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Aislamiento y caracterización de microorganismos ácido-lácticos con potencial probiótico
a partir de leche de manatí antillano (Trichechus manatus).
Juliana Valentina Arias Bonilla1
1
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
Resumen: El manatí antillano (Trichechus manatus) es una especie que se encuentra en peligro
debido a la cacería de sus individuos y a la destrucción de su ecosistema. Es por esto que se han
desarrollado diferentes programas e investigaciones que buscan la conservación de la especie.
En este trabajo se busca evaluar la composición microbiológica de leche de manatí por medio de
métodos clásicos de microbiología, con el fin de aislar e identificar cepas con potencial
probiótico que complementen la dieta de los bebes manatíes en procesos de rehabilitación para su
posterior reintroducción al medio natural. Se aislaron en total 111 morfotipos distintos
bacterianos y levaduriformes a partir de cuatro muestras de leche de manatí. 84 de estos
corresponden a bacterias Gram positivas y 18 a Gram negativas. Los 9 aislamientos restantes
presentaron una morfología levaduriforme. 52 cepas bacterianas de estos aislamientos fueron
identificados usando la secuenciación del gen de ARN ribosomal 16S. Las familias detectadas
con mayor frecuencia son Staphylococcaceae y Erwiniaceae, entre los Gram positivos y Gram
negativos, respectivamente. Se encontraron especies y géneros que han sido anteriormente
usados para evaluar propiedades probióticas con resultados positivos; entre estos se destacan
Lactobacillus casei y especies del género Streptococcus, Streptomyces, Microbacterium,
Clostridium, Agrobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus y Micrococcus. Por lo anterior, se
propone dar continuidad al proyecto en la identificación hasta el nivel de especie pertenecientes
a los géneros Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus y Pseudomonas, y con la
evaluación de las propiedades probióticas de las especies Lactobacillus casei, mencionada
anteriormente, y Clostridium ghonii, que aunque no ha sido evaluada como probiótico pertenece
a un género con propiedades beneficiosas para su hospedero.
Palabras clave: probióticos, manatí, leche de manatí, aislamiento.
Abstract: The West Indian manatee (Trichechus manatus) is an endangered species due to the
hunting of its individuals and the destruction of its ecosystem. Hence different programs and
investigations have been developed seeking for the conservation of the species. This work evaluated
the microbiological composition of manatee milk through classical microbiologicaly methods, in
order to isolate and identify strains with probiotic potential that could complement the diet of baby
manatees in rehabilitation processes for their subsequent reintroduction into the natural environment.
A total of 111 different bacterial and yeast morphotypes were isolated from four manatee milk
samples. 84 of these corresponded to Gram positive bacteria and 18 to Gram negative ones. The
remaining 9 isolates presented a yeast morphology. 52 bacterial strains were identified using 16S
ribosomal RNA gene sequencing. The predominant families are Staphylococcaceae and Erwiniaceae,
among the Gram positive and Gram negative, respectively. Among the recovered species and genera,
some have been previously used to evaluate their probiotic properties giving positive results; among
these, Lactobacillus casei and species of the genus Streptococcus, Streptomyces, Microbacterium,
Clostridium, Agrobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus and Micrococcus stand out. Therefore,
it is proposed to continue the project with the identification of species belonging to the genera
Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus and Pseudomonas and with the evaluation of the
probiotic characteristics of the species Lactobacillus casei, mentioned above, and Clostridium ghonii,
which although it has not been evaluated as a probiotic it belongs to a genre with beneficial properties
for its host.
1. Introducción
El manatí antillano (Trichechus manatus) es una especie que se distribuye en el sur de Brasil, las
costas de Centroamérica, el Caribe y Florida- EE.UU incluyendo algunas islas del Caribe, como
Cuba, Puerto Rico y República Dominicana (Caldwell & Caldwell, 1985). Con base en los
resultados obtenidos por Castelblanco-Martínez et al. T. manatus es una especie que en Colombia
se encuentra ubicada mayormente en las cuencas principales, tributarios, complejos cenagosos y
planicies inundables de los ríos Orinoco, Guaviare, Meta, Atrato, Sinú y Magdalena y ocupan un
área aproximada de 33.265 Km2. No se tiene un dato preciso sobre la abundancia de la población
de manatíes en Colombia. Sin embargo, se sabe que la población ha sido reducida principalmente
por la caza para el consumo de la carne y otros productos, el enmallamiento en redes de pesca, la
contaminación y la destrucción del hábitat. En medio de esta problemática por la disminución de
las poblaciones de manatíes, se han desarrollado programas de conservación de la especie que
buscan proteger las poblaciones e incentivar acciones e investigaciones para su preservación.
La crianza de bebés manatíes en condiciones de cautiverio se ha vuelto uno de los mayores retos
para los programas de conservación, pues debido a los requerimientos nutricionales de las crías
de esta especie su mantenimiento es bastante costoso. Esto último debido a que estas crías no
pueden ser alimentadas con leche que contenga lactosa ya que sufren inflamación del colon y
puede producirles la muerte (Vergara, 2000). Teniendo en cuenta la problemática anteriormente
mencionada es importante encontrar alternativas para el cuidado de la alimentación de estas crías.
Los probióticos son microorganismos vivos que pueden conferir un beneficio para la salud de su
huésped si se administran en cantidades adecuadas (FAO / OMS 2001). Estudios previos, sobre
el uso de probióticos en otros animales mencionan posibles beneficios de su uso en la salud,
inhibición del crecimiento de patógenos, la supresión de algunos de sus factores de virulencia, la
modulación de la microbiota intestinal y la prevención de enfermedades infecciosas (Díaz et al.
2013). Se espera que un probiótico efectivo funcione y sobreviva bajo una variedad de condiciones
establecidas. Estos probióticos pueden ser tanto bacterias como hongos, que al ser aislados de leche
su temperatura de crecimiento estará alrededor de los 37°C, que es la temperatura corporal
promedio en la que se mantiene un mamífero (Feldhamer, 2007). Según Ganguly et al. (2011), un
probiótico debe cumplir con pruebas in vitro e in vivo entre las que se encuentran resistencia a la
acidez gástrica, resistencia a los ácidos biliares, actividad antimicrobiana contra bacterias
patógenas, capacidad de adherirse a superficies y actividad de hidrolasa de sal biliar; además
pruebas in vivo para verificar la seguridad y eficacia en modelos animales.
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Aislar e identificar microorganismos con potencial probiótico en la leche materna del manatí
antillano (T. manatus).
2.2 Objetivos específicos
Aislar y caracterizar bacterias y hongos ácido-lácticos presentes en las muestras de leche de
manatí.
Identificar características probióticas en los aislamientos obtenidos.
3. Metodología
Se analizaron tres muestras de leche de diferentes hembras de manatíes obtenidas en el parque
Dolphin Discovery en Playa del Carmen, México y una muestra proveniente de una manatí
liberada, luego de un proceso de rehabilitación y reintroducción exitoso realizado por la
Fundación Omacha en el Río Sinú, Colombia.
3.1 Aislamiento y cultivo de microorganismos.
3.1.1 Cultivos en aerobiosis
Se hicieron diluciones (10−1, 10−2y 10−3) añadiendo 100uL de la muestra de leche de manatí a
900uL de solución salina estéril. Se realizaron siembras en superficie en agar MRS Scharlau,
(Man, Rogosa, Sharpe), M17 OXOID, Nuevo (Triptona 1.5%, Agar 1.5 % Extracto de levadura
0.5%, Brain-Heart Infusion 0.5%, Glicerol 1%, NaCl 0.2%, K2HPO4 0.2% L-Cisteína HCl
0.03%, Tween 80 0.025%) (Baquero, 2014) CNA Scharlau. (Columbia NaladixicAcid Agar) y
agar nutritivo Scharlau, de 100ul de cada dilución, y se incubaron a 37°C por 24-72 h. Para verificar
que los morfotipos estuvieran aislados se comprobó la presencia de un solo tipo de morfología en
caja (realizando subcultivos en sus respectivos medios de cultivo) y se realizó una tinción de Gram
para verificar también la presencia de una sola morfología microscópica.
3.1.2 Cultivos en anaerobiosis
Se hicieron diluciones (10−1, 10−2) añadiendo 100uL de la muestra de leche de manatí a 900uL de
solución salina estéril. En agar MRS, M17 y CNA se sembraron por superficie 100ul de cada
dilución y muestras directas de cada leche. Se incubaron a 37°C por 3-8 días en jarra de
anaerobiosis, con sobre de anaerobiosis de la marca Thermo Fisher. A las diferentes morfologías
obtenidas se les hizo un segundo o tercer pase a su respectivo agar. Para verificar que los morfotipos
estuvieran aislados se comprobó la presencia de un solo tipo de morfología en caja y se realizó
una tinción de Gram para verificar la presencia de una sola morfología microscópica.
3.1.3 Aislamiento de hongos
Se hicieron diluciones (10−1, 10−2) añadiendo 100uL de la muestra de leche de manatí a 900uL de
solución salina estéril. Los medios de cultivo usados para la siembra de las muestras fueron
extracto de malta con agar bacteriológico de la marca Scharlau, rosa de bengala marca Scharlau
y PDA (Potato Dextrose Agar) de la marca Scharlau. Además, en un segundo ensayo se le añadió
a los medios un antibiótico llamado Meropenem de la marca sigma-aldrich (0,008g/L), esto con
el fin de evitar el crecimiento de cepas bacterianas. En estos medios se sembraron por superficie
100ul de cada dilución y muestras directas de cada leche y se incubaron a 37°C por 3-8 días. A
los diferentes morfotipos obtenidos se les hizo un segundo o tercer subcultivo a su respectivo agar.
Para verificar que los morfotipos estuvieran aislados se comprobó la presencia de un solo tipo de
morfología en caja y se realizó una tinción de Gram para verificar también la presencia de una sola
morfología microscópica.
3.2 Caracterización de los aislamientos
A las cepas aisladas en cada uno de los tratamientos se les hizo una descripción detallada, la cual
consistía en una caracterización macroscópica y microscópica de las cepas. La caracterización
macroscópica incluyó su morfología en caja, el color, tamaño, contextura y en ocasiones olor que
presentaran en los medios del que fueron aisladas. La caracterización microscópica se hizo por la
técnica de coloración de Gram por la cual se identificó la agrupación y la morfología de las células
(cocos, bacilos, cocobacilos, levaduriformes) y a bacterias se les clasificó en Gram positivas o
Gram negativas.
3.3 Identificación de cepas bacterianas aislada
Con el objetivo de identificar las cepas bacterianas aisladas de las muestras se realizó la extracción
del ADN por el método de boiling, en el cual se añadían 4 colonias de cultivos puros a 200 μl de
agua destilada estéril en tubos eppendorf de 1.5 ml. Después, en una gradilla de icopor se ponían
los tubos en agua hirviendo por 15 minutos y después se pasaban a hielo por otros 15 minutos.
Las muestras se descongelaban y luego se centrifugaban a 13000 rpm por 2 min. Posteriormente,
50 μl del pellet se resuspendía en otro eppendorf y se guardaba a -20°C. La amplificación del gen
de ARN ribosomal 16S se hizo por medio de una PCR convencional usando los primers 27f (5'-
GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 ') y 1492r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3') (Rainey
et al. 1996). Los resultados de la PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1.2%, con
colorante SYBR Green para su posterior secuenciación mediante el método de Sanger. Las
secuencias obtenidas fueron evaluadas por medio de un BLASTn, plataforma perteneciente al
Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (disponible a través de http: //www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST/), para la identificación de la especie aislada.
3.4 Conservación de aislamientos
Luego de aislados, purificados o identificados, los morfotipos que se encontraban en medio sólido
se conservaron en glicerol al 10% por ultracongelación en -80°C para posteriores ensayos del
potencial probiótico.
4. Resultados
4.1 Aislamiento, cultivo y conservación de microorganismos.
En total se obtuvieron 130 morfologías distintas entre bacterias y hongos. De estas, 111 fueron
posteriormente aisladas y conservadas. Las bacterias que no se lograron conservar corresponden
a bacterias aisladas que en la purificación dejaban de crecer en los medios de cultivo o se
contaminaban. Se intentaron recuperar estas cepas en varias ocasiones, pero no fue posible.
Con el cultivo en aerobiosis se obtuvieron 85 morfotipos distintos de las cuatro muestras de leche
analizadas. De los 85 morfotipos, 73 fueron aislados y conservados; 57 de estos presentaron una
coloración de Gram positiva y 16 negativa. En cuanto a las morfologías microscópicas 34 de estos
son cocos, 12 son cocobacilos y 27 son bacilos. Un resumen de los resultados se presenta en la
Tabla 1.
Con el cultivo en anaerobiosis se lograron obtener 33 morfotipos distintos de las cuatro muestras
de leche. De los 33, 29 morfotipos fueron aislados y conservados. A su vez, 27 de estos
presentaron una coloración positiva y dos negativas. En cuanto a las morfologías microscópicas,
19 de estos son cocos, dos son cocobacilos y ocho son bacilos.
En total, se aislaron nueve morfologías levaduriformes, no se obtuvo ningún hongo filamentoso.
Tabla 1. Resultados morfología microscópica y Gram.
4.2 Identificación de los microorganismos aislados.
*Teniendo en cuenta la emergencia sanitaria mundial que se vivió en el año 2020 debido a la
pandemia por COVID-19, no se alcanzaron a lograr todos los objetivos propuestos inicialmente
por el impedimento de realizar los ensayos experimentales*
En este estudio se seleccionaron 52 cepas bacterianas para la secuenciación e identificación por
el método de secuenciación de Sanger. De estas, 32 cepas fueron aisladas en aerobiosis y 14 de
estas fueron identificadas hasta especie; por otra parte, 20 de las cepas secuenciadas fueron
aisladas en anaerobiosis y 12 de estas fueron identificadas hasta especie. Los resultados se
muestran en las tablas 2 y 3. Las cepas aisladas pertenecen a las siguientes familias:
Staphylococcaceae con 20 aislamientos, lo que corresponde al 38 % de las cepas identificadas;
Erwiniaceae con 9 aislamientos, corresponde al 16 % de las cepas identificadas;
Enterobacteriacea con 5 aislamientos, corresponde al 10 %; Streptococcaceae con 5 aislamientos
identificados como Streptococcus dysgalactiae, corresponde al 10 %; Microbacteriaceae con 3
aislamientos corresponde al 6 %; familias como Clostridiaceae (4 %) , Pseudomonadaceae (4 %)
o Micrococcaceae (4 %) presentan 2 aislamientos cada una y finalmente, familias como
Moraxellaceae (2 %), Lactobacillaceae (2 %), Rhizobiaceae (2 %) y Streptomycetacea (2 %)
tienen un solo representante cada una. Los representantes de las familias Enterobacteriacea,
Erwiniaceae, Moraxellaceae, Microbacteriaceae, Pseudomonadaceae y Micrococcaceae fueron
aisladas exclusivamente de los cultivos en aerobiosis. Por otro lado, los representantes de las
familias Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Streptomycetacea Rhizobiaceae y Clostridiaceae
fueron únicamente aislados de los cultivos en anaerobiosis. Staphylococcaceae fue la única
familia que presentó cepas en los dos sistemas de cultivo.
Tabla 2. Aislamientos que fueron identificados hasta especie.
Tabla 3. Aislamientos identificados hasta género o familia.
A continuación, se presenta un piechart con la distribución de los datos por familia.
Figura 1. Piechart de la distribución de los datos por familias de las cepas identificadas.
Entre las especies y géneros identificados dentro de las muestras se resaltan algunos de
importancia probiótica como la especie Lactobacillus casei (Parra et al. 2004, (Yadav et al. 2007),
(Isolauri et al. 1991), y los géneros Streptococcus (Guarner et al. 2011), Streptomyces (de Lima
Procópio et al. 2012), Microbacterium, Clostridium, Agrobacterium, Pseudomonas,
Staphylococcus y Micrococcus (Zorriehzahra et al. 2016). Además de su potencial probiótico,
varias especies de estos géneros se han aislado de leches de otros mamíferos como las vacas
(Kazwala et al. 1998), (Abd-El-Malek & Gibson, 1948), (Wiedmann et al. 2000). Asimismo,
también se logró identificar bacterias que se han reportado como productoras de antimicrobianos
evaluados en leche y bacterias aisladas de sustancias fermentadas, entre ellas se encuentra una
especie del género Kocuria que es productora de variacina, un antimicrobiano evaluado en leche
(O’mahony et al. 2001), y Franconibacter daqui que ha sido aislada de un licor fermentado
conocido como daqu de origen chino (Gao et al. 2017).
Por otra parte, algunos de los aislamientos identificados se han reportado como patógenos de
plantas, entre ellos se encuentra Curtobacterium plantarum (Dunleavy, 1989), el género
Agrobacterium (Binns y Thomashow, 1988), Streptomyces (Loria et al. 1997) y especies del
género Pantoea como Pantoea agglomerans (Cruz et al. 2007), Pantoea ananatis(Coutinho y
Venter, 2009) y Pantoea brenneri (Walterson & Stavrinides, 2015). Asimismo, se identificaron
aislamientos relacionados con la microbiota normal de plantas o relacionados con la microbiota
en sedimentos marinos; entre ellos se encuentra también el género Pantoea (Walterson &
10%
16%
2%
38%
6%
4%
4%
2%
10%
2%4% 2%
Frecuencia de familias
Enterobacteriacea Erwiniaceae Moraxellaceae Staphylococcaceae
Microbacteriaceae Pseudomonadaceae Micrococcaceae Lactobacillaceae
Streptococcaceae Rhizobiaceae Clostridiaceae Streptomycetacea
Stavrinides, 2015), (Silvi et al. 2013). También se encuentra el género Leclercia aislado de
sedimentos marinos (Keren, 2014).
Además, muchas de las bacterias identificadas pertenecen a géneros de importancia clínica que se
pueden ver involucrados en bacteriemias; entre ellos, resaltan géneros como Acinetobacter,
Cronobacter (Healy et al. 2010), Pseudomonas, Staphylococcus (Cisneros-herreros, 2007). De
hecho, todas las bacterias que se lograron identificar hasta especie dentro del género
Staphylococcus son de importancia clínica como Staphylococcus aureus (un aislamiento),
Staphylococcus epidermidis (tres aislamientos), Staphylococcus saprophyticus (un aislamiento),
Staphylococcus sciuri (dos aislamientos), Staphylococcus cohnii (un aislamiento) y
Staphylococcus haemolyticus (un aislamiento), que se han reportado cada vez más en los últimos
años como agentes causales de infecciones nosocomiales (Shittu et al. 2004) (Garza-González et
al. 2011).
5. Discusión de resultados
Se logró caracterizar todas las cepas aisladas y purificadas de las muestras de leche de manatíes,
diferenciando si correspondían a cepas bacterianas o fúngicas y haciendo descripción de su
morfología tanto macroscópica como microscópica. Sin embargo, no todas las cepas lograron ser
identificadas por medio de secuenciación por el método Sanger. A pesar de este impedimento
podemos resaltar algunos de los resultados más significativos y que contribuyen a la identificación
y caracterización de algunas cepas con potencial probiótico aisladas de leche de manatíes. Uno de
los resultados más significativos para este estudio es la identificación de la especie Lactobacillus
casei, (un solo aislamiento) puesto que se ha estudiado ampliamente su potencial probiótico tanto
en humanos (Isolauri et al. 1991) como en animales (Yadav et al. 2007) y es ampliamente conocida
por los beneficios que tiene esta en el sistema inmune innato de sus hospederos (Parra et al. 2004).
Por otra parte, aunque el género Streptococcus ha sido objeto de varias investigaciones que
resaltan su potencial probiótico (Laleman et al. 2015), fue Streptococcus dysgalactiae una de las
especies más frecuentes en las bacterias identificadas (cinco aislamientos); esta especie es
reconocida por generar infecciones comúnmente relacionadas con la mastitis en mamíferos como
las vacas (Calvinho et al. 1998). Por otro lado, las especies del género Microbacterium, (dos
aislamientos en este estudio), sí han sido probadas como potencial probiótico en animales como
la Artemia franciscana (Medina, 2000); sin embargo, hace falta investigación sobre su efectividad
en animales mamíferos como el manatí. En el caso de Clostridium, la especie identificada en este
estudio fue Clostridium ghonii (dos aislamientos), que no se reconoce como patógeno y se
encuentra por lo general en sedimentos marinos (Jyothsna et al. 2016) en donde es fácilmente
transmitible a los manatíes. De hecho, en el artículo escrito por McNulty (2011) se menciona que
géneros como Bacteroides, Clostridium, Ruminococcus, Dorea son géneros ampliamente
encontrados en la microbiota intestinal en animales, son buenos competidores y beneficiosos para
sus hospederos.
Por lo demás, algunas de las bacterias aisladas en este estudio no lograron ser identificadas hasta
especie y al ser pertenecientes a géneros como Agrobacterium, Streptomyces, Pseudomonas,
Staphylococcus y Micrococcus se encuentran en la dicotomía de tener un potencial probiótico o
ser patógenas. Esto debido a que los géneros anteriormente mencionados tienen representantes
comúnmente evaluados como probióticos o asociados a la producción de metabolitos secundarios
beneficiosos para el hospedero, entre ellos Streptomyces griseus (de Lima Procópio et al. 2012)
Agrobacterium azotophilum (Social & Campus), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas
corrugata, Pseudomonas fluorescens (Valverde & Ferraris, 2009), Staphylococcus hominis (Sung
et al. 2010), Micrococcus nihinomyaensis (Osman et al. 2010), (Zorriehzahra et al. 2016); y
también, representantes comúnmente asociados a enfermedades en animales, plantas o humanos
como Streptomyces scabies (Loria et al. 1997), Staphylococcus aureus (Lowy, 1998),
Staphylococcus epidermidis (Vuong & Otto, 2002), Pseudomonas aeruginosa (Bodey et al.
1983), Micrococcus luteus (Dürst et al. 1991), Agrobacterium tumefaciens (Goodner et al. 2001)
(Binns y Thomashow, 1988), entre otros. Por lo anterior, aquellas bacterias que pertenezcan a
alguno de estos géneros deben ser previamente evaluadas para saber si pertenecen a una especie
patógena o a una especie con potencial probiótico. Para esto es pertinente secuenciar otro gen
diferente al gen de ARN ribosomal 16S, evaluar la patogenicidad por medio de genes que les
confieran esta característica o realizar pruebas bioquímicas que permitan conocer la especie a la
que corresponden. En el caso del género Agrobacterium se pueden secuenciar los genes virD2 e
ipt, que según Haas et al. (1995) son dos marcadores genéticos que en conjunto permiten
determinar patogenicidad en todas las especies de Agrobacterium. Por otra parte, para el género
de Pseudomonas se han propuestos los marcadores rpoD y gyrBEl para la identificación de
especies de este género cuando no es posible hacer la identificación con el gen de ARN ribosomal
16S (Mulet et al. 2010). Asimismo, se han propuesto marcadores genéticos como hsp60 en el
género Staphylococcus para la identificación de especies (Kwok, & Chow, 2003). En el caso del
género Micrococcus las bacterias que se han reportado asociadas con infecciones son
Micrococcus luteus y Micrococcus lylae y para la identificación de estas especies Wieser et al.
(2002) describe diferentes pruebas bioquímicas entre ellas la asimilación de acetato, de L-
fenilalanina, L-serina y fenilacetato. Cabe resaltar que bacterias del género Micrococcus se
encuentran en ocasiones en la piel de mamíferos como microbiota normal (MacCallum y
Hastings, 1899), la presencia de esta bacteria en la leche se puede deber a una contaminación con
bacterias de la piel del manatí al tomar las muestras de leche.
En cuanto a las características generales de los aislamientos se pueden resaltar algunas
particularidades. En estudios previos, como el realizado por Arbelaez y Caballero (2019) la
mayoría de las bacterias encontradas en la leche de manatí fueron Gram negativas pertenecientes
al phylum Proteobacteria. Sin embargo, en esta investigación se encontró una alta frecuencia de
bacterias aisladas Gram positivas, lo que se debe principalmente al uso de medios selectivos como
CNA, MRS y M17. Por otra parte, la poca cantidad de aislamientos fúngicos se puede deber
principalmente a un tema de competencia entre hongos y bacterias; puesto que aun al añadir
antibiótico al medio se presentaba crecimiento de cepas bacterianas. Otra de las razones se puede
contemplar en el artículo escrito por Luna et al. (2004) en el que se muestra la baja frecuencia de
aislamientos fúngicos en leche materna de mamíferos sanos. Sin embargo, autores como
Monsalve y González (2005) sugieren que en leches crudas hay gran cantidad de hongos y
levaduras. En ese caso, podríamos concluir que las especies cultivables de hongos o levaduras
presentes en leche son muy pocas, lo que condiciona su crecimiento en ensayos como los llevados
a cabo en este estudio. En conclusión, a pesar de la presencia de hongos y levaduras en leche de
mamíferos los métodos utilizados para su aislamiento en este estudio solo permiten recuperar unos
pocos, esto se conoce en microbiología como la anomalía del recuento en placa.
En relación con la investigación de Arbelaez y Caballero (2019), cuya finalidad fue dilucidar el
metagenoma de las mismas muestra de leche de manatí evaluadas en este estudio, se pueden
evidenciar varias diferencias y similitudes en los resultados. Por ejemplo, Arbelaez resalta la alta
frecuencia de la especie Acinetobacter baumannii que no se logró identificar en este estudio a
pesar de la alta prevalencia en el metagenoma. Lo mismo sucede con Cronobacter sakazakii que
se encuentra regularmente en el metagenoma de las muestras, pero no fue aislada en este estudio.
Sin embargo, la muestra que corresponde a Cronobacter sp. aislada en esta investigación podría
corresponder a la especie C. sakazakii. Del mismo modo, Christensenella massiliensis y
Burkholderia dolosa, fueron especies frecuentes en los resultados de Arbelaez, pero no lo fueron
en esta investigación. Todo esto se puede deber a varios factores, entre ellos la competencia en un
medio rico en nutrientes que hay entre bacterias. Por ejemplo, Palkova (2004) describe que en
ambientes naturales o silvestres las relaciones ecológicas son muy distintas a las que se pueden
presentar en ambientes simulados como los usados en este estudio; es por esto que, bacterias que
se presentan ampliamente en el metagenoma resultan no ser buenas competidores en ambientes
simulados. Otra razón puede ser la falta de condiciones adecuadas para el cultivo de estas
bacterias, lo que condiciona su crecimiento. Sin embargo, muchas de las bacterias que Arbelaez
resalta por su frecuencia en el metagenoma fueron encontradas también en este estudio, entre estas
se encuentran especies pertenecientes al género Pantoea y Pseudomonas que están entre las
bacterias identificadas.
Entre los resultados esperados para este estudio se esperaban varias especies pertenecientes a los
géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, debido a la presencia de estos en leche de varios
mamíferos por sus características probióticas (Guarner, et al. 2011) y a la utilización de medios
selectivos que favorecían el crecimiento de géneros como estos. Sin embargo, entre las bacterias
que fueron identificadas mediante el método de secuenciación Sanger solo figuró una especie
perteneciente a estos dos géneros. Este último se puede deber a un posible sesgo en los resultados,
debido a la implementación del método de boiling para la extracción del ADN, empleado en este
estudio. Según Sahin et al. (2016) muchas de las bacterias Gram positivas, debido a estructuras
complejas en sus paredes celulares como glucopeptidos, requieren de otros protocolos de
extracción un poco más complejos para la extracción efectiva de su ADN. Al implementar
únicamente el método de boiling para la extracción del ADN se generó un sesgo que favorecía a
las bacterias Gram negativas. Es por esto que muchas de las bacterias que lograron ser detectadas
por el análisis metagenómico correspondían a bacterias Gram negativas a pesar de su baja
frecuencia en la caracterización. Esto significa que muchas de las bacterias Gram positivas que
podían pertenecer a géneros comúnmente usados como probióticos no pudieron ser secuenciadas
debido a problemas con la extracción de su ADN por métodos clásicos como el boiling.
Los resultados de la identificación de los microorganismos aislados permiten escoger algunas de
las bacterias identificadas para posteriormente realizar una evaluación de propiedades probióticas.
Las únicas dos bacterias que se pudieron identificar hasta especie y presentan condiciones para su
evaluación como probióticos son la especie Lactobacillus casei y Clostridium ghonii. En el caso
de Lactobacillus casei como se ha mencionado anteriormente, es una especie conocida por sus
propiedades probióticas, además de haber sido encontrada en otras leches de mamíferos como
yaks (Di et al. 2017), cabras (Herreros et al. 2003), camellos (Lü et al. 2014) y humanos (Rajoka
et al. 2018). Asimismo, esta especie ha sido previamente evaluada en cuanto a tolerancia a la
acidez y bilis, adhesión e hidrofobicidad de la superficie celular, efecto antimicrobiano sobre
patógenos comunes y reducción del colesterol, experimentos en los cuales siempre se ha visto un
buen desempeño de las diferentes cepas de esta especie (Mishra & Prasad, 2005). Por otro lado,
Mansour et al. (2014) evaluó en una cepa de esta misma especie la resistencia a enzimas
pancreáticas, la sensibilidad a tres antibióticos (cloranfenicol, tetraciclina y eritromicina) para
asegurar la seguridad en los hospederos, la activación de receptores inmunes innatos específicos
y comprobó que esta especie activará el receptor 2 tipo Toll, lo que sugiere lipopéptidos como su
estructura inmunomoduladora activa. También se han realizado ensayos de transformación en
leches fermentadas, en los cuales también se comprobó el aumento significativo de lactobacilos
intestinales después de su suministro en ratas (Minelli et al. 2004). En cuanto a la bacteria
identificada como Clostridium ghonii también tiene un fuerte potencial para ser evaluada en los
ensayos de potencial probiótico, puesto que según McNulty et al. (2011) bacterias pertenecientes
a este género deberían ser evaluadas como probióticos debido a la prevalencia que tienen en la
microbiota intestinal de muchos mamíferos y a que se consideran mejores competidores frente a
otras bacterias acido lácticas ampliamente usadas como probióticos. Otra cosa que destaca este
autor es que, debido a la condición anaerobia de especies como esta, colonizan muy bien el tracto
gastrointestinal de mamíferos por no depender de oxígeno para su crecimiento. A diferencia de L.
casei esta especie no ha sido evaluada como probiótico; sin embargo, debido a lo anteriormente
mencionado puede evaluarse su potencial ya que no es una bacteria que se haya reportado como
patógena. Otras bacterias como las pertenecientes a los géneros Microbacterium, Streptomyces,
Micrococcus, Staphylococcus y Pseudomonas requieren de una identificación previa de la especie
a la que pertenecen para determinar si pueden ser evaluadas como probióticos o no. En resumen,
las bacterias que se evaluarían como posibles probióticos son Lactobacillus casei, Clostridium
ghonii y especies de los géneros Microbacterium, Streptomyces, Micrococcus, Staphylococcus y
Pseudomonas que no se reporten como patógenas.
En estudios posteriores se podría evaluar las características probióticas de estas cepas con pruebas
como: resistencia a la acidez gástrica, resistencia a los ácidos biliares, actividad antimicrobiana
contra bacterias patógenas como Escherichia coli, Salmonella enterica y Staphylococcus aureus.
También se puede evaluar la capacidad de adherirse a superficies por medio de una prueba de
actividad de autoagregación (Collado et al. 2008). Además, se pueden realizar pruebas in vivo para
verificar la seguridad y eficacia en modelos animales después de completadas las pruebas in vitro
mencionadas anteriormente.
6. Conclusiones
En conclusión, muchas de las bacterias identificadas en este estudio tienen el potencial, según
literatura científica, para ser evaluadas como posibles probióticos. Muchas de ellas, al ser
pertenecientes a géneros cuyos representantes se han evaluado como probióticos y han resultado
efectivos en animales o humanos. Las bacterias y hongos que no lograron ser identificados
contaron con una caracterización microscópica y macroscópica que permite su posterior
reactivación, para lograr ser identificadas y posteriormente evaluadas como posibles probióticos.
Con base en los resultados podemos inferir que muchas de las especies aisladas de las muestras
de leche de manatíes son beneficiosas y pueden contribuir a la formación de microbiota en los
bebes manatíes, algunas por estar relacionadas a la dieta herbívora de la especie y otras por estar
relacionadas a modulación de la microbiota, o a efectos positivos en la modulación del sistema
inmune innato de los hospederos. La baja prevalencia de hongos aislados se puede deber a la
competencia que hay con bacterias en medios nutritivos o a la poca frecuencia de especies
cultivables en muestras provenientes de leche. La alta incidencia de especies Gram positivas se
debe al uso de medios selectivos que favorecían el crecimiento de estas bacterias. Por otra parte,
la abundancia de especies Gram negativas identificadas se debe a la utilización del método de
boiling para la extracción del ADN de las cepas, puesto que la sencillez de la pared celular de
estas bacterias las hace más viables para la extracción en comparación con bacterias Gram
positivas. Finalmente, las bacterias que posteriormente pueden ser evaluadas como probióticos
son Lactobacillus casei, Clostridium ghonii y después de una identificación de especie algunas
de los géneros Microbacterium, Streptomyces, Micrococcus, Staphylococcus y Pseudomonas por
sus estudios previos de potencial probiótico y aislamientos previos de otras leches de diferentes
mamíferos.
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