Aislamiento e Identificacion de Microorganismos en Una Muestra

8/17/2019 Aislamiento e Identificacion de Microorganismos en Una Muestra

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Aislamiento e identificación de

microorganismos en una muestra

Muestra: suspensión que contiene

una mezcla de microorganismos


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Siembra y aislamiento - BÚSQUEDA

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un

medio adecuado con el fin de iniciar un culti!o microbiano" #uego de sembrado el

medio de culti!o se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento" #a

siembra puede realizarse en medio l$quido sólido o semisólido utilizando punta ansa

%isopo o pipeta est&ril"

Cultivo en medio líquido'abitualmente se realiza en tubos o en matraces" El crecimiento se puede manifestar

por aparición de turbidez formación de !elo o pel$cula o sedimento"

Cultivo en medio sólidouede ser en tubos o placas"

En medio sólido cada c&lula !iable dar origen a una colonia * por lo tanto la siembraen placas se puede utilizar no solo para culti!ar microorganismos sino adems para

contar * aislar"

+uando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado puede

ser necesario diluir la muestra con un dilu*ente est&ril como suero fisiológico"


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AISA!IE"#$ara el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacteriasdonde podremos !er la morfolog$a color * otras caracter$sticas de los distintos tipos de

microorganismos presentes en la muestra" Se lle!arn a cabo inoculaciones en %lacasde medios sólidos * en medio líquido

ara aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

a) aislamiento por estr$as"

b) aislamiento por dilución

Aislamiento en %laca %or estrías E,isten distintas t&cnicas el ob-eto es obtener colonias

aisladas"

+onsiste en cargar el ansa con la muestra * %acer estr$as

paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa. se

quema el ansa se enfr$a se gira la placa /01 * se !uel!e a

estriar tocando 2 o 3 !eces el rea sembrada inicialmente *

cubriendo otro cuarto de placa" or 4ltimo sin quemar el

ansa se estr$a el resto de la superficie sin sembrar"

Aislamiento %or dilución en medio sólidoSe emplean tanto el m&todo de siembra incorporada como el de siembra en superficie"

Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiológico o alg4n otro dilu*ente"


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BUSQUEDA

+uando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en ba-a

proporción en una muestra se lle!a a cabo un procedimiento llamado b4squeda que

in!olucra una primera etapa de aumento del n4mero del tipo de microorganismo que

se desea aislar" #uego se a$sla por el m&todo de estr$as o por dilución * se identifica"

5na b4squeda implica los siguientes pasos:

6) enriquecimiento 7) aislamiento selectivo (medios selecti!os *8o diferenciales)2) reaislamiento (medio no selecti!o)3) identi&icación

Eta%a de enriquecimiento' su ob-eti!o es aumentar el n4mero del microorganismoque se desea determinar

uede di!idirse en dos: 9%reenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo (seusan medios nutrientes l$quidos) para organismos daados" 9 enriquecimiento

selectivo se realiza incubando la muestra en medios l$quidos selecti!os (permitencrecer el organismo buscado)

Eta%a de aislamiento: empleando la t&cnica de estr$as en superficie en medios sólidosselecti!os * diferenciales" E,aminar las colonias t$picas para el microorganismo buscado


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(eaislamiento' si se usaron medios selecti!os las colonias deben aislarsenue!amente en medios no selecti!os por el m&todo de las estr$as"

Es necesario para asegurar la obtención de un CU#I)$ *U($ del microorganismode inter&s"

El e,amen microscópico de una colonia de un culti!o puro de un microorganismo debemostrar c&lulas razonablemente seme-antes respecto al ;ram * a la morfolog$a"

Informe de b4squeda: se e,presa *(ESE"CIA o AUSE"CIA en los gramos o m# de

muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento)"


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Identificación de una cepa bacteriana

desde el punto de !ista bioqu$mico

+, $btener un cultivo %uro

, E.amen microscó%icoEn general se realiza de c&lulas !i!as * de frotis teido por coloración ;ram" Se

determina as$ la forma * la tinción ;ram"


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2, (eali1ación de %ruebas secundarias y terciarias A efectos de llegar a especie es necesario la ma*or$a de las !eces realizar pruebas

suplementarias" Estas dependern del g&nero o familia determinado" (e-: producción

de pigmentos producción de indol a partir de triptofano etc")

Seroti%o A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas o cuando las pruebas

bioqu$micas no son conclu*entes se recurre al uso de antisueros espec$ficos

(anticuerpos contra determinados ant$genos bacterianos)"

#os ant$genos bacterianos pueden ser capsulares somticos (=) que corresponden al

lipopolisacrido de la pared de los ;ram negati!os flagelares (') * los antisueros se

identifican con esas letras * el n4mero o letra del ant$geno correspondiente"

En una primera identificación se usan sueros poli!alentes * para la caracterización

serológica se usan sueros mono!alentes dentro de cada tipo de ant$geno" E,isten enel comercio antisueros para caracterización de: Salmonella Shigella E.coli

Haemophilus etc"

Se puede e,presar el nombre de una cepa de la siguiente manera:

Yersinia enterocolítica 3 02&nero es ecie bioti o seroti o


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Ensayos bioquímicos

?eterminan la acti!idad de una !$a metabólica (con-unto de reacciones

qu$micas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de culti!o *

que la bacteria al crecer transforma o no" ruebas simples que se %an desarrollado para demostrar una determinada

caracter$stica bioqu$mica como presencia o ausencia de una determinada

acti!idad enzimtica grupo de enzimas o determinada !$a metabólica

crecimiento a una determinada temperatura crecimiento en presencia de

in%ibidores"

#as siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismosobtenidos en los aislamientos en placa"

Se pueden usar @it comerciales o pruebas bioqu$micas tradicionales

3it comerciales: utilizan modificaciones de las pruebas bioqu$micascon!encionales *a sea sustratos des%idratados tiras de papel de filtro

impregnadas en reacti!os o pequeos compartimentos con medios prontos

para sembrar"


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BB4 E"#E($#UBE II 5Becton Dic6inson,7 Es un sistema pronto parausar para la identificación de Enterobacterias definidas como bastones

;ram 9 aerobios o anaerobios facultati!os o,idasa (9)"

+onsiste en un tubo de plstico con 67 medios de culti!o contenidos encompartimentos indi!iduales que se inoculan simultneamente en una etapa

* permiten la detección de 6 caracter$sticas bioqu$micas"

$8I9:E(! #UBE II4 5BectonDic6inson,7 Es un sistema listo parausar para la identificación de

bastones ;ram (9) aerobios o

anaerobios facultati!os o,idasa ()"+onsiste en un tubo de plstico de

67 medios de culti!o que permite la

realización simultnea de 63 pruebas

bioqu$micas"


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Batería de %ruebas A*I;E (BioMerieu,) Es un sistema estandarizadopara la identificación de Bacterias ;ram 9" +onsiste en una plantilla con

microtubos conteniendo medios de culti!o des%idratados que sereconstitu*en al agregar una suspensión bacteriana" ermite la

realización de 72 pruebas bioqu$micas a partir de una 4nica colonia

bacteriana"

E,isten tambi&n sistemas de identificación comerciales para le!aduras


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Sistema %ara la identi&icación de Enterobacterias que consta de nue!e

pruebas bioqu$micas con!encionales (SCS /E)Este sistema identifica las 72 especies ms frecuentemente aisladas de

muestras cl$nicas"

Est integrado por las siguientes pruebas:

Dproducción de '7S (


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a reali1ación de una %rueba bioquímica im%lica'

D+ulti!ar el microorganismo en un medio que contiene un determinadosustratoD luego de la incubación !isualizar el crecimiento * la degradación de un

sustrato *a sea por !ira-e de un indicador o por agregado de un reacti!o

re!elador de la presencia del sustrato o de alg4n producto de su

degradación"D#a prueba bioqu$mica tambi&n puede consistir en demostrar el crecimiento

en presencia de determinado in%ibidor"

D+ulti!ar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el

sustrato de una enzima inducible * luego de la incubación demostrar la

acti!idad enzimtica"

Se debe tener un culti!o &resco (6973 %rs" de incubación) en un medio enque el microorganismo se desarrolla en forma óptima a p' fuerza iónica

atmósfera * temperatura adecuados"


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+77 #est de la Catalasa7 Algunas bacterias poseen catalasa una enzimacapaz de destruir el agua o,igenada generada en algunos procesos

metabólicos" Esta enzima est presente en la ma*or$a de las bacterias quecontienen citocromos bien aerobias o anaerobias

7 '7=7 +A


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, (equerimientos de o.í


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+ontroles

>ermentador de glucosa: Escherichia coli

=,idati!o de glucosa: Pseudomonas aeruginosa

Ho reacciona: icrococcus spp

:E(!E"#ACI=" DE >UC$SA#a determinación de la capacidad de fermentación de la glucosa es importante

en las primeras etapas de identificación de bacterias quimiótrofas"

Se utiliza un caldo que contiene glucosa (az4car del cual la ma*or$a de las

bacterias quimiotrofas pueden obtener energ$a *a sea por fermentación o

respiración) peptona * un indicador de p' que permite detectar la producción

de cidos (caracter$stica de la fermentación de la glucosa)"

Adems en la fermentación se produce gas *a sea +=7 solo o una mezcla de

'7 * +=7"

El '7 es insoluble * se detecta por la formación de una burbu-a en una

campana de ?ur%am presente en el medio"


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Inter%retación#as bacterias fermentadoras de glucosa producen un !ira-e del indicador al

cido (color amarillo)" Si se produce gas puede obser!arse en la campanita

in!ertida" #as bacterias no fermentadoras no producen !ira-e o producen un

!ira-e %acia el p' alcalino (p4rpura a !ioleta)"


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7+ Caldo tioermentan o Resp


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2) ?escomposición de a 4cares simples cidos orgnicos otros


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2) ?escomposición de az4cares simples cidos orgnicos * otros

roducción de cido o cido * gas

?etección de enzimas * !$as metabólicas (RM9 ="H"";" 9orto nitro J9?9

galactopiranósido9 esculina)

3) >uente 4nica de carbono: citrato malonato

) 5tilización de compuestos nitrogenados asimilación de nitrato (reducción a

amonio)

desnitrificación (utilización de nitrato como aceptor de electrones)

descomposición de carbo%idratos aminocidos * otros (indol fenilalaninaurea descarbo,ilación de lisina etc)

K) Ensa*os combinados :


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7/7 #est de 3li


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b, *roducción de


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Producción de ácidos de :

Lactosa Glucosa

Todo el cultivo amarillo + +

Amarillo en el fondo y rosa en el pico deflauta©

- +

Todo el cultivo rojo o rosa - -

Precipitado negro Producción de !"

#ractura o despla$amiento del medio Producción de gases


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707 !anita-!ovilidad7 Se utiliza un medio semisólido para detectar lamovilidad de las bacterias" Este medio contiene manitol como fuente decarbono" Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produceuna acidificación del medio lo que da lugar a un !ira-e del indicador de p'

de ro-o a amarillo

Medio MM

eptona de case$na 60 g8l

Hitrato potsico 6 g8l

Manitol L g8lRo-o fenol 003 g8l

Agar 2 g8l

p' L"K

(esultado' El test de la mo!ilidad se %ace mirando el desplazamientodel microorganismo" Si el crecimiento se limita a la 1ona de la %icadurael microorganismo no es móvil" Si el crecimiento se produce %or todo elmedio el microorganismo es móvil"


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Géneros Gas SH2

Lactosa Manita-

Movilidad

Escherichia

9

Shigella 9 9 9 9

Salmonella 9

Citrobacter

"lebsiella 9

Enterobacter 9

Serratia 9

Proteus 9


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orma coco coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco

Agrupación racimos racimoscadena

s t&tradas pares

+recimientoaerobio

+recimientoanaerobio

Esporas

Mo!ilidad o o o o o o 9

+atalasa

=,idasa

>ermentación(glucosa) o

=,idación>ermentación

= óInacti!

o> > > > > óInacti!o > inacti!o inacti!o = > > =

Micrococcus F

Stap%*lococcus F

Streptococcus F#actococcus F

Enterococcus F

#euconostoc F

ediococcus F F

Aerococcus F

#actobacillus F

+lostridium F


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Referencias

Documents

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