอบการท างานของตวขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน โดยใชความเขมขนท 10 ไ ม โคร โมลา รส า ห ร บ fluoxetine hydrochloride และ desipramine hydrochloride 0.1 ไมโครโมลารส าหรบ GBR 12935 dihydrochloride (98)

3.3 กำรเตรยมสำรสกดสมนไพรและสำรละลำยยำตำนโรคซมเศรำทใชในกำรศกษำวจย

3.3.1 กำรสกดสมนไพรดวยตวท ำละลำยเอทำนอลโดยวธมำเซอเรชน (Maceration) วธมาเซอเรชน (Maceration) เปนวธการสกดสารส าคญจากพชหรอสมนไพรโดย

การหมกพชหรอสมนไพรกบตวท าละลายจนกระทงเนอเยอของพชหรอสมนไพรออนนม และตวท าละลายสามารถแทรกซมเขาไปละลายองคประกอบภายในพชหรอสมนไพรออกมาได

เรมจากน าสมนไพรสดมาลางน าใหสะอาดและน าไปตากใหแหง บดสมนไพรใหละเอยดเปนผง จากนนน าไปหมกกบตวท าละลายเอทานอล ทอตราสวนระหวางสมนไพรบดแหงบดแหง 1 กรมตอตวท าละลาย 10 มลลลตร ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง น าสารสกดทไดมากรองดวยกระดาษกรอง Whatman NO.3 จากนนน าไประเหยตวท าละลายออกดวยวธ evaporation ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส ไดสารสกดหยาบ (crude extract) ออกมา ละลายสารสกดหยาบใหไดความเขมขน 100 มลลกรมตอมลลลตร ดวย dimethyl sulphoxide (DMSO) และน ามากรองดวย syringe filter ทมขนาดของรกระดาษกรอง เทากบ 0.2 ไมโครเมตร เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ในทมด

3.3.2 กำรสกดสมนไพรดวยตวท ำละลำยน ำโดยวธตม (Boil) น าผงสมนไพรแหงทไดในขนตนมาตมกบน ากลนทอตราสวนสมนไพรบดแหง 1 กรมตอ

น า 10 มลลลตร ทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ทงสารสกดไวใหเยนแลวน ามากรองดวยกระดาษกรอง Whatman NO.3 จากนนน าไปท าใหแหงดวยวธ lyophilization จนไดเปนสารสกดหยาบ (crude extract) ออกมา ละลายสารสกดหยาบดวย DMSO ใหได

37

ความเขมขน 100 มลลกรมตอมลลลตรและน ามากรองดวย syringe filter ทมขนาด ของรกระดาษกรองเทากบ 0.2 ไมโครเมตร เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ในทมด

3.3.3 กำรเตรยมยำตำนโรคซมเศรำ น าสาร fluoxetine hydrochloride, desipramine hydrochloride และ GBR12935

dihydrochloride มาละลายดวยน ามลลคว (Milli-Q) ใหไดความเขมขนเรมตนเทากบ 10 มลลโมลลาร จากนนน าไปท าใหปราศจากเชอโดยกรองดวย syringe filter ทมขนาด ของรกระดาษกรองเทากบ 0.2 ไมโครเมตร เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ในทมด

3.4 กำรทดสอบฤทธทำงชวภำพในกำรตำนโรคซมเศรำของสำรสกดจำกสมนไพร

3.4.1 กำรทดสอบควำมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ของสำรสกดจำกสมนไพร และยำตำนโรคซมเศรำดวยวธ MTT assay เทคนค MTT เปนเทคนคทวดการเปลยนแปลงของส (Colorimetric assays) โดยสาร

สเหลอง MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,a tetrazole) จะถกรดวซโดยเอนไซมในเซลลทยงมชวตอย เปลยนเปนตะกอนของ formazan สมวงสามารถละลายตะกอน formazan ดวยสารตวท าละลาย dimethyl sulfoxide (DMSO) จากนนวดคาการดดกลนแสง (absorbance) ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลนตงแต 500-600 nm (99)

ภำพท 3.4 ปฏกรยารดกชน (Reduction reaction) ของวธ MTT assay

เลยงเซลลประสาทเพาะเลยงในจานเพาะเลยงขนาด 96 หลม โดยใหมจ านวนเซลล ในแตละหลมเทากบ 25,000 เซลล และมปรมาตรเทากบ 150 ไมโครลตร น าเซลลไป บมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด, อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา

38

24 ชวโมง จากนนน ามาทดสอบกบสารทดสอบ ดงน 1.) สารสกดสมนไพรแตละชนดทความเขมขน 1,000, 800, 600, 300, 100, 50, และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตรในอาหารเลยงเซลล 2.) สารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนดทความเขมขน 1000, 100, 10, 1 และ 0.1 ไมโครโมลาร ในอาหารเลยงเซลล 3.) อาหารเลยงเซลล โดยปรมาตรสดทายเทากบ 200 และน าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนน ามาเตมสารละลาย MTT (ความเขมขน 5 mg/ml ในฟอสเฟตบฟเฟอร, pH 7.5) 20 ไมโครลตร (สารละลาย MTT 10 ไมโครลตรตอปรมาตรสดทาย 100 ไมโครลตร) แลวน ากลบเขาไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง เมอครบเวลา น ามาดดสวนน าใสดานบนทงทงหมด เตมสารผสมระหวาง DMSO และ เอทานอลในอตราสวน 1 ตอ 1 จ านวน 200 ไมโครลตร ใชปเปตดดขนลงจนตะกอนถกละลายจนหมด แลวดดสวนน าดานบน 100 ไมโครลตร ใสจานเพาะเลยงเซลลใหม น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ดวยเครองวดคาการดดกลนแสง Synergy Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader จากนนน าคาดดกลนแสงทไดมาค านวณหาเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลล (% cell viability)

% cell viability = (treated cell - blank) x 100 (untreated cell - blank)

3.4.2 กำรทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรแสดงออก ในระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ดวยว ธ Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) เพาะเลยงเซลลประสาท LAN-5 ลงในจานเพาะเลยงขนาด 6 หลม โดยใหมจ านวนเซลล

ในแตละหลมเทากบ 550,000 เซลล และมปรมาตรเทากบ 1.5 มลลลตร น าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนน ามาทดสอบกบสารทดสอบ ดงน 1.) สารสกดสมนไพรแตละชนดทความเขมขน 100 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร 2.) อาหารเลยงเซลล โดยใหมปรมาตรสดทายเทากบ 2 มลลลตร และน าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบเวลาจงน าเซลลมาสกดอารเอนเอ (Total RNA) โดยใชน ายา TRIzol

3.4.2.1 กำรสกด Total RNA โดยใชน ำยำ TRIzol

39

น าเซลลทเพาะเลยงไวมาลางดวยฟอสเฟตบฟเฟอร 1 ครง เตมน ายา TRIzol 1 มลลลตร ตอเซลลจ านวน 5x10^6 เซลล ผสมใหเซลลเปนเนอเดยวกนโดยใชปเปต ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท ดดสารละลายทงหมดใสในหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร เตมสารละลายคลอโรฟอรมเยน 200 ไมโครลตร ตอ น ายา TRIzol 1 มลลลตร ผสมสารใหเปนเนอเดยวกนโดยการเขยาอยางรนแรง ตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 3 นาท น าไปปนตกตะกอนทความเรวไมเกน 12,000 g นาน 15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จะไดเปนสารละลายทงหมด 3 ชน โดยอารเอนเอจะอยในสวนใสชนบนสด ดดสวนใสชนบนสดประมาณ 400 ไมโครลตร ใสในหลอดทดลองอนใหมขนาด 1.5 มลลลตร เตมสารละลายไอโซโพรพานอลเยน 500 ไมโครลตร ตอน ายา TRIzol 1 มลลลตร ผสมใหเขากนโดยการกลบหลอดขนลงประมาณ 10 ครง ตงทงไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท น าไปปนตกตะกอนทความเรว 12,000 g นาน 10 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จะเกดเปนตะกอนรปเขมสขาวขนทกนหลอด จากนนเทสารสวนใสดานบนทง ลางตะกอนดวย 75 เปอรเซนตเอทานอลในน า (DEPC-treated water) ทปราศจากเอนไซมยอยอารเอนเอ (RNase) ปนทความเรว 7500 g อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท เทสวนใสทง ตากตะกอนอารเอนเอใหแหง ละลายตะกอนอารเอนเอดวยน า DEPC ทปราศจาก RNase ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เกบรกษาอารเอนเอทสกดไดไวทอณหภม -80 องศาเซลเซยส ไดนานหลายเดอน

3.4.2.2 กำรวดควำมเขมขนของ total RNA ทสกดได ดวยกำรวดคำ Optical Density (OD) น าอารเอนเอทสกดได 2 ไมโครลตร ตรวจวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

260 และ 280 นาโนเมตร ดวยเครอง NanoDrop โดยใหคา OD260 มคาเทากบ 1.00 เทยบไดกบปรมาณอารเอนเอ 40 µg/ml ไมตองเจอจางอารเอนเอดวยน ากลนกอน เครองจะท าการค านวณคาความเขมขนอารเอนเอจากสตร

[RNA] = OD260 x 40 x คาการเจอจาง x 10-3

3.4.2.3 กำรก ำจดดเอนเอปนเปอนออกจำกตวอยำงอำรเอนเอดวยเอนไซม DeoxyribonucleaseI (DNase I)

40

น าอารเอทสกดไดปรมาณ 500 ng มาท าปฏกรยากบเอนไซม DNase I ดงตารางท 3.1 ตงทงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เมอครบเวลาใหหยดการท างานของเอนไซม DNaseI ดวย 25 mM EDTA, pH 8.0 ทอณหภม 65 องศา-เซลเซยส เปนเวลา 10 นาท

ตำรำงท 3.1 ขนตอนกำรเตมน ำยำเพอก ำจดดเอนเอปนเปอนออกจำกตวอยำงอำรเอนเอ

Reagent ปรมำตรตอ 1 ปฏกรยำ (µl) 10x DNase I Reaction buffer 1 DNase I 1 RNA ขนกบความเขมขนของ RNA ตวอยาง DEPC-treated water เตมใหปรมาตรของปฏกรยาครบ 10 µl รวมปรมาตรทงหมดเปน 10 µl ตงทงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท

25 mM EDTA, pH 8.0 1 น าไปวางไวทอณหภม 65ºC เปนเวลา 10 นาท

3.4.2.4 กำรสรำง complementary DNA (cDNA) จำกอำรเอนเอ น าอารเอนเอทผานการก าจดดเอนเอปนเปอน 10 ไมโครลตร ท าปฏกรยากบ

เอนไซม Reverse Transcriptase (RT) ดงตารางท 3.2 โดยมสภาวะทเหมาะสมในการท าปฏกรยาคอ ตงทอณหภม 25 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท ปรบอณหภมขนเปน 50 องศาเซลเซยส นาน 60 นาท ซงเปนอณหภมทเหมาะสมในการท างานของเอนไซม RT จากนนหยดปฏกรยาของเอนไซมโดยปรบอณหภมขนเปน 70 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท

ตำรำงท 3.2 ขนตอนกำรเตมน ำยำเพอสรำง cDNA จำกอำรเอนเอ

41

Reagent ปรมำตรตอ 1 ปฏกรยำ (µl) 50 µM Oligo-dT 20 mer 1 Total RNA 10pg-5µg 10 10 mM dNTP Mix 1 DEPC-treted water เตมใหครบ 13 µl

ทงไวทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวแชน าแขงทนท นาน 1 นาท SuperScript III 5X First-Strand Buffer 4 SuperScript III 0.1 M DTT 1 40 unit RiboLock 1 SuperScript III Reverse Transcriptase (200 units/ µl) 1

รวมปรมาตรสดทายเทากบ 20 ไมโครลตร

3.4.2.5 กำรทดสอบกำรแสดงออกระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ดวยเทคนค Polymerase chain reaction (PCR) ท า PCR เพอตรวจสอบการแสดงออกระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ

hSERT ของเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดยใช cDNA จากขนตอน 3.2.2.4 เปน ดเอนเอตนแบบ ผสมกบชดน ายาท า PCR ดงตารางท 3.3 และใช primers ทจ าเพาะ ตอยนทตรวจวดส าหรบตรวจสอบการแสดงออกยนทสนใจ ดงตารางท 3.4 โดยปรมาตรสดทายจะเทากบ 25 ไมโครลตร จากนนท าการเพมปรมาณดเอนเอ ดวยเทคนค PCR โดยใชเครอง Themal Cycler ในสภาวะทเหมาะสมในการท าปฏกรยา ดงตารางท 3.5 น ามาตรวจสอบขนาดของดเอนเอ โดยใชกระแสไฟฟา บน agarose gel ความเขมขน 2 เปอรเซนตใชความตางศกย 90 โวลต (gel electrophoresis) ยอมเจลดวย เอทเดยมโบรมายด และถายภาพเจลทยอมแลวดวยเครองถายภาพเจล จากนนวดความเขมของชนผลตภณฑในภาพโดยใชโปรแกรม GeneTool เปรยบเทยบความเขมของชนผลตภณฑ (product band) เพอดระดบการแสดงออกของ mRNA เทยบกบชนผลตภณฑของยนควบคม (GAPDH) และค านวณหารอยละของการแสดงออกของ mRNA ใน เซลลเพาะเลยงทถกทดสอบดวยสารสกดสมนไพรเทยบกบเซลลเพาะเลยงทไมมสารทดสอบ (%cell expression of mRNA)

%cell expression of mRNA = 100 x treated cell

42

untreated cell

ตำรำงท 3.3 ขนตอนกำรเตมน ำยำเพอเพมจ ำนวนชนสวนดเอนเอของยนทสนใจศกษำ

น ำยำ ปรมำตรตอ 1 ปฏกรยำ (µl) 10X NEB Standard Buffer 2.5 ส าหรบ DAT, NET และ SERT

3.25 ส าหรบ GAPDH 10 mM dNTP Mix 0.5 10 µM Forward primer 0.5 ส าหรบ DAT, NET และ SERT

0.125 ส าหรบ GAPDH 10 µM Reward primer 0.5 ส าหรบ DAT, NET และ SERT

0.125 ส าหรบ GAPDH DMSO* 1.25

Taq-DNA polymerase 0.125ส าหรบ DAT, NET และ SERT 0.1875 ส าหรบ GAPDH

cDNA 5 ส าหรบ DAT, NET และ SERT

1 ส าหรบ GAPDH

Milli-Q water 14.625 ส าหรบ NET และ SERT

15.875 ส าหรบ DAT 18.5625 ส าหรบ GAPDH

รวมปรมาตรสดทายเทากบ 25 ไมโครลตร เพมจ านวน DNA ดวยเทคนค PCR หมายเหต: *DMSO ใสเฉพาะ NET, SERT และ GAPDH

ตำรำงท 3.4 Primersจ ำเพำะส ำหรบตรวจสอบกำรแสดงออกของยนและขนำดของผลตภณฑ

ยน ล ำดบเบส ขนำด

ผลตภณฑ

43

hDAT forward primer(100) 5’ GTC ACC AAC GGT GGC ATC TA 3’ 195 bp

hDAT reverse primer(100) 5’GCT GAC CAG CTT CCA GCA 3’ hNET forward primer(101) 5’ GCT TCT ACT ACA ACG TCA TCA TC 3’

294 bp hNET reverse primer(101) 5’ CGA TGA CGA CGA CCA TCA G 3’ hSERT forward primer(101) 5’ CAT CTG GAA AGG CGT CAA G 3’

319 bp hSERT reverse primer(101) 5’ CGA AAC GAA GCT CGT CAT G 3’ GAPDH forward primer(102)

5’ GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC T 3’

452 bp GAPDH reverse primer(102)

5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG 3’

ตำรำงท 3.5 ปฏกรยำและอณหภมทใชในกำรเพมจ ำนวนดเอนเอของยน hDAT, hNET, hSERT และ GAPDH

ขนตอน อณหภม (ºC) เวลำ (นำท) จ ำนวนรอบ Pre-denature 94 2 1

Denature 95 45 วนาท

40 Annealing 55 ส าหรบ NET, SERT และ GAPDH

57.2 ส าหรบ DAT 45 วนาท

Extension 72 45 วนาท

Final extension 72 7 1 Hold temp. 4 forever -

3.4.3 กำรทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรตำนโรคซมเศรำ ทมผลตออตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทโดพำมน, นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 โดยใชชดน ำยำ Neurotransmitter transporter uptake assay kit

ชดทดสอบ Neurotransmitter transporter uptake assay kit (Molecular Devices) ภายในน ายาของชดทดสอบจะมสวนประกอบของโมเลกลทสงเคราะหเลยนแบบสารสอ

44

ประสาทชนดโมโนเอมนท าใหโมเลกลเหลานนสามารถเคลอนทผานตวขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนได ซงโมเลกลนนตดฉลากดวยสารเรองแสงฟลออเรสเซนต (Fluorescent) ทมสารกดการเรองแสงอยเมออยในสภาวะปกต (Masking Dye) แตเมอน าน ายาไปท าการทดสอบกบเซลลเพาะเลยงทมการแสดงออกของยน หรอมองคประกอบของตวขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน โมเลกลเลยนแบบนนจะสามารถเคลอนผานเขาสเซลลโดยอาศยชองทางของตวขนสงสารสอประสาทเหลานนท าใหสารกดการเรองแสงฟลออเรสเซนตหลดออก ดงนนเมอน าเซลลเพาะเลยงไปวดการเรองแสงฟลออเรสเซนตโดยใชเครอง Fluorometer จะสามารถวดการเรองแสงฟลออเรสเซนตไดภายในเซลล โดยคาการดดกลนแสงทวดไดจะแปรตามปรมาณโมเลกลเลยนแบบทเคลอนผานตวขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนทท างานไดเขาสเซลลเพาะเลยงท าใหสามารถวดอตราการท างานของตวขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนได (ภาพท 3.5)

ทมา: http://www.moleculardevices.com/Products/Assay-

Kits/Transporters/Neurotransmitter.html

ภำพท 3.5 หลกการของชดน ายา Neurotransmitter Transporter Uptake Assay Kit

เลยงเซลลประสาทเพาะเลยงในจานเพาะเลยงขนาด 96 หลม ชนดกนใสดานขางมด โดยใหมจ านวนเซลลในแตละหลมเทากบ 35,000 เซลล และมปรมาตรเทากบ 100 ไมโครลตร น าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด, อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบเวลาใชปเปตดดเอาอาหารเลยงเซลลออกใหหมด จากนนน ามาทดสอบกบสารทดสอบดงตารางท 3.6 ซงสามารถแบงเปนกลมทดสอบได 4 กลม ดงตารางท 3.7 โดยปรมาตรสดทายเทากบ 100 ไมโครลตร น าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนน ามา

45

เตมน ายา fluorescent dye/masking dye mix ลงไปในแตละหลมการทดสอบปรมาตร 100 ไมโครลตร น าไปวดอตราการเรองแสงฟลออเรสเซนตทเวลาท 0, 10, 20, 30, 40, 50 และ 60 นาท ทความยาวคลน 440, 550 นาโนเมตร ดวยเครอง Synergy Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader ขอมลทไดน ามาหกออกจากคาการเรองแสงฟลออเรสเซนตของสารทดสอบและเซลลทไมไดใสน ายา fluorescent dye/masking dye mix (Blank) จากนนน าคาทไดมาสรางกราฟความสมพนธระหวางคาอตราการเรองแสง ฟลออเรสเซนต (RFU) และระยะเวลาทวด (min) (ภาพท 3.6) และน ามาค านวณหาพนทใตกราฟ (Area below curve) โดยใชโปรแกรม Sigma Plot เวอรชน 11.0

3.4.4 กำรทดสอบควำมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ของสำรทดสอบทใชในกำรทดสอบอตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทโดพำมน, นอรอพเนฟรน และซโรโทนน ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ดวยวธ MTT Assay

เลยงเซลลประสาทเพาะเลยงในจานเพาะเลยงขนาด 96 หลม โดยใหมจ านวนเซลล ในแตละหลมเทากบ 35,000 เซลล และมปรมาตรเทากบ 100 ไมโครลตร น าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด, อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบเวลาใชปเปตดดเอาอาหารเลยงเซลลออกใหหมด จากนนน ามาทดสอบกบสารทดสอบดงตารางท 3.6 โดยปรมาตรสดทายเทากบ 100 ไมโครลตร น าเซลลไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากนนน ามาเตมสารละลาย MTT (ความเขมขน 5 mg/ml ในฟอสเฟตบฟเฟอร, pH 7.5) 20 ไมโครลตร (สารละลาย MTT 10 ไมโครลตรตอปรมาตรสดทาย 100 ไมโครลตร) แลวน ากลบเขาไปบมทสภาวะ 5 เปอรเซนต คารบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง เมอครบเวลา น ามาดดสวนน าใสดานบนทงทงหมด เตมสารผสมระหวาง DMSO และ เอทานอลในอตราสวน 1 ตอ 1 จ านวน 200 ไมโครลตร ใชปเปตดดขนลงจนตะกอนถกละลายจนหมด แลวดดสวนน าดานบน 100 ไมโครลตร ใสจานเพาะเลยงเซลลใหม น าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ดวยเครองวดคาการดดกลนแสง Synergy Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader จากนนน าคาดดกลนแสงทไดมาค านวณหาเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลล (% cell viability)

% cell viability = (treated cell - blank) x 100 (untreated cell - blank)

46

ตำรำงท 3.6 สำรทดสอบทใชในกำรทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรตำน โรคซมเศรำท มผลตออตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทชนดโดพำมน, นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5

สำรทดสอบ ใชทดสอบ สารสกดสมนไพรแตละชนด โปรตนขนสงสารสอประสาททง 3 ชนด

สารสกดสมนไพร+flu+des โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน

สารสกดสมนไพร+flu+GBR12935 โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน

สารสกดสมนไพร+des+GBR12935 โปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน

Flu+des+GBR12935 Positive control ของการทดสอบโปรตนขนสงสาร

สอประสาททง 3 ชนด

Flu+des Negative control ของการทดสอบโปรตนขนสง

สารสอประสาทชนดโดพามน

Flu+GBR12935 Negative control ของการทดสอบโปรตนขนสง

สารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน

Des+GBR12935 Negative control ของการทดสอบโปรตนขนสง

สารสอประสาทชนดซโรโทนน

1X HBSS+0.1% BSA Buffer Negative control ของการทดสอบทงหมด

สำรทกชนดเจอจำงใน 1X HBSS+0.1 BSA Buffer ควำมเขมขนสำรสกดสมนไพรเทำกบ 25 และ 100 ไมโครกรมตอไมโครลตร

ควำมเขมขนของ flu และ des เทำกบ 10 ไมโครโมลำร ควำมเขมขนของ GBR12935 เทำกบ 0.1 ไมโครโมลำร

ตำรำงท 3.7 กำรแบงกลมทดสอบเพอทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรตำน โรคซมเศรำท มผลตออตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทชนดโดพำมน, นอรอพเนฟรน และซโรโทนน ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5

กลมท กำรทดสอบ

47

1 ทดสอบผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน 2 ทดสอบผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามน 3 ทดสอบผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน 4 ทดสอบผลตออตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน

ทมา: http://www.moleculardevices.com/products/assay-

kits/transporters/neurotransmitter.html

ภำพท 3.6 กราฟความสมพนธระหวางคาการเรองแสงฟลออเรสเซนต (RFU) และระยะเวลา (min)

3.5 กำรรวบรวมและวเครำะหขอมล ในการศกษาวจยครงนแตละการทดสอบจะท าการทดสอบจ านวน 3 ครง (triplicate) และน าคาทไดมาหาคาเฉลยและคาเบยงเบนมาตรฐาน จากนนน ามาวเคราะหความแตกตางทางสถต

48

โดยใชหลกสถต Independent Student’s t-test ทระดบนยส าคญ P < 0.05 ดวยโปรแกรม SPSS Statistics เวอรชน 17.0 และการค านวณหาพนทใตกราฟค านวณโดยใชโปรแกรม SigmaPlot11.0

บทท 4

ผลกำรวจย

49

4.1 ผลกำรพสจนชนดของสมนไพร สมนไพรทใชในการศกษาวจยไดรบการพสจนโดย ศ .ดร.ทวศกด บญเกด ภาควชา

พฤกษศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย และเกบตวอยางของสมนไพรไทยในพพธภณฑพช (herbarium) ณ พพธภณฑพช ศ.กสน สวตะพนธ ภาควชาพฤกษศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ผลดงแสดงในตารางท 4.1

ตำรำงท 4.1 ผลกำรพสจนชนดของสมนไพร

Collector Number

Herbarium Number

Scientific Name

Vernacular Name

Common Name

Family

Lukkiga Thanesphatisuk

1

013436 (BCU)

Centella asiatica (L.)

Urb. บวบก

Asiatic pennywort

Umbelliferae (Apiaceae)

Lukkiga Thanesphatisuk

2

013438 (BCU)

Senna aiamea (Lam.)

Irwin&Barneby

ขเหลก, ขเหลกบาน

Thai copper

pod

Leguminosae-Caesalpinioideae

Visa Thongrakard

21

013445 (BCU)

Mentha cordifolia Opiz

ex Fresen

สะระแหน, สะระแหนสวน,

หอมดวน

Kitchen mint

Labiatae (Lamiaceae)

4.2 ผลกำรสกดสมนไพรดวยเอทำนอลโดยวธมำเซอเรชน (Maceration) จากการสกดสมนไพรโดยการน าไปหมกกบเอทานอลทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ไดผลผลตสดทายดงแสดงในตารางท 4.2

4.3 ผลกำรสกดสมนไพรดวยน ำโดยวธกำรตม (Boil) จากการสกดสมนไพรโดยการน าไปตมกบน าทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา

30 นาท ไดผลผลตสดทายดงแสดงในตารางท 4.2

ตำรำงท 4.2 ผลกำรสกดสมนไพรดวยตวท ำละลำยเอทำนอล และ น ำ

50

Name of medicinal material Family Extract yield (%)

Ethanol Water

Centella asiatica (L.) Urb. Umbelliferae (Apiaceae)

7.56 9.15

Senna aiamea (Lam.) Irwin&Barneby

Leguminosae-Caesalpinioideae

11.46 9.639

Mentha cordifolia Opiz ex Fresen Labiatae (Lamiaceae) 4.36 11.2

4.4 ผลกำรทดสอบควำมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ของสำรสกดจำกสมนไพร และยำตำนโรคซมเศรำดวยวธ MTT assay

จากการทดสอบวดความเปนพษของสารสกดสมนไพรทสกดจากเอทานอล และน าทง 3 ชนด ทความเขมขน 1000, 800, 600, 300, 100, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตรในอาหารเลยงเชอ และสารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด ทความเขมขน 1000, 100, 10, 1 และ 0.1 ไมโครโมลาร ในอาหารเลยงเชอ ตอเซลลประสาทเพาะเลยงLAN-5 โดยใหเซลลกลมทไมไดทดสอบดวยสารสกดสมนไพร และสารละลายยาเปนกลมควบคมลบ (Negative control) มคาเปอรเซนตของอตราการรอดชวต (Cell viability) เทากบ 100 เปอรเซนต น ากลมทดสอบ มาค านวณเทยบกบกลมควบคมเพอหารอยละของอตราการรอดชวต (%Cell viability) และน ามาวเคราะหเปรยบเทยบระหวางกลมควบคม และกลมทดสอบโดยใชหลกสถต Independent Student’s t-test โดยใหคาความเชอมนอยทระดบ 95 เปอรเซนต (P<0.05) ผลการทดสอบพบวาสารสกดจากใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกดจาก เอทานอล และ น า ความเขมขน 300, 600, 800 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตรมความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดยเปอรเซนตของอตราการรอดชวตมคานอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) (ภาพท 4.1-4.3) ส าหรบสารละลายยา fluoxetine hydrochloride และ desipramine hydrochloride ทความเขมขน 100 และ 1000 ไมโครโมลาร GBR12935 dihydrochloride ทความเขมขน 10, 100 และ 1000 ไมโครโมลาร นนมความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยงโดยเปอรเซนตของอตราการรอดชวตมคานอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) (ภาพท 4.4)

51

จากผลทดสอบดงกลาวคณะผวจยไดเลอกความเขมขนของสารสกดสมนไพรทนอยทสด ทไมเปนพษตอเซลล และ มากทสดทไมเปนพษตอเซลล คอ 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ไปท าการทดสอบวดฤทธของสารสกดสมนไพรตอการแสดงออกระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 และทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรตอระดบการท างานของโปรตนขนสงสารสอปะสาทชนดโมโนเอมน, โดพามน, นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ส าหรบความเขมขนของยาตานโรคซมเศราไดใชความเขมขนตามงานวจยของ Gang Zhao และคณะ โดย fluoxetine hydrochloride และ desipramine hydrochloride ใชความเขมขนท 10 ไมโครโมลาร และ GBR12935 ใชความเขมขนท 0.1 ไมโครโมลาร โดยน าไปใชเปนสารทดสอบฤทธตอระดบการท างานของโปรตนขนสงสาร สอประสาททง 3 ชนด ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 ใหเปนกลมควบคมบวกในการทดสอบ

ภำพท 4.1 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากใบสะระแหน ทสกดจากเอทานอล และ น า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 24 ชวโมง โดยม “cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละ

* * * *

52

ตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาตวท าละลายทง 2 ชนด ทความเขมขน 300 µg/ml ขนไป (*) สามารถลด %cell viability ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

ภำพท 4.2 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากใบขเหลก ทสกดจากเอทานอล และ น า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 24 ชวโมง โดยม “cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาตวท าละลายทง 2 ชนด ทความเขมขน 300 µg/ml ขนไป (*) สามารถลด %cell viability ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

* * * *

53

ภำพท 4.3 ผลการทดสอบความเปนพษของสารสกดจากบวบก ทสกดจากเอทานอล และน า ทความเขมขน 25, 50, 100, 300, 600, 800 และ 1000 µg/mL ตอเซลลเพาะเลยงLAN-5 เปนเวลา 24 ชวโมง โดยม “cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาตวท าละลายทง 2 ชนด ทความเขมขน 300 µg/ml ขนไป (*) สามารถลด %cell viability ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

* * * *

54

ภำพท 4.4 ผลการทดสอบความเปนพษของสารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด

ทความเขมขน 0.1, 1, 10, 100 และ 1000 µM ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 24 ชวโมง

โดยม “cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง

จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวา fluoxetine, desipramine ทความเขมขน 100 และ 1000 µM

และ GBR12935 ทความเขมขน 10, 100 และ 1000 µM (*) สามารถลด % cell viability ไดอยาง

มนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

*

* *

55

4.5 ผลกำรทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรแสดงออก ในระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ดวยวธ Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

จากการวดการแสดงออกในระดบ mRNA ของยน hDAT, hNET และ hSERT ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 เมอทดสอบดวยสารสกดสมนไพรทง 3 ชนด ดวยตวท าละลาย เอทานอล และ น า ทความเขมขน 25 และ 100 ug/mL โดยน าไปเปรยบเทยบอตราสวนกบ housekeeping gene ซงในงานวจยนไดใชยน GAPDH จากนนน าคาอตราสวนของกลมทดสอบไปเปรยบเทยบหาคารอยละของการแสดงออกของของยนกบกลมควบคมลบ โดยใหคาอตราสวนของกลมควบคมลบเทากบ 100 เปอรเซนต เมอไดคารอยละแลวจงน าไปวเคราะหเปรยบเทยบกบกลมควบคมลบโดยใชหลกสถต Independent Student’s t-test โดยใหคาความเชอมนอยทระดบ 95 เปอรเซนต (P<0.05) ผลการทดสอบพบวาสารสกดสมนไพรทมฤทธกดการแสดงออกของยน hDAT โดยม คารอยละของการแสดงออกของยนนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ไดแก สารสกดจากใบสะระแหน, ใบขเหลก และ บวบกดวยตวท าละลายเอทานอล และน าท ความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (ภาพท 4.6) สวนสารสกดสมนไพรทมฤทธกดการแสดงออกของยน hNET โดยมคารอยละของการแสดงออกของยนนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ไดแก สารสกดจากใบสะระแหนดวยตวท าละลายเอทานอลท ความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และน าทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร สารสกดจากใบขเหลกดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และสารสกดจากบวบกดวยเอทานอลทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และน าทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร (ภาพท 4.7) ส าหรบยน hSERT นนสารสกดสมนไพรทมฤทธกดการแสดงออกของยนน โดยมคารอยละของการแสดงออกของยนนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ไดแก สารสกดจากใบสะระแหนดวยตวท าละลายเอทานอลทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร และน าทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร สารสกดจากใบขเหลกดวยตวท าละลายเอทานอลทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และสารสกดจากบวบกดวยตวท าละลายเอทานอลทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และน าทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (ภาพท 4.8)

56

hDAT=195bp

hNET=294bp

SERT=319bp

GAPDH=452bp

hDAT=195bp

hNET=294bp

SERT=319bp

GAPDH=452bp

ใบขเหลก ใบสะระแหน

บวบก

ภำพท 4.5 ผลการตรวจสอบการแสดงออกของยนในเซลล LAN-5 ดวยวธ Gel electrophoresis เมอทดสอบดวยสารสกดใบขเหลก, ใบสะระแหน และ บวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง

Un

trea

ted

cel

ls

EtO

H 2

5 µ

g/m

L

EtO

H 1

00

µg

/mL

Wa

ter 2

5 µ

g/m

L

Wa

ter 1

00

µg

/mL

Un

trea

ted

cel

ls

EtO

H 2

5 µ

g/m

L

EtO

H 1

00

µg

/mL

Wa

ter 2

5 µ

g/m

L

Wa

ter 1

00

µg

/mL

Un

trea

ted

cel

ls

EtO

H 2

5 µ

g/m

L

EtO

H 1

00

µg

/mL

Wa

ter 2

5 µ

g/m

L

Wa

ter 1

00

µg

/mL

57

ภำพท 4.6 ผลการแสดงออกของยน hDAT ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกด ใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง “Cell” คอ เซลลทไมไดถกทดสอบดวยสารสกด (กลมควบคมลบ) (ท าการทดสอบจ านวน 3 ครงการทดลอง) พบวาสารสกดทง 3 ชนดทสกดดวยตวท าละลาย เอทานอล และน า ทง 2 ความเขมขน (*) สามารถลดการแสดงออกของยน hDAT ไดอยาง มนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

*

*

* *

* *

hDAT

58

*

*

* *

* *

ภำพท 4.7 ผลการแสดงออกของยน hNET ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกด ใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง “Cell” คอ เซลลทไมไดถกทดสอบดวยสารสกด (กลมควบคมลบ) (ท าการทดสอบจ านวน 3 ครงการทดลอง) พบวาสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยตวท าละลาย เอทานอล ความเขมขน 25 และ 100 µg/mL และทสกดดวยน า ความเขมขน 25 µg/mL สารสกด ใบขเหลกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทง 2 ความเขมขน และสารสกดบวบกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล ความเขมขน 100 µg/mL และน า ความเขมขน 25 µg/mL (*) สามารถลดการแสดงออกของยน hNET ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

* * * *

* *

hNET

59

ภำพท 4.8 ผลการแสดงออกของยน hSERT ในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกด ใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 24 ชวโมง “Cell” คอ เซลลทไมไดถกทดสอบดวยสารสกด (กลมควบคมลบ) (ท าการทดสอบจ านวน 3 ครงการทดลอง) พบวาสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยตวท าละลาย เอทานอล ความเขมขน 25 µg/mL และทสกดดวยน า ความเขมขน 100 µg/mL สารสกดใบขเหลกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล ทง 2 ความเขมขน และสารสกดบวบกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล ความเขมขน 100 µg/mL และน า ความเขมขน 25 และ 100 µg/mL (*) สามารถ ลดการแสดงออกของยน hSERT ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

*

* * * *

*

hSERT

60

4.6 ผลกำรทดสอบฤทธของสำรสกดสมนไพรตอกำรตำนโรคซมเศรำ ทมผลตออตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทโดพำมน, นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนน ในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 โดยใชชดน ำยำ Neurotransmitter transporters uptake assay kit

จากการวดอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโดพามน, นอรอพเนฟรน และซโรโทนน ในเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 เมอทดสอบดวยสารทดสอบดงตารางท 3.6 แบงเปน 4 กลมการทดสอบดงตารางท3.6 เปนเวลา 30 นาท โดยใชชดน ายา Neurotransmitter transporters uptake assay kit น าคาอตราการเรองแสงฟลออเรสเซนตทได (RFU) ไปสรางกราฟความสมพนธกบระยะเวลา (min) จากนนน ามาค านวณหาพนทใตกราฟ (Area below curve) โดยใชโปรแกรม Sigma Plot เวอรชน 11.0 เมอไดคาพนทใตกราฟแลวจงน าไปวเคราะหเปรยบเทยบกบกลมควบคมลบ (negative control) ของแตละกลมทดสอบโดยใชหลกสถต Independent Student’s t-test โดยใหคาความเชอมนอยทระดบ 95 เปอรเซนต (P<0.05) ผลการทดสอบพบวา สารสกดสมนไพรทมฤทธตานโรคซมเศราโดยผานกลไกการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน ซงจาการทดสอบไดแบงกลมทดสอบเปน 4 กลม โดยกลมแรกทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนพบวา สารสกดใบสะระแหนดวยเอทานอล และ น า ทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร และสารสกดบวบกดวยเอทานอล ทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน โดยมคาพนทใตกราฟนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) (ภาพท 4.9) กลมทสองทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนพบวา สารสกดใบสะระแหนดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนโดยมคาพนทใตกราฟนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) (ภาพท 4.10) กลมทสามทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนพบวาสารสกดสมนไพรทใชในการทดสอบทง 3 ชนดไมมฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน (ภาพท 4.11)

61

กลมทสทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนนพบวา สารสกดใบสะระแหนดวยตวท าละลายเอทานอลทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร และน าทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มฤทธยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนนโดยมคาพนทใตกราฟนอยกวากลมควบคมลบอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) (ภาพท 4.12) ส าหรบผลการทดสอบฤทธของสารสกดใบขเหลกดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ตอการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนทง 3 ชนด ไมสามารถน าผลการทดสอบมาวเคราะหไดเนองจากคาพนทใตกราฟทค านวณไดจากการทดสอบมคาตดลบทกการทดสอบ (ภาพท 4.13)

ภำพท 4.9 อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบสะระแหน และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท “Cell” คอ เซลลทไมไดถกทดสอบดวยสารสกด (กลมควบคมลบ), “Flu+Des+GBR” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด

* * *

*

*

62

(กลมควบคมบวก) ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารสกดใบสะระแหน และ สารสกดบวบกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL สารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (*) สามารถยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

ภำพท 4.10 อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบสะระแหน และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท “Flu+Des” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตาน โรคซมเศรา fluoxetine และ desipramine (กลมควบคมลบ), “Flu+Des+GBR” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (กลมควบคมบวก) ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และ น าทความเขมขน 100 µg/mL และ สารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (*) สามารถยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

*

*

63

ภำพท 4.11 อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบสะระแหน และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท “Flu+GBR” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตานโรคซมเศรา fluoxetine และ GBR12935 (กลมควบคมลบ), “Flu+Des+GBR” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (กลมควบคมบวก) ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารสกดใบสะระแหน และบวบกทสกดดวยตวท าละลาย เอทานอล และ น าทความเขมขน 25 และ100 µg/mL ไมมฤทธในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรน ซงแตกตางจากสารละลายยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (*) ทสามารถยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนไดอยาง มนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

*

64

ภำพท 4.12 อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนนในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบสะระแหน และบวบก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน า ทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท “GBR+Des” คอ เซลลทถกทดสอบดวย ยาตานโรคซมเศรา GBR12935 และ desipramine (กลมควบคมลบ), “Flu+Des+GBR” คอ เซลลทถกทดสอบดวยยาตานโรคซมเศราทง 3 ชนด (กลมควบคมบวก) ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยตวท าละลาย เอทานอลทความเขมขน 25 µg/mL และน าทความเขมขน 100 µg/mL สารละลายยาตาน โรคซมเศราทง 3 ชนด (*) สามารถยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนนไดอยางมนยส าคญทางสถต (P < 0.05)

* * *

65

ภำพท 4.13 อตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนทง 3 ชนดในเซลล LAN-5 เมอทดสอบเซลลกบสารสกดใบขเหลก ดวยตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 µg/mL เปนเวลา 30 นาท ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง จากกราฟไมสามารถวเคราะหผลการทดสอบไดเนองจากคาพนทใตกราฟทค านวณไดมคาตดลบท าใหการทดสอบนไมสามารถสรปผลการทดสอบได

66

ส าหรบผลการทดสอบฤทธของสารสกดใบขเหลกจากเอทานอล และน าทความเขมขนต า ง ๆ ต อ ก า ร ย บ ย ง ก า ร ท า ง า นข อ ง MATs ด ว ย ว ธ Uptake assay โ ด ย ช ด น า ย า Neurotransmitter transporter uptake assay ไมสามารถน าคาทไดจากการทดสอบมาวเคราะหผลได เ นองจากการค านวณคาพน ทใตกราฟความสมพนธระหวางอตราการ เรองแสง ฟลออเรสเซนต และระยะเวลาทไดมคาตดลบ ซงสาเหตอาจเนองมาจากสารประกอบภายในสารสกดใบขเหลกบางชนดสามารถเรองแสงฟลออเรสเซนตได หรอทเรยกวา Autofluorescence ดงนนคณะผวจยจงไดทดสอบวดการเรองแสงฟลออเรสเซนต (Fluorescent spectrum) ของสารสกดใบขเหลก ทความยาวคลน excitation 440 นาโนเมตร และ emission 480-600 นาโนเมตร ไดผลการทดสอบดงน คอ สารสกดใบขเหลกจากเอทานอล และน าทความเขมขน 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร สามารถเรองแสงฟลออเรสเซนตได ทความยาวคลน excitation 440 นาโนเมตร และ emission 520 นาโนเมตร ซงเปนความยาวคลนเดยวกบการเรองแสง ฟลออเรสเซนตของชดน ายาทใชทดสอบ (ภาพท 4.15-4.17) ดงนนอาจสรปไดวาสารสกด ใบขเหลกทงจากเอทานอล และ น า อาจมสารประกอบทสามารถเรองแสงฟลออเรสเซนตได ซงอาจจะเปนสารประกอบ Baracol ทมอยในใบขเหลก เนองจากลกษณะโครงสรางของ Barakol มลกษะเปนวงแหวนอะโรมาตกหลายวง (Poly-aromatic hydrocarbons) (ภาพท 4.14) ซงโครงสรางโมเลกลลกษณะนสามารถเรองแสงฟลออเรสเซนตไดเปนอยางด ดงนนจงท าให ไมสามารถทดสอบฤทธของสารสกดใบขเหลกตอการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนโดยใชชดน ายา Neurotransmitter transporter uptake assay ได และ หากมการศกษาลกษณะแบบนอกในอนาคตอาจจะตองใชวธอนในการทดสอบ เชน การใชสารกมมนตรงสมาทดสอบแทน ([3H] Monoamine) แตอาจเปนอนตรายตอผ ใชไดเนองจากสารกมมนตรงสมความเปนพษตอสงแวดลอม และสงมชวต

ภำพท 4.14 ลกษณะโครงสรางโมเลกลของสารประกอบ Barakol

67

ภำพท 4.15 Fluorescent spectrum ของสารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกดจากเอทานอลทความยาวคลน excitation 450 nm และ emission 480-600 nm โดย “Blank” = 1XHBSS+0.1%BSA Buffer

68

ภำพท 4.16 Fluorescent spectrum ของสารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกดจากน า ทความยาวคลน excitation 450 nm และ emission 480-600 nm โดย “Blank” =1XHBSS+0.1%BSA Buffer

69

ภำพท 4.17 Fluorescent spectrum ของสารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และบวบก ทสกดจากเอทานอล และน า ทความยาวคลน excitation 450 nm และ emission 520 nm โดย “Blank” = 1XHBSS+0.1%BSA Buffer

Fluorescent

spectrum

70

4.7 ผลกำรทดสอบวดควำมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ของสำรทดสอบทใชในกำรทดสอบอตรำกำรท ำงำนของโปรตนขนสงสำรสอประสำทโดพำมน, นอรอพเนฟรน และ ซโรโทนนในเซลลประสำทเพำะเลยง LAN-5 ดวยวธ MTT Assay

จากการทดสอบวดความเปนพษของสารทดสอบ ตอเซลลประสาทเพาะเลยงLAN-5 เมอทดสอบดวยสารทดสอบดงตารางท 3.5 แบงเปน 4 กลมการทดสอบดงตารางท 3.6 เปนเวลา 30 นาท โดยใหเซลลกลมทไมไดทดสอบดวยสารสกดสมนไพร และสารละลายยาเปนกลมควบคมลบ (Negative control) มคาเปอรเซนตของอตราการรอดชวต (Cell viability) เทากบ 100 เปอรเซนต น ากลมทดสอบมาค านวณเทยบกบกลมควบคมเพอหารอยละของอตราการรอดชวต (%Cell viability) และน ามาวเคราะหเปรยบเทยบระหวางกลมควบคม และกลมทดสอบ โดยใชหลกสถต Independent Student’s t-test โดยใหคาความเชอมนอยทระดบ 95 เปอรเซนต (P<0.05)

ผลการทดสอบพบวาสารทงหมดทน ามาใชทดสอบวดอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนนนไมมความเปนพษตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดย คาเปอรเซนตของอตราการรอดชวตของทกกลมการทดสอบ และกลมควบคมลบไมแตกตางกน (P<0.05) (ภาพท 4.18-4.21)

71

ภำพท 4.18 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมน ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 30 นาท โดยม “Cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารทดสอบทงหมดไมสามารถลด % cell viability ได (P < 0.05)

72

ภำพท 4.19 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโดพามนตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 30 นาท โดยม “Cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารทดสอบทงหมดไมสามารถลด % cell viability ได (P < 0.05)

73

ภำพท 4.20 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดนอรอพเนฟรนตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 30 นาท โดยม “Cell” เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารทดสอบทงหมดไมสามารถลด % cell viability ได (P < 0.05)

74

ภำพท 4.21 ผลการทดสอบความเปนพษของสารทใชทดสอบอตราการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน ตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 เปนเวลา 30 นาท โดยม Cell เปนกลมควบคมลบ ดวยวธ MTT assay ท าการทดสอบแตละตวอยางซ า 3 ครง จ านวน 3 ครงการทดลอง พบวาสารทดสอบทงหมดไมสามารถลด % cell viability ได (P < 0.05)

75

4.8 ผลของสำรสกดจำกเหงำกระชำยด ำ (Kaempferia parviflora) และลกจนทนเทศ (Myristica fragrans) ตอระดบของ monoamine neurotransmitters ในสมองหนสวน hippocampus

คณะผวจย ไดวเคราะห ผลของสารสกดจากเหงากระชายด า (Kaempferia parviflora) และ

ลกจนทนเทศ (Myristica fragrans) ตอระดบของ monoamine neurotransmitters ในสมองหนสวน hippocampus ภาพท 4.22 แสดงลกษณะและองคประกอบส าคญของสมนไพรทงสองชนด

Kaempferia parviflora

Myristica fragrans

ภำพท 4.22 แสดงลกษณะและองคประกอบส าคญของเหงากระชายด า (Kaempferia

parviflora) และลกจนทนเทศ (Myristica fragrans) ส าหรบการทดลองน หนประกอบดวย 4 กลม (8 ตวตอกลม) ไดแก กลมควบคม (control group) กลมทไดรบยาตานซมเศรา (fluoxetine) กลมทไดรบสารสกดเหงากระชายด า และกลมทไดรบสารสกดลกจนทนเทศ โดยหนไดรบสารสกดหรอยา เปนเวลา 2 สปดาห เมอฆาหนแลว ไดแยกสมองสวน hippocampus มาวเคราะหหา norepinephrine (NE), sertotonin (5-HT) และdopamine ทงน ไดมการใช internal standard (IS) เปนตวควบคมในการวเคราะหดวย คณะผวจยไดพฒนาเทคนคการตรวจ monoamine neurotransmitters ดวยเทคนค high performance liquid chromatography โดยแสดงโครมาโตแกรมในภาพท 4.23 ทงน ผลการเปรยบเทยบ ดงแสดงในตารางท 4.3 ทงน ยงไมสามารถหาคาทแนนอนนาเชอถอไดในกรณของ norepinephrine ดงนน จงอยระหวางการท าการทดลองซ า สวนระดบซโรโทนนนน พบวา กลมทไดรบยาตานซมเศรา (fluoxetine) กลมทไดรบสารสกดเหงากระชายด า และกลมทไดรบสารสกดลกจนทนเทศ มการเพมสงขนกวาในกลมควบคม สวนระดบโดพามนนน พบวา เฉพาะกลมทไดรบสารสกดลกจนทนเทศเทานน ทมระดบสงกวาในในกลมควบคม

76

Control group

Fluoxetine�group

Kaempferia parviflora group

ภำพท 4.23 แสดงโครมาโตแกรมในการวเคราะหปรมาณ norepinephrine (NE), sertotonin (5-HT) และ dopamine ดวยเทคนค HPLC ในสมองหนสวน hippocampus 4 กลม ไดแก กลมควบคม (control group) กลมทไดรบยาตานซมเศรา (fluoxetine) กลมทไดรบสารสกดเหงากระชายด า และกลมทไดรบสารสกดลกจนทนเทศ โดยการใช internal standard (IS) เปนตวควบคมในการวเคราะห

77

ตำรำงท 4.3 แสดงผลการเปรยบเทยบระดบสาร monoamine neurotransmitters จากการวเคราะหดวยเทคนค HPLC ในสมองหนสวน hippocampus 4 กลม ไดแก กลมควบคม (control group) กลมทไดรบยาตานซมเศรา (fluoxetine) กลมทไดรบสารสกดเหงากระชายด า และกลมทไดรบสารสกดลกจนทนเทศ

Group

Norepinephrine

(µg/g)Serotonin

(5-hydroxytryptamine� (µg/g)

Dopamine

(µg/g)

Control NA 0.3657 1.0283

Fluoxitine NA 0.8534 1.0383

Myristica fragrans NA 0.6261 1.8631

Kaempferia parviflora NA 0.6346 1.0543

78

บทท 5

สรปผลกำรวจย อภปรำยผล และ ขอเสนอแนะ

5.1 สรปผลกำรวจย และอภปรำยผลกำรวจย

แหลงทมาของสมนไพรไทย การศกษาครงน คณะผวจย ไดใชสมนไพรทน ามาจากสวนสมนไพรในกรงเทพมหานคร

และ จงหวดชลบร ภายในเดอน ธนวาคม 2553 ดงนน ผลการศกษาทไดอาจไมสามารถเปนตวแทนของสมนไพรทงประเทศได เนองจากมปจจยทสงผลถงสารส าคญ หรอองคประกอบภายในสมนไพร เชน ปจจยของสภาพแวดลอม (สภาพดน น า และอากาศ) นอกจากนผ วจยยงขาดขอมลเกยวกบอายของสมนไพร ซงอาจมผลตอสารส าคญ หรอองคประกอบภายในสมนไพร

วธการสกดสารจากสมนไพร ผวจยใชวธมาเซอเรชน (Maceration) ในการสกดสารส าคญจากสมนไพร โดยใชตวท า

ละลายเอทานอล และวธตม (Boil) โดยใชตวท าละลายน า ผวจยเลอกใชตวท าละลายทง 2 ชนดน เนองจาก ตวท าละลายทง 2 ชนดหาไดทวไปในประเทศ มความปลอดภยตอสภาพแวดลอม สามารถน าไปรบประทานไดซงถอเปนขอส าคญ เนองจากงานวจยนมวตถประสงคเพอน าไปพฒนาใชในการรกษามนษย ภายหลงจากการสกดสารส าคญออกจากสมนไพร ตวท าละลายจะถกท าใหระเหยออกดวยวธ evaporation ส าหรบเอทานอล และ lyophilization ส าหรบน าเพอใหไดสารสกดหยาบ จากนนผ วจยเลอก DMSO เปนตวท าละลายสารสกดหยาบ เนองจาก DMSO สามารถละลายสารตางๆไดทงสวนทมขว (polar) และ ไมมขว (nonpolar) ถงแมวาจะมการรายงานถงความเปนพษของ DMSO ตอเซลลเพาะเลยง แตอยางไรกตาม ณ ความเขมขนท 0.1 เปอรเซนต (v/v) เปนทยอมรบกนวาไมเปนพษตอเซลลเพาะเลยง ซงการวจยครงนผวจยไดท าการทดสอบความเปนพษของ DMSO รวมดวย พบวา DMSO ไมเปนพษตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 ทงความเขมขนท 0.1 และ 0.01 เปอรเซนต (v/v)

การทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรไทยตอเซลลประสาทมนษยเพาะเลยง (LAN-5 cells) การทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรไทยตอเซลลประสาทมนษยเพาะเลยง ผ วจยเลอก

เซลล LAN-5 ในการศกษา เนองจากลกษณะส าคญของเซลลชนดนเปนเซลลประสาทซงนาจะมการแสดงออกของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน, โดพามน และนอรอพเนฟรน ดงนน

79

จงน าเซลลเพาะเลยงชนดนมาใชเปน in vitro model ส าหรบการศกษาโรคซมเศรา ผวจยใชเซลล LAN-5 เพอศกษา 1. ศกษาความเปนพษของสารสกดสมนไพร และยาตานโรคซมเศราตอเซลลประสาทเพาะเลยง LAN-5 โดยวดจากอตราการรอดชวตของเซลลเมอทดสอบดวยสารสกดสมนไพร 2. ศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรตอการแสดงออกของยน hSERT,hDAT และ hNET ในระดบ mRNA ซงเปนโปรตนทใชขนสงสารสอประสาทชนดซโรโทนน, โดพามน และนอรอพเน - ฟรน บรเวณ synaptics cleft กลบเขาส pre-synaptic cell โดยปรมาณสารสอประสาทบรเวณ synaptic cleft มความสมพนธตอการเกดโรคซมเศรา ผวจยใชเวลาในการทดสอบสารสกดสมนไพรไทย เปนเวลา 24 ชวโมง ปกตเซลล LAN-5 จะมเวลาในการแบงตว (doubling time) ประมาณ 5 ชวโมง (50,000 เซลล) (103) ผวจยจงคาดวานาจะครอบคลมเวลาทใชในการแบงตวของเซลล ดงนนผลการทดสอบนาจะแสดงถงฤทธของสารสกดสมนไพรตอเซลล LAN-5 ในทกระยะการแบงตวของเซลลทประกอบดวยระยะ G1, S, G2 และ M 3 และ การศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรตอการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนเปรยบเทยบกบฤทธของยาตานโรคซมเศราโดยใชชดน ายา Neurotransmitter transporter uptake assay เพอวดอตราการท างานของโปรตน โดยการทดสอบนผวจยใชเวลาในการทดสอบสารสกดสมนไพรเปนเวลา 30 นาท เนองจากเปนระยะเวลาทชดทดสอบนแนะน าใหใชในการทดสอบ

การทดสอบวดความเปนพษของสารสกดสมนไพรตอเซลลเพาะเลยง LAN5 คณะผวจยไดใชวธ MTT assay ซงคาทไดจากวธ MTT assay มกใชบงชสภาวะการเสยหายของเอนโดร- พลาสมกเรตคลม และไมโทคอนเดรย เพราะการเกดปฏกรยาการรดวซสารประกอบ MTT ดวย ตวรดวซคอ NADH และ NAD(P)H ตองใชเอนไซมภายในเอนโดรพลาสมก เรตคลม และ ไมโทคอนเดรย เปนตวเรงปฏกรยา เมอทดสอบเซลล LAN-5 กบสารสกดสมนไพรไทยทสกดจากตวท าละลายเอทานอล และน า พบวา เมอทดสอบดวยวธ MTT assay สารสกดใบสะระแหน, ใบขเหลก และ บวบก จากตวท าละลายเอทานอล และน าทความเขมขนสง ไดแก 300, 600, 800 และ 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร มความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 อยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ซงจากผลการทดสอบทได คณะผวจยไดเลอกความเขมขนทนอยทสด และมากทสดจากการทดสอบ MTT assay ทไมมความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง LAN-5 ไปใชทดสอบฤทธในการตานโรคซมเศรา ไดแก 25 และ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร เพอใหผลการทดสอบทไดมความใกลเคยงกบความจรงมากทสด สามารถน าไปวเคราะหผลไดวาฤทธในการยบยงการแสดงออกของยน hSERT, hDAT และ hNET และฤทธยบยงการท างานของโปรตน

80

ขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนของสารสกดสมนไพรสามารถยบยงไดจรง ไมไดเกดจากความเปนพษของสารสกดสมนไพรทท าใหเซลลเพาะเลยงตาย

ส าหรบผลทดสอบวดความเปนพษของสารละลายยาตานโรคซมเศราดวยวธ MTT assay พบวาสารละลายของ fluoxetine, desipramine hydrochloride ทความเขมขน 10 ไมโครโมลาร และ GBR12935 ทความเขมขน 0.1 ไมโครโมลาร (ความเขมขนทใชในการทดสอบ) ไมมความเปนพษตอเซลลเมอทดสอบดวยสถต Independent sample t-test เทยบกบเซลลในกลมควบคมลบ ดงนนจงน าความเขมขนดงกลาวไปใชทดสอบฤทธในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทชนดโมโนเอมนได

จากการทดสอบฤทธของสารสกดใบสะระแหนในการตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และhSERT ในระดบ mRNA ดวยเทคนค RT-PCR และผานกลไกการยบยงการท างานของ MATs ดวยเทคนค Uptake assay พบวา สารสกดใบสะระแหน ทสกดดวยเอทานอลความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตรมฤทธตานโรคซมเศราผานทง 2 กลไก โดยทสามารถยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และ hSERT ในระดบ mRNA ได และสามารถยบยงการท างานของ MATs และเมอทดสอบแยกกนระหวาง DAT, NET และ SERT พบวายงสามารถยบยงการท างานของ SERT ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) อกดวย ส าหรบทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตรพบวามฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และสามารถยบยงการท างานของ MATs และเมอทดสอบแยกกนระหวาง DAT, NET และ SERT พบวายงสามารถยบยงการท างานของ DAT ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05)

ส าหรบสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยน าทความเขมขน 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT และ hNET ในระดบ mRNA ได และยบยงการท างานของการท างานของ MATs ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ส าหรบทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตรมฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT และ hSERT ในระดบ mRNA สามารถยบยงการท างานของ MATs อกทงยงสามารถยบยงการท างานของ DAT และ SERT ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) เมอทดสอบแยกกน

จากการทดสอบขางตนสรปไดวาสารสกดใบสะระแหนทสกดดวยดวยเอทานอล และ ทสกดดวยน า มฤทธยบยงการท างานของ SERT และ DAT ซงอาจเนองจากสารประกอบในสาร

81

สกดใบสะระแหนบางชนดมฤทธกระตน หรอยบยงโปรตนไคเนสตางๆ ทเกยวของกบกระบวนการ phosphorylation ซงเปนกลไกควบคมการท างานของ MATs ในเซลลประสาท ท าใหสาร สอประสาทผาน MATs เขาสเซลลไดลดลง โดยจากงานวจยทผานมาไดศกษาเกยวกบ ตวอยางของโปรตนไคเนสทมความเกยวของกบระบบประสาท monoaminergic อกดวย (ตารางท 5.1)

ซงสอดคลองกบงานวจยของ Haeseler และคณะในป 2002 ศกษาพบวาสารประกอบเมนทอล (Menthol) ซงเปนสารประกอบทพบมากในพชตระกล Mentha. (Mentha species) ซงเปนตะกลเดยวกบสะระแหน มฤทธยบยงการท างานของ voltage-sensitive sodium channels ซงมกลไกการท างานคลายกบ MATs โดยอาศยโซเดยมในการพาสารสอประสาทเขาสเซลล ดงนนจงอาจตงสมมตฐานไดวาสารประกอบเมนทอลเปนสารออกฤทธยบยงการท างานของ SERT และ DAT (104)

นอกจากนผวจยไดท าการทดสอบฤทธของสารสกดใบสะระแหนตอกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hSERT และ hNET ในระดบ mRNA ซงเปนกลไกหนงทเกยวของกบการตานโรคซมเศรา พบวาสารสกดใบสะระแหน ทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และน า มฤทธยบยงการแสดงออกของยนทง 3 ชนดไดในระดบ mRNA ดงนนจงอาจกลาวไดวาสารสกดใบสะระแหนมฤทธในการตานโรคซมเศราไดใน in vitro model

ส าหรบการทดสอบฤทธของสารสกดจากบวบกในการตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และhSERT ในระดบ mRNA ดวยเทคนค RT-PCR และผานกลไกการยบยงการท างานของ MATs ดวยเทคนค Uptake assay พบวา สารสกดจากบวบกทสกดดวยเอทานอล และน ามฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และ hSERT ในระดบ mRNA ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) เพยงกลไกเดยวเทานน ไมสามารถยบยงการท างานของ MATs ได จากผลการทดสอบขางตนอาจกลาวไดวาสารสกดบวบกจากเอทานอล และน า มฤทธในการตานโรคซมเศราไดโดยผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และ hSERT ในระดบ mRNA ท าใหเซลลไมสามารถสงเคราะห MATs มาใชในการพาสารสอประสาทเขาสเซลลได ซงสอดคลองกบการศกษาของ Sakina และคณะในป ค.ศ. 1990 ทศกษาฤทธของสารสกดบวบกในการตานโรคซมเศราในหน rat พบวา สารประกอบ atropine ในบวบกมฤทธกดประสาท และตานโรคซมเศราไดเชนกน แตไมทราบกลไกการออกฤทธของสารทแนชด (105)

82

และผลการทดสอบฤทธของสารสกดใบขเหลกในการตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และhSERT ในระดบ mRNA ดวยเทคนค RT-PCR และผานกลไกการยบยงการท างานของ MATs ดวยเทคนค Uptake assay พบวาสารสกดใบขเหลกทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และน ามฤทธยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และ hSERT ไดอยางมนยส าคญทางสถต (P<0.05) ซงใหผลคลายกบสารสกดใบสะระแหน และ บวบก จงอาจกลาวไดวาสารสกดใบขเหลกดวยตวท าละลายเอทานอล และน ามฤทธในการตาน โรคซมเศราไดใน in vitro model โดยผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hDAT, hNET และ hSERT และเนองจากในปจจบนยงไมมการศกษาฤทธของใบขเหลกในการตานโรคซมเศรา ดงนนท าใหคณะผวจยไมสามารถสรปไดวาสารประกอบชนดใดในสารสกดใบขเหลกทออกฤทธตาน โรคซมเศราไดผานกลไกดงกลาว จงตองมการศกษาเพมเตมตอไปในอนาคต

แตจากงานวจยทผานมาทศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรตอการตานโรคซมเศราทงใน in vitro model และ in vivo model ไดคนพบสารประกอบหลายชนดทมฤทธในการตานโรคซมเศรา (ตารางท 5.2) ดงนนจงอาจกลาวไดวาสารสกดสมนไพรทง 3 ชนดทใชศกษาในงานวจยนมสวนประกอบของสารประกอบดงกลาวอยดวย

การทดสอบวดความเปนพษของสารทใชทดสอบฤทธในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนดวยวธ MTT Assay พบวาสารทดสอบทงหมดไมมความเปนพษตอเซลล (P<0.05) ดงนนผลทดสอบทไดจงมความนาเชอถอ โดยทฤทธในการยบยงการท างานของโปรตนขนสงสารสอประสาทโมโนเอมนนนเกดขนจรงไมไดเกดจากการตายของเซลล

ตำรำงท 5.1 โปรตนไคเนสทมควำมเกยวของกบระบบประสำท monoaminergic

ชนดของโปรตนไคเนส หนำทกำรท ำงำน แหลงอำงอง

PKC กระตนการท างานของ MATs ทง 3 ชนด

(79) p38 MAPKC ยบยงการท างานของ SERT และ NET

CaMK II ยบยงการท างานของ MATs ทง 3 ชนด

ERK1/2 ยบยงการท างานของ DAT

83

ตำรำงท 5.2 สำรประกอบในสำรสกดสมนไพรทมฤทธตำนโรคซมเศรำ

สำรประกอบ กำรออกฤทธ แหลงอำงอง

Ginsenoside ยบยงการท างานของ DAT และ SERT

(106) Crosin ยบยงการท างานของ MATs ทง 3 ชนด

Safranal ยบยงการท างานของ MATs ทง 3 ชนด

Hyperfolin, Hypericin ยบยงการท างานของ MATs ทง 3 ชนด 5.2 สรป และขอเสนอแนะ จากผลการทดสอบทงหมดทกลาวมานน สามารถสรปไดวาสารสกดสมนไพรทง 3 ชนด มฤทธตานโรคซมเศราไดโดยผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hSERT, hDAT และ hNET ในระดบ mRNA แตส าหรบสารสกดใบสะระแหนยงมฤทธตานโรคซมเศราไดโดยผานกลไกการยบยงการท างานของ DAT และ SERT ทงทสกดดวยตวท าละลายเอทานอล และ ทสกดดวยตวท าละลายน า ไดอกดวย (P<0.05) อยางไรกตามคณะผวจยไดใชสารสกดสมนไพรทเปนสารสกดหยาบในการทดสอบ (crude extract) ดงนนจงไมสามารถระบไดวาสารประกอบชนดใดทสามารถออกฤทธตานโรคซมเศราผานทง 2 กลไกดงกลาวได ท าใหอาจจะตองมการศกษาคนควาเพมเตมตอไปในอนาคต เพอสามารถระบไดวาสารประกอบชนดใดในสารสกดสมนไพรทง 3 ชนดทออกฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการแสดงออกของยน hSERT, hDAT และ hNET ในระดบ mRNA และสารประกอบชนดใดในสารสกดใบสะระแหน ทออกฤทธตานโรคซมเศราผานกลไกการยบยงการท างานของ DAT และ SERT โดยอาจใชเทคนคแยกสารสมนไพรใหเปนสารประกอบบรสทธ เชน Liquid column chromatography, Silica gel column chromatography, Gas chromatography และ ใชเทคนคทสามารถระบโครงสรางโมเลกลของสารนนๆไดรวมดวย เชน Nuclear magnetic resonance (NMR), Mass spectrometry นอกจากนอาจจะศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรภายในสตวทดลอง (In vivo study) เพมเตมเพอศกษากระบวนการดดซมสารออกฤทธภายในรางกายวาสามารถออกฤทธไดเปนอยางด และใหผลคลายกนกบการทดสอบในหลอดทดลอง (In vitro study) เพอเปนประโยชนในการไปปรบใช และพฒนายาตานโรคซมเศราทใหผลขางเคยงตอผ ปวยไดนอยทสด และมประสทธภาพในการรกษาไดมากทสดในอนาคต

84

รำยกำรอำงอง

(1) World Health Organization (WHO). Depression. [Online]. 2011. Available from: http://www.who.int/en/. [2011,February 4]

(2) ศนยสารสนเทศ กองแผนงาน กรมสขภาพจต กระทรวงสาธารณสข. จ านวนและอตราผ ปวยสขภาพจตตอประชากร 100,000 คน ปพ.ศ. 2540 - 2549 หนวยนบ:คน [Online]. 2011. Available from: http://www.plan.dmh.go.th/. [2011,February 4]

(3) สถาบนเวชศาสตรผ สงอาย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข. โรคซมเศรา. [Online]. 2009. Available from: http://www.agingthai.org/page/709.[2011,February 4]

(4) Thomson, W. Barlow Abnormal psychology: An integrative approach. 5, editor. Belmont, CA, USA 2005.

(5) Dwivedi, Y. Brain-derived neurotrophic factor: role in depression and suicide. Journal of Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5 (2009): 433-49.

(6) Delgado, P., and Schillerstrom , J. Cognitive Difficulties Associated With Depression: What Are the Implications for Treatment? Psychiatric Times. 26 (2009).

(7) Faculty of Psychiatry of Old Age, N. B., RANZCP. Consensus Guidelines for Assessment and Management of Depression in the Elderly: NSW Health Department 2001, 2001.

(8) Yohannes, A. M., and Robert, C. Medical Comorbidities in Late-Life Depression. (2008).

(9) Shah, N., Eisner, T., Farrell, M., and Raeder, C. An Overview of SSRIs for the Treatment of Depression. Journal of the Pharmacy Society of Wisconsin. (1999).

(10) Caspi, A., Sugden, K., Moffitt, T. E., Taylor, A., Craig, I. W., Harrington, H. L., et al. Influence of Life Stress on Depression: Moderation by a Polymorphism in the 5-HTT Gene. Science. 301 (2003): 386-89.

(11) Krishnan, V., and Nestler, E. J. The molecular neurobiology of depression. Nature. 455 (2008): 894-902.

http://www.who.int/en/

http://www.plan.dmh.go.th/

http://www.agingthai.org/page/709

85

(12) Meyer, J., Ginovart, N., Boovariwala, A., Sagrati, S., Hussey, D., Garcia, A., et al. Elevated Monoamine Oxidase A Levels in the Brain An Explanation for the Monoamine Imbalance of Major Depression. Archives of General Psychiatry. 63 (2006): 1209-16.

(13) Heim, C., Newporta, D. J., Mletzkoa, T., Millera, H. A., and Nemeroffa, B. C. The link between childhood trauma and depression: Insights from HPA axis studies in humans. Psychoneuroendocrinology. 33 (2008): 693-710.

(14) Kessler, R. THE EFFECTS OF STRESSFUL LIFE EVENTS ON DEPRESSION. Annual Review of Psychology. 48 (1997): 191-214.

(15) Kendler, K., Hettema, J., Butera, F., Gardner, C., and Prescott, C. Life Event Dimensions of Loss, Humiliation, Entrapment, and Danger in the Prediction of Onsets of Major Depression and Generalized Anxiety. Archives of General Psychiatry. 60 (2003): 789-96.

(16) Jenny, D., Eman, S., and Gabrielle, M. Do psychiatrists perform appropriate physical investigations for their patients? A review of current practices in a general psychiatric inpatient and outpatient setting. Journal of Mental Health. 17 (2008): 293-98.

(17) Diagnostic and statistical manual of mental disorders DSM-IV-TR. Arlington VA American Psychiatric Association, 2010.

(18) Practice guideline for the treatment of patients with major depressive disorder. American Journal of Psychiatry. 157 (2000): 1-45.

(19) Turner, E., Matthews, A., Linardatos, E., Tell, R., and Rosenthal, R. Selective publication of antidepressant trials and its influence on apparent efficacy. The New England Journal of Medicine. 358 (2008): 252-60.

(20) Yuferov V, Butelman E, and Kreek M. Biological clock: biological clocks may modulate drug addiction. European Journal of Human Genetics. 13 (2005): 1101–3.

86

(21) Stimmel, Dopheide G.L., and Stahl S.M. Mirtazapine: an antidepressant with

noradrenergic and specific serotonergic effects: Pharmacotherapy (American College of Clinical Pharmacy), 1997.

(22) Broquet K. Status of treatment of depression. Southern Medical Journal. 92 (1999): 846-56.

(23) Cascade, E., and Kalali, A. EMSAM: The First Year. Psychiatry. (2007). (24) King, M. Serotonin. The Medical Biochemistry Page. (2009). (25) Frazer, A., and Hensler, J. Understanding the neuroanatomical organization of

serotonergic cells in the brain provides insight into the functions of this neurotransmitter1999.

(26) Coccaro, E. Central serotonin and impulsive aggression. The British Journal of Psychiatry. 155 (1989): 52-62.

(27) Berger, M., Gray, J. A., and Roth, B. L. The Expanded Biology of Serotonin. The Annual Review of Medicine. 60 ( 2009): 355-66.

(28) Walther, J. D., Peter, J. U., Bashammakh, S., Ho¨ rtnagl, H., Voits, M., Fink, H., et al. Synthesis of Serotonin by a Second Tryptophan Hydroxylase Isoform. BREVIA NEUROSCIENCE. 299 (2003): 76.

(29) Encyclopedia of Drugs, Alcohol, and Addictive Behavior. Ventral Tegmental Area. [Online]. 2001. Available from: http://www.enotes.com/health/ browse/sources/encyclopedia-drugs-alcohol-addictive-behavior. [25 september 2011]

(30) Ben-Jonathan, N., and Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (2001): 724-63.

(31) Arias-Carrión, O., and Pöppel, E. Dopamine learning and reward-seeking behavior. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 67 (2007): 481-88.

87

(32) Carlsson, A. Perspectives on the discovery of central monoaminergic neurotransmission. Annual Review of Neuroscience Letters. 10 (1987): 19-40.

(33) Koob, G. Drug abuse and alcoholism. Overview. . Advances in Pharmacology. 42 (1998): 969–77.

(34) Redgrave, P., and Gurney, K. The short-latency dopamine signal: a role in discovering novel actions? Nature Reviews Neuroscience. 12 (2006): 967-75.

(35) Renal Vasodilatory Action of Dopamine in Patients With Heart Failure: Magnitude of Effect and Site of Action. Circulation. 117 (2008): 200-05.

(36) Morón, J., Brockington, A., Wise, R., Rocha, B., and Hope, B. Dopamine uptake through the norepinephrine transporter in brain regions with low levels of the dopamine transporter: evidence from knock-out mouse lines. The Journal of Neuroscience. 22 (2002): 389-95.

(37) Henekaa, M. T., Nadrignyb, F., Regenc, T., Martinez-Hernandezd, A., Dumitrescu-Ozimeka, L., Terwela, D., et al. Locus ceruleus controls Alzheimer’s disease pathology by modulating microglial functions through norepinephrine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (2010): 6058-63.

(38) Rang, H. P., Dale, M. M., and Ritter, J. M. Chapter 11 in: Rod Flower. Edinburgh2007.

(39) Klimek, V., Stockmeier, C., Overholser, J., Meltzer, H., Kalka, S., Dilley, G., et al. Reduced levels of norepinephrine transporters in the locus coeruleus in major depression. The Journal of Neuroscience. 17 (1997): 8451-58.

(40) The American Heritage® Stedman's Medical Dictionary(2011). Norepinephrine. (n.d.).

88

(41) Tanaka, M., Yoshida, M., Emoto, H., and Ishii, H. Noradrenaline systems in the hypothalamus, amygdala and locus coeruleus are involved in the provocation of anxiety: basic studies. European Journal of Pharmacology. 405 (2000): 397-406.

(42) White, M. Introduction to Autonomic Pharmacology. Pharmacology. 512 (2008). (43) ISCID Encyclopedia of Science and Philosophy Monoamine Neurotransmitters

[Online]. 2011. Available from: http://www.iscid.org/encyclopedia/ Monoamine_Neurotransmitters. [2011,February 4]

(44) Wikipedia, the free encyclopedia. Monoamine neurotransmitter. [Online]. 2010. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Monoamine_neurotransmitter. [2010,December 30]

(45) Barker, E., and Blakely, R. Norepinephrine and serotonin transporters: Molecular targets of antidepressant drugs. Bloom, F., Kupfer, D., editors. New York: Raven Press, 1995.

(46) Jayanthi, L., and Ramamoorthy, S. Regulation of monoamine transporters: influence of psychostimulants and therapeutic antidepressants. The AAPS Journal. (2005): E728-38.

(47) Yamashita, A., Singh, S., Kawate, T., Jin, Y., and Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl−-dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (2005): 215–23.

(48) Vaughan, R. A., Huff, R. A., Uhl, G. R., and Kuhar, M. J. J. Protein kinase C-mediated phosphorylation and functional regulation of dopamine transporters in striatal synaptosomes. . Biological Chemistry. 272 (1997): 15541–46.

(49) Zhang, L., Coffey, L. L., and Reith, M. E. Regulation of the functional activity of the human dopamine transporter by protein kinase C. Biochem Pharmacol. 53 (1997): 677–88.

http://en.wikipedia.org/wiki/Monoamine_neurotransmitter

89

(50) Bonisch, H., Hammermann, R., and Bruss, M. Role of protein kinase C and second messengers in regulation of the norepinephrine transporter. . Advances in Pharmacology. 42 (1998): 183-86.

(51) Ramamoorthy, S., Giovanetti, E., Qian, Y., and Blakely R. D. Phosphorylation and regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporters. The Journal of Biological Chemistry. 273 (1998): 2458–66.

(52) Biochemistry of Methamphetamine. [Online]. 2011. (53) Lesch, K., Wolozin, B., Estler, H., Murphy, D., and Riederer, P. Isolation of a cDNA

encoding the human brain serotonin transporter. Journal of Neural Transmission. 91 (1993): 67-72.

(54) Rudnick, G. Active transport of 5-hydroxytryptamine by plasma membrane vesicles isolated from human blood platelets. The Journal of Biological Chemistry. 252 (1977).

(55) Gordon, J., and Barnes, N. Lymphocytes transport serotonin and dopamine: agony or ecstasy? Trends in Immunology. 24 (2003): 438-43.

(56) Balkovetz, D., Tiruppathi, C., Leibach, F., Mahesh, V., and Ganapathy, V. Evidence for an imipraminesensitive serotonin transporter in human placental brush-border membranes. The Journal of Biological Chemistry. 264 (1989): 2195-98.

(57) Paczkowski, N., Vuocolo, H., and Bryan-Lluka, L. Conclusive evidence for distinct transporters for 5-hydroxytryptamine and noradrenaline in pulmonary endothelial cells of the rat. . Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 353 (1996).

(58) Talvenheimo, J., Fishkes, H., Nelson, P., and Rudnick, G. The serotonin transporter- imipramine “receptor. The Journal of Biological Chemistry. 258 (1983): 6115-19.

(59) Benmansour, S., Deltheil, T., Piotrowski, J., Nicolas, L., Reperant, C., Gardier, A., et al. Influence of brainderived neurotrophic factor (BDNF) on serotonin

90

neurotransmission in the hippocampus of adult rodents. European Journal of Pharmacology. 587 (2008): 90-98.

(60) Daws, L., Gerhardt, G., and Frazer, A. 5-HT1B antagonists modulate clearance of extracellular serotonin in rat hippocampus. . Neuroscience Letters. 266 (1999): 165-68.

(61) Daws, L., Gould, G., Teicher, S., Gerhardt, G., and Frazer, A. 5-HT(1B) receptor- mediated regulation of serotonin clearance in rat hippocampus in vivo. . Journal of Neurochemistry. 75 (2000): 2113-22.

(62) Launay, J., Bondoux, D., Oset-Gasque, M., Emami, S., Mutel, V., Haimart, M., et al. Increase of human platelet serotonin uptake by atypical histamine receptors. American Journal of Physiology. 266 (1994): 526-36.

(63) Matheus, N., Mendoza, C., Iceta, R., Mesonero, J., and Alcalde, A. Regulation of serotonin transporter activity by adenosine in intestinal epithelial cells. . Biochem Pharmacol. 78 (2009): 1198-204.

(64) Steiner, J., Carneiro, A., Wright, J., Matthies, H., Prasad, H., Nicki, C., et al. cGMP-dependent protein kinase Ialpha associates with the antidepressant-sensitive serotonin transporter and dictates rapid modulation of serotonin uptake. . Molecular Brain Research. 2 (2009): 26.

(65) Zhu, C., Hewlett, W., Feoktistov, I., Biaggioni, I., and Blakely, R. Adenosine receptor, protein kinase G, and p38 mitogen-activated protein kinase-dependent up-regulation of serotonin transporters involves both transporter trafficking and activation. Molecular Pharmacology. 65 (2004): 1462-74.

(66) Zhu, C., Hewlett, W., Francis, S., Corbin, J., and Blakely RD. Stimulation of serotonin transport by the cyclic GMP phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil. European Journal of Pharmacology. 504 (2004): 1-6.

91

(67) Gu, H., Wall, S., and Rudnick, G. Stable expression of biogenic amine transporters reveals differences in inhibitor sensitivity, kinetics, and ion dependence. The Journal of Biological Chemistry. 269 (1994): 7124-30.

(68) Bolan, E., Kivell, B., Jaligam, V., Oz, M., Jayanthi, L., Han, Y., et al. D2 receptors regulate dopamine transporter function via an extracellular signal-regulated kinases 1 and 2-dependent and phosphoinositide 3 kinase-independent mechanism. Molecular Pharmacology. 71 (2007): 1222-32.

(69) Carvelli, L., Moron, J., Kahlig, K., Ferrer, J., Sen, N., Lechleiter, J., et al. PI 3-kinase regulation of dopamine uptake. Journal of Neurochemistry. 81 (2002): 859-69.

(70) Foster, J., Pananusorn, B., Cervinski, M., Holden, H., and Vaughan, R. Dopamine transporters are dephosphorylated in striatal homogenates and in vitro by protein phosphatase 1. . Molecular Brain Research. 110 (2003): 100-08.

(71) Hoover, B., Everett, C., Sorkin, A., and Zahniser, N. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. Journal of Neurochemistry. 101 (2007): 1258-71.

(72) Foote, S., Bloom, F., and Aston-Jones, G. Nucleus locus ceruleus: New evidence of anatomical and physiological specificity. Physiological Reviews. 63 (1983): 844-914.

(73) Moore, R., and Bloom, F. Central catecholamine neuron systems: anatomy and physiology of the norepinephrine and epinephrine systems. . Annual Review of Neuroscience. 2 (1979): 113-68.

(74) Jayanthi, L., Vargas, G., and DeFelice, L. Characterization of cocaine and antidepressant-sensitive norepinephrine transporters in rat placental trophoblasts. . British Journal of Pharmacology. 135 (2002): 1927-34.

(75) Schroeter, S., Apparsundaram, S., Wiley, R., Miner, L., Sesack, S., and Blakely, R. Immunolocalization of the cocaine- and antidepressant-sensitive

92

l-norepinephrine transporter. The Journal of Comparative Neurology. 420 (2000): 211-32.

(76) Sung, U., Apparsundaram, S., Galli, A., Kahlig, K., Savchenko, V., Schroeter, S., et al. A regulated interaction of syntaxin 1A with the antidepressant-sensitive norepinephrine transporter establishes catecholamine clearance capacity. . The Journal of Neuroscience. 23 (2003): 1697-709.

(77) Gu, H., Wall, S., and Rudnick, G. Ion coupling stoichiometry for the norepinephrine transporter in membrane vesicles from stably transfected cells. The Journal of Biological Chemistry. 271 (1996): 6911-16.

(78) Apparsundaram, S., Galli, A., DeFelice, L., Hartzell, H., and Blakely, R. Acute regulation of norepinephrine transport: I. PKC-linked muscarinic receptors influence transport capacity and transporter density in SK-N-SH cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 287 (1998): 733-43.

(79) Ramamoorthy, S., Shippenberg, T., and Jayanthi, L. Regulation of Monoamine Transporters: Role of Transporter Phosphorylation. Pharmacology & Therapeutics. 129 (2011): 220-38.

(80) Ernst, E. St. John’s wort, an anti-depressant?A systematic, criteriabased. Phytomedicine. 2 (1995): 67–71.

(81) Linde, K., and Mulrow, C. St John’s wort for depression. Cochrane Database of Systematic Reviews. (1998).

(82) Gaster B. St John’s wort for depression. A systematic review. Archives of Internal Medicine. 160 (2000): 152–6.

(83) Williams, J. W. j., Mulrow, C., Chiquette, E., Hitchcock, N. P., Aguilar, C., and Cornell, J. A systmatic review of newer pharmacotherapies for depression in adults: evidence report summary. Annals of Internal Medicine. 132 (2000): 743–56.

93

(84) Akhondzadeh, S., Fallah-Pour, H., Afkham, K., Jamshidi, A. H., and Khalighi-Cigaroudi, F. Comparison of Crocus sativus L. and imipramine in the treatment of mild to moderate depression: A pilot double-blind randomized trial. BMC Complementary and Alternative Medicine. ( 2004).

(85) Akhondzadehbasti A, Moshiri E, Noorbala A, Jamshidi A, Abbasi S, and Akhondzadeh S. Comparison of petal of Crocus sativus L. and fluoxetine in the treatment of depressed outpatients: A pilot double-blind randomized trial. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 31 (2007): 439-42.

(86) Joshi, H., and Parle, M. Evaluation of nootropic potential of Ocimum sanctum Linn. in mice. Indian Journal of Experimental Biology. 44 (Feb. 2006): 133-6.

(87) สมนไพรสวนสรรกขชาต. กรงเทพมหานคร: ภาควชาเภสชพฤกษศาสตร คณะเภสชศาสตรมหาวทยาลยมหดล, 2543.

(88) Quisumbing, E. Medicinal Plants of the Philippines. (1978). (89) บณยะประภศร นนทวน, และ โชคชยเจรญพร อรนช. สมนไพรไมพนบาน. 4, editor.

กรงเทพมหานคร: ส านกพมพประชาชน, 2539. (90) McKemy, D. D., Neuhausser, W. M., and Julius, D. Identification of a cold receptor

reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature. 416 (2002): 52-58.

(91) Villaseñor, I. M., Echegoyen, D. E., and Angelada, J. S. A new antimutagen from Mentha cordifolia Opiz. Mutation Research. 515 (2002): 141-46.

(92) Wijeweeraa, P., Arnasona, J. T., Koszyckib, D., and Meralib, Z. Evaluation of anxiolytic properties of Gotukola – (Centella asiatica) extracts and asiaticoside in rat behavioral models. Phytomedicine. 13 (2006): 668-76.

(93) Somchit, M. N., Sulaiman, M. R., Zuraini, A., and et al. Antinociceptive and antiinflammatory effects of Centella asiatica. Indian Journal of Pharmacology. 36 (2004): 377-80.

94

(94) George, M., Joseph, L., and Ramaswamy. Anti-allergic, antipruritic, and anti-inflammatory activities of Centella asiatica extracts. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines. 6 (2009): 554-59.

(95) Sudha, S., Kumaresan, S., Amit, A., David, J., and Venkataraman, B. V. Anti-convulsant activity of different extracts of Centella asiatica and Bacopa monnieri in animals. Journal of Natural Remedies. 2 (2002): 33-41.

(96) Wang, X. S., Dong, Q. J., Zuo, P., and Fang, J. N. Structure and potential immunological activity of a pectin from Centella asiatica (L.) Urban. Carbohydrate Research. 338 (2003): 2393-402.

(97) Chantong, B., Wongtongtair, S., Nusuetrong, P., Sotanaphun, U., Chaichantipyuth, C., and Meksuriyen, D. Stability of Barakol under Hydrolytic Stress Conditions and its Major Degradation Product. Planta Medica. 75 (2008): 346-50.

(98) Zhao, G., Gai, Y., Chu, W., Qin, G., and Guo, L. A novel compound N1, N5-(Z)-N10- (E)-tri-p-coumaroylspermidine isolated from Carthamus tinctorius L. and acting by serotonin transporter inhibition. European europsychopharmacology. 19 (2009): 749-75.

(99) Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays Journal of immunological methods. 65 (1983): 55-63.

(100) Frankhausera, P., Grimmerb, Y., Bugertc, P., Deuschlea, M., Schmidtb, M., and Schlossd, P. Characterization of the neuronal dopamine transporter DAT in human blood platelets. Neuroscience Letters. 399 (2006): 197-201.

(101) Kubota, N., Kiuchi, Y., Nemoto, M., Oyamada, H., Ohno, M., Funahashi, H., et al. Regulation of serotonin transporter gene expression in human glial cells by growth factors. European Journal of Pharmacology. 417 (2001): 69-76.

(102) Divya, C. S., and Pillai, M. R. Antitumor action of curcumin in human papillomavirus associated cells involves downregulation of viral

95

oncogenes, prevention of NFkB and AP-1 translocation, and modulation of apoptosis. Molecular Carcinogenesis. 45 (2006): 320-32.

(103) DSMZ. LAN-5 Cell line index. [Online]. 2004. Available from: http://old.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines/info.php?dsmz_nr=673&from=cell_line_index&firstload=1. [2012,July 20]

(104) Haeseler G., Maue D., Grosskreutz J., Bufler J., Nentwig B., Piepenbrock S., et al. "Voltage-dependent block of neuronal and skeletal muscle sodium channels by thymol and menthol". European Journal of Anaesthesiology.19 (2002): 571-79.

(105) Sakina, M. R., and Dandiya, P. C. A psychoneuropharmacological profile of Centella asiatica extract. Fitoterapia. 61 (1990): 291-96.

(106) Sarris, J. Herbal medicine for depression, anxiety and insomnia: A review of psychopharmacology and clinical evidence. European Neuropsychopharmacology. (2011).

http://old.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines/info.php?dsmz_nr=673&from=cell_line_index&firstload=1

http://old.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines/info.php?dsmz_nr=673&from=cell_line_index&firstload=1

96

ภำคผนวก

97

ภำคผนวก ก

น ำยำและสำรละลำยทใชในกำรทดสอบ

1. MTT stock solution reagents 5 มลลกรมตอมลลลตร MTT dye 5 มลลกรม ละลายในฟอสเฟตบฟเฟอร (pH 7.4) 1 มลลลตร กรองผาน

กระดาษกรองผานกระดาษกรองขนาด 0.22 µm เพอท าใหปราศจากเชอ และแยกตะกอนเลกๆ ทยงละลายไมดออก เกบท -20 องศาเซลเซยส

2. กำรเตรยม DEPC-treated water ประกอบดวย 0.01% Diethylpyrocarbonate (DEPC) ผสมกบน าในภาชนะทปราศจาก

Rnase ตงทงไวขามคนและน าไปอบฆาเชอ (autoclave) 3. กำรเตรยม 10% DMEM with glucose (50mL) DMEM 45 มลลลตร Fetal Bovine Serum 5 มลลลตร

Antibiotic - Antimycotic 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากนในหลอดทดลองขนาด 50 mL เกบไวทอณหภม 4oC

4. กำรเตรยม Tris-acetate Buffer (TAE) (50X) Tris base 242 กรม Glacial acetic acid 57.1 มลลลตร 0.5 M EDTA, pH 8 100 มลลลตร เตมน าจนครบ 1 ลตร 5. กำรเตรยมอะกำโรสเจล 2% (100 mL) ชงผงอะกาโรส 2 กรมแลวเตม 1X TAE buffer จนมปรมาตรเปน 100 มลลลตร ผสมใหเขากนจากนนน าเขาไมโครเวฟจนละลายเปนเนอเดยวกน เทลงแมพมพเกบไวทอณหภมหองโดยการแชไวใน 1X TAE buffer 6. กำรเตรยม 1X HBSS (1 ลตร)

10X HBSS 100 มลลลตร 1M HEPES 20 มลลลตร เตมน าจนครบ 1 ลตร

7. กำรเตรยม 1X HBSS+0.1%BSA Buffer 35%BSA 286 ไมโครลตร 1X HBSS 100 มลลลตร

98

ภำคผนวก ข ค ำอธบำยสญลกษณและค ำยอทใชในกำรวจย

สญลกษณ ค ำยอ และค ำอธบำย ค ำยอ ค ำอธบำย 5-HT serotonin ºC องศาเซลเซยส OD การดดกลนแสง (optical density) % เปอรเซนต / per µ micro (10-6) µl microlitre Abs Absorbance bp Base pairs cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DA Dopamine DAT Dopamine transporter DMSO Dimethyl sulfoxide DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease FBS Fetal Bovine Serum g Gram GBR12935 1-(2-(diphenylmethoxy)ethyl)-4-(3-phenylpropyl)

piperazine hDAT Human dopamine transporter gene hNET Human norepinephrine transporter gene hSERT Human serotonine transporter gene M Molar

99

MATs Monoamine transporters mM Milimolar µM Micromolar mg Milligram ml Millilitre MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) mRNA Messenger Ribonucleic acid NADP Nicotinamide adenine dinucleotide (reduced) NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

(reduced) NE Norepinephrine NET Norepinephrine transporter nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction P P-value PBS Phosphate Buffered Saline pH Negative logarithm of the hydrogen ion

concentration RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SERT Serotonin transporter U Unit v / v Volume by volume

100

ประวตประวตหวหนำโครงกำรวจย

ผชวยศาสตราจารย ดร. เทวน เทนค าเนาว คณวฒ

วท. บ. (เทคนคการแพทย, เกยรตนยม), จฬาลงกรณมหาวทยาลย, พ.ศ. 2537

Ph.D. (Biochemistry and Molecular Biophysics), Virginia Commonwealth

University/USA, พ.ศ. 2544

Post-doctoral training, Institute of Molecular Medicine and Genetics (IMMAG),

Medical College of Georgia/USA, พ.ศ. 2544 – 2545

สำขำวชำกำรทมควำมช ำนำญเปนพเศษ

- ดานการควบคมการแสดงออกของยน (regulation of gene expression) โดยมประสบการณศกษากลไกทควบคมการแสดงออกยนของเอนไซมทเกยวกบการผลตไขมนชนดตางๆในสมอง ซงในการวจยดงกลาว ใชเทคนคทางอณชววทยา (molecular biology) เชน molecular cloning, polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, reverse transcription (RT)-PCR, Northern blot analysis, Western blot analysis, electrophoretic mobility shift assay และ reporter gene assay เปนตน

- การวจยทใชการเพาะเลยงเซลล (cell culture) เชน เซลลสมอง (neuronal cells) และเซลลตนก าเนด (stem cells) เพอทดสอบดวา เมอถายโอน chimeric genes ทผลตขนจากยนทสนใจเขาสเซลลแลว เซลลเกดการเปลยนแปลงอยางไร รวมทงตรวจสอบการเคลอนท (subcellular localization) หรอการแสดงออกของโปรตนทสนใจโดยใชเทคนคการยอมหรอตดฉลาก แลวตรวจดเซลล ดวยอปกรณตางๆ เชน confocal microscopy และ fluorescence microscopy เปนตน

- การศกษาในลกษณะ association study เพอวเคราะหความหลากหลายทางพนธกรรมของยน (genetic polymorphism) กบการเกดโรค โดยมงศกษาอณชววทยาของยน receptor for advanced glycation endproduct (RAGE), angiotensin-converting enzyme (ACE) และยนหลกในระบบสารสอประสาท serotonergic และ dopaminergic เชน serotonin transporter gene, serotonin receptor genes, dopamine transporter gene และ dopamine receptor genes เปนตน ทงน ไดศกษาในโรคทก าลงเปนปญหาสาธารณสข ไดแก โรคเบาหวาน โรคสะเกดเงน และโรคซมเศรา

101

- การศกษาฤทธทางชวภาพของสารสกดจากสมนไพรไทย เชน ฤทธตานอนมลอสระ ฤทธในการลดน าตาลในเลอด ฤทธตานเซลลมะเรง และฤทธตานโรคสะเกดเงน

ผลงำนทำงวชำกำร

ผลงานทตพมพในวารสารระดบนานาชาต Original articles in international peer-reviewed journals

1. Effect of Gloriosa superba and Catharanthus roseus extracts on IFN-ϒ-induced Keratin 17 expression in HaCaT human keratinocytes. Pattarachotanant N., Rakkhittawattana V. and Tencomnao T. Evid Based Complement Alternat Med. 2014 (In press)

2. Medicinal herbs and antioxidants: potential of Treatment?, nasutus for disease. Brimson, J.M. and Tencomnao, T. Phytochem. Rev. 2014; 13: 643–51.

3. Protection from UVB Toxicity in Human Keratinocytes by Thailand Native Herbs Extracts. Thongrakard V, Ruangrungsi N, Ekkapongpisit M, Isidoro C, Tencomnao T. Photochemistry and Photobiology. 2014; 90: 214–24.

4. Turmeric Toxicity in A431 Epidermoid Cancer Cells Associates with Autophagy Degradation of Anti-apoptotic and Anti-autophagic p53 Mutant. Thongrakard V, Titone R, Follo C, Morani F, Suksamrarn A, Tencomnao T, Isidoro C. Phytother Res. 2014 Jul 11. doi: 10.1002/ptr.5196. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25044209.

5. Effect of Moringa oleifera on advanced glycation end-product formation and lipid metabolism gene expression in HepG2 cells. Sangkitikomol W, Rocejanasaroj A, Tencomnao T. Genet Mol Res. 2014;13(1):723-735.

6. Thunbergia laurifolia extract minimizes the adverse effects of toxicants by regulating P-glycoprotein activity, CYP450, and lipid metabolism gene expression in HepG2 cells. Rocejanasaroj A, Tencomnao T, Sangkitikomol W. Genet Mol Res. 2014; 13(1):205-219.

7. Effects of ethanolic extract of Annona squamosa L. leaves on the expression of EGFR. Ronpirin C, Charueksereesakul T, Thongrakard V and Tencomnao T.

Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2014; 6(4): 791-797. 8. Suppressive effect of ethanolic extract of Annona squamosa L. leaves on the

expression of Id1 biomarker: Phytochemical investigation and antioxidant activity study. Kawjit N, Charueksereesakul T, Thongrakard V, Sangsuthum S and

102

Tencomnao T. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2014; 6(1):499-506.

9. Fluorescence of Senna simea Lam. leaf extracts: a possible interference in a fluorescence-based assay. Thanesphatisuk L and Tencomnao T. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2013; 5(5):105-110.

10. Amyloidosis in Alzheimer's Disease: The Toxicity of Amyloid Beta (Aβ), Mechanisms of Its Accumulation and Implications of Medicinal Plants for Therapy. Prasansuklab A and Tencomnao T. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:413808. doi: 10.1155/2013/413808.

11. Are religious beliefs and practices of Buddhism associated with disability and salivary cortisol in office workers with chronic low back pain? Sooksawat A, Janwantanakul P, Tencomnao T, Pensri P. BMC Musculoskelet Disord. 2013; 14:29.

12. Acceleration of gene transfection efficiency in neuroblastoma cells through polyethyleneimine/poly(methyl methacrylate) core-shell magnetic nanoparticles. Tencomnao T, Klangthong K, Pimpha N, Chaleawlert-Umpon S, Saesoo S, Woramongkolchai N, Saengkrit N. Int J Nanomedicine. 2012;7:2783-92.

13. Associations of the +45 T/G and +276 G/T polymorphisms in the adiponectin gene with biliary atresia. Udomsinprasert, W., Tencomnao, T., Honsawek, S., Anomasiri, W., Vejchapipat, P., Chongsrisawat, V., Poovorawan, Y. World Journal of Pediatrics. 2012; 8:328-34.

14. Dithranol downregulates expression of Id1 mRNA in human keratinocytes in vitro. Ronpirin, C., Tencomnao, T. J Genetics and Molecular Research. 2012; 11:3290-7.

15. Rhinacanthus nasutus Extracts Prevent Glutamate and Amyloid-β Neurotoxicity in HT-22 Mouse Hippocampal Cells: Possible Active Compounds Include

Lupeol, Stigmasterol and β-Sitosterol. (2012). Brimson, J.M.; Brimson, S.J.;

103

Brimson, C.A.; Rakkhitawatthana, V.; Tencomnao, T. Int J Mol Sci, 13, pp. 5074-5097.

16. Effects of the antipsoriatic drug dithranol on E2A and caspase-9 gene expression invitro. (2012). Ronpirin C, Tencomnao T. Genet Mol Res, 11(1), pp. 412-420.

17. Layer-by-layer deposition of cationic polymers on gold nanoparticle for non-viral gene delivery system. (2011). Saengkrit, N., Sajomsang, W., Pimpa, N., Chaleawlert-umpon, S., Rakkhithawatthana, V., Tencomnao, T. Technical Proceedings of the 2011 NSTI Nanotechnology Conference and Expo, NSTI-Nanotech 2011, 3 , pp. 302-305.

18. Semi-quantitative detection of gene expression using bisbenzimide dye. (2011). Kittimongkolsuk, P., Tencomnao,T., Santiyanont, R. Genet Mol Res, 10(4), pp. 3747-3759.

19. Modulation of Human Serotonin Transporter Expression by 5-HTTLPR in Colon Cells. (2011). Prasansuklab, A., Poovorawan, Y., Tencomnao, T. Int J Mol Sci, 12, pp. 6619-6634.

20. Immunomodulatory effect of hexane extract of vernonia cinerea less. trunk on human peripheral blood mononuclear cells. ( 2011( . Laosim, T., Chuchawankul, S., Tencomnao, T.Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 3 )4( , pp.

188-195 . 21. In vitro effect of Thai herbal extracts with anti-psoriatic activity on the expression

of caspase 9) .2011 .( Charueksereesakul, T., Thongrakard, V., Tencomnao, T. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research Volume 3, Issue 4, 2011, Pages 196-203 .

22. Rhinacanthus nasutus Protects Cultured Neuronal Cells against Hypoxia Induced Cell Death. (2011). Brimson, J.M., Tencomnao, T. Molecules, 16, pp. 6322-6338.

104

23. Nano-polyplex as a non-viral gene carrier for the expression of bone morphogenetic protein in osteoblastic cells. (2011). Saengkrit, N., Sajomsang, W., Rakkhithawatthana, V., Tencomnao, T. Carbohydrate Polymers, 86, pp. 587-593.

24. Effects of Thai Medicinal Herb Extracts with Anti-Psoriatic Activity on the

Expression on NF-κB Signaling Biomarkers in HaCaT Keratinocytes. (2011). Saelee, C., Thongrakard, V., Tencomnao, T. Molecules, 16, pp. 3908-3932.

25. Gold/cationic polymer nano-scaffolds mediated transfection for non-viral gene delivery system Carbohydrate Polymers. (2011). Tencomnao, T., Apijaraskul, A., Rakkhithawatthana, V., Chaleawlert-umpon, S., Pimpa, N., Sajomsang, W., Saengkrit N. Carbohydrate Polymers, 84, pp. 216-222.

26. Antioxidant effects of anthocyanins-rich extract from black sticky rice on human erythrocytes and mononuclear leukocytes. (2010). Sangkitikomol, W., Tencomnao, T., Rocejanasaroj, A. African Journal of Biotechnology, 9 (48), pp. 8222-8229.

27. An investigation of the relationship between serotonin transporter gene promoter polymorphism (5-HTTLPR) and psoriasis susceptibility in a Thai population. (2010). Tencomnao, T., Wongpiyabovorn, J. Genet Mol Res, 9 (4), pp. 2275-2282.

28. Up-regulation of Id1 in peripheral blood of psoriatic patients. (2010). Ronpirin, C., Achariyakul, M., Tencomnao, T., Wongpiyabavorn, J., Chaicumpa, W. Genet Mol Res, 9 (4), pp. 2239-2247.

29. Influence of demographic factors and serotonin transporter-linked polymorphic region (5-HTTLPR) variants on major depression in a northeastern Thai population. (2010). Tencomnao, T., Sritharathikhun, T., Suttirat, S. Asian Biomedicine, 4(6), pp. 893-899.

105

30. The effects of Thai black sticky rice extract on oxidative stress and lipid metabolism gene expression in HepG2 cells. (2010). Sangkitikomol, W., Tencomnao, T., Rocejanasaroj, A. Genet Mol Res, 9 (4), pp. 2086-2095.

31. Psoriasis: A review of the role of serotonergic system. (2010). Ronpirin C., and Tencomnao T., 2010. African Journal of Biotechnology, 9 (11), p. 1528-1534.

32. Modulatory effects of Thai medicinal plant extract on proinflammatory cytokines-induced apoptosis in human keratinocyte HaCaT cells. (2010). Thongrakard, V., Tencomnao, T. African Journal of Biotechnology, 9 (31), pp. 4999-5003.

33. No relationship found between -1438A/G polymorphism of the serotonin 2A receptor gene (rs6311) and major depression susceptibility in a northeastern Thai population. (2010). Tencomnao, T., Thongrakard, V., Phuchana, W., Sritharathikhun, T., Suttirat, S. Genet Mol Res, 9 (2), pp. 1171-1176.

34. Association between Toll-like receptor 2 (TLR2) polymorphisms and asymptomatic bancroftian filariasis. (2010). Junpee, A., Tencomnao, T., Sanprasert, V., Nuchprayoon, S. Parasitology Research, pp. 1-10.

35. Association of C/T polymorphism in intron 14 of the dopamine transporter gene (rs40184) with major depression in a northeastern Thai population. (2010). Pattarachotanant, N., Sritharathikhun, T., Suttirat, S., Tencomnao, T. Genet Mol Res, 9 (1), pp. 565-572.

36. Investigation of gene transferring efficacy through nano-polyplex consisting of methylated N-(4-pyridinylmethyl) chitosan chloride and poly(ethylenimine) in human cell lines. (2010). Rakkhithawatthana, V., Sanitrum, P., Sajomsang, W., Na Ubon, P., Tencomnao, T., Saengkrit, N. Carbohydrate Polymers, 80 (1), pp. 276-284.

37. Association between the -1438A/G polymorphism of the serotonin 2A receptor gene and late-onset psoriasis in a Thai population. (2010). Ronpirin, C., Tencomnao, T., Wongpiyabovorn, J. Genet Mol Res, 9 (1), pp. 208-214.

106

38. Interaction of serotonin-related genes affects short-term antidepressant response in major depressive disorder. (2010). Tencomnao, T. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 34 (2), p. 432.

39. Effect of Gymnema inodorum on postprandial peak plasma glucose levels in healthy human (2010). Chiabchalard, A., Tencomnao, T., Santiyanont, R. Afr. J. Biotechnol., 9 (7), pp. 1079-1085.

40. Association of angiotensin-converting enzyme gene promoter single nucleotide polymorphisms and haplotype with major depression in a northeastern Thai population (2009). Angunsri R., Sritharathikhun T., Suttira S., Tencomnao

T.Journal of Renin-Angiotensin-Aldosterone System, 10, pp. 179-184. 41. Decreased EGF receptor mRNA expression in response to antipsoriatic drug

dithranol in vitro (2009). Tencomnao T., Ronpirin C., Prasansuklab A., Poovorawan Y. Afr. J. Biotechnol., 8, pp. 3141-3146.

42. Misgenotyping of Dopamine Receptor D1 Gene -48A/G Polymorphism (2009).Tencomnao T. and Boonmalert R. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 150B, pp. 447-449.

43. A high-throughput non-immunological method for determination of microalbuminuria based on utilization of Albumin blue 580 (2008). Laiwattanapaisal W., Saythanu P., Nubtueboon P., Tencomnao T., and Santiyanont R. Laboratory Medicine, 39, pp. 727-729.

44. Construction and evaluation of a novel luciferase reporter gene construct: a positive control plasmid for reporter gene assay (2008). Tencomnao T.,

Rakkhitawatthana V., and Sukhontasing K. Afr. J. Biotechnol., 7, pp. 2124-2127. 45. Analysis of autoantibodies to serotonin and serotonin levels in psoriasis (2007).

TencomnaoT.,Ketboonlue K., Wongpiyabavorn J., Ronpirin C., Achariyakul M., Laiwattanapaisal W., and Chuchawankul S. Chin Med J., 120 (suppl. 2), p. P07-02 .

107

ผลงานทตพมพในวารสารระดบชาต 1. Sangkitikomol W., Tencomnao T., and Rocejanasaroj A, 2008.

Comparison of total antioxidants of red rice, black rice and black sticky rice. Journal of Nutrition Association of Thailand vol. 43, p. 13-21

2. Ronpirin C., and Tencomnao T., 2005. “Food and Disease in the Genomic Era.” J. Food Tech., Siam University 2, p. 11-17.

3. Tencomnao T., 2003. “Genetic Polymorphisms: Implications for Neurodegenerative Diseases.” J. Allied Health Sciences, Chulalongkorn University 3, p. 48-56.

ต าราหรอหนงสอ Brimson, J. M. & Tencomnao, T. Rhinacanthus Nasutus Extract as a Neuroprotectant. In "Bioactive nutraceuticals and food supplements in neurological and brain diseases: prevention and therapy", Ronald Ross Watson and Victor R. Preedy (Editors, 1st edtion), pages 77-83, Elsevier (2014).

Documents