Analize citogenetice la pacienții cu hipostatură: evaluarea cauzelor

determinante

Coordonatori: Absolvent:Conf. Dr. Viorica COȘIER Paula Petronela GROZAAsist. Dr. Diana MICLEA (UMF Cluj)

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară

Facultatea de Zootehnie şi Biotehnologii Cluj-Napoca

2014

CUPRINS

PARTEA IDocumentare

științifică1. INTRODUCERE2. HIPOSTATURA3. GENA SHOX4. EVIDENȚIERA

MUTAȚIILOR GENEI SHOX

PARTEA IICercetări personale

5. IPOTEZE și SCOP 6. STUDIUL I 7. STUDIUL II 8. STUDIUL III 9. STUDIUL IV 10. PERSPECTIVE

INTRODUCERE

IMPORTANTA: SHOX – factor genetic de importanță majoră în creșterea și dezvoltarea organismelor, mutațiile acesteia cauzează – hipostatură.

- Aplicarea precoce a tratamentului în vederea corectării defectului de creștere.

SCOP: Studierea posibilelor anomalii numerice și structurale ale cromozomului de sex X care cauzează

hipostatura, în special a mutațiilor genei SHOX.

TEMA: Evaluarea cauzelor determinate ale hipostaturii

Conceptul de hipostatură

- un individ cu înălțime sub media persoanelor același sex și aceeași vârstă.

- 3% din totalul populației globale

CLASIFICARE

a) Primară b) Secundarăc) Idiopatică

Sursa: http://www.gfmer.ch

Sursa: http://internalmedicine.pagesperso-orange.fr/madelung.htm

LANGER

LERI-WEILL

TURNER

GENA SHOXRegiuniile pseudoautozomale

blocuri de secvențe identice de pe heterozomi;

- 2 astfel de regiuni la oameni;

- PAR1 – 2.7Mb, 500 kb de telomeri

- PAR2 – 0.33Mb;- Conțin 29 gene cu ereditate

pseudoautozomală.- O singură genă cauzatoare

de boli

MUTAȚII 59 de mutații - pozitionate pe toate lungimea genei. Pot fi: Deleții – 70 %, Substituții, Inserții.

100% - cazurile de Sindrom Turner 70-80% - cazurile de Discondrosteoză Leri – Weill 2-15% - cazurile de hipostatură idiopatică

EVIDENȚIERA MUTAȚIILOR

Tehnici

Bazate pe PCR - MLPA

Bazate pe HIBRIDARE - FISH

CERCETĂRI PERSONALE

Cariotipare -

MONOSOMII

Evidențiere deleții-

SHOX

STUDII: 1 - BIOINFORMATIC

3 - CLINICE – CITOGENETICE

DEPARTAMENTUL DE GENETICĂ – UMF CLUJ

Evidențiere –

MOZAICISME

Studiul BioinformaticGENA SHOX UMANĂ

• Familia de gene SHOX – SHOX și SHOX 2 Datele de identificare a genelor

SHOX în bazele de date: - ID de identificare 6473 (NCBI) - Numărul de acces ENSG00000185960 (EMBL) - Sinonime: SS; GCFX; PHOG; SHOXY. - Acces referințe secvență genomică: NC_000023.11. - Secvenţa genomică - 35068 nucleotide, - Regiunea genomică cuprinsă între poziţiile 624344..659411. - SHOX2 - ID 6474 (NCBI), - Localizare: 3 în poziţia q25.32, - Coordonatele genomice (GRCh37): 3:157,813,799 - 157,823,95.1 - Sinonime: OG12; SHOT; OG12X.

Asamblarea exomului – transcriptul primar al SHOX a

Studiile Clinice – Citogenetice

I. Evidențierea absenței cromozomului X

OBIECTIV: Evidențierea absenței unui

cromozom X

Material : Sânge periferic de la 22 de paciente cu hipostatură

Metodă : Cariotiparea clasică

Rezultate: Confirmare absență cromozom X – 4 paciente

METODĂCariotiparea standard

Etape

1. Recoltare sânge venos : 5 ml sânge venos de la 10 paciente cu hipostatură

2. Cultura celulară: tuburi Chromosome kit P – 7 ml mediu complet + factor mitogen + 800 µl sânge termostat 37 C, 72 h.⁰

3. Blocarea în metafază: 100 µl colchichină termostat 37 C, 5% ⁰CO₂ , 40 minute.

4. Şoc hipoton: soluţie hipotonă KCl 0,075M centrifugare tuburi (5min. – 1500 RPM)... 10 ml KCl 0,075M (37 C) termostat ⁰37 C, 5% CO₂, 20 min.⁰

5. Fixarea : metanol+acid acetic glacial (3:1)

6. Etalare

7. Colorare – Giemsa

REZULTATECariotip normal - 18 paciente

Cariotip TURNERIAN 4 paciente.

II. Observarea mozaicismelor la pacientele cu cariotip normal

OBIECTIV: Observarea mozaicismelor

Material: Sângele periferic de la 18 paciente cu cariotip normal

200 de interfaze – 15 metafazeMetodă:

Tehnica FISH – sondă centromerică pentru cromozomul X

Rezultate: Absența mozaicismelor

Material și metodă Microscopul în epifluorescență

Zeiss

Pretratamentul lamelor Tratementul lamelor

Lame

REZULTATE

Tehnica FISH

III. Evidențierea delețiilor genei SHOX

Rezultate: o Nu s-a observat nici o deleție a genei SHOX prin

tehnica utilizată.

OBIECTIV: o Evidențierea existenței deleției genei SHOX

Material: o Sângele perifieric de la cele 18 paciente

o 200 interfaze – 15 metafazeMetodă:

o Tehnica FISH – sondă de locus specifică regiunii SHOX o Semnal fluorescent – ROȘU

Semnalul roșu pentru locusul SHOX

REZULTATE

CONCLUZII

Testarea genetică în cazul hipostaturii este foarte importantă pentru stabilirea tratamentului adecvat.

Tehnica FISH – nu prezintă o sensibilitate ridicată decât pentru delețiile de mari dimensiuni.

Utilizarea, pe viitor, a unor tehnici de înaltă precizie – cum ar fi MLPA.

VĂ MULȚUMESC

PENTRU ATENȚIE !!!