89

ภาคผนวก ก

1. การหาคาปรมาณความชน ของแขงทงหมด ของแขงทระเหยได

%Moisture content, %Total solid content (TSC), %Volatile solid content (VSC) (AOAC Official Method 985.29, 2000) วธวเคราะห

1. อบครซเบลทอณหภม 103 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง หรอจนน าหนกคงท 2. น าครซเบลใสในเดซเคเตอร ทงไวใหเยน (ประมาณ 15-30นาท) 3. ชงน าหนกครซเบล (A) 4. ชงตวอยางททราบน าหนกแนนอนใสในครซเบล 5. บนทกน าหนกตวอยางรวมกบน าหนกครซเบล (B) 6. น าไปอบทอณหภม 103 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมงหรอจนน าหนกคงท 7. น าครซเบลไปใสในเดซเคเตอร ทงไวใหเยน (ประมาณ 15-30 นาท) 8. ชงน าหนกรวมของตวอยางรวมกบน าหนกครซเบล หลงการอบ (C) 9. น าไปเผาโดยใชเตาเผา ทอณหภม 550±50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท 10. น าครซเบลใสในเดซเคเตอร ทงไวใหเยน (ประมาณ 30 นาท) 11. ชงน าหนกรวมของตวอยางรวมกบน าหนกครซเบล หลงการเผา (D) และค านวณผล

การค านวณ ปรมาณของแขงทงหมด (% TSC) = (Y x 100)/ X ความชน (% MC) = ((X – Y) x 100) / X ปรมาณของแขงทระเหยได = ((Y – Z) x 100) / X โดยท X = น าหนกของตวอยางสด (B – A) หนวยเปนกรม Y = น าหนกของตวอยางหลงอบ (B – C) หนวยเปนกรม Z = น าหนกของตวอยางหลงเผา (C – D) หนวยเปนกรม

90

2. การวเคราะหคาซโอด (COD) วธ Close Reflux Tritrimetric Method (AOAC Official Method 2000)

เครองมอและอปกรณ 1. หลอดทดลองชนดฝาปด ขนาด 25 x 150 มลลลตร 2. ทใสหลอดทดลอง 3. เตาอบทอณหภม 150±2 องศาเซลเซยส 4. ปเปตขนาด 1, 10 มลลลตร 5. บวเรตขนาด 50 มลลลตร 6. ขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร

สารเคม 1. สารละลาย (Digestion reagent): ละลายสาร K2Cr2O7 4.913 กรม ทผานการอบแหงท

103 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง ในน ากลน 500 มลลลตร คอยๆเตมกรดซลฟวรกเขมขน 167 มลลลตร เตม HgSO4 ลงไป 33.3 กรม คนใหละลายตงทงไวใหเยนทอณหภมหอง แลวปรบปรมาตรเปน 1 ลตร

2. กรดซลฟวรกเขมขนทผสม AgSO4 (Sulfuric acid reagent): AgSO4 22 กรมในกรดซลฟวรกเขมขน น าหนก 4.1 กโลกรม (2.5 ลตร) แลวตงทงไว 1-2 วนเพอใหละลาย

3. สารละลายมาตรฐาน (Ferrous acid reagent: FAS) 0.1 นอรมล: ละลาย (NH4)2SO4.FeSO4.6H2O 39 กรม ในน ากลนแลวเตมกรดซลฟวรกเขมขนลงไป 20 มลลลตร ท าใหเยนแลวเตมน ากลนลงไปจนปรมาตร 1 ลตร สารละลายนตองน ามาหาความเขมขนทแนนอนดวยสารละลาย Digest reagent ดงน เตมน ากลน 10 มลลลตร สารละลาย Digest reagent 14 มลลลตร จากนนใชปเปตคอยๆเตม Sulfuric sufate (FAS) โดยใช Ferroin จ านวน 2-3 หยด เปนอนดเคเตอร สารละลายจะเปลยนจากสเหลองเปนสเขยวอมเขยวและเปนสน าตาลแดงทจดยต

Normality of FAS solution = mL K2Cr2O7 x 0.1 mL Fe(NH4)2(SO4)2

91

4. สารละลาย Ferroin อนดเคเตอร: ละลาย 1-10 Phenantroline monohydrate 1.485 กรม และ FeSO4.7H2O 695 มลลลตร ในน ากลนแลวเตมน ากลนจนมปรมาตรครบ 100 มลลลตร

วธการทดลอง 1. ลางหลอดทดลองและฝาจกดวยกรดซลฟรก 20 เปอรเซนตกอน เพอปองกนการ

ปนเปอนจากสารอนทรย 2. ปเปตตวอยางน ามา 10 มลลลตร ใสลงในหลอดทดลองแลวเตม Digestion reagent ลง

ไป 6 มลลลตร 3. คอยๆเตมกรดซลฟรกเขมขนทผสม AgSO4 ลงไป 14 มลลลตร ใหไหลลงกน

หลอดแกวเพอใหชนของกรดอยใตชนของน าตวอยาง และ Digestion reagent หมายเหต ภายหลงการเตมกรดซลฟรก ใหสงเกตสของตวอยาง ดงตอไปน

- ถาไดสเขยวแสดงวาปรมาณ K2Cr2O7 เหลออยมากใชปรมาณน าตวอยางนอยเกนไปตองเพมปรมาณน าตวอยางอก

- ถาไดสเขยวอมเหลองแสดงวาน าตวอยางเหมาะสมสามารถน าตวอยางไปรฟลกซได - ถาไดสเขยวอมฟาแสดงวาปรมาณ น าตวอยางมากเกนไป ตองท าการเจอจางน าตวอยาง

ใหมความเขมขนนอยกวาน โดยจะใชอตราสวนระหวางน าตวอยาง: น ากลน เทาไหรกไดแตผลรวมของปรมาตรน าตวอยางตองเทากบ 10 มลลลตร 4. ปดจกหลอดทดลองใหแนนแลวคว าหลอดไปมาหลาย ๆ ครง อยางทวถงกอนจะน า

ตวอยางไปรฟลกซ เพองปองกนไมใหเกดความรอนสะสมอยทกนหลอดซงอาจแตกไดในขณะท าการรฟลกซ

5. ใหท าแบลงคโดยใชน ากลนแทนน าตวอยางดวยวธการทดลองเชนเดยวกบการวเคราะหน าตวอยางประมาณ 1-2 หลอด

6. น าหลอดทดลองทงหมดทใสน าตวอยางและแบลงควางบนทตงหลอดทดลองแลวเขาเตาอบทท าใหอณหภมสงถง 150±2 องศาเซลเซยส เมอครบเวลา 2 ชวโมง ใหน าตวอยางออกมาทงไวทอณหภมหองจนเยน

7. เทตวอยางจากหลอดใสลงขวดรปชมพไทเทรตดวยสารละลาย FAS จนกระทงถงจต จะเหนการเปลยนสจากสเหลองเปนสฟาอมเขยวและเปนสน าตาลแดงทจดยตอานปรมาตรทไทเทรตตอนเรมเปลยนน าตาลแดง

92

การค านวณ COD (mg/L) = (a-b) x N x 8000 mL sample a = mL ของ Fe(NH4)2(SO4)2 ทใชเทรตแบลงค b = mL ของ Fe(NH4)2(SO4)2 ทใชเทรตน าตวอยาง N = Normality ของ Fe(NH4)2(SO4)2 ทใช ตารางท 1 ปรมาตรของตวอยางน าและรเอเจนตตางๆ ในหลอดทดลอง

Digestio vessel Sample Digestion Solution

H2SO4 reagent (mL)

Total final Volume (ml)

Culture 16 x 100 mm 2.5 1.5 3.5 7.5 20 x 150 mm 5.0 3.0 7.0 15.0 25 x 150 mm 10.0 14.0 14.0 30.0 Standard 10 mL ampule 2.5 1.5 3.5 7.5

3. การวเคราะห ปรมาณเจลดาหลไนโตรเจน Total Kjeldahl nitrogen,TKN (AOAC Official Method 973.48, 2000)

เครองมอและอปกรณ 1. เครองยอย และหลอดยอย Kjeldahl 8 หลอด 2. เครองกลนไนโตรเจน 3. บกเกอรขนาด 250 มลลลตร 4. บวเรตขนาด 50 มลลลตร 5. ปเปตขนาด 10, 50 มลลลตร

93

สารเคม 1. K2SO4 2. Conc. H2SO4 3. CuSO4 4. สารละลาย NaOH (40%): ละลาย NaOH ประมาณ 400 กรม ในน ากลน 600 มลลลตร คนใหละลาย ตงทงไวใหเยน แลวปรบปรมาตรเปน 1 ลตรดวยน ากลน 5. สารละลาย H3BO3: ละลาย H3BO3 40 g ในน าอนประมาณ 600 มลลลตร ตงทงไวใหเยน แลวปรบปรมาตรเปน 1 ลตรดวยน ากลน

6. การเตรยม 0.1 M HCl: ปเปต Conc. HCl 9 มลลลตร แลวปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ดวย น ากลน

7. การเตรยม indicator: ชง methyl red 0.08 กรม และ bromocresol green 0.4 กรม จากนน ละลายใน 95% ethyl alcohol ปรมาตร 100 มลลลตร

วธการทดลอง 1. การยอย

1. เตมตวอยาง 1 กรม ลงในหลอดยอย 2. เตม CuSO4 1 กรม K2SO4 9 กรม และเตม Conc. H2SO4 30 มลลลตร 3. เตม boiling ships 2-3 ชน 4. น าเขาเครองยอย ยอยทอณหภม 375oC จนไดสารละลายใส จากนนยอยตอไปอก 20-30 นาท

2. การกลน 1. น าสารทยอยเสรจแลวเขาเครองกลนแอมโมเนย โดยเตมน า 100 มลลลตร และสารละลาย 40% NaOH ปรมาตร 50 มลลลตร กลนเปนเวลา 3 นาท 2. เกบสารทกลนไดดวยสารละลายกรด H3BO3 50 มลลลตร ทเตมอนดเคเตอร 2-3 หยด โดยสารทกลนไดจะเปลยนสจากสมวงอมชมพเปนสเขยว

3. การไทเทรต 1. น าสารทกลนออกมาไดไทเทรตดวยสารละลายมาตรฐาน 0.1 M HCl 2. ไทเทรตจนสารละลายเปลยนจากสเขยวเปนสมวง

94

การค านวณ

%N = [{(V1-V2)M x 0.014}/W] 100 เมอ V1 = ปรมาตรของ HCl ทใชส าหรบตวอยาง (มลลลตร) V2 = ปรมาตรของ HCl ทใชส าหรบแบลงค (มลลลตร) M = ความเขมขนของสารละลาย HCl

4. การวเคราะหปรมาณคารบอนอนทรยทงหมด Total organic carbon, TOC วธ Walkley-black method, 1934

เครองมอและอปกรณ 1. ขวดรปชมพขนาด 500 มลลลตร 2. ปเปตขนาด 1, 10 มลลลตร 3. บวเรตขนาด 50 มลลลตร 4. เครองชง

สารเคม 1. H2SO4 2. H3PO4 3. NaF 4. การเตรยมสารละลาย K2Cr2O7 ความเขมขน 0.167 โมลาร: ละลาย K2Cr2O7 49.04 กรม ท ผานการอบแหงท 105 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง ในน ากลน คนใหละลายแลว ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร 5. การเตรยม diphenylamine อนดเคเตอร: ชง diphenylamine 1 กรม ละลายในน ากลน ปรมาตร 20 มลลลตร จากนนเตม conc. H2SO4 ปรมาตร 100 มลลลตร ตงทงไวใหเยน

6. การเตรยมสารละลายFerrous acid reagent, FAS ความเขมขน 0.5 โมลาร: ละลาย (NH4)2SO4.FeSO4.6H2O 196.1 กรม ในน ากลนแลวเตมกรดซลฟวรกเขมขนลงไป 20 มลลลตร ท าใหเยนแลวเตมน ากลนลงไปจนปรมาตร 1 ลตร

95

วธการทดลอง 1. ชงตวอยาง 0.5 กรม ใสในขวดรปชมพขนาด 500 มลลลตร 2. เตมสารละลาย K2Cr2O7 ปรมาตร 10 มลลลตร เขยาและหมนขวดรปชมพเบาๆ จากนน เตม conc. H2SO4 ปรมาตร 20 มลลลตร อยางรวดเรวแลวเขยาขวดรปชมพเบาๆ

3. ตงทงไวใหเกดปฏกรยาประมาณ 30 นาท 4. เตมน ากลนปรมาตร 200 มลลลตร แลวเตม conc. H3PO4 ปรมาตร 10 มลลลตร 5. เตม diphenylamine อนดเคเตอร จ านวน 10 หยด จะเกดเปนสน าเงนอมเทา จากนนน าไป ไทเทรตกบสารละลาย Ferrous acid reagent จนกระทงถงจต จะเหนการเปลยนสน าเงน

อมเทาเปนสเขยวใส

การค านวณ %TOC = (B-S) x M of Fe2+ x 0.3x 100

Sample wt. เมอ:

B = ปรมาตรของ Fe2+ ทใชไทเทรตแบลงค S = ปรมาตรของ Fe2+ ทใชไทเทรตตวอยาง

5. การวเคราะหปรมาณธาตอาหารฟอสฟอรสทเปนประโยชน Available phosphorus (Mehlich III) Mehlich (1984) การเตรยมสารละลาย

1. รเอเจนท เอ เตรยมจาก สารละลายแอมโมเนยมโมลบเดต (Ammonium molybdate) จ านวน 50 กรมลงในบกเกอรขนาด 500 มลลลตร เตมน ากลน 200 มลลลตร คนใหละลาย ละลายสารแอนตโมน โพแทสเซยมทาเทรต (Antimony potassium tartrate) 1.213 กรมลงในน ากลน 50 มลลลตร น าสารละลาย Reagent A และสารละลายแอนตโมน โพแทสเซยมทาเทรต เทผสมใหเขากนเตมกรดซลฟวรกเขมขน 700 มลลลตร ปลอยทงไวใหเยน แลว ปรบปรมาตรดวยน ากลนเปน 1 ลตร เกบไวในขวดสชา

96

2. เตรยมสารเชงซอนกรดแอสคอบค ละลาย ascorbic acid จ านวน 1.76 กรม ในน ากลน 1.6 ลตร เตมสารละลาย รเอเจนท เอ 40 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 2 ลตร ดวยน ากลน ตงทงใหเยน สารละลายนเกบไดไมเกน 24 ชวโมง ตองเตรยมใหมทกครงกอนใช

3. เตรยมสารละลายกรดผสมสกดดนดบเบลแอซด (Double acid, DA) ในถงพลาสตกขนาด 2 ลตร โดยเตมน ากลนลงไป 1.5 ลตร แลวเตมกรดไฮโดรคลอรกเขมขนจ านวน 83 มลลลตร และกรดซลฟวรกเขมขนจ านวน 14 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนเปน 2 ลตร

4. เตรยมสารละลายมาตรฐานฟอสฟอรสจากโพแทสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO

4)

ดวยการดดสารละลายฟอสฟอรสมาตรฐาน 0, 5, 10 และ 15 มลลกรมตอลตร ลงในขวดแกวปรมาตร 50 มลลลตรเตมสารละลายสกด DA ใหไดระดบ 50 มลลลตร

5. ดดสารละลายมาตรฐานฟอสฟอรส และสารละลายดนทสกดดวย DA อตราสวน 1 มลลลตรตอ สารเชงซอนกรดแอสคอบค 9 มลลลตร

การเตรยมตวอยาง 1. ชงดน 1 กรม ใสขวดรปชมพขนาด 50 มลลลตร เตมสารละลายสกด DA ปรมาตร 4 มลลลตร ปดดวยจกยาง น าไปเขยาดวยเครองเขยา ความเรว 200 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท

2. น าสารทไดมาเทลงขวดแกวผานกระดาษกรองเบอร 5 ปรบปรมาตรเปน 6 มลลลตร การวเคราะหตวอยาง

1. ดดสารละลายตวอยางมา 2 มลลลตร แลวน าไปเตมสารเชงซอนกรดแอสคอบค 18 มลลลตร ทงไว 30 นาท

2. น าไปวดความยาวคลนดวยเครองสเปคโทรโฟโตมเตอรทความยาวคลน 740 นาโนเมตร บนทกคาและค านวณผล

6. การวเคราะหปรมาณกรดไขมนระเหยได

Volatile Fatty Acid, VFA วธ Direct titration method อปกรณ และเครองมอ 1. บกเกอร

2. ปเปต 3. ขวดรปชมพ 4. บวเรต

97

5. Hot plate 6. ชดกลน 7. ขวดวดปรมาตร

สารเคมทใช 1. NaOH 2. H2SO4

การเตรยมสารละลาย 1. การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 0.1 M NaOH 1.1 ชง NaOH 4 g

1.2 จากนนปรบปรมาตรดวยน ากลนเปน 1000 mL 2 การเตรยมสารละลาย H2SO4 (1:1) 2.1 เตมน ากลนลงไปในบกเกอรขนาด 250 mL ปรมาตร 100 mL

2.2 เตม H2SO4 ปรมาตร 100 mL ลงไปในบกเกอรขนาด 250 mL 2.3 กวนใหเขากน 2.4 วางทงไวใหเยน แลวจงสามารถน าไปใชงานได

วธการทดลอง 1. วางตวอยางปลอยใหเกดการตกตะกอน 2. น าของเหลวสวนทใสปรมาตร 100 mL เตมลงไปใน boiling flask 3. เตมน ากลนปรมาตร 100 mL ลงไปผสมกน 4. ใส Glass bead ลงไป 3-4 เมด 5. ใชปเปตดดกรด H2SO4 (1:1) เตมลงไป 5.0 mL 6. เขยาใหเขากน แลวตอเขากบชดกลน 7. เปดสวตซเตาหลม 8. หลงจากกลนได 5 นาท ใหเทของเหลวสวนทกลนออกมาไดทงกอนเพอปองกนการ ปนเปอน 9. เมอกลนครบ 30 นาท หรอจนของเหลวใน boiling flask ลดลงมากใหหยดกลน 10. ปเปตของเหลวสวนทกลนได 100 mL ใสในขวดรปชมพ แลวน าไปวางบน Hot plate เปนเวลา 2 นาท 11. หยด Phenolphthalein 5 หยด แลวน าไปไทเทรตกบ 0.1 M NaOH 12. จดยตสารละลายจะเปลยนจากใสไมมสกลายเปนสชมพออนๆ

98

13. บนทกปรมาตรของ 0.1 M NaOH ทใช การค านวณ

VFA (mg /L) = (ปรมาตร 0.1 M NaOH ทใช) (6000) (ปรมาตรของของเหลวทใชไทเทรต)(0.77)

7. วธการค านวณอตราการผลตแกสชวภาพ 1. บนทกปรมาตรน าทสามารถรองรบไดในแตละวน ซงเปนปรมาตรแกสชวภาพทสามารถ ผลตไดในแตละวน 2. รวบรวมจ านวนปรมาตรแกสชวภาพสะสมทงหมด หลงจากหมกครบ 30 วน หรอตาม จ านวนวนทวางแผนท าการทดลอง 3. น าปรมาตรแกสชวภาพสะสมทงหมด หารดวยจ านวนวนทท าการหมก สมมตต : ชดการทดลองหนงมปรมาตรแกสชวภาพสะสมทงหมดหลงการหมกเปน 5,000 mL ซงการทดลองนใชระยะในการหมกเปน 30 วน วธการ : อตราการผลตแกสชวภาพ = 5,000 mL / 30 d = 167 mL d-1

working volume สรป : ชดการทดลองนมอตราการผลตแกสชวภาพเปน 167 mL d-1

working volume 8. วธการค านวณผลเปอรเซนตมเทน

1. ฉดแกสมเทนมาตรฐาน ปรมาตร 0.5 มลลลตร จ านวน 3 ซ า 2. น าพนทใตกราฟของแตละครงมาหาคาเฉลย (A) 3. ฉดแกสตวอยาง ปรมาตร 0.5 มลลลตร 4. น าพนทใตกราฟ ณ เวลาของแกสมเทน (B) มาใชในการค านวณหาเปอรเซนตมเทน

99

สตรในการค านวณ % แกสมเทน = B A

5. ปรมาตรทได มหนวยเปน %v/v

* 100

100

ภาคผนวก ข

ตารางท ข-1 ปรมาณแกสมเทนมาตรฐาน

Time (d) Peak area Average

1 51907

52886 55023 51728

2 56986

53975 53107 51833

3 55520

55343 54156 56352

4 56525

54951 54258 54069

5 58541

53695 51954 50591

6 52020

52444 51524 53787

7 52975

51541 50123 51524

8 56056

53525 52881 51637

101

Time (d) Peak area Average

9 54826

51618 49568 50459

10 56136

54720

52908 55117

11 54687

53161

53649 51147

12 52852

52617

52927 52073

13 56914

55608

52442 57469

14 55152

53619

53721 51984

15 55296

53186

51385 52876

16 57320

54543

52830 53480

18 59686

54412 48958 54591

102

Time (d) Peak area Average

20 60049

57585 55964 56742

22 57590

53445

52855 49889

24 59288

54932

54436 51072

26 56607

55020

52923 55529

28 56794

53332

53325 49876

30 54660

52862

50778 53147

32 58219

53931

52285 51290

34 57475

53166

53492 48532

36 53975

52515

52726 50845

103

Time (d) Peak area Average

38 50182

50543

51159 50289

40 52027

50697

48406 51657

42 55857

52320

50442 50662

44 47999

52452

54284 55074

45 42699

48102 50845

50762 ตารางท ข-2 เปอรเซนตของแกสมเทนของการทดลองในระบบผสมรวมวตถดบ เมอขยายขนาด ความจของถงปฏกรณ เปน 6ลตรควบคมปรมาณของแขงทงหมด คาพเอชเทากบ 7 และ สดสวนคารบอนตอไนโตรเจนท 15

Time (d) % CH4 1 0.0 2 0.0 3 0.0 4 0.0 5 0.0 6 0.0 7 0.0

104

Time (d) % CH4 8 0.0 9 65.96

10 42.10 11 18.24 12 37.10 13 61.60 14 27.05 15 29.33 16 50.38 18 22.29 20 18.43 22 20.70 24 47.38 26 44.69 28 50.36 30 53.33 32 48.71 34 44.38 36 47.05 38 47.42 40 45.86 42 39.80 44 43.86 45 42.39