1

Аминокиселине

1. предавање

Природно-математички факултетУниверзитет у Крагујевцу

2

Појам аминокиселине

• Аминокиселине су органске киселине...• Општа формула:

• Као органски молекул то је α-аминокарбонска киселина• Као биомолекул то је α-аминокиселина

полиенске

хидрокси

кето

По положају базне аминогрупе могу бити α, β...

R CH COOH

NH2

1

R CH CH

R CH

OH

R C

O

*

Ar

Rалифатичне

ароматичне

3

α-аминокиселине

• α-аминокиселине су протеинске киселине које на α-С атому увек имају две функционалне групе: карбоксилну и амино

• Постоји преко 200 аминокиселина• Само 20 њих јесу протеинске аминокиселине

4

Неполарне аминокиселине

H3C CH COOH

NH2

HC CH COOH

NH2

H3C

CH3

H2C CH COOH

NH2

HC

CH3

H3C

HC CH COOH

NH2

H2CH3C

CH3

CH2 COOH

NH2

глицин, Gly, G

aланин, Ala, A

валин, Val, V

леуцин, Leu, L

изолеуцин, Ile, I

нема хиралан α-С

5

Аминокиселине са сумпором

H2C CH COOH

NH2SH

H2C CH COOH

NH2

H2CSH3C

цистеин, Cys, C

метионин, Мet, M

6

Аминокиселине са хидроксилном групом

H2C CH COOH

NH2OH

HC CH COOH

NH2OH

H3C

серин, Ser, S

треонин, Thr, S

7

Дикарбоксилне аминокиселине

H2C CH COOH

NH2

HOOC

H2C CH COOH

NH2

HOOC

аспарагинска киселина, Asp, D

глутаминска киселина, Glu, E

8

Амиди дикарбоксилних аминокиселина

H2C CH COOH

NH2

OCH2N

H2C CH COOH

NH2

H2COCH2N

аспарагин, Asn, N

глутамин, Gln, Q

9

Базне аминокиселине

H2C CH COOH

NH2

H2CH2CHN

CHN

NH2

H2C CH COOH

NH2

H2CH2CH2C

NH2

H2C CH COOH

NH2

HN

N

аргинин, Arg, R

лизин, Lys, K

хистидин, His, H

ε

10

Ароматичне аминокиселне

H2C CH COOH

NH2

H2C CH COOH

NH2

HO

H2C CH COOH

NH2NH

фенилаланин, Phe, P

тирозин, Tyr, Y

триптофан, Trp, W

11

Аминокиселине са прстеном

NH

COOHпролин, Pro, P

12

Eсенцијалност аминокиселина• Есенцијалност је више биолошки појам и односи се на биолошку

функцију аминокиселина• Есенцијалне аминокиселине ћелија НЕ МОЖЕ да биосинтетише и

њихова потреба се мора регулистати екстерним путем (исхраном)

Аминокиселина(ознака)

Есенцијалност (g/дневно)

Тип (структура)

Порекло (намирница)

Val 0,8 неполарна месо, соја, пасуљ, легуминозеLeu 1,1 неполарна месо, пилетина, соја, кукуруз, млеко Ile 0,7 неполарна јаја, соја, пилетина, алге, сир

Met 1,1 са сумпором јаја, сусам, риба, цералијеThr 0,5 са -ОН купус, сир, риба, месо, сочивоArg 1,8 базна купус, сир, млеко, свињетина, туна,

брашно, орах, кикирики, сојаLys 0,8 базна риба, пилетина, соја, сочивоHis 0,9 базна месо, риба, пиринач, туна, соја,

кукуруз, парадајз, печурке, банане, цитруси

Phe 1,1 ароматична месо, риба, јаја, орах, кикирикиTrp 0,25 ароматична јаја, соја, сир, свињетина, пилетина,

риба, бресква, банана, парадајз, рижа, млеко

10 аминокиселина је есенцијално

13

Стереохемија аминокиселина• Структура аминокиселина је тетраедарска

• Обзиром да већина аминокиселина (осим Gly!!!) поседује хиралан α-С, оне поседују способност да окрећу раван поларизоване светлости

• Све аминокиселине које имају бар један асиметричан угљеников атом јављају се као L-облик, D-облик и рацемат

R

COOHH2NH

*

R

COOHH2NH

*

R

HOOC NH2

H*

L-изомер D-изомер

14

• 1861. године Emil Fischer је предпоставио да све протеинске аминокиселине имају исту релативну конфигурацију и да припадају L-серији

• То је доказао синтезом L-Ala из L-Ser

H2N C H

R

COOH

*

R

COOHH2NH

*

=

L-аминокиселина

H2N C H

CH2

COOH

OH

CH3OH

HClCl H3N C H

CH2

COOCH3

OH

PCl5Cl H3N C H

CH2

COOCH3

Cl

HClLiOH

H2N C H

CH2

COOH

Cl

Na/Hg

H3OH2N C H

CH3

COOH

L-Ser

L-Ala

15

• Синтезом аминокиселина из других супстрата увек су се добијали рацемати које је било немогуће раздвоји

• Структура L-облика аминокиселина дефинитивно је потврђена синтезом из L-глицералдехида

HO C H

CH2

CHO

OH

OHCH

CH2

CHO

HO

* *

L-глицералдехид D-глицералдехид

16

• Huggens и Ingold су 1950. године дали нови доказ да су све протеинске аминокиселине L-облика синтезом L-(-)-Ala из L-(-)-глицералдехида

L-(-)-глицералдехид L-(-)-млечна киселинаПРЕКУРСОР

D-(+)-α-бромпропионскакиселина

L-(-)-азид пропионскекиселине

L-(+)-Ala

Walden-ова инверзија

Walden-ова инверзија

HO C H

CH2

CHO

OH

HgO

OHO C H

CH2

COOH

OH

Br2

H C Br

CH2

COOCH3

OH

NH3

N3 C H

CH2

COOH

OH

H2/PtH2N C H

CH3

COOH

SN2

SN2

17

• Постоје и протеинске аминокиселине које имају 2 асиметрична угљеникова атома (Thr, Ile, Pro, HyPro) - СТЕРЕОИЗОМЕРИ

• Код тих аминокиселина постоји асиметрија и на α-С* и на β-С*

HC CH COOH

NH2OH

H3C**

CHH2N

HC

CH3

COOH

OH

HC NH2

CH

CH3

COOH

HO

L-Thr D-Thr

CHH2N

CH

CH3

COOH

HC NH2

HC

CH3

COOH

HO OH

L-Allo-Thr D-Allo-Thr

R

COOHH2NH

*

1 2

3

18

Chan-Ingold-Prelog-ово правило стереохемисјког приоритета:SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > CH3

• Све аминокиселине, изузев L-Cys имају (S) релативну конфигурацију

CH2OH

COOHH2NH

*

1 2

3

CH2SH

COOHH2NH

*

2 3

1

L-Ser L-Cys

(S) (R)

19

Хемијско понашање аминокиселина• Због своје специфичне структуре у којој су на једном С атому везане

киселинска –СООН и базна –NH2, аминокиселине се различито понашају у односу на рН у којој егзистирају

• Структура аминокиселине јесте динамичка равнотежа свих облика у којима она егзистира

обе групе депротонованеZwitter јон

обе групе протоноване

рН

С

20

R CH COOH

NH2

R CH COOH

NH2

R CH COO

NH2

R CH COOH

NH3

R CH COOH

NH2

H

OH

Протоновани парПар киселина

Депротоновани парПар база

R CH COO

NH3

R CH COO

NH2

R CH COOH

NH3

H OH

21

• У чврстом стању (кристали), растворне у јако полараним растварачима

• Енергетски сиромашно стање E = 44.0 – 51.5 KJ/Mol• Висока тачка топљења, на температурама вишим од 80°С се распадају• Слаба растворљивост у неполарним растварачима• Карактеристично понашање у киселој и у базној средини

R CH COO

NH3

Zwitter jon

Егзистирање у облику условљава да:

22

• Све аминокиселине изузев Asp, Glu, His, Tyr су добро растворне у води, NH3 и другим поларним растварачима (ЕtAc, DMSO, THF...)

• У слабо поларним (МеОН, ЕtOH...) и неполарним (ССl4, CHCl3) су нерастворне

R CH COO

NH3

R CH COOH

NH2

Равнотежа потпунопомерена ка енергетскистабилнијој структури

23

• рН = 2 јако сузбијена дисоцијација карбоксилне групе, аминокиселина протонована, аминокиселина као катјон

• рН = 4 дисоцијација није више толико сузбијена, слаби јачина ОН везе

• рН = 7.4 биполарни јон, Zwitter joн• рН = 9 амино група је депротонована и неутрална је, карбоксилна

група је дисосована

R CH COO

NH3

R CH COO

NH2

R CH COOH

NH3

H OH

Ка1 Ка2

24

• Што је могућност дисоцијације протона већа, киселина је јача и њена рКа вредност је мања

• За тачно одређивање киселости аминокиселина потребно је конструисати титрациону криву

ОН-

рН

НАЈМАЊУ РАСТВОРЉИВОСТ У ВОДИАМИНОКИСЕЛИНЕ ПОКАЗУЈУ НА рI

25

Aминокиселина рКа1 рКа2 рКа3 pKI

-COOH -NH3 -R

Gly 2.34 9.60 5.97Ala 2.34 9.69 6.01Val 2.92 9.62 5.97Leu 2.36 9.60 5.98Ile 2.39 9.68 6.02

Cys 1.96 10.28 8.18 5.07Met 2.28 9.21 5.74Ser 2.21 9.15 5.68Thr 2.11 9.62 5.81Asp 1.88 9.60 3.65 2.77Glu 2.19 9.67 4.25 3.22Asn 2.02 8.80 5.41Gln 2.17 9.13 5.56Arg 2.17 9.04 12.48 10.76Lys 2.18 8.95 10.53 9.74His 1.82 9.17 6.00 7.59Phe 1.83 9.13 5.48Tyr 2.20 9.11 10.07 5.66Trp 2.38 9.39 5.89Pro 1.99 10.96 6.48

Табела 2. рКа и рКI вредности аминокиселина

26

Хемијско понашање неутралних аминокиселина

Gly Ala Val Leu Ile

27

CH2 COOH3N CH2 COOH2NCH2 COOHH3N

pKa1 pKa2

Gly0Gly+1Gly-1

рI

OH-

pH

2.34

9.60

5.97

28

pKa1 = 2.34

Jaча киселина од сирћетне због +I NH 3

+групе

pKa = 4.7 pKb = 10.75

pKa2 = 9.60

Смањена базност NH2

групе због -I-COO- групе

29

Хемијско понашање аминокиселина са сумпором

Постоји могућност дисоцијације тиолне групе у јако базној средини.На титрационој кривој постоји и рКа3 = pKaR

Cys

Met

30

Хемијско понашање дикарбонских аминокиселина и амида дикарбонских киселина

Asp Glu Asp Gln

31

CH COOH3N CH COOH3NCH COOHH3N

pKa1 pKa2

Glu0Glu+1Glu-1

CH2

CH2

COOH

CH2

CH2

COOH

CH2

CH2

COO

CH COOH2N

CH2

CH2

COO

pKa3

Glu-2

OH-

рI

pH

2.19

4.25

9.67

3.22

32

Хемијско понашање ароматичних аминокиселина

Phe Tyr Trp

Moгућа дисоција у екстремним рН условима

33

Хемијско понашање аминокиселина са хидроксилном групом

Ser Thr

34

Хемијско понашање базних аминокиселина

35

CH COOH3N CH COOH2NCH COOHH3N

pKa1 pKa2

Lys+1Lys+2Lys0

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH COOH2N

CH2

CH2

CH2

pKa3

Lys-1

CH2

CH2

NH3

CH2

CH2

NH3

CH2

CH2

CH2

NH3

CH2

CH2

NH2

OH-

pH

2.18

8.9510.53

9.74рI

36

CH COOH3N CH COOH2NCH COOHH3N

pKa1 pKa2

Arg+1Arg+2Arg0

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH COOH2N

CH2

CH2

CH2

pKa3

Arg-1

NH NH

C

NH3

CH2

NH

C

NH3

NH

C

NH2

C NH

NH3

NH NH NH

NH2

C NH2

NH2

NH2

C NH2

NH2

NH2

C NH2

NH2

рН < 2 рН ≈ 8 рН ≈ 10.8 рН > 13

CH COOH3N CH COOH3NCH COOHH3N

pKa1 pKa2

His+1His+2His0

CH2CH2 CH2

CH COOH2N

CH2

pKa3

His-1

HN

NH

HN

NH

N

NH

N

NH

1.82 6.00 9.17

2.17 9.04 12.48

pI = 7.59

pI = 10.76

37

Хемијско понашање аминокиселина са прстеном

38

• Oдвајање електрофорезом• Различите АК имају различито pI на различитим рН• При истом рН амино киселине путују различитом брзином

R CH COOH

NH3

R CH COO

NH2

узорак

вијалица

(анода)

(катода)

39

Добијање аминокиселина

• Хемијска синтеза –D, L-AK• Изоловање из биолошког материјала – L-AK• Микробиолошки поступци добијања - D, L-AK

40

Хемијска синтеза – L-, D-AK

• Увек се добија рацемска смеша L- и D-изомера• Изомере је потребно одвојити• Најједноставнији поступак добијања је амонолиза халогенкарбонских

киселина

R CH COOH

Cl

R CH COOH2 NH3

NH2

*

41

Оптичко одабирање: L- и D-облици кристализацијом дају различите полиедарске кристале, па се простим одабирањем под микроскопом кристали могу одвојити. Кристали се разликују по облику и карактеристични су за L- и D-облик. Glu и Asn дају лепе кристале. Модификација овог поступка је калемљење истих антипода

42

Хемијско разлагање: Заснива се на грађењу дијастереоизомерних соли N-ацил-аминокиселина са оптички активним алкалоидима: стрихинин, бруцин, хинин, цинхонин и другим базама: фенил-етил-амин.

Бихемијско разлагање:

Метода 1. Оксидазе и декарбоксилазе неких микроорганизама делују само на L-облике а D-облици остају у подлози. Управо је то недостатак што се добијају D-аминокиселине.

Метода 2. Асиметрична синтеза се заснива на особини неких ензима да катализују грађење амидне везе само L-облика аминокиселина.

Метода 3. Асиметрична хидролиза је заснована на особини ацилаза из бубрега и карбоксипептидаза из панкреаса да брже хидролизује N-ацил-деривате L-аминокиселина од D-изомера. Ослобођена L-аминокиселина се обично таложи са етил-алкохолом.

43

Изоловање из биолошког материјала - L

• Ситњење биолошког материјала• Екстракција• Хидролиза

Биолошки материјал

Хомогемизација(ситњење)

Екстракција погоднимрастварачем

44

Хидролиза протеина

• Добијају се мономерне јединице, протеинске аминокиселине.• Поступци за хидролизу протеина:

a. Кисели поступак

b. Базни поступак

c. Хидролиза под утицајем протеолитичких ензима

H

OH

протеолитички ензими

Казеин из млека

45

Хидролиза протеина помоћу киселина

• Хидролиза се врши у присуству 5-6 M HCl или 5-6 M H2SO4

• инертна атмосфера• 12-72 h, у зависности од стабилности пептидне везе (између Val, Leu, Ile)• Недостатак је распадање појединих АК

Thr, Ser се разлажу 10-20% Аsn, Gln преводе се у Asp, Glu Cys до H2S

Тrp, Thr се потпуно разлажу Phe, Tyr – НЕЕНЗИМСКО ТАМЊЕЊЕ

46

Хидролиза протеина помоћу база

• Хидролиза се врши у присуству 5-6 M Ba(OH)2 или 5-6 M Ca(OH)2

• инертна атмосфера• Под притиском од 5-7 x 107 Pa• 6-7 h, у зависности од стабилности пептидне везе • Недостатак је распадање појединих АК

Ser до Ala и Gly Thr до Ala, Gly и Abu (γ-аминобутерна киселина) Arg до Orn и Cyt Cys до H2S

47

Хидролиза помоћу протеолитичких ензима

• Врши се помоћу протеолитичких ензима и за потпуну хидролизу протеина потребна је сукцесивна хидролиза уз употребу већег броја ензима

• Врши се раскидање тзв. пептидне везе, те су протеолитички ензими по типу С-N хидролазе

• Добијају се високо пречишћени производи и то искључиво L-аминокиселине

• Поступак је скуп али се користи за потребе фармацеутске, козметичке, индустрије хране

N C

O

H Протеазе: пепсин трипсин химотрипсин

папаин

Пептидазе: леуцинаминопептидаза карбоксипептидаза А карбоксипептидаза Б

48

Микробиолошкипоступци добијања

• Коришћење високоспецифичних облика микроорганизама који се развијају на хранљивој подлози

• Извор угљеника је уреа

• Неорганске соли као извор азота, NH4+, NO3

-

• Факори раста: биотин, витамини B1, B2 и B6• Пример: добијање Glu из

• Micrococcus, • Corynebacterium, • Brevibacterium, • Microbacterium

49

Хемијске реакције аминокиселина

декарбоксилација

деаминација

трансминација

естерификација

R CH COOH

NH2

R CH2 NH2

CO2

R CO

H

R CO

OHNH3 CO2

NADH+ + H+ NAD+

R1 C COOH

O

R1 CH COOH

NH2

R C COOH

O

+

R CH COOEt

NH2

EtOH

H

декарбоксилаза

биогени амин

деаминазадекарбоксилаза

дехидрогеназа

трансаминаза

50

Реакције амино групе

R CH COOH

NH2

R CH COOHHNO2

OH

+ H2O + N2

R CH COOH

NH2

(CH3)2SO4R CH COOH

N(CH3)3

R CH COOH

NH2

R CH COOH

NH

OR1

Cl

OR1

оксидација

алкиловање

ациловање

51

Идентификација аминокиселина

• Хроматографија на танком слоју силика-гела (TLC)• Спектрофотометријска идентификација (UV-Vis) • Инфрацрвена спектроскопија (IR)• Нуклеарна магнетна резонанаца (NMR)• Масена спектрометрија (MS)• Ензимско одређивање

52

R CH COO

NH3

O

O

OH

OHR C

O

HNH3 CO2

O

O

H

HO+ + +

O

O

OH

OHN +

O

O

H

HOH

HH

+

O

O

N

O

O

O

O

OH

OH

+HN

COOH

O

O

N

3 H2O

нинхидринхидридантин

λmax = 570 nm

λmax = 440 nm

53

TLC – танкослојна хроматографија

Tанки слојSiO2 наалуминијуму или стаклу

стартна мрља

када за хроматографију

елуент

iButOH:Acc(glac): H2O = 4:1:1

фронт растварача

а1

а2

а6

а3

а4

а5

54

UV-Vis спектрофотометрија

Lambert-Beer-ов законС

А

А

λmax

Добијају се карактеристични апсорбциони спектри који се користе за идентификацију нарочито ароматичних аминокиселина

55

IR спектроскопија

HC CH COOH

NH2OH

H3CHC CH COOH

NH2

H3C

CH3

56

NMR спектоскопија

H2C CH COOH

NH2SH

57

MS (масена спектрометрија)

H2C CH COOH

NH2SH

58

Ензимско одређивање

• Волуметријске методе уз помоћ ензима

• Glu, gекарбоксилаза CO2

• Arg, уреаза карбамид

• Lys, Tyr, Orn, gекарбоксилаза CO2

• His, хистиgиназа NH3

59

КРАЈ