Anela Topĉagić Lejla Klepo Ismet Tahirović za organsku hemiju i... · 2020. 2. 21. · BIOHEMIJA II LABORATORIJSKE VJEŽBE (INTERNA SKRIPTA) Student:_ Grupa:_ Sarajevo,

Anela Topĉagić

Lejla Klepo

Ismet Tahirović

BIOHEMIJA II

LABORATORIJSKE VJEŽBE

(INTERNA SKRIPTA)

Student:____________________________

Grupa:___________________

Sarajevo, 2016.

BIOHEMIJA II–laboratorijske vjeţbe

2

Vježba broj 1

ODREĐIVANJE SADRŽAJA ASKORBINSKE KISELINE

U UZORKU VOĆNOG SOKA

1. TEORETSKI DIO

Vitamini su spojevi prisutni u hrani ţivotinjskog i biljnog porijekla u malim količinama

koji su neophodni za rast i odrţavanje organizma. Iako su po hemijskom sastavu i fiziološkim

ulogama u organizmu heterogeni spojevi, vitamini ipak imaju nekoliko zajedničkih osobina.

Prema rastvorljivosti u vodi ili uljima dijelimo ih na hidrosolubilne i liposolubilne vitamine.

Vitamini topljivi u vodi (hidrosolubilni) su:

Vitamini B kompleksa (B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12)

Vitamin C

Vitamin H

Vitamini topljivi u ulju (liposolubilni) su:

Vitamin A

Vitamin D

Vitamin E

Vitamin K

Vitamini su uglavnom proizvodi biljaka i nekih mikroorganizama. U organizam se

unose u malim količinama – neki i u mikrogramskim količinama. Poslije resorpcije deponuju

se u nizu organa, a prije svega u jetri. Zbog toga i mnoge ţivotinjske namirnice-jetra i drugi

unutrašnji organi, riblje ulje, mlijeko, jaja itd., sluţe kao izvor vitamina. U organizmu vitamini

imaju vaţne fiziološke uloge. Mnogi od njih ulaze u sastav koenzima mnogih enzima u

organizmu ili su neophodni za plodnost, razvoj embriona i fetusa, za procese rasta i razvoja, za

pravilno sazrijevanje eritrocita, za pravilan razvoj i strukturu epiderma i epitela.

Nedostatak vitamina u hrani dovodi do odreĎenih poremećaja u organizmu, koji su

specifični za svaki vitamin. Primijećeno je da koţa osobito osjetljivo reagira na pomanjkanje

različitih vitamina. Hipervitaminoze su poznate kod nekih vitamina topljivih u ulju (A, D). One

su gotovo uvijek posljedica pogrešnog doziranja pri terapiji vitaminima. U normalnim uvjetima

prehrane praktično ne postoje avitaminoze, iako su one uvijek posljedica jednostrane prehrane.

Klinički su vaţnije, hipovitaminoze, tj. relativno stanje pomanjkanja vitamina koje još ne

dovodi do klasične slike bolesti. Kod nekih vitamina organizam sisavaca moţe provesti

posljednji stupanj sinteze, tj. moţe prevesti provitamin u sam vitamin. U tim slučajevima

(vitamin A) potreba se najvećim dijelom pokriva uzimanjem provitamina. Pokriću normalne

potrebe za vitaminima znatno pridonose bakterije crijeva koje moramo smatrati simbiotima.

Npr. potrebu čovjeka za vitaminom K u znatnoj mjeri pokrivaju bakterije.


3

Tabela: Pregled i hemijske strukture vitamina

Naziv

vitamina Hemijska struktura

Hemijski naziv

vitamina

Preporučene

doze Uloga u organizmu

Bolest usljed

nedostatka

vitamina

B1 N

N

NH2

CH3

N+

S

CH3

OH

Cl-

Tiamin 1,2 mg

Dekarboksilacija,

transfer

aldehidne grupe

Beriberi

B2 N N

NNH

O

O

OH

OH

OH

OH

CH3

CH3

H

H

H

HH

Riboflavin 1,3 mg Reakcije

redukcije Ariboflavinoza

B3

N

O

NH2

Nikotinamid,

Nikotinska

kiselina 16,0 mg

Reakcije

redukcije Pelagra

B5

O

ONH

OH

OHCH3

CH3

OH

Pantotenska

kiselina 5,0 mg

Prenos acilne

grupe Parestezija

B6

NOH

CH3

OH

OH

Piridoksin 1,3–1,7 mg Prenos amino

grupe

Anemija

periferne

neuropatije

http://en.wikipedia.org/wiki/Riboflavin

http://en.wikipedia.org/wiki/Riboflavin

http://en.wikipedia.org/wiki/Niacin

http://en.wikipedia.org/wiki/Pellagra

http://en.wikipedia.org/wiki/Pantothenic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Pantothenic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Paresthesia

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_B6


4

B7 S

NH

NHOH O

H

H

O

Biotin 30,0 µg Reakcija

karboksilacije Dermatitis

B9 N

NH

N

N

NHO

O

O

NH2

NH

O OH

OH

Folna

kiselina 400 µg Prenos C1 grupe

Megaloblastična

anemija

B12

N

Co+

N

N

N

NN

O

PN

OO

-

OO

NH

O

O

O

O

OH

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

NH2

NH2

NH2

CH3

NH2

NH2

NH2

CH3CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

HH

H

H

Kobaltamin 2,4 µg Intramolekularna

premještanja

Perniciozna

anemija

http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin

http://en.wikipedia.org/wiki/Biotin

http://en.wikipedia.org/wiki/Dermatitis

http://en.wikipedia.org/wiki/Folic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_B12

http://en.wikipedia.org/wiki/Megaloblastic_anemia


5

C

O

OH OH

O

OH

OH

Askorbinska

kiselina 90,0 mg Hidroksilacija Skorbut

A OH

CH3

CH3CH3CH3 CH3

Retinol 900 μg Vid, rast i

reprodukcija

Noćno sljepilo,

kseroftalmija

D

CH2

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

H

Kalciferol 5,0 µg–

10 µg

Metabolizam

kalcija i fosfora Rahitis

E O

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

Tokoferol 15,0 mg Lipidni

antioksidant Mišićna slabost

K

O

O

CH3

CH3

CH3CH3

CH3CH3

Menakinon 120 µg Zgrušavanje krvi

Usporeno

zgrušavanje

krvi

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C

http://en.wikipedia.org/wiki/Ascorbic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Scurvy

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_D

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E

http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_K

http://en.wikipedia.org/wiki/Bleeding_diathesis


6

L-askorbinska kiselina (vitamin C)

Pod vitaminom C podrazumijeva se L-askorbinska kiselina. Vitamin C je ketolakton

sa šest ugljikovih atoma, pa je po strukturi jako sličan glukozi i topiv je u vodi. To je

kristalni spoj, vrlo kiselog karaktera, ima sposobnost reverzibilnog prelaska iz keto u enolni

oblik, te igra ulogu oksidaciono-redukcionog sistema. Najbogatiji izvori su šipak, limun,

paprika, kao i drugo svjeţe voće i povrće. Osim biljaka, mogu ga sintetizirati i mnoge

ţivotinjske vrste. Ljudski organizam nije u mogućnosti da sintetizira vitamin C, te ga

čovjek mora unositi hranom .

Rastvori askorbinske kiseline su nestabilni, jer podlijeţu razgradnji u prisustvu

oksidacijskog sredstva, a pogotovo molekulskog kisika. Oksidacijom L-askorbinska

kiselina prelazi u formu L-dehidroaskorbinske kiseline, koja zadrţava vitaminska svojstva,

a daljnjom oksidacijom i prelaskom u 2,3-diketogulonsku kiselinu gubi se vitaminska

aktivnost. Oksidaciju L-askorbinske kiseline potiču i svijetlo, reakcije u baznoj sredini i

teški metali (Fe, Cu, Ag). Oksidaciju u biološkom materijalu kataliziraju i razni enzimi.

Obzirom da oksidacijom L-askorbinske kiseline nastaju inaktivni spojevi, koji ne posjeduju

vitaminsko djelovanje, tokom obrade potrebno je paziti na uslove rada i time smanjiti

njenu razgradnju. Kako je L-askorbinska kiselina termolabilna, povišene temperature

takoĎer pospješuju razgradnju. Kuhanjem namirnica pri visokim temperaturama dolazi do

njene razgradnje. Reaguje kao reducent u mnogim biološkim procesima. Vaţna je za

sintezu kolagena i karnitina, kao i za sintezu hormona serotonina i adrenalina, te za

metabolizam masnih kiselina.

Postoji veliki broj metoda odreĎivanja sadrţaja vitamina C. Spektrofluorimetrijska

metoda za kvantifikaciju vitamina C zasniva se na njegovoj oksidaciji u L-

dehidroaskorbinsku kiselinu, koja u reakciji sa o-fenilendiaminom (OFDA) u baznoj sredini

daje N-heterociklični spoj sa velikim brojem konjugiranih π-veza, koji moţe emitovati jaku

fluorescenciju. Intenzitet fluorescencije nastalog spoja proporcionalan je koncentraciji i

mjeri se pri talasnoj duţini ekscitacije oko 350 nm i emisije oko 430 nm.

Mehanizam fluorescirajuće reakcije odreĎivanja vitamina C


7

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni reagensi:

o Askorbinska kiselina (AK) (radna koncentracija): 0,100 g AK otopiti u 100 ml

destilovane vode (1mg/ml) i čuvati u tamnoj reagens boci.

o o-fenilendiamin (OFDA): 0,5 g OFDA otopiti u 100 ml 0,1 mol/l HCl i čuvati u

tamnoj reagens boci na 4 °C.

o Pufer NH3-NH4Cl (pH 9,4): 13,5 g NH4Cl i 15,75 ml amonijaka otopiti u 100 ml

destilovane vode. Zatim se doda rastvor 0,1 mol/l NaOH, da bi se dobio optimalan

pH otopine (provjeriti pH metrom)

Upotrebom radne koncentracije, pripremiti u odmjernim sudovima od 10 ml standardne

otopine AK slijedećih koncentracija: 0,5; 1; 5; 10; 30; 50 i 70 μg/ml.

Izvagati 1g uzorka voća ili povrća i macerirati sa 9 ml destilovane vode, a potom ga

centrifugirati pri 15 000obr/min, 15 minuta. Od dobijenih supernatanata pripremiti deset

puta razblaţeniji uzorak. U slučaju uzorka voćnog soka, uzorak samo centrifugirati prema

istim uslovima i razblaţiti na isti način kao uzorak voća ili povrća.

Ovako pripremljeni rastvori AK i uzoraka se koriste za mjerenje. Rastvori se miješaju po

slijedećem redoslijedu: 1 ml AK, 1,0 ml 0,5% OFDA, 1,5 ml pufera NH3-NH4Cl. Rastvor

se dopuni do 10 ml s destilovanom vodom, dobro izmiješa i ostavi da stoji 5 minuta prije

mjerenja. Intenzitet fluorescencije se mjeri u kvarcnoj kiveti od 1 cm pri talasnoj duţini

ekscitacije od 330 nm i talasnoj duţini emisije od 430 nm.

Izračunati koncentraciju AK u uzorku i rezultat izraziti kao mg/100 ml uzorka ili kao

mg/100 g uzorka.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koji od navedenih vitamina, kao strukturne elemente, sadrţi izoprenske fragmente:

a) vitamin E

b) vitamin A

c) nikotinska kiselina

d) vitamin K

2. Koji od navedenih vitamina je derivat sterola:

a) vitamin B12

b) vitamin D

c) vitamin A

d) vitamin B2

3. Kakva je hemijska struktura askorbinske kiseline:

a) derivat sterola

b) derivat izoaloksazina

c) amid piridin-3-karbonske kiseline

d) lakton dienilgulonske kiseline (2-keto-L (-)-gulonkiseli-γ-lakton)

4. Spojite vitamine sa ponuĎenim odgovorima

A. Nikotinamid a. Sadrţi prsten tiazola

B. Tiamin b. U organizmu ţivotinja sintetizira se iz triptofana


8

C. Pantotenska kiselina c. Učestvuje kao koenzim u reakcijama transaminacije

i dekarboksilacije aminokiselina

D. Piridoksalfosfat d. Ulazi u sastav koenzima A

5. Vitamini A i D se mogu uzeti odmah, u jednoj dozi, u takvoj količini da je dovoljna

za odrţavanje njihove normalne koncentracije u toku nekoliko sedmica. Vitamine B

grupe neophodno je uzimati znatno duţe i češće. Zašto?

_________________________________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

6. Ako je dnevna potreba za vitaminom C 75 mg, koliko mg ili g ispitivanog uzorka je

potrebno uzeti da bi se zadovoljila dnevna potreba za vitaminom C?


9

4. REZULTATI

Standard / Uzorak Intenzitet fluorescencije

OdreĎivanje sadrţaja vitamina C u uzorku (izraziti kao mg/100 ml uzorka)

OVJERA VJEŽBE:


10

Vježba broj 2

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA I TRIGLICERIDA U

SERUMU ILI PLAZMI

1. TEORETSKI DIO

Ukupni serumski (plazma) lipidi su sastavljeni od triglicerida, fosfolipida,

holesterola, estera holesterola, neesterificiranih masnih kiselina, glikolipida (cerebrozida),

acetilfosfatida (plazmalogena), fosfatidnih kiselina, viših alkohola, karotinoida, steroidnih

hormona, te vitamina A, D, E. Po svojoj vaţnosti, naročito je bitno u uzorcima odrediti

koncentracije triglicerida i ukupnog holesterola.

U analitici ukupnih lipida opisane su gravimetrijske i turbidimetrijske metode,

računske, te kolorimetrijske metode.

Ukupni lipidi plazme (seruma) se odreĎuju spektrofotometrijski, reakcijom sa

vanilinom i fosfornom kiselinom. Pretpostavka je da pri dodavanju koncentrirane sulfatne

kiseline serumu uz zagrijavanje, svi lipidi koji u svojoj strukturi posjeduju dvostruke veze

daju ketone ili ketole. Ovi potom reagiraju sa vanilinom u fosfornoj kiselini uz nastajanje

ruţičasto crvene boje, čiji intenzitet apsorpcije se mjeri izmeĎu 510-550 nm. Reakcija

odreĎivanja ukupnih lipida se odvija u tri stepena:

1. Nezasićena masna kiselina reagira sa H2SO4 stvarajući karbonium jon:

2. Vanilin reagira sa H3PO4 stvarajući aromatski ester:

3. Karbonijum jon reagira s aktiviranom karbonilnom grupom fosfovanilina stvarajući

nabijeni ruţičasto obojeni kompleks, koji se stabilizira rezonancijom i maksimalno

apsorbira kod 525 nm:

Trigliceridi su esteri glicerola i masnih kiselina. Glavni su sastojak ţivotinjskih i

biljnih masti i ulja. Masti nas opskrbljuju velikom količinom energije. Nalazimo ih u


11

masnom tkivu i u masnim kapljicama ostalih ćelija. Zbog toga su masti i ulja vrlo vaţna

skupina spojeva u ljudskoj prehrani. One su rezerva energije neophodne svakom ţivom

organizmu za njegov razvoj i odrţavanje. Vrlo su široko rasprostranjene u prirodi, a osim

biološkog, imaju i veliko tehničko značenje. One sluţe kao sirovina za proizvodnju sapuna,

margarina, raznih maziva, lakova i boja. Maslac i margarin su vrlo česti izvori masti u

prehrani. U probavi hrane, mast se razgraĎuje tek u tankom crijevu. Ţuč, koja dolazi iz

ţučnog mjehura u duodenum (prvi dio tankog crijeva), zajedno s hranom putuje kroz tanko

crijevo i razgraĎuje mast na njene komponente: glicerol i masnu kiselinu. Masna kiselina se

dalje probavlja, a glicerol se metabolizira u jetri.

Trigliceridi se odreĎuju po hemijskom ili enzimskom principu odreĎivanja

glicerola. Samo odreĎivanje triglicerida se sastoji od ekstrakcije, potom odvajanja

fosfolipida i drugih hromogena, te saponifikacije, odnosno ekstrakcije, nakon čega slijedi

direktno odreĎivanje glicerola. Faza ekstrakcije se izvodi u rastvaračima poput metanola,

etanola, izopropanola ili hloroforma. Svi ovi rastvarači dovode do denaturacije lipoproteina,

dakle disocijacije vezanih triglicerida. Interferirajuće supstance se mogu ukloniti na dva

načina i to korištenjem adsorbensa poput zeolita, salicilne kiseline ili aktivnog magnezij-

silikata ili pak korištenjem nonana ili heksana. Glavne interferirajuće supstance koje se

mogu ukloniti na ovaj način su fosfolipidi i glukoza zajedno sa nekim hromogenima i

ponekad sa slobodnim glicerolom. Druga faza u sklopu ovih postupaka uključuje hidrolizu

triglicerida na glicerol i masne kiseline i obično se izvodi sa etanolnim rastvorom kalij-

hidroksida pri visokim temperaturama (saponifikacija). U trećoj fazi dolazi do oksidacije

glicerola u formaldehid, koji se prevodi u reakciji sa acetilacetonom u obojeni spoj.

OdreĎivanje triglicerida se moţe prikazati hemijskim reakcijama u tri stepena:

Prvi stepen:

CH2

CH

CH2

O

O

O

C

C

C

O

O

O

R

R

R

+ K OH

CH2

CH

CH2

OH

OH

OH

+ RCOOK3 3

Drugi stepen:

CH2

CH

CH2

OH

OH

OH

+ NaJO4 C

O

H H + NaJO3 + H2O3

Treći stepen:

Holesterol je najprisutniji sterol u organizmu, koji po svom hemijskom sastavu

sadrţi ugljikov skelet ciklopentanoperhidrofenantrena.


12

Struktura holesterola

Porijeklo holesterola u organizmu je dvojako, većina ćelija sintetizira holesterol, a drugi

njegov izvor je hrana kojom se unosi. Oko 2/3 holesterola nastaje sintezom u organizmu

(kod odrasle osobe oko 800-900 mg/dan), a svega 1/3 se unosi hranom (oko 150-300

mg/dan). Djeci je potrebna proporcionalno veća količina, što se opravdava njegovom

značajnom ulogom kao strukturnog elementa svih ćelijskih i unutarćelijskih membrana.

Najveći dio holesterola nastaje u jetri, a do njegove sinteze moţe doći i u sluzokoţi crijeva i

nadbubreţnim ţlijezdama. Odatle se putem krvotoka transportuje do ćelija organizma.

Pošto je nerastvorljiv u vodi, u krvi se holesterol transportuje tako što se veţe za proteine

gradeći lipoproteine. Postoji više vrsta ovih lipoproteina i dijele se prema gustoći na:

VLDL (Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini vrlo male gustoće

LDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini male gustoće

HDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini velike gustoće

Lipoproteini sa dosta lipida imaju niţu gustoću.

U krvi holesterol je prisutan u slobodnom i esterificiranom obliku vezan sa jednom

molekulom masne kiseline. Esterifikacija holesterola odigrava se u plazmi pod djelovanjem

enzima lecitin-holesterol-acetiltransferaze (LHAT), koji se nalazi u krvnoj plazmi. U

plazmi je pribliţno 75 % ukupnog holesterola esterificirano najčešće nezasićenim masnim

kiselinama, (od toga 55 % linolnom kiselinom). Eliminacija holesterola iz organizma se

vrši preko ţuči (konverzijom u holne kiseline), perutanjem koţe, mala količina se gubi

urinom, dok ţene koje doje gube nešto holesterola preko mlijeka.

Holesterol je neophodan za normalno funkcioniranje svake ćelije, kao bitan

strukturni element. Specifične uloge holesterola su:

Sinteza ţučnih kiselina u hepatocitima

Sinteza steroidnih hormona u kori nadbubreţnih i polnih ţlijezda

Transport liposolubilnih vitamina (A, D, E i K)

Štetno djelovanje holesterola se ispoljava kada je u krvi prisutan u znatno većim

količinama. Povećanje LDL-a, a time i holesterola u krvnoj plazmi dovodi do povišenog

ulaska estera holesterola u ćelije krvnih sudova, gdje dolazi do taloţenja estera holesterola,

što moţe da dovede do začepljenja krvnih sudova, smanjenja njihove prirodne elastičnosti,

a u kasnijim stadijima, formiranja tromba i infarkta miokarda.

Prilikom uklanjanja holesterola iz organizma slobodni holesterol dospijeva u ţuč u

kojoj je nerastvorljiv. On se u ţuči inkorporira u micele koje čine lecitin i ţučne soli. Ove

micele imaju ograničen kapacitet rastvaranja holesterola. Kod ljudi sa kamenom u ţučnoj

kesi dolazi do formiranja abnormalne ţuči, koja postaje prezasićena holesterolom. Pod

djelovanjem različitih faktora dolazi do viška taloţenja holesterola u vidu kristala. Ako se

kristali ne izluče u crijevo, narastaju i formiraju kamenje.

Metode odreĎivanja holesterola su spektrofotometrijske, enzimske i

hromatografske. Najčešće se primjenjuje Liberman-Burchard-ova metoda odreĎivanja, gdje

holesterol u bezvodnoj sredini sa anhidridom acetatne kiseline i koncentriranom sulfatnom


13

kiselinom daje nezasićene visokomolekularne ugljikovodike, plavozelene boje, tzv.

halokrome. Intenzitet nastale boje direktno je srazmjeran koncentraciji holesterola i mjeri se

fotometrijski. Acetatna kiselina i anhidrid acetatne kiseline sluţe kao rastvarači i

dehidratacijska sredstva, jer se reakcija odvija u bezvodnom mediju, a sulfatna kiselina

dehidrira i ujedno oksidira holesterol.


14


2.1. ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA

Potrebni reagensi:

- Sulfatna kiselina, koncentrirana

- o-fosfatna kiselina, p.a.

- Vanilin 0,008 M vanilina (C8H8O3, Mr 152,15) otopi se u 100 ml redestilirane vode

- Fosfovanilinski reagens: fosfatna kiselina 11,9 M i vanilin 0,008 M, 1 dio fosfatne

kiseline pomiješa se s 1 dijelom (1:1) otopine vanilina. Reagens je stabilan u tamnoj

boci na sobnoj temperaturi 2 sedmice

- Standard maslinova ulja, 1 g maslinova ulja/100 ml etanola.

Otopine su stabilne jednu godinu na sobnoj temperaturi, ako su zatvorene. Otopine

treba čuvati u tamnim bocama.

U epruvete s brušenim staklenim čepom otpipetira se:

_________________________________________________

Proba Standard

_________________________________________________

Serum 50 μl -

Standard lipida - 50 μl

H2SO4 2,0 ml 2,0 ml

Sulfatna kiselina dodaje se tako da se pokupe svi tragovi seruma na zidovima epruvete na

dno. Epruvete se stave 10 minuta u ključalo vodeno kupatilo i ohlade u hladnoj vodi.

U nove epruvete se otpipetira:

Smjesa analize: 100 μl - -

Smjesa standarda lipida: - 100 μl -

Fosfovanilinski reagens: 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

Miješati i ostaviti da stoji 30 min. a nakon toga se mjeri apsorpcija (A) probe i standarda

lipida prema slijepoj probi kod 530 nm u kiveti od 1 cm.

Odrediti sadrţaj ukupnih lipida u uzorku seruma, a rezultat izraziti kao g/L.

Referentne vrijednosti ukupnih lipida: 4 do 8 g/l.

2.1. ODREĐIVANJE TRIGLICERIDA

Potrebni reagensi:

- n-heptan;

- izopropanol;

- sulfatna kiselina, 0,04 mol/L;

- acetatna kiselina, 1 mol/L;

- kalij-hidroksid 6,25 mol/L;

- rastvor metaperjodata: rastvoriti 3 g natrij-metaperjodata i 25 mL glacijalne acetatne

kiseline u destiliranoj vodi i dopuniti vodom do 500 mL;

- amonij-acetat, 2 mol/L;


15

- rastvor acetilacetona: rastvoriti 0,75 mL acetilacetona i 2,5 mL izopropanola i

dopuniti do 100 mL 2,0 mol/l rastvorom amonij-acetata. Rastvor čuvan u tamnoj

boci stabilan je mjesec dana na +4 °C;

- standard: maslinovo ulje.

Pipetirati u epruvete sa brušenim zatvaračima prema priloţenoj tabeli:

1. Ekstrakcija

Slijepa proba Standard Uzorak

Destilirana voda 0,5 mL

Standard 0,5 mL

Serum 0,5 mL

n-heptan 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Izopropanol 3,5 mL 3,5 mL 3,5 mL

Sulfatna kiselina 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Miješati na vorteksu oko 30 s i sačekati da se odvoje slojevi.

2. Saponifikacija i oksidacija

Na 0,4 mL heptanskog sloja (gornji sloj) dodati 2 mL izopropanola i kap KOH. Dobro

promiješati i inkubirati na 70 °C u trajanju od 10 min. Nakon toga dodati 0,2 mL reagensa

NaJO4 i 1 mL reagensa acetilacetona. Dobijeni rastvor dobro promiješati i inkubirati na 70

°C u trajanju od 10 min. Nakon toga, smjesu ohladiti na sobnu temperaturu. Dobijenom

rastvoru mjeriti apsorbansu na 425 nm. Boja je stabilna oko sat vremena. Standardne

rastvore čije koncentracije idu do 2 g/L tretirati na isti način. Na osnovu dobijenih

vrijednosti apsorbansi za standard triglicerida, konstruirati kalibracionu krivu i pomoću

jednačine pravca odrediti sadrţaj triglicerida. Sadrţaj triglicerida izraziti kao g/L.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. OslobaĎanje masnih kiselina u toku posta ide iz kog organa:

a) Jetre

b) Masnog tkiva

c) Epitela tankog crijeva

d) Limfe

2. Koji se proces naziva saponifikacija masti:

a) Enzimska hidroliza

b) Alkalna hidroliza

c) Hidrogenizacija

d) Reakcija sa olovo-acetatom

e) Emulzifikacija masti

3. Kakvom pretvaranju podlijeţe glicerol koji nastaje u prvoj etapi pri razgradnji

triacilglicerola:

a) Redukciji

b) Oksidaciji

c) Metiliranju

d) Fosforiliranju

e) Aciliranju


16

4. Koji od navedenih lipoproteina se karakterizira kao „loši“ holesterol:

a) LDL

b) HDL

c) Hilomikroni

d) IDL

5. Koji se od vitamina ponašaju kao lipidi:

a) vitamin C

b) vitamin K

c) vitamin A

d) vitamin E

e) vitamin D

6. Koji sastojci ćelije sadrţe fosfolipide:

a) mijelinski omotač nervnih ćelija velikog mozga

b) hijeloplazma

c) kompleks membrana

7. Objasniti ulogu sulfatne kiseline u reakciji odreĎivanja ukupnih lipida?

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________


17

4. REZULTATI

- OdreĎivanje koncentracije ukupnih lipida (rezultat izraziti kao g/L)

Uzorak Apsorpcija (A)

- OdreĎivanje koncentracija triglicerida (rezultat izraziti kao g/L)


OVJERA VJEŽBE


18

Vježba broj 3

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE HOLESTEROLA PO

LIBERMANN-BURCHRD-U

1. TEORETSKI DIO

Holesterol pripada grupi supstanci koje nazivamo steroidi. Oni u svojoj strukturi imaju

ciklopentanoperhidro fenantrenski prsten. On je veoma vaţan za normalno funkcionisanje

organizma jer predstavlja jednu od esencijalnih komponenti membrana svih ţivotinjskih

ćelija, prekursor je u biosintezi ţučnih kiselina kao i prekursor u biosintezi steroidnih

hormona.

OdreĎivanje ukupne koncentracije holesterola implicira odreĎivanje esterificiranog i

nesterificiranog holesterola. U serumu (plazmi) oko 2/3 ukupnog holesterola se javlja u

esterificiranoj formi, a ostatak u slobodnoj formi.

U analitici holesterola javljaju se tzv. jednostepene, dvostepene, trostepene i četverostepene

metode. Kod jednokratnih metoda ne postoji u klasičnom smislu te riječi ono što se naziva

pripremanje uzorka, to znači da ne postoji izolacija i pročišćavanje steroida. Kod ovih

metoda jedan reagens je dovoljan za manipulaciju sa uzorkom. S toga su ove metode jako

pogodne za automatizaciju.

Kod dvostepenih metoda potrebno je uraditi ekstrakciju u organskoj fazi prije mjerenja

holesterola i drugih njemu sličnih steroida. Ova procedura uklanja nespecifične

hromatogene koji mogu inferferirati.

Trostepene metode se od dvostepenih razlikuju po tome što pored ekstrakcije holesterola

ovdje imamo zastupljen i proces saponifikacije koji obezbjeĎuje hidrolizu

masnokiselinskog ostatka od holesterolskog estra. Uslijed toga mjeri se samo slobodni

holesterol.

Kod četvorofaznih metoda pored metode esterifikacije, saponifikacije i razvijanja boje

imamo i purifikaciju holesterola koja se postiţe dodavanjem saponina, digitronina.

LIEBERMANN-BURCHARD-OVA REAKCIJA

Ova reakcija se izvodi u jako kiseloj sredini koju obezbjeĎuju sulfatna kiselina, acetatna

kiselina i acetat anhidrid. Holesterol u bezvodnoj sredini sa anhidridom acetatne kiseline i

koncentrovanom sulfatnom kiselinom daje nezasićene visokomolekularne ugljikovodike,

plavozelene boje, tzv. halokrome ( Liberman-Burchard-ova reakcija ). Intenzitet nastale

boje direktno je srazmjeran koncentraciji holesterola i mjeri se fotometrijski. Acetatna

kiselina i anhidrid acetatne kiseline sluţe kao otapala i dehidratacijska sredstva jer se

reakcija odvija u bezvodnom mediju, a sulfatna kiselina dehidrira i ujedno oksidira

holesterol.

U Liberman-Burchard-ovoj reakciji nastaju plavozeleni polienski kationi i SO2.

U hemijskom smislu holesterol se podvrgava stepenastoj oksidaciji gdje u svakoj fazi

nastaje holestapoilen molekula, koja uvijek ima jednu dvostruku vezu više od supstance od

koje originalno potiče. U prvoj fazi reakcije uključena je protonacija hidroksline grupe

holesterola i gubitak vode tako da se dobije tzv. karbonijum ion ili 3,5 holestadien, čije

dobivanje predstavlja prvu fazu kod razvijanja boje. Stepenasta oksidacija ovog aliličnog

karbonijum jona putem sulfita uzrokuje stvaranje holestaheksan-sulfonske kiseline kao

hromafora koji pokazuje maksimum apsorpcije na 410nm.

Ova klasična metoda doţivjela je niz promjena u smislu da se na istom principu moglo

vršiti odreĎivanje bilo slobodnog bilo esterificiranog holesterola ili pak oba.


19

Liebermann-Bruchard-ova reakcija je kompleksna i ovisi od više faktora poput

koncentracije sulfatne kiseline, vode, sadrţaja acetatne kiseline u anhidridu, rastvarača,

vremena reakcije te uticaja svjetlosti i temperature.

Slika 1: Mehanizam reakcije po Liebermann-Burhardu


Potrebni reagensi:

- holesterol reagens: stabilizirana smjesa acetatne kiseline 5 mol / L, anhidrid

acetatne kiseline 5,87 mol / L, sulfatna kiselina 1,87 mol / L i natrijev sulfat 0,14

mol / L

- Standard holesterola 5,17 mmol/L ( korišten je standard holesterola 2,73 mmol / L

od firme Precinorm U )

Potrebna oprema i pribor:

- spektrofotometar S106 WPA, Velika Britanija

PROCEDURA ZA RAD

a) Priprema reagenasa:

- Holesterol-reagens: u tikvicu od 1 L pomiješa se 150 mL glacijalne acetatne

kiseline i 300 mL anhidrida acetatne kiseline ( CH3CO )2O, Mr 102,09), te se uz

hlaĎenje polahko doda 50 mL koncentrovane sulfatne kiseline. Kad se tekućine

pomiješaju, doda se 10 g bezvodnog natrijevog sulfata (Na2SO4, Mr 142,04) i

miješa se dok se potpuno ne otopi. Reagens se drţi u tamnoj boci. Stabilan je oko

četiri sedmice na + 4 C. Prije upotrebe ga treba dovesti na sobnu temperaturu.

Reagens je bezbojan ; ako se pojavi boja treba ga baciti.

- Standard holesterola: 199,9 mg holesterola (C27H46O, Mr 386,67) otopi se i dopuni

do 100 mL glacijalnom acetatnom kiselinom u odmjernoj tikvici. Neograničeno je

stabilan.


20

b) Eksperimentalna procedura: Paralelno se odreĎuju: slijepa proba, standard i uzorak.

Smjesa se laganim mućkanjem dobro promiješa i ostavi da stoji 20 minuta na sobnoj

temperaturi te izmjeri apsorpcija ( A ) probe i standarda prema slijepoj probi kod 610 nm.

Boja je postojana 30 minuta.

holesterol (mmol / L) = Euzorka / Estandarda x koncentracija standarda

Referentne vrijednosti: 3,36 do 6,72 mmol / L

Napomene: Metoda je nedovoljno specifična jer pored holesterola reagiraju i neki steroli

analogne strukture. MeĎutim , u rutinskom radu metoda uglavnom zadovoljava jer se

interferirajući spojevi nalaze u serumu u vrlo niskim koncentracijama.Tačnost metode se

smanjuje kod hemoliziranih i ikteričnih seruma. Serumi sa više od 1 g / L hemoglobina nisu

upotrebljivi, dok do 0,5 g / L hemoglobina, hemoglobin ne smeta. Normalne koncentracije

bilirubina ne smetaju, dok koncentracija od 85 mmol / L povećava apsorpciju za oko 0,01.

Takve serume treba razrijediti sa 0,15 mol / L NaCl. U odnosu na druge, ova metoda ima

prednosti u jednostavnosti postupka izvoĎenja, povećanoj stabilnosti holesterol-reagensa

dodatkom natrijevog sulfata, smanjenom utjecaju temperature na reakciju i u povećanoj

stabilnosti apsorpcije nastalog produkta. To su razlozi zbog kojih se ova metoda često

izvodi u rutinskom radu i na automatskim analizatorima.

Uzorak Standard Slijepa proba

Holesterol-reagens 4,0 ml 4,0 ml 4,00 ml

Serum 100 μl - -

Standard

holesterola

- 100 μl -

Destilirana voda - - 100 μl


21

3. REZULTATI

- Izvršiti eksperimentalni dio vjeţbe

- Vrijednosti mjerenja apsorpcije


- Koncentracija nepoznatog uzorka

OVJERA VJEŽBE


22

Vježba broj 4

RAZDVAJANJE PROTEINA GEL ELEKTROFOREZOM

(RAZDVAJANJE I IDENTIFKACIJA PROTEINA U UZORCIMA GOVEĐEG

SERUMA NA AGAROZNOM GELU UZ PRIMJENU ISTOSMJERNE ELEKTRIČNE

STRUJE)

1. TEORETSKI DIO

Elektroforeza po svojoj definiciji, je tehnika kojom se razdvajaju naelektrisane

čestice pod djelovanjem homogenog električnog polja. Tom prilikom otopljena čestica

efektivnog naboja q putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem električnog polja prema

jednoj od elektroda, u ovisnosti od prirode njenog naboja. Ovo je jedna od vaţnijih tehnika

u separaciji bioloških molekula, jer obično ne uzrokuje promjene na nivou strukture

molekula koje se separiraju, a osim toga osjetljiva je na male promjene u naboju i masi

makromolekula.

Kretanje molekula u električnom polju predstavlja funkciju naboja q i koeficijenta trenja f.

Brzina koju ostvaruje jedan molekul sa nabojem u električnom polju je funkcija jačine polja

E tako da imamo odnos:

v=f

Eq

v - brzina kretanja molekule (m/s)

E - jačina električnog polja (V/m)

q - naboj molekule

f - koeficijent trenja (Vs/m2)

Pri tome je razdvajanje čestica u električnom polju ovisno i o vremenu.

Kao analitička metoda, elektroforeza je jednostavna, brza i vrlo osjetljiva. U kombinaciji s

drugim tehnikama molekularne biologije, postala je jedna od najčešće primjenjivanih

metoda.

Postoje dva tipa elektroforeze: slobodna i zonska.

Kod slobodne elektroforeze naelektrisani joni se slobodno kreću kroz rastvor sve

dok postoji djelovanje električnog polja. Ovdje se radi o jednom dinamičkom sistemu koji

direktna mjerenja moţe da vrši samo kod onih čestica koje svojom različitom brzinom

putovanja stvaraju mjesta različite gustoće. Za ovu potrebu koristi se U-cijev koja u donjem

dijelu sadrţi uzorak i krajeve koji su napunjeni elektrolitom kako bi se odrţavale oštre

granice prema uzorku. Kretanje uzorka se mjeri pomoću pomjeranja granica u funkciji

vremena. Na ovaj način dolazi do optičke pojave (tzv. šlira), do prelamanja svjetlosti na

granici dvije različite koncentracije i one se registruju posredstvom mjerenja indeksa

prelamanja svjetlosti. Ova tehnika uglavnom se koristi u analizama fizičkih karakteristika

molekula.

Mnogo pogodnija tehnika je tzv. zonska elektroforeza. Naelektrisane čestice se kod ove

tehnike kreću kroz interni potporni medij koji moţe biti filter papir, celuloza-acetat, škrobni

gel, agar gel, poliakrilamid gel... Prednost ove tehnike je i u tome da se razdvojene

supstance u ţeljenom poloţaju mogu stabilizirati, osušiti i hemijski fiksirati. Potporni medij

pri tome ima ulogu da spriječi sve poremećaje vezane za kretanje uzoraka, a osim toga

predstavlja u izvjesnom smislu i molekulsko sito ili pak stabilizirajući medij za pH

gradijent. Napon koji se koristi kod razdvajanja će ovisiti od tipa uzorka i vrste potpornog


23

medija. Tako npr. visoki naponi se koriste za papirne potporne medije uslijed velikog

otpora samog papira. Visoki napon se takoĎer koristi za izbjegavanje problema koji bi

nastali difuzijom i doveli tako do širenja molekula. Sa velikim naponima stvaraju se i veće

jačine struje, dolazi do stvaranja toplote što zahtijeva hlaĎenje sistema. Dodatni problem u

nekim efektivnim potpornim medijima je fenomen elektroendoosmoze u kojem pufer sam

pokazuje elektroforetski učinak i time maskira pokretljivost molekule koja se prati. Ova

pojava se moţe kao takva pripisati efektima kretanja pufera koji se javljaju uslijed

negativno nabijenog potpornog medija i dovode to toga da pufer, kada se izloţi električnom

polju se kreće prema katodi. Proteini su negativno nabijeni i kreću se prema anodi. Drugim

riječima, kada dolazi do ove pojave dolazi do njihovog kretanja suprotno kretanju pufera.

Brzina kretanja pufera se mijenja sa korištenjem različitih potpornih medija. U izvjesnom

smislu efekat elektroendoosmoze se pokazao korisnim, jer pomaţe kod razdvajanja gama

globulina od ostalih proteina. Ova frakcija proteina ima negativan naboj, ali se radi o

molekulama velike molekulske mase tako da naboj koji oni posjeduju nije dovoljan da

anulira efekat kretanja pufera.

Dostupan je širok raspon opreme za elektroforezu, ali u osnovi postoji zajednički

bazni dizajn. Dobro dizajnirana komora treba da spriječi bilo koji stepen isparavanja sa

potpornih medija, da ima učinkovit sistem hlaĎenja kada se koriste gelovi ili tehnike

visokog napona pri čemu je potrebno posebno voditi računa o sigurnosnim prekidačima.

Tipovi elektroforeze su:

ELEKTROFOREZA NA FILTER PAPIRU

ELEKTROFOREZA NA CELULOZAACETATU

ELEKTROFOREZA NA TANKOM SLOJU

KAPILARNA ELEKTROFOREZA

GEL ELEKTROFOREZA

Idealan potporni medij za elektroforezu je hemijski inertan, sa njima se lahko rukuje i u

svakom trenu je moguće kontrolirati poroznost. Iako se papir smatra pravim nosačem kod

separacije aminokiselina, malih peptida, ovaj medij neosporno pokazuje velike nedostatke,

jer se u ovom slučaju poroznost ne moţe kontrolirati. Supstance sa velikim molekulskim

masama poput proteina i nukleinskih kiselina se ne separiraju dobro na papiru, jer celulozna

vlakna pokazuju veliki otpor prema kretanju. Gelovi sa varirajućom poroznošću su idealni

kod separacije visokomolekularnih supstanci jer dozvoljavaju lagano kretanje

makromolekula uz istovremeno spriječavanje konvekcije i uz minimalnu difuziju. Tri tipa

gela se koriste u ovu svrhu: skrobni gel, poliakrilamid gel i agaroza. Aparati mogu biti za

cilindrične gelove i za gel ploče (gdje broj rupica za uzorke se utvrĎuje na osnovu broja

zuba na plastičnom češlju koji se koristi).

Najpoznatiji gelovi koji se koriste u elektroforezi su:

AGAROZNI

ŠKROBNI

POLIAKRILAMIDNI

AGAROZA KAO GEL

Agarozni gelovi se stvaraju tako što se suha agaroza otopi u vodenom puferu, potom zagrije

dok se ne dobije bistri rastvor, a zatim ohladi na sobnoj temperaturi. Agaroza je prirodni

linearni polisaharid graĎen od galaktoze i 3,6-anhidrogalaktoze. Dobija se iz agara.

Visokoporozni gel koji se dobija na ovaj način je pogodan za elektroforezu i za neke

imunološke tehnike. Agaroza se obično koristi pri koncentracijama izmeĎu 1% i 3%.

Agarozni gel se odlikuje relativno velikom veličinom para nakon njegovog hlaĎenja. Ove

pore su stabilizirane vodikovim vezama. Veličina pore se kontrolira početnom

koncentracijom agaroze. Velike pore se stvaraju pri korištenju niskih koncentracija agaroze,


24

a manje veličine se stvaraju prilikom korištenja velikih koncentracija agaroze. Velike pore i

gelovi niskih koncentracija agaroze omogućavaju separiranje vrlo velikih molekula poput

DNK, lipoproteina, imunoglobulina i enzimatskih kompleksa. Agaroza predstavlja

definitivno metod izbora kod pripreme DNK lanca za sekvencioniranje. Fragmente DNK je

pri tome moguće ekstrahirati direktno sa niskotopive agaroze (62 oC-65

oC) nakon

zagrijavanja na 65 oC. Ovaj tip gela vrlo se često koristi za imunoelektroforezu gdje se

separiraju veliki kompleksi antigen-antitijelo, a takoĎer se koristi i kod izoelektričnog

fokusiranja. Dobra strana ovih gelova je da su oni fizički jači od niskoprocentnih

poliakrilamid gelova.

SDS-PAGE kontinuirana elektroforeza (Weber-Osborn postupak) je tehnika kod koje se

deterdţent natrijumdodecilsulfat (SDS) dodaje na sistem. Uglavnom se koristi u

istraţivačke svrhe za karakterizaciju proteina u toku izolacije. Proteini velikih molekulskih

masa, proteinski kompleksi ili pak nukleinske kiseline se vrlo često razdvajaju u prisustvu

agensa koji djeluju na razbijanje nativne strukture. Natrijum dodecilsulfat (SDS) je

deterdţent koji pokazuje polarne i nepolarne karakteristike. SDS se vezuje za najveći broj

proteina tako da su njegovi nepolarni hidrofobni dijelovi pohranjeni u nepolarni region

proteina, a negativno nabijeni sulfatni izloţen prema rastvaraču. Vezivanje SDS-a ima

dvojake efekte. Prvi su vezani za interferenciju sa nativnim hidrofobnim i jonskim vezama

što dovodi do disocijacije najvećeg broja oligomernih proteina u njihove monomere i do

razaranja njihove sekundarne strukture. Ukoliko su polipeptidni lanci povezani disulfidnim

vezama, potrebno je dodatno uzorke zagrijati u prisustvu disulfid reducirajućih agenasa

(betamerkaptoetanola ili 1,4-ditiotreitola). Da bi se to postiglo, potrebno je da protein

disocira na manje podjedinice. Ovaj drugi efekat se pojavljuje kada proteini postanu

zasićeni sa negativno nabijenim molekulama SDS-a. Tada elektroforetska separacija ovisi

isključivo od molekulske mase, tako monomeri malih molekulskih masa putuju znatno brţe

jer je koeficijent trenja manji. Elektroforeza koja se izvodi pod ovim uvjetima moţe da se

koristi za utvrĎivanje molekulske mase proteina.

Weber i Osborn su pokazali da se molekulske mase najvećeg broja proteina mogu

utvrditi putem mjerenja pokretljivosti na poliakrilamidnom gelu koji sadrţi SDS. Standardi

proteina poznatih molekulskih masa se analiziraju elektroforetski i njihova pokretljivost se

mjeri i nanosi na graf papir i izraţava u obliku logaritma molekulske mase. Ovaj grafikon

daje jednu pravu liniju. Pokretljivost nepoznatog uzorka se moţe odrediti pod identičnim

uslovima, a molekulska masa se moţe dobiti na osnovu grafika pokretljivosti standarda u

odnosu na njihove odgovarajuće logaritme molekulskih masa. Molekulske mase utvrĎene

metodom elektroforeze pod disocirajućim uslovima zadovoljavaju tačnost u rasponu od 5-

10 %.

SDS-PAGE primjena


25


Potrebni reagensi:

- GoveĎi serum

- Standard - albumin goveĎeg seruma (BSA)

- Agaroza

- glicin

- tris (hidroksimetil)-aminometan

- natrijum-dodecilsulfat (SDS)

- 2-merkaptoetanol

- glicerol

- brom-fenol plavo

Za analizu uzoraka koristiće se jednodimenzionalna agarozna gel elektroforeza.

Detekcija se vrši pomoću indikatora brom-fenol plavog, komazi briljantno plavog

(coomassie brilliant blue) ili bojenjem sa srebrom.

Intenzitet trake je veličina za relativno odreĎivanje količinskih dijelova neke komponente.

Na osnovu protoka referentnih proteina sa poznatom masom, mogu se odrediti molekulske

mase različitih proteina u uzorku i isti mogu biti identificirani. U slijedećoj tablici navedene

su relativne molekulske mase različitih proteina odreĎene na poliakrilamidnom gelu:

Protein

Mr PreĎena

udaljenost

(mm)

Transferin 78 000 6,0

Albumin goveĎeg seruma 66 000 12,5

Ovalbumin (albumin jajeta) 45 000 32,0

Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza 36 000 38,0

Protein

Mr PreĎena

udaljenost

(mm)

Karboanhidraza 29 000 50,0

Tripsinogen 24 000 54,0

Tripsin inhibitor soje 20 100 61,0

-laktoglobulin 18 400* 69,0

Mioglobin 17 800 69,0

Lizozim 14 300 79,0

Citohrom c 12 400 86,5 * -laktoglobulin ima Mr od 36 800 jer je dimer od dvije identične subjedinice sa Mr od 18 400. Pod

reducirajućim uvjetima pufera za uzorak disulfidne veze podjedinica su reducirane (pocijepane) tako da se na

gelu vide monomerni lanci.

1. Priprema potrebnih pufera

a) Elektroforetski pufer

Postoji više pogodnih elektroforetskih pufera za analizu proteina, ali je najčešće u upotrebi

TRIS-Glicin pufer koji se priprema na slijedeći način:

Pripremiti po 1 litar 0,192 mol/dm3 glicina i 0,025 mol/dm

3 tris (hidroksimetil)-

aminometana. Miješanjem tih komponenata dostići pH vrijednost 8,3.


26

b) Pufer za tretman uzorka

400 l elektroforetskog pufera + 100 l 2-merkaptoetanola + 100 l 2 % SDS-a u

elektroforetskom puferu.

c) Pufer za aplikaciju uzorka

300 l elektroforetskog pufera + 700 l 87 %-og glicerola + nekoliko kristalića brom-fenol

plavog ili komazi briljant plavog.

2. Priprema uzorka ili standarda

U kivetu za centrifugu odmjeriti 200 l uzorka ili standarda (pripremljenog tako da se 0,01

g albumina goveĎeg seruma otopi sa 1 ml elektroforetskog pufera), dodati 200 l pufera za

tretman uzorka, promiješati na vorteks miješalici i drţati na ključalom vodenom kupatilu 5

minuta.

3. Eksperimentalna procedura

a) Pripremiti 1% rastvor agaroze ukupnog volumena 150 mL (agarozu otopiti u

elektroforetskom puferu).

b) Miješati na magnetnoj miješalici uz grijanje dok se agaroza ne otopi.

c) Nakon otapanja, ostaviti otopinu na sobnoj temperaturi da se hladi uz miješanje na

drugoj magnetnoj miješalici. Dok je otopina još vrela popuniti s njom šupljine

izmeĎu ivica staklene ploče i okvira koristeći Pasterovu pipetu. Kada se ruka moţe

zadrţati na tikvici sa otopinom, tada dodati 0,1 g SDS-a, promiješati staklenim

štapićem da se otopi i sipati otopinu gela na staklenu ploču.

d) Odmah uroniti češalj u otopinu blizu jednog od krajeva ploče. Češalj podesiti tako

da donji dijelovi njegovih zubaca ne dodiruju površinu ploče (debljina gela na tim

mjestima treba da je 0,5 – 1,0 mm.

e) Nakon što proĎe 30 – 45 minuta paţljivo ukloniti češalj i okvir, te staviti ploču s

gelom u elektroforetsku jedinicu.

f) U udubljenja koja su napravili zupci češlja aplicirati uzorke koji su pripremljeni na

odgovarajući način (pomiješati 75 l pufera za aplikaciju uzorka sa 300 l uzorka ili

standarda).

g) U elektroforetske komore sipati elektroforetski pufer da dodiruje ivice gela.

h) Pokriti sistem sa poklopcem i priključiti kablove sa elektrodama koje su spojene sa

ispravljačem.

i) Uključiti ispravljač uz podešavanje odgovarajućeg napona (u početku dok uzorci ne

uĎu u gel napon moţe biti oko 50-60 V, a kasnije 80-100 V).

NAPOMENA

Prije rada upoznati se sa načinom rukovanja hemikalijama koje se koriste. Podaci o

štetnosti kemikalija, kao i načinu pruţanja prve pomoći nalaze se u laboratoriju

(konsultovati asistenta i laboranta)! Ovdje su navedene neke informacije za supstance

povećanog rizika:

- 2-Merkaptoetanol

Štetan ukoliko se proguta ili udiše. Toksičan u kontaktu sa koţom. Uzrokuje upaljenje.

Toksičan za vodene organizme, moţe uzrokovati dugotrajne štetne efekte u vodenoj

sredini! Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice i rad obavljati u

digestoru!

- Natrijum-dodecilsulfat

Štetan ukoliko se proguta ili udiše. Iritira koţu, oči i respiratorni trakt. Moţe uzrokovati

alergiju koţe ili respiratornu reakciju (kašalj i sl.). Zapaljiv u čvrstom stanju!


27

Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice!

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Kakav je pravac kretanja peptida (ostaje na startu, kreće se ka anodi ili katodi) u

procesu eletroforeze pri pH 2; 3,5; 6,5; 10:

a) Lys-gly-ala-glu

b) Glu-gly-ala-glu

c) Gly-gly-ala-lys

2. Smjesa glicina, glutaminske kiseline, lizina, arginina i serina razdvaja se metodom

elektroforeze na papiru pri pH 6,0. Navedite koja su se jedinjenja kretala ka anodi, +

(A), katodi, - (K), a koja su ostala na startu C.

A:

B:

C:

3. Navedite pravac kretanja peptida lyz-gly-ala-gly u procesu elektroforeze na papiru

pri pH 1,9; 3,0; 6,5; 10,0.

4. Navesti u koje svrhe se moţe koristiti elektroforetska metoda?

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________


28

5. Koju ulogu u pripremi uzorka za elektroforezu imaju 2-merkaptoetanol i natrijum-

dodecilsulfat?

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________


29

4. REZULTATI

OVJERA VJEŽBE


30

Vježba broj 5

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH PROTEINA BIURET

METODOM

1. TEORETSKI DIO

Proteini predstavljaju kompleksne polimere koji se sintetiziraju na nivou svih ţivih

bića. MeĎusobno se razlikuju po svojim funkcijama, veličini, obliku molekule te strukturi,

rastvorljivosti, sastavu, elektroforetskoj pokretljivosti. U odnosu na ulogu koju imaju u

organizmu, u principu se mogu podjeliti na proteine katalizatore (enzime), potom

regulatorne proteine (receptori, hormoni, represori, inhibitori), transportne proteine,

strukutrne proteine, proteine odbrane (imunoglobulini), onkofetalne i placentalne proteine i

proteine čija funkcija još nije poznata. Najstariji pristup odreĎivanja ukupnih proteina jeste

utvrĎivanje koncentracije azota proteinskog porijekla. Poznati postupak koji se koristi kod

odreĎivanja ovog tipa je Khjeldahl-ov postupak. Ovom metodom se utvrĎuje koncentracija

ukupnog azota u biološkom materijalu. Princip je da se supstance koje sadrţe azot pretvore

u amonijum jon posredstvom oksidacije u sistemu za razaranje koji sadrţi koncentrovanu

sulfatnu kiselinu kao katalizator i so koja ima funkciju da podigne tačku ključanja smjese.

Amonijum jon se najbolje analizira pretvorbom u amonijak sa dodatkom alkalija. Nakon

destilacije upari se u rastvor borne kiseline i amonijak potom titrira sa standardnim

rastvorom hlorovodonične kiseline. Korekcija za neproteinski azot se ostvari korištenjem

seruma koji ne sadrţi proteine. Metoda odreĎivanja po Khjeldahlu odlikuje visokom

tačnošću i preciznošću, činjenica je da traje dugo i da je dosta komplikovana sa aspekta

izvoĎenja rutinske analize serumskih proteina čak i u slučajevima kada se amonijak

odreĎuje enzimatskim analizama. Postoji takoĎer i nesigurnost oko tačnosti faktora

konverzije azota u proteine. Historijski se još uvijek koristi faktor 6,25 iako se zna da je

vrijednost istog relativno niska. Ova metoda se još uvijek koristi kao standardna metoda sa

kojom se uporeĎuju sve druge metode.

Jedna od najčešće korištenih metoda za utvrĎivanje koncentracije serumskih

proteina je zasnovana na principu Biuret reakcije. U ovoj reakciji bakarni jon reagira sa

peptidnim vezama proteina u osnovnom rastvoru gradeći ljubičasto obojene komplekse koji

pokazuju apsorpcioni maksimum na 540 nm. Biuretska reakcija predstavlja vrlo pogodnu

metodu i odlikuje se dobrom preciznošću (pozitivna bojena reakcija dobija se i pri

razblaţenju 1:104). Količina boje koju daje Biuret reagens u vrlo bliskom je odnosu sa

polipeptidnim dijelom različitih serumskih proteina što je direktna prednost nad Lowry-

evom metodom. Reakcija koristi jedan vrlo stabilan reagens i uslijed toga našla svoju

široku primjenu u automatizaciji. Nedostatak je što pozitivnu reakciju mogu dati i neke

supstance koje ne poseduju peptidnu vezu u molekuli, kao što su histidin, asparagin ili

oksamid.

Kingsley je 1942. godine koristio prvi reagens koji nije bio veoma stabilan. Prvi

stabilan Biuret reagens opisao je Weichselbaum koji je dodao kalij natrij tartarat kao

stabilizator i kalij jodid da bi spreiječio autoredukciju alkalnog bakar tartarata i separaciju

bakar oksida. Ovaj metod se zasniva na interakciji Cu2+

jona sa atomima nitrogena i

oksigena u peptidnoj vezi proteina u alkalnoj otopini, pri čemu nastaje ljubičasto obojeni

kompleks čija apsorpcija se mjeri na 545 nm.

Pored ove metode, najčešće korištene metode za kvantitativno odreĎivanje proteina su:


31

1. Bredford-ova metoda: zasniva se na mjerenju apsorpcije kompleksa proteina sa

Bredfordovim reagensom pri 595 nm. Bredfordov reagens je Coomassie briljantno plavo G

u fosfatnoj kiselini i metanolu. Linearno područje koncentracija proteina: 0,1-1,4 mg/ml.

Ukoliko u uzorku ima tragova deterdţenata prikladnija je BCA metoda koja će biti opisana.

2. Lowry-jeva metoda: zasniva se na redukciji fosfomolibden-volfram mješovitog

kiselog kromogena u fenolskom Folin-Ciocalteu reagensu od strane proteina, što rezultira u

apsorpcionom maksimumu pri 750 nm. Nedostatak je što se na rezultat moţe negativno

odraziti prisustvo ostalih reducirajućih supstanci i što reagens reagira samo sa proteinima

koji sadrţe tirozin.

3. Metoda sa bicinkoninskom kiselinom (BCA metod) zasniva se na redukciji

kupri (Cu2+

) jona do kupro (Cu+) jona proteinom. Bicinkoninska kiselina se koristi za

detekciju Cu+. Ova metoda ima nekoliko interferirajućih supstanci čiji efekat moţe biti u

izvjesnoj mjeri umanjen razrijeĎivanjem ispitivane otopine proteina.

4. Fluorimetrijski metod zasniva se na derivatizaciji proteina sa o-ftalaldehidom

(OPA), koji reagira sa primarnim aminima proteina (N-terminalne aminokiseline i -NH2

grupa lizina). Osjetljivost se moţe povećati prethodnom hidrolizom proteinskog uzorka.

5. Metoda mjerenja refraktivnog indeksa zasniva se na mjerenju prelamanja

ulazne svjetlosti na smjesu uzorka, ali za serum, to će u principu odraţavati masu prisutnih

proteina. Obzirom da serum sadrţi i znatnu količinu ostalih tvari, refraktometar se mora

specifično kalibrirati sa serumom poznate koncentracije proteina.

Vrlo vaţni koraci na nivou standardizacije prilikom odreĎivanja ukupnih serumskih

proteina su poduzeti osamdesetih godina prošlog stoljeća. U tom periodu univerzalno se

prihvatilo korištenje goveĎeg serumskog albumina kao referentnog materijala koji će se

koristiti za odreĎivanje ukupne koncentracije proteina u spektrofotometrijskim metodama

poput biuretske i Lowry-eve metode. On se preporučuje kod svih odreĎivanja koja za

princip imaju biuretsku reakciju.


32


Potrebni reagensi:

- 200,00 g 0, 9% vodene otopine NaCl

- 100,00 g 6% vodene otopine NaOH

- 200,00 mL Biuret reagensa koji se priprema na slijedeći način: 3,46 g bakar (II)-sulfata

otopiti u 10,00 ml vruće vode i ostaviti da se ohladi (otopina A). Otopiti 34,6 g

natrijumcitratdihidrata i 20,0 g natrijumkarbonata u 80,0 ml vruće vode i ohladiti (otopina

B). Pomiješati otopine A i B i razrijediti sa vodom do 200,0 ml. Ovakav Biuret reagens

stabilan je pri sobnoj temperaturi 6 mjeseci. Ukoliko se pojavi zamućenje ili talog ne

koristiti takav reagens.

- 0,2% NaOH u 50% etanolu (za uzorke pšenice, raţi, ječma, zobi)

Priprema slijepe probe:

Na 1 ml otopine NaOH dodati 1 ml Biuret reagensa i sadrţaj protresti. Na to dodati 0,4 ml

otopine NaCl i promiješati.

Priprema i upotreba standardne otopine proteina:

Odvagati 0,0500 g albumina goveĎeg seruma (BSA) (liofilizirani prah, nabavljen od

Sigma

) i otopiti u 5,00 ml 0,9 % NaCl. Dobijenu otopinu izraziti u mg/mL, označiti je kao

osnovnu otopinu, te od nje prirediti po 10,00 mL slijedećih radnih otopina: 7.5, 5.0, 2.5, 1.0

i 0.5 mg/ml.

Izmjeriti apsorbansu svih otopina (uključujući i osnovnu) pri 545 nm koristeći se slijedećim

postupkom:

U čiste i označene epruvete (pripremiti istovremeno za standarde, uzorke i slijepu probu)

sipati po 1 ml otopine 6% rastvora NaOH, dodati u svaku 1 ml Biuret reagensa i sadrţaj

protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine standarda (ili uzorka) zatvoriti i promiješati. Nakon

15 minuta sadrţaj istresti u kivetu, obrisati kivetu i mjeriti apsorbansu. Konstruirati

kalibracionu krivu A = f (c), nanoseći na apscisu konačne koncentracije standardnih

otopina.

Priprema i rad sa uzorkom proteina

UZORAK 1: Odvagati pribliţno 2 g sirovog bjelanca (sa preciznošću na četiri decimalne

cifre) u prethodno odvaganoj čistoj i suhoj čašici. Pomoću 0,9 % otopine NaCl prebaciti

kvantitativno sadrţaj bjelanca u odmjerni sud od 50 ml. Izmjeriti apsorbansu tako

pripremljenog uzorka pri istim uvjetima korištenim za rad sa standardnom otopinom BSA.

Pomoću jednačine pravca dobijene iz kalibracione krive izračunati koncentraciju ukupnih

proteina u uzorku bjelanca izrazivši konačan rezultat kao mg proteina/g svjeţeg bjelanca.

UZORAK 2: Odmjeriti ispitivanog uzorka po 1-1,5 g materijala koji je prethodno usitnjem

ili izmljeven u staviti u odgovarajuće posebne porculanske avane. Probama dodati 2 g

kvarcnog pijeska i dodati po 3 mL NaOH u alkoholu, a zatim paţljivo rastrljavati uzorak u

trajanju od tri minute kako bi se razorile ćelije i ekstrahovali proteini. Posle isteka 3 minute

dodati u avan još 12 mL rastvarača i ponovo homogenizirati u trajanju od dvije minute.

Tako dobijenu smjesu kvantitativno prebaciti u odmjerni sud od 50 mL; avan 2-4 puta


33

isprati sa po 5 mL rastvarača i prenijeti u odmjerni sud. Odmjerni sud dopuniti sa

rastvaračem do mjerne crte, dobro promućkati i ostaviti sa stoji 1 sat. Sadrţaj profiltrirati u

suhu erlenmajericu od 50 mL. 10 mL takvog filtrata staviti u kivete za centrifugiranje i

dodati po 1 mL 6% NaOH i po 1 mL Biuret reagensa. Smjesu u epruvetama dobro

promućkati i centrifugirati u trajanju pd 5 minuta. Ako rastvor nije proziran, onda je

potrebno da se eksperiment ponovi uz dodavanje po 2 mL baze i reagensa. Poslije

centrifugiranja, rastvor mora biti bistar (proziran).

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Prikazati mehanizam Biuret reakcije na primjeru uree?


34

4. REZULTATI

Standard/

Uzorak

Apsorpcija

(A)

Sadrţaj ukupnih protiena (rezultat kao mg proteina/g uzorka)

- Napomena: Priloţiti grafik

OVJERA VJEŽBE:


35

Vježba br. 6

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE ALBUMINA I GLOBULINA

1. TEORETSKI DIO

Prečišćavanje proteina je osnovni korak u izučavanju njihovih fizičkih i bioloških

svojstava i jedan je od najčešćih postupaka u praktičnoj biohemiji. Za postizanje

prečišćavanja protein mora biti osloboĎen od svog biološkog matriksa i selektivno odvojen

od ostalih proteina odgovarajućim postupkom frakcioniranja. Predmeti izučavanja na

prečišćenim proteinima odreĎuju prihvatljivost granica čistoće koju je potrebno dostići.

Tako, ispitivanja aktivnosti ne zahtijevaju 100% čist preparat, dok osnovna strukturna

izučavanja zahtijevaju. Suprotno, ispitivanja aktivnosti zahtijevaju očuvanje funkcije i stoga

smanjenje denaturacije i proteolize, dok strukturna ispitivanja se mogu izvesti na

denaturiranom proteinu. Količina prečišćenog proteina potrebna za izučavanje objektivno

utiče na izbor metoda prečišćavanja. Neke tehnike imaju visok kapacitet i mogu raditi sa

velikim volumenima i koncentracijama proteina, dok druge imaju ograničen kapacitet.

Proteini se razlikuju u njihovoj osjetljivosti na denaturaciju tokom procesa

ekstrakcije i prečišćavanja, posebno u njihovoj osjetljivosti na povišene temperature (iznad

40 C), na prisutnost deterdţenata, teških metala i na ekstremne pH vrijednosti. Ove razlike

često su iskorištene u strategiji prečišćavanja pojedinih proteina i tehnika zasnovanih na

njihovom zajedničkom svojstvu u ranim fazama procesa prečišćavanja. Topivost prirodnih

proteina uvjetovana je pH vrijednošću (topivost postaje minimalna u izoelektričnoj tački),

dodatkom soli kao što su amonijumsulfat i prisutnošću organskih otapala, kao što su aceton

i butanol, pri niskim temperaturama. Male razlike u ovakvim svojstvima enzima takoĎer su

iskorištene u postupcima frakcioniranja i prečišćavanja. Spojevi koji sadrţe tiolnu grupu

kao što su merkaptoetanol i glutation (redukovani oblik) često se dodaju enzimskim

preparatima da spriječe oksidaciju sulfhidrilnih grupa, koja se moţe desiti odmah nakon

razaranja stanice i prethodne denaturacije.

Tokom odvijanja prečišćavanja proteina često se prave razrijeĎene otopine proteina.

Naţalost, razrijeĎene otopine proteina, posebno prečišćenih proteina, često su nestabilne ili

zbog disocijacije subjedinica ili adsorpcije proteina na površini posude. Problemi adsorpcije

mogu biti smanjeni upotrebom silikoniziranih posuda uz dodatak malih koncentracija

deterdţenata kao što su Triton X-100 ili Tween 20. Problemi disocijacije mogu često biti

prevaziĎeni dodatkom glicerola (10% do 40% (v/v)), glukoze ili saharoze ili povremeno

albumina goveĎeg seruma (bovine serum albumin, BSA). Čuvanje uzoraka pri 0-4 C je

takoĎer korisno. Duţe čuvanje moţe biti omogućeno upotrebom visokih koncentracija

amonijsulfata (to objašnjava zašto su trgovački preparati enzima često spremljeni u otopini

amonijsulfata).

Prečišćene proteine moguće je frakcionirati na različite načine:

1. Frakcioniranje denaturacijom koristi razlike u toplotnoj osjetljivosti proteina.

Kada je poznata temperatura denaturiranja, moguće je ukloniti više termolabilnih

kontaminirajućih proteina grijanjem smjese do temperature koja je 5-10 C niţa od

ove kritične temperature u trajanju od 15-30 minuta. Denaturirani, neţeljeni protein

se potom ukloni centrifugiranjem. Prisustvo supstrata, produkta ili inhibitora enzima

često stabilizira enzim i omogućava da se moţe primijeniti čak i viša temperatura

toplotne denaturacije. Na sličan način, proteini se razlikuju u lakoći denaturiranja

pri ekstremnim pH vrijednostima ( 3 ili 10 ). Kompletan proteinski ekstrakt se


36

dovede na pH ne manji od jedne pH jedinice od pH unutar kojeg se ispitivani

protein taloţi. Osjetljiviji proteini će se istaloţiti i ukloniti centrifugiranjem.

2. Frakcioniranje solima izvodi se postepenim dodavanjem odgovarajuće soli. U

praksi amonijsulfat je najčešće korišten jer je dobro topiv u vodi, moţe se dobiti u

visokom stepenu čistoće, jeftin je i nema štetnog uticaja na strukturu proteina.

Nakon svakog dodatka soli mora se osigurati potpuno otapanje soli i nastajanje

homogenog otapala. Istaloţeni protein se odcentrifugira, otopi u svjeţem puferu i

ispita u odnosu na ukupni protein i proteinsku aktivnost. Sve faze se izvode pri 0-10

C radi smanjenja denaturacije. Dati protein se normalno isoli u okviru uskog

područja koncentracije amonijsulfata. To je posljedica činjenice da protein-protein

udruţivanje za dati protein naglo postaje dominantno nad protein-voda i protein-so

interakcijama. To je zbog toga što dodatak soli uklanja sloj molekula vode koji

okruţuje hidrofobne grupe na površini proteina, što omogućava hidrofobnim

grupama da uzrokuju udruţivanje proteina i stoga taloţenje.

3. Frakcioniranje organskim otapalom zasniva se na razlikama u topivosti proteina

u vodenim otopima organskih otapala kao što su etanol, aceton i butanol. Organsko

otapalo sniţava dielektričnu konstantu medija putem povećanja privlačnosti izmeĎu

nabijenih molekula proteina i smanjenja njihove interakcije sa vodom. Topivost

proteina se stoga smanjuje. Frakcioniranje organskim otapalom u biti je suprotno

procesu obuhvaćenim frakcioniranjem solima. Kod prvog procesa, hidrofobne grupe

proteina su znatno zaštićene molekulama organskog otapala, a jonske grupe postaju

dominantne, dok kod drugog procesa hidrofobne grupe su jako izloţene.

4. Frakcioniranje organskim polimerom slično je frakcioniranju organskim

otapalom u mehanizmu djelovanja, ali zahtijeva niţe koncentracije za izazivanje

taloţenja proteina. Najčešće korišteni polimer je polietilenglikol (PEG) sa

relativnom molekulskom masom u području 6 000 - 20 000.

5. Izoelektriĉno frakcioniranje (frakcioniranje taloţenjem u izoelektričnoj tački)

zasnovano je na tome da proteini imaju minimalnu topivost u izoelektričnoj tački.

Pri ovom pH postoji jednak broj pozitivnih i negativnih naboja proteinske molekule

i intermolekulska odbijanja su minimalna, a intermolekulska privlačenja

maksimalna, što rezultira u nastajanju netopivih agregata. Osnovno što se moţe

iskoristiti je ili uklanjanje neţeljenog proteina, podešavanjem pH ekstrakta proteina

tako da se izazove taloţenje ovih proteina, ali ne i ispitivanog proteina, ili

uklanjanje ispitivanog proteina, podešavanjem pH ekstrakta na pHi tog proteina.

Centrifugiranje je moćna i opće primjenjiva metoda za razdvajanje i analizu stanica,

organela i bioloških makromolekula. Čestica koja se kreće kruţno sa poluprečnikom r,

ugaonom brzinom , izloţena je centrifugalnom polju koje iznosi 2r.

Brzina taloţenja tj. brzina sedimentacije čestice ovisi o nekoliko činioca:

o masi čestice – teţe čestice brţe se taloţe od onih lakših;

o obliku čestice – koeficijent trenja kompaktne čestice manji je nego u slučaju

izduţene čestice iste mase, što znači da će se kompaktnije čestice brţe taloţiti od

izduţenih;

o gustoći čestice – gušće čestice se kreću mnogo brţe od onih manje gustoće;

o gustoći otopine u kojoj se čestica nalazi.

Krvna plazma je svijetlo-ţuta tečnost, a najveći dio nje čini voda (oko 90%) u kojoj su

otopljene različite organske i anorganske tvari, oko 7% proteina, 1% raznih anorganskih


37

soli i 0,1% glukoze. MeĎu organskim tvarima najvaţnije su proteini plazme. U 1 litri

plazme ima ih oko 73 grama.

Te proteine moţemo svrstati u 3 velike grupe:

- Albumini – 45 g/l – to su proteini plazme s najmanjom molekulskom masom, te su vrlo

prikladni za odrţavanje osmotskog tlaka. Osmotski tlak je vrlo vaţan, jer odrţava protuteţu

hidrostatskom tlaku krvi koji stvara srce. Albumini se sintetiziraju u jetri i odatle se

otpuštaju u krv. Sudjeluju u prijenosu raznih hormona, različitih jona, aminokiselina,

masnih kiselina, lijekova itd.

- Globulini – 25 g/l – vaţni su nositelji odbrane organizma u obliku različitih antitijela.

Dijele se na alfa, beta i gama globuline. Uloga alfa i beta globulina je slična ulozi albumina,

a gama globulini su zapravo imunoglobulini (Ig), a to su molekule koje obavljaju zaštitne

funkcije.

- Fibrinogeni – 3 g/l – vrlo vaţni proteini u procesu zgrušavanja krvi, te osiguravaju

zaustavljanje krvarenja. Fibrinogeni pomoću trombocita stvaraju «mreţu» u kojoj se onda

ulove eritrociti i nastaje ugrušak (tromb). Krv bez fibrinogena je defibrinirana krv.


38


Potrebni reagensi:

- 0, 9 % vodena otopina NaCl

- 2, 0 % otopina trihloracetatne kiseline u 0,9 %-om NaCl

- Biuret reagens

- 6,0 % vodena otopina NaOH

U uzorku goveĎeg seruma izmjeriti koncentraciju ukupnih proteina koristeći se Biuret

testom (100 l goveĎeg seruma razrijediti sa 900 l 0,9 % -ne otopine NaCl, a za daljnju

proceduru vidjeti vjeţbu „Kvantitativno odreĎivanje ukupnih proteina Biuret metodom“).

Podatak zabiljeţiti u radni dnevnik i preračunati na sadrţaj proteina izraţen u mg/100 ml

seruma.

Nakon toga u dvije ependorf epruvete (centrifugalne kivete) odmjeriti po 100 l uzorka

goveĎeg seruma i na to dodati po 900 l 2,0 % otopine trihloracetatne kiseline. Propisno

zatvoriti kivete, okrenuti ih nekoliko puta da se sadrţaj izmiješa i ostaviti ih 10 minuta da se

izvrši taloţenje. Za to vrijeme podesiti centrifugu na 3 500 o/min i centrifugiranjem u

trajanju 5 minuta oboriti globuline na dno kiveta. U supernatantima odrediti sadrţaj

albumina Biuret testom. Iz razlike koncentracija ukupnih proteina i albumina izračunati

koncentraciju globulina.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Glavne osobine albumina (A), globulina (B) i prolamina (C) su:

a) Nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u 70-80% alkoholu

b) Dobro rastvorljivi u vodi

c) Nerastvorljivi u vodi i u rastvorima soli umjerene koncentracije


39

4. REZULTATI

Standard/

Uzorak

Apsorpcija

(A)

Sadrţaj ukupnih proteina, albumina i globulina (rezultat izraziti kao mg/100 ml seruma)

- Napomena: Priloţiti grafik

OVJERA VJEŽBE:


40

Vježba broj 7

ENZIMI

1. TEORETSKI DIO

Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne strukture, koji na površini

imaju većinu polarnih aminokiselinskih ostataka, dok su nepolarni ostaci okrenuti prema

unutrašnjosti molekule. Ovako organizirane proteinske molekule nazvane enzimi imaju

visoku katalitičku moć i specifičnost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u ţivim

organizmima. Katalitička moć enzima se manifestira njegovom sposobnošću da smanjuje

energiju aktivacije potrebnu za odvijanje hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i

vrlo često kataliziraju samo jednu hemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a

specifičnost za supstrat je najčešće potpuna.

U trenutku katalitičke promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabim

nekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Waalsove veze), što omogućava

brzu izmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se dogaĎa u jednom dijelu enzima

nazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smještenih u

unutrašnjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekule, čije prostorno ureĎenje odgovara

molekuli supstrata. Taj prostor u hidrofobnoj unutrašnjosti je odgovoran za njegovu

katalitičku moć.

Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od šest vrsta na osnovu

hemijske reakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe,

koenzima i drugih grupa uključenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC),

svaki enzim moţe se označiti jedinstvenim kodom od četiri broja i nedvosmislenim

sistematskim imenom zasnovanim prema kataliziranoj reakciji.

Šest vrsta enzima su:

Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog

substrata na drugi;


41

Transferaze, koje prenose hemijske grupe izmeĎu substrata;

Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitičke reakcije;

Liaze, koje razlaţu substrate reakcijama različitim od hidrolize;

Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedan u drugi intermolekularnim

premještanjem;

Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, uz cijepanje

odgovarajućeg nukleotid-trifosfata.

Jedinica za enzimsku aktivnost

Jedna enzimska jedinica definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25

°C, 1 bar), razloţi 1 μmol supstrata za jednu minutu. Specifična aktivnost enzima moţe se

izraziti kao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina.

Nova internacionalna jedinica (IU) odreĎena od strane EC je katal (kat). Definira se kao

količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 °C, 1 bar) razloţi 1 mol supstrata za

jednu sekundu. Iz praktičnih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (μkat),

pikokatal (pkat), nanokatal (nkat) itd.

Amilaza spada u grupu hidrolaza (karbohidraze), jer kataliziraju hidrolizu oligo- i

polisaharida. Hidroliza se vrši razlaganjem glikozidnih veza izmeĎu monosaharida, koji

izgraĎuju oligo- i polisaharide. α-amilaza se nalazi u svim organima čovjeka i drugih sisara

(ubikvitaran enzim), a najveća aktivnost je u pljuvački (gdje se naziva ptijalin) i u

pankreasnom soku (gdje se naziva dijastaza). Specifična je za α1-4 glikozidnu vezu u

polisaharidima (škrob i glikogen). Pošto ne moţe da cijepa α1-6 glikozidnu vezu, razlaţe se

oko 80% molekule škroba tj. potpuno hidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti

koji nastaju hidrolizom škroba ovim enzimom su maltoza i granični dekstrini koji nastaju

na mjestima grananja u amilopektinu, tj. gdje se nalazi α1-6 glikozidna veza. Zato se α-

amilaza još naziva i endoamilaza (unutrašnja) ili dekstrinogena amilaza. Za razliku od α-

amilaze, β-amilaza je biljnog porijekla. Specifična je, takoĎer, za α1-4 glikozidnu vezu, ali

djeluje na krajevima polisaharidnih lanaca. Zato ima naziv-egzoamilaza (spoljašnja) i krajni

produkti njenog djelovanja su molekule maltoze.

Pepsin je takoĎer enzim iz grupe hidrolaza (III grupa enzima) iz grupe peptidhidrolaza. To

je proteolitički enzim koji cijepa peptidne veze u denaturiranim proteinima u ţelucu. Kada

se proteini u ţelucu denaturiraju hloridnom kiselinom iz ţelučanog soka, dobiju naziv acid

albumini (acid proteini). Pepsin prvenstveno cijepa peptidne veze izmeĎu aromatskih i

dikarboksilnih aminokiselina tako da nastaju, kao produkti, duţi ili kraći peptidni lanci.

Kraći lanci se nazivaju peptoni, a duţi albumoze. Smjesa peptona i albumoza se koristi kao

podloga za bakterije. Pepsin luče glavne ćelije ţelučane sluznice u obliku proenzima-

pepsinogena koji je neaktivan što se tiče proteolize. Pepsinogen se pri pH ispod 3

reverzibilno aktivira promjenom konformacije, a zatim autokatalizom odcjepljuje dva

peptida sa N-terminalnog kraja, prelazeći ireverzibilno u pepsin.

Schardingerov enzim katalizira oskidaciju aldehida i otuda se naziva aldehid-dehidrogenaza

Schardingera (aldehid: O2-oksidoreduktaza 1.2.3.1.). Pored toga, ovaj enzim ubrzava

oksidaciju hipoksantina i ksantina u mokraćnu kiselinu. Zahvaljujući drugoj reakciji koju

katalizira, dobio je naziv ksantin-oksidaza (ksantin: O2-oksido-reduktaza-1.2.3.2). Dugo se

mislilo da su to dva odvojena enzima. Svijeţe mlijeko sadrţi dosta Schardingerovog

enzima. Jetra čovjeka takoĎer je bogata ovim ezimom. Schardingerov enzim oksidira

podjednako efikasno i aromatske i alifatske aldehide. Da bi se ostvarila oksidacija (putem

oduzimanja hidrogena) in vitro, potrebno je reakcionoj smjesi dodati supstancu-akceptor


42

hidrogena. U tu svrhu moţe da posluţi metilensko plavo, jer ono prima hidrogen do

oksidiranog supstrata i odmah se obezboji-prelazi u leuko formu. Ako duţe stoji,

metilensko plavo moţe ponovo da se oboji, jer lahko predaje hidrogen oksigenu iz zraka. In

vivo, hidrogen oduzet od supstrata predaje se direktno oksigenu, ili preko NAD-a, ako je

hipoksantin supstrat oksidacije. Schardingerov enzim spada u aerobne dehidrogenaze u oba

slučaja: i kada djeluje na aldehide i kada djeluje na purine. Ako upotrebljavamo mlijeko

kao izvor enzima, neophodno je da bude svjeţe. Temperatura ključanja brzo razara enzim.


Specifiĉnosti enzima

Specifičnost enzimske aktivnosti moţe se jednostavno promjeriti sa enzimima amilazom i

saharazom, od koji je prva specifična za škrob, koga hidrolizom škrob prevodi u maltozu, a

druga vrši hidrolitičko razlaganje saharaze do fruktoze i glukoze.

- 2 % ratvor saharoze

- 1% rastvor škroba u 0,3% rastvoru NaCl

- Rastvor saharaze (100 g suhog kvasca usitniti u avanu do praha, preliti sa 450-500 mL

vode, ekstrahovati u toku 1,5-2 sata, zatim filtrirati polako (obično preko noći) i dobiveni

filtrat čuvati u boci na hladnom)

- Amilaza

- 10% NaOH

- 5% rastvor CuSO4

- Vodeno kupatilo

Specifičnost amilaze. U jednu epruvetu dodati 5 mL rastvora škroba, a u drugu 5 mL

saharoze. Dodati u svaku epruvetu po 1-1,5 mL rastvora amilaze, pomješati i uroniti

epruvetu u vodeno kupatilo, čija je temperatura 38-40°C. Posle isteka od 8-10 minuta

sadrţaj obje epruvete ispitati na prisustvo redukujućih šećera (maltoza iz škroba, glukoza i

fruktoza iz saharoze) pomoću Fehling-ove reakcije. Epruvete sa škrobom će dati pozitivnu

reakciju, jer je nastala maltoza koja ima redukujuća svojsta, pa redukuje rastvor Fehling-a

do Cu2O (crvena boja). U drugoj epruveti pozitivna reakcija izostaje jer je saharoza

neredukujući šećer.

Specifičnost saharaze. Postupak je isti kao u prvom slučaju, samo se umjesto amilaze

dodaje rastvor saharaze. Posle inkubacije u trajanju od 15-20 minuta izvrši se testiranje obje

epruvete pomoću Fehling-ovo reagensa. Epruveta koja je sadrţavaja saharozu i saharazu će

dati pozitivnu reakciju uslijed reakcije izmeĎu reagensa i produkata hidrolize saharoze

(glukoze i fruktoze).


43

Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvaĉke)

Sakupiti 2-3 ml pljuvačke, podijeliti na dva dijela. Jedan dio proključati na plameniku ili

rešou. U tri epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli:

Epruveta I II III

Škrob

2-3 ml 2-3 ml 2-3 ml

Neprokuhana

pljuvačka

Nekoliko

kapi

Prokuhana

pljuvačka

Nekoliko

kapi

Lugolov reagens

2-3 kapi 2-3 kapi 2-3 kapi

Sve epruvete staviti u vodeno kupatilo na 37 ºC na inkubiranje od 30 minuta. Nakon tog

vremena izvaditi epruvete i zaključiti šta se desilo u epruvetama.

Izvesti Fehling-ovu reakciju na sadrţaje u drugoj i trećoj epruveti. U svaku dodati po 1-2 ml

pripremljenog Fehlingovog reagensa i zagrijavati do ključanja. Zaključiti šta se desilo u

ovim epruvetama.

Optimalni pH za djelovanje amilaze

Postupak: U četiri epruvete dodati po 5ml fosfatnog pufera pripremljenog na slijedeći

način:

Epruveta 1

pH=5,59 Epruveta 2

pH=6,64 Epruveta 3

pH=7,17 Epruveta 4

pH=8,04

Na2HPO4 (0,067 M) 0,25 mL 2,00 mL 3,00 mL 4,75 mL

KH2PO4 (0,067 M) 4,75 mL 3,00 mL 2,00 mL 0,25 mL

0,5% škrob 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Amilaza (1:15) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Rastvore Na2HPO4 (0,067 M) i KH2PO4 (0,067 M) paţljivo sipati iz birete i dobro

izmješati. U svaku epruvetu dodati 0,5 % rastvor škroba i razrijeĎene amilaze. Sadrţaj

promješati i staviti u vodeno kupatilo. Ostaviti 10-15 min na 40°C. Epruvete izvaditi,

ohladiti i u svaku dodati po 3-4 kapi joda u kaloj-jodidu (Lugolov reagens). Prema boji joda

moţe se orediti stepen razgradnje škroba u zavisnosti od pH sredine. Epruveta u kojoj ne

nastane plava boja sa micelama škrba imala je optimalan pH za djelovanje amizale.

Intezivna plava boja indicira neakrivnost amilaze (izvan dometa pH za djelovanje amilaze),

dok blijedoplava boja indicira aktivnost u sredini udaljenoj od optimalnog pH, ali još uvijek

u domenu djelovanja pluvačne amilaze.

U domenu optimalnog pH za djelovanje amilaze (u epruveti u kojoj nema plave boje sa

Lugolovim reagensom) škrob se razlaţe na sastojke koji ne daju plavu boju sa jodom, uz

povaju pozitivne redukujuće reakcije.

U domenu djelovanja enzima izvan optimalnog pH (niţi ili viši pH) škrob se djelimično

razgraĎuje, a za potpunu razgradnju treba više vremena, pa je i rekacija joda sa preostalim

škkrobom manje intezivna. Izvan domena djelovanja enzima, pri pH izrazitije udaljenom od


44

optimalnog pH, nema promjena na škrobu, ostaje nerazgraĎen, i reakcija sa jodom je

maksimalnog inteziteta.

Prikaţi grafički djelovanje enzima u zavisnosti od pH sredine.

Inhibitorsko djelovanje hlorida na dehidrogenazu

U krompiru se nalazi dehidrogenaza, čije se djelovanje na zraku zapaţa tamnjenjem

razrezane površine krompira. Hloridni joni inhibiraju djelovanje dehidrogenaze i izostaje

efekat tamnjenja (oksidacije) na površini razrezanog krompira.

Postupak: Jedan krompir razrezati na polovine i označiti ih brojevima 1 i 2.

Polovina br. 1: Kontrola

Polovina br. 2: Posuti kristalima natrij-hlorida.

Stajanjem na zraku uočite razliku izmeĎu polovica krompira.

Ureaza

Ureaza procesom hidrolize razlaţe ureu na amonijak i ugljendioksid.

(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

U rastvoru osloboĎeni amonijak se bolje razlaţe, nastaje bazna sredina, pri kojoj

fenolftalein prelazi u crvenu boju.

Postupak: Na oko 1g uree dodati 5 mL destilovane vode. U dvije epruvete nasuti po 2 mL

rastvora uree i po 3 kapi fenolftaleina. U prvu epruvetu na vrhu kašičice dodati malo

sojinog brašna (koje sadrţi enzim ureazu) i obje epruvete drţati 30 minuta na 38°C. U prvoj

epruveti će se pojaviti crvena boja, a u drugoj neće.

Pepsin

Treba pripremiti kuhano bjelance kokošijeg jajeta isjeckano na kockice koje će posluţiti

kao supstrat. Uzeti četiri epruvete i dodati u njih:

Epruveta Bjelance Pepsin Prokuhani pepsin 0,2% HCl 1% Na2CO3

I 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL

II 2-3 kockice 5 mL

III 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL

IV 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL

Sve četiri epruvete staviti u vodeno kupatilo, na 37 °C i inkubirati 30 minuta. Pripremiti

nove četiri epruvete i nakon inkubacije sadrţaje epruveta dekantirati u nove pripremljene

epruvete. U izdvojene filtrate dodati 1-2 ml Biuret reagensa. Uočiti gdje se desila Biuret

reakcija.

Dehidrogenaza mlijeka

Ovaj enzim sadrţi mlijeko, a funkcija mu je oksidacija nekih aldehida u odgovarajuće

kiseline. Reakcija se odvija u anaerobnim ulovima i tada neko organsko jedinjenje sluţi kao

primalac vodika. Bojeni indikator oksido-redukcije je jedinjenje koje gubi boju primajući

vodik (nastaje redukovani derivat). Često se u ogledima koristi metilensko-plavo:


45

MP + 2H+ → MPH2

Nastali derivat je autoksidabilan, pa se na vazduhu prevodi u svoj oksidovani oblik, pa

treba izbjegavati duţe izlaganje zraku.

MPH2 + O2 → MP + H2O2

Postupak: U tri epruvete staviti:

- epruveta 1: 5 mL svijeţeg, nekuhanog mlijeka + 0,5 mL metilenplavog (0,05%)

- epruveta 2: 5 mL svijeţeg, nekuhanog mlijeka + 0,5 mL rastvora metilenplavog

(0,05%) + 1 mL 0,4% rastvora formaldehida

- epruveta 3: 5 mL svijeţeg, kuhanog mlijeka + 0,5 mL rastvora metilenplavog

(0,05%) + 1 mL 0,4% rastvora formaldehida

Svaku epruvetu treba dobro promješati (izbjeći, po mogućnosti, veća izlaganja zraku), pa

staviti u vodeno kupatilo na 42°C. Zapaziti da se u epruveti br. 2 metilenplavo dekoloriše,

jer prima vodik iz aldehid-hidrata i prelazi u leukoderivat:

Napomena: Uslijed neizbjeţnog kontakta sa kisikom iz zraka i na površini epruvete br. 2

moţe se zadrţati nešto plave boje (autooksidacija redukovanog enzima).

Dehidrogenaza djeluje i na ksankin i hipoksantin prevodeći ih u mokraćnu kiselinu, pa se

često naziva i ksantin-oksidaza.

Tirozinoksidaza krompira

Ovaj enzim, sadrţan izmeĎu ostalog i u krompiru, oksidira tirozin koristeći kisik. Tirozin se

postepeno prevodi u oksidacione produkte, koji imaju crvene, odnosno, daljom

oksidacijom-crnu boju.

Postupak: U dvije epruvete staviti po nekoliko kapi 1% rastvora tirozina. U epruvetu 1

dodati 0,5 mL filtriranog, vodenog ekstrakta krompira (narendani krompir-ekstrahovati

vodom) (Narendani krompir staviti u gazu, zatim uroniti u laboratorijsku čašu od 500 mL,


46

koja sadrţi 200 mL destilovane vode. Lagano istisnuti škrob. Promjeniti vodu i ponoviti

ekstrakciju. Pustiti da se iz ekstrakta istaloţi škrob i filtrirati supernatant. Dobijeni filtrat

koristiti za uzorak u epruveti 1). U epruvetu 2 dodati 0,5 mL vode. Staviti obje epruvete u

vodeno kupatilo na 40°C, i tokom inkubacije sadrţaj epruveta nekoliko puta promješati

rada inteziviranja aeracije. Utvrditi da tokom inkubacije djelovanjem tirozinoksidaze, uz

korištenje kisika, tirozin prelazi (u prvoj epruveti) u crveno obojeni derivat.

Stajanjem, tj. inkubacijom u roku 1-2 sata tirozin prelazi u crni pigment melanin.

U drugoj epruveti nema promjene, jer nije dodan enzim, pa tirozin ostaje nepromjenjen.

Katalaza

Ova grupa enzima razlaţe vodikperoksid (nastao oksidacijom-dehidrogenacijom-kada se

ona vrši u aerobnim uslovima).

2H2O2 → 2H2O + O2

Izdvaja se molekularni kisik.

Postupak: U epruvetu staviti 1 mL 6% rastvora vodikperoksida i 1 kap krvi. Odmah se

izdvajaju mjehurići kisika, tečnost se zapjeni i pjena puni epruvetu.

Peroksidaze

Peroksidaze kataliziraju oksidacije fenola i polifenola vodikperoksidom ili organskim

peroksidima. Prenose nascentni kisik iz peroksida na primaoca, koji se oksidira.

Peroksidazna aktivnost hemoglobina

Hemoglobin i citohromi imaju izraţenu peroksidaznu aktivnost, što se moţe potvrditi

reakcijom sa benzidinom i H2O2.

Postupak: Rastvoriti malo benzidina (ima ulogu primaoca aktivnog-nascentnog kisika) u 3-

4 mL 25% sirćetne kiseline. Promućkati, pa dodati 1 mL razblaţenog vodikperoksida i

jednu kap razblaţene, defibrirane krvi. Rastvor postaje vrlo plav ( u prisustvu tragova krvi),

jer se benzidin oksidiše i prelazi u plavo, odnosno tamno-zeleno obojene oksidacione

derivate.

Peroksidaza krompira

Postupak: Ponoviti postupak sa benzidinom, ali umjesto krvi uzeti 1mL vodenog ekstrakta

krompira. Utvrditi da benzedin prelazi u oksidacioni produkt plave boje.


47

Peroksidaze hrena

Postupak: Napraviti ekstrakt hrena u vodi (nastrugati korjen hrena u 5-10 mL vode), pa ga

poslije 60 minuta stajanja filtrirati. Filtrat sadrţi peroksidazu.

U dvije numerisane epruvete uzeti po 20 kapi 2% pirogalola u vodi, pa zatim:

- epruvetu 1 staviti 20 kapi ekstrakta hrena i 2 kapi vode

- u peruvetu 2 staviti 20 kapi ekstrakta hrema i 2 kapi 1 % rastvora vodikperoksida

Ekstrakt hrema sadrţi peroksidazu, koja u drugoj epruveti koristeći dodani vodikperoksid,

prevodi pilogalol u purpurgalin.

Purpurgalin je nerastvorljiv i izdvaja se kao talog crvene boje.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koji enzim pokazuje apsolutnu specifičnost prema supstratu:

a) Himotripsin

b) Papain

c) Ureaza

d) Arginaza

e) Lizozom

2. Koji od proteolitičkih enzima pokazuje esteraznu aktivnost:

a) Tripsin

b) Karboksipeptidaza

c) Aminopeptidaza

d) Himotripsin

e) Pepsin

3. Na kojoj temperaturi se enzimi denaturiraju:

a) 0 °C

b) 80-100 °C

c) 20-30 °C

d) 30-40 °C

4. Koja je temperatura optimalna za djelovanje većine enzima:

a) 50-60 °C

b) 15-20 °C

c) 80-100 °C

d) 35-40 °C

5. Koji optimum pH ima enzim pepsin:

a) 1,5-2,5

b) 4-5

c) 6-7

d) 8-9

e) 10-11


48

6. Kinetika enzima je riješena preko Michael-Mentenove konstante. Napisati jednačinu

i prikazati je grafički?

4. REZULTATI

Specifiĉnost enzima

Specifiĉnost

amilaze Rezultat Fehling-ova proba Komentar

Epruveta I

Epruveta II

Specifiĉnost

saharaze Rezultat Fehling-ova proba Komentar

Epruveta I

Epruveta II


49

Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvaĉke)

Broj epruvete

Rezultat

Fehling-ova proba

Komentar

Optimalni pH djelovanja amilaze

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

Inhibitorsko djelovanje hlorida na dehidrogenazu

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

Ureaza

Broj epruvete

Rezultat

Komentar


50

Praćenje aktivnosti pepsina

Broj epruvete

Biuret proba

Komentar

Dehidrogenaza mlijeka

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

Tirozinoksidaza krompira

Broj epruvete

Rezultat

Komentar


51

Katalaza

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

Peroksidaze

Peroksidna

aktivnost

hemoglobina

Peroksidna

aktivnost

krompira

Peroksidna aktivnost hrena

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

OVJERA VJEŽBE:


52

Vježba broj 8

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA: α-AMILAZE I KATALAZE

1. TEORETSKI DIO

Postoji niz metoda za odreĎivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu

se podijeliti na slijedeće grupe:

o Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora škroba

zbog hidrolitičkog djelovanja amilaze);

o Saharogene metode, zasnivaju se na odreĎivanju reduktivnih spojeva koji nastaju

hidrolizom škroba. Ove metode nisu precizne;

o Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na

djelovanju amilaze na škrob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani

(eterski ili esterski) za neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobaĎa pri

hidrolizi škroba (amiloze ili amilopektina) , centrifugiranjem odvaja i mjeri

fotometrijski;

o Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamućenosti reakcione smjese

škroba i ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvačka) nakon hidrolize škroba;

o Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se prati

oksidoredukcija nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a);

o Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima čiji se razgradni produkti mogu

mjeriti fotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-

nitrofenilni maltozidi (u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode.

Zamjenjuju klasične metode zbog toga, što hidrolizom škroba pod djelovanjem

amilaze nastaju produkti koji nisu tačno definirani u datom momentu (amilo-, eritro-

, ahromodekstrini);

o Amiloklasične metode-zasnivaju se na svojstvu škroba ili amiloze da sa jodom daju

plavi produkt (amilopektin sa jodom daje ljubičastu boju). Djelovanjem amilaze na

škrob nastaju prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubičastu boju), zatim

eritrodekstrini (sa jodom daju crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa

jodom se ne boje

U grupu amiloklasičnih metoda ubraja se i metoda odreĎivanja amilaze po Wohlgemuth-u.

Prva metoda za odreĎivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeĎenje

uzorka još razgraĎuje škrob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava

boja. Metodu je uveo Wohlgemuth kao prvu metodu odreĎivanja enzima u dijagnostičke

svrhe. Najveću dijagnostičku vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i

parotitisa. Tako α-amilaza iz pljuvačke (ptijalin) ima povećanu aktivnost u pljuvačci,

serumu i urinu kod akutnog parotitisa (zaušnjaka) ili kod čira (ulcusa) na ţelucu. Amilaza

iz pankreasa (dijastaza) ima povećanu aktivnost u serumu i urinu kod akutne nekroze

pankreasa u početnom stadiju, akutnog pankreatitisa. Značajno povišenje aktivnosti

dijastaze u urinu javlja se kod upala ţučne kese, uremije, perforacije čira na ţelucu,

postoperativnih stanja.

Katalaza je široko rasprostanjen enzim i sreće se kod prokariaota i eukariota. Predstavlja

dio antioksidativne zaštite organizma. Katalaza razlaţe toksični vodikperoksid na molekul

kisika i vodu. Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, svaki sadrţi preko

500 aminokiselina. Sadrţi četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju enzimu da

reaguje sa vodikperoksidom.


53

Zastupljen je gotovo kod svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i

anaerobnih), biljaka, ţivotinja do čovjeka. Kod čovjeka je široko zastupljenja posebno u

ćelijama jetre u peroksizomima i crvenim krvnim zrncima. Optimalni pH za ljudsku

katalazu je oko 7, dok kod ostalih organizama, u zavisnosti od vrste pH se kreće izmeĎu 4-

11. Ljudska katalaza djeluje na 37°C, dok kod nekih jednoćelijskih organizama optimalna

temperatura djelovanja je 90°C. Osnovna uloga ovog enzima je razgradnja vodikperoksida.

Katalaza je veoma aktivan enzim, jedna molekula katalaze konvertuje million molekula

vodikperoksida u vodu i kisik svake sekunde. Katalaza moţe katalizirati i oksidaciju,

pomoću vodikperoksida, različitih metabolita i toksina, kao što su formaldehid, mravlja

kiselina, fenoli, acetilaldehid i alkoholi. Dešava se slijedeća reakcija, čiji mehanizam je i

dalje nepoznat.

H2O2 + H2R → 2H2O + R

Joni teških metala (kao što su bakarni joni) mogu da se ponašaju kao nekompeticijski

inhibitori katalaze. Otrovi, kao što su cijanidi su kompeticijski inhibitori katalaze, snaţno se

vezuju za hem katalaze i zaustavljaju enzimsku reakciju.

Kod čovjeka i drugi enzimi mogu da razgrade vodikperoksid. Glutationperoksidaza je u

fiziološkim uslovima (mala koncentracija vodikperoksida) je čak aktivnija od katalaze.

Kada koncentracija vodikperoksida poraste uključuje se katalaza. Katalaza test je jedan od

tri glavna testa koji se koristi u mikrobiologiji za identifikaciju bakterija. Prisustvo enzima

katalaze se detektuje upotrebom vodikperoksida. Bakterije koje su katalaza-pozitivne

dodavanjem vodikperoksida „oslobaĎaju” kisik.


54


OdreĊivanje aktivnosti α-amilaze

U stalak se pripremi 10 čistih epruveta i u svakoj odpipetira po 1 ml fiziološkog

rastvora (0,90% NaCl). U posebnu, čistu epruvetu se sakuplja profiltrirana pljuvačka bez

dodatka vode radi lakšeg i brţeg filtriranja. Sakupi se nešto više od 1 ml, a potom

odpipetira 1 ml i stavi u prvu epruvetu.

Sadrţaj epruvete se dobro promiješa i na taj način se dobije dva puta razblaţena pljuvačka.

Nakon toga se odpipetira 1 ml tako razblaţene pljuvačke i stavi u drugu epruvetu. Sadrţaj i

ove epruvete se dobro promiješa i dobije četiri puta razblaţena pljuvačka. Postupak se

ponavlja sve do desete epruvete iz koje se 1 ml pljuvačke izbaci. Potrebno je prilikom ovog

razblaţivanja pipetu kojom se pipetira i prebacuje sadrţaj jedne epruvete u drugu, nakon

svakog prebacivanja sadrţaja isprati vodom. Kada se naprave razblaţenja pljuvačke, u

svaku epruvetu se odpipetira po 1 ml 0,1% koloidnog rastvora škroba. Sadrţaji u svakoj

epruveti se promiješaju, sve se vrati u stalak i termostatira na sobnoj temperaturi. Poslije 15

minuta termostatiranja u svaku epruvetu (od desete do prve) se doda po jedna kap

Lugolovog reagensa. U epruvetama u kojima je škrob hidroliziran nema plave boje, a u

kojima nije hidroliziran pojavljuje se plava boja. IzmeĎu obojenih i neobojenih sadrţaja u

epruveta javlja se jedan koji sa Lugolovim rastvorom daje crvenu boju. Boja potiče od

razgradnih produkata škroba-eritrodekstrina sa jodom iz Lugolovog reagensa. U toj

epruveti razblaţena pljuvačka sadrţi jednu enzimsku jedinicu α-amilaze, po Wohlgemuth-u.

Jedna enzimska jedinica α-amilaze po Wohlgemuth-u je ona aktivnost ovog enzima pri

kojoj se na temperaturi od 38 C hidrolizira 1 mg škroba za 30 minuta, odnosno 0,00055

mg škroba za jednu sekundu. Najmanje razblaţenje uzorka u kome se za 30 minuta na

temperaturi od 38 C hidrolizira jedan mg škroba do produkata koji sa Lugolovim

rastvorom ne daju plavu boju (eritrodekstrini-daju crvenu boju) sadrţi jednu jedinicu α-

amilaze po Wohlgemuth-u (1 WJ).

Pretvaranje IU u katale:

1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x106 μmol/min = 6x10

7 IU

1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat

Ukoliko se kao supstrat na koji djeluje amilaza koristi škrob koji ima molekulsku masu

55000, onda 1 WJ α-amilaze iznosi 0,01 nkat.

OdreĊivanje aktivnosti katalaze

Princip određivanja: Prema Bah-u i Oparin-u kvantitativno odreĎivanje katalaze zasnovano

je na osobini H2O2 koji zaostaje nakon razloţnog djelovanja katalaze, da reaguje sa KMnO4

uz obrazovanje slobodnog kisika. Jednačina ove reakcije je slijedeća:

2KMnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4 → 2MnSO4 + 2KHSO4 + 8 H2O + 5O2

Na osnovu razlike u mL rastvora KMnO4 utrošenog za titraciju kontrolne probe i ogledne

probe dolazi se do količine H2O2 koja je razloţena od strane enzima.

Osim KMnO4, kao sredstvo za razlaganje viška H2O2 posle inkubacije sluţi J2.

Reakcija se odvija po po jednačini:


55

H2O2 + 2KJ H2SO4 → K2SO4 + J2 + 2H2O

Višak joda se odreĎuje sa Na2S2O3.

Reagensi i pribor:

1. Preparat katalaze: Odmjeriti na analitičkoh vagi 2g brašna ili drugog izmljevenog biljnog

materijala, staviti u balon od 100 mL, dodati vode i dobro promućkati, zatim dodati 2-3

kapi toluola, dopuniti balon destilovanom vodom do markice i ostaviti smjesu na sobnoj

temperaturi u toku 2 sata. Posle ekstrakcije, sadţaj profilitrirati kroz naboran filter papir

(moţe i centrifugirati) i filtrat koristiti kao ekstrakt katalaze.

Za ekstrakciju enzima moţe se koristiti i krompir. 20g krompira isitniti i izmrviti, staviti u

balon, dodati vode, promućkati, dopuniti vodom do 50 mL i profiltirrati.

Za ispitivanje katalaze moţe se koristiti i krv u razblaţenju 1:1000.

- 1% rastvor H2O2

- 10% H2SO4

- 0,1 M KMnO4

- 0,1 M NaOH

Tok odreĎivanja: U četiti tikvice nasuti pipetom po 20 mL filtrata, zatim u posljednje dvije

(3 i 4) koje sluţe kao kontrolne zagrijati da sadrţaj proključa (kuhati 5 minuta) radi

inaktivacije enzima, a onda ohladiti.

Posle toga u sve tikvice dodati po 20 mL destilovane vode, po 5 mL 1% rastvora H2O2, koji

je prethodno neutraliziran rastvorom NaOH i ostaviti ih na sobnoj temperaturi u toku 30

minuta. Posle tog roka dodati u probe po 5 mL 10% H2SO4 i smjesu titrirati rastvorom

KMnO4.

Aktivnost katalaze se odreĎuje po količini mg H2O2 koji se u toku 30 minuta razloţi

pomoću katalaze koja sadrţi 1 g ispitivanog materijala (1 mL 0,1 M KMnO4 ekvivalentan

je 1, 7 mg H2O2).

A = g

xba 7,1)(

Gdje je:

a- broj mL 0,1 M KMnO4 utrošenog za kontrolnu probu

b - broj mL 0,1 M KMnO4 utrošenog za uzorak

g – količina ispitivanog uzorka u g


56

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koji pH optimum ima enzim amilaza:

a) 1,5-2

b) 7-7,5

c) 8-9

d) 3,5-4

e) 4,5-5

2. Za koje enzime su Mg2+

aktivatori:

a) Fosforilaze

b) Amilaze

c) Heksokinaze

d) Kreatinkinaze

e) Karboksipeptidaze

3. Za koje enzime su joni Zn2+

aktivatori:

a) Karboksipeptidazu

b) Karboanhidrazu

c) Glutamatdehidrogenazu

d) Laktatdehidrogenazu

e) Aminooksidazu

4. Koji je jon neophodan za djelovanje kinaza (fosfotransferaza) koje kataliziraju

graĎenje O-fosfatnih estera:

a) Mg2+

b) Co2+

c) Ca2+

d) Na+

e) K+

7. Kod kojih enzima u aktivnom centru su dokazane aminokiseline glutamat i aspartat:

a) Piruvatdehidrogenaze

b) Lizozomu

c) Pepsinu

d) Ureazi

e) Karboksipeptidazi

8. Koji enzimi pripadaju grupi „serinskih“ enzima:

a) Pepsin

b) α-himotripsin

c) tripsin

d) acetilholinesteraza

e) lizozom

9. Dokazati da 1 WJ iznosi 0,01 nkat?


57


58

4. REZULTATI

Izračunati aktivnost uzorka amilaze i prikazati u WJ, kat i IU.

Broj

epruvete

Razblaţenje

pljuvačke

WJ


59

Izračunati aktivnost katalaze

OVJERA VJEŽBE:


60

Vježba broj 9

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE SADRŽAJA

UKUPNIH FENOLA U UZORKU PĈELINJEG MEDA

1. TEORETSKI DIO

Postoji više načina da se odredi ukupna količina fenolskih spojeva, uz napomenu da

nijedna od ovih tehnika ne detektuje sve fenolske spojeve. Jedna od najčešće korištenih

metoda za odreĎivanje ukupnog sadrţaja fenola je stara oko 100 godina i u početku je

razvijena za istraţivanje metabolizma proteina kod ljudi. Folin i Denis (1912) su koristili

kolorimetrijski metod detekcije tirozina prilikom hidrolize proteina. Aktivni reagens je ţut i

sastavljen je od kompleksnih polimernih jona formiranih od fosfomolibdenove i

fosfovolframove kiseline. Čini se da ovaj rastvor sadrţi integrirane polimerne serije i da

imaju formu tetraedra okruţenu sa oktaedarskim molibden oksikiselinskim jedinicama u

kojoj volfram moţe lahko supstituirati molibden. Ovaj reagens oksidira fenolate i

heteropolarna kiselina biva reducirana iz stanja +6 u smjesu stanja +6 i +5 uz nastanak

plavog molibden-volframovog kompleksa. Metod je modificiran od strane Folin-a i

Ciocalteu-a (1927). Modifikacija uključuje dodatak litijuma u fosfovolframat /

fosfomolibdat reagens na kraju procesa kuhanja. Dodatak litijuma spriječava precipitiranje i

smetnje prilikom kvantifikacije u odnosu na intenzitet boje. Intenzitet boje moţe biti

korišten za kvantitativnu analizu na osnovu vrijednosti apsorbanse. Koncentracija fenola se

izraţava kao ekvivalenti galne, odnosno hlorogenske kiseline koje se koriste kao standardi.

Od ranije je evidentan uticaj fenolskih komponenti na ljudsko zdravlje.

Najvjerovatnije najstarija medicinska primjena fenolskih komponenti je upotreba fenola

kao antiseptika. Zbog negativnog uticaja koji ima na tkiva, posebno nastajanje rana pri

velikim koncentracijama, nije više u upotrebi. Do danas su se zadrţale u upotrebi 0,5%

otopina fenola protiv bakterija Staphylococcus aureus i 1,5% otopina kao oralni anestetik.

Druga česta upotreba fenolskih komponenti je kao zaštita od UV zračenja. Prisustvo

aromatskog prstena doprinosi efektivnoj apsorpciji UV zračenja (izmeĎu 280-315 nm) i na

taj način štiti od opekotina. Najčešći sastojak krema za sunčanje je p-aminobenzojeva

kiselina (nije fenolski spoj). Ovaj sastojak se koristio do 1970-ih kada je otkriveno da

izaziva osip i akne. Alternative aktivne komponente su salicilati, kao što je oktilsalicilat,

cimetati kao što je oktilmetilcimetat (nerastvoran u vodi i koristi se za kreme nerastvorne u

vodi), benzofenon, oksibenzon, antraanilati kao što je metilantranilat. Imaju ulogu pri

stresnim situacijama u okolini, što uključuje zaštitu od visokih nivoa vidljive i UV

svjetlosti, odbrana od patogena i opšta zaštita od oksidativnog stresa, ozona. TakoĎer, utiču

na ljudsko zdravlje uz moguće djelovanje kao antioksidanti, antikancerogeni i

karvoprotektivni agens. Fenoli u biljkama nalaze slijedeće uloge: zaštita od štetnog UV

zračenja, odbrana od biljojeda, odbrana od patogena, zaštita od fitoinhibije i zaštita od

reaktivnih kisikovih čestica (ROS-reactive oxygen species).


Potrebni reagensi:

- Uzorci za analizu-Pčelinji med

- Standard-galna kiselina, 98 %, - Folin-Ciocalteu's reagens

- Natrij-karbonat


61

Za analizu će biti korištena metoda po Singleton-Rossiju.

a) Priprema standardne otopine galne kiseline

U čistoj i suhoj čašici odvagati 0,0250 g galne kiseline, dodati 200 l 95% etanola, lagano

protresti rukom da se supstanca otopi, te dodavanjem destilirane vode špric balonom

kvantitativno prenijeti sadrţaj (ispirati čašicu destiliranom vodom) u odmjerni sud od 50

ml. Postojanost ove otopine je 2 dana na 4 C. Odgovarajuća razrijeĎenja ove standardne

otopine koriste se za pripremu kalibracionog pravca (npr. pripremiti po 10,00 ml 200, 150,

100, 50 i 10 mg/l galne kiseline).

b) Priprema uzorka

U čistoj i suhoj čašici odvagati na analitičkoj vagi oko 1 g uzorka meda, zapisati tačnu

masu odvage, dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i miješati staklenim štapićem do

otapanja. Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje

čaše sa još 10 ml (u porcijama po 5-6 ml) destilirane vode. Nakon što se i taj dio prenese u

odmjerni sud, otopina se protrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomoću špric balona.

Ukoliko se primijete čvrsti ostaci u otopini, kompletan sadrţaj profiltrirati preko običnog

filtar papira u čistu čašu ili drugi odmjerni sud. Nakon toga, odreĎeni volumen uzorka

razrijediti u omjeru 1 : 10 (npr. na 1,00 ml uzorka dodati 9,00 ml destilirane vode).

c) Eksperimentalna procedura

Na 2,00 ml otopine uzorka ili standarda (razrijeĎenih na gore opisani način) doda se 10,00

ml Folin-Ciocalteu reagensa razrijeĎenog u omjeru 1:10 i promiješa. Ova smjesa se ostavi

da odstoji oko 10 minuta. Zatim se doda 8,0 ml 7,5 %-og Na2CO3. Nakon 30 minuta

stajanja na sobnoj temperaturi očita se apsorbansa pri 743 nm.

Priprema slijepe probe obavlja se na isti način, s tom razlikom što se umjesto uzorka ili

standarda uzima 2,00 ml destilirane vode

3. REZULTATI

Uzorak γ(mg/L) Apsorbansa (A)


62

- Koncentracija nepoznatog uzorka (rezultat izraziti kao mg galne kiseline/g

uzorka)

- Uz izvještaj priloţiti i grafik kalibracione krive

OVJERA VJEŽBE


63

Vježba broj 10

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE UKUPNOG

HLOROFILA

1. TEORETSKI DIO

Hlorofili apsorbuju svjetlost u plavom (430-490 nm) i crvenom (630-760 nm) dijelu

spektra, a zelenu svjetlost propuštaju pa otuda imaju zelenu boju. Hlorofil ima sposobnost

fluorescencije, što znači da svjetlost koju apsorbuje moţe ponovo da otpusti, ali kao

svetlost veće valne duţine, dalekocrvene. Zbog toga je rastvor hlorofila, posmatran u

epruveti u odbijenoj svetlosti, tamnocrvene boje.

Apsorbcioni spekrar hlorofila a b hlorofila b

Količinski odnos hlorofila a i b u tijelu viših biljaka zavisi od količine svjetla kojom su

izloţene. Tako dobro osjvetljene biljke imaju tri puta više hlorofila a nego hlorofila b, dok

one koje ţive u sjenci imaju više hlorofila b. Razlog tome je pojava označena kao

komplementarna hromatična adaptacija prema kojoj biljke stvaraju pigmente čija je boja

podudarna boji raspoloţive svjetlosti. Hlorofil, hemoglobin i vitamin B12 imaju sličnu

hemijsku strukturu, ali im se uloge u ćelijama biljaka i ţivotinja bitno razlikuju. Hlorofil je

po hemijskoj graĎi porfirinski spoj izgraĎen od:

porfirinskog prstena u čijem se centru nalazi atom magnezijuma (Mg); porfirinski

prsten je aktivni dio molekula;

fitolnog lanca u vidu produţetka (rep hlorofila) lipofilnih svojstava preko koga se

molekul pričvršćuje za tilakoidnu membranu.

Strukture hlorofila a i hlorofila b


64

Hlorofili a i b se meĎusobno razlikuju po tome što je kod hlorofila a na poziciji 3 u

porfirinskom prstenu metil grupa (CH3), dok je na istoj poziciji kod hlorofila b aldehidna

grupa (CHO).Na tilakoidnim membranama pigmenti se udruţuju sa proteinima gradeći

naročite makromolekulske komplekse pigment/protein koji se označavaju kao:

fotosistem I koji sadrţi hlorofil a i hlorofil b u odnosu 12:1, β-karoten (pripada

karotenoidima) i polipeptida; loptastog je oblika i velike molekulske mase od 110

000 Da;

fotosistem II se sastoji od hlorofila a i b u jednakim količinama (1:1), ksantofila,

feofitina i kompleksa mangana koji oksiduje vodu; ima jajast oblik i manju

molekulsku masu od fotosistema I (32 000 Da)

U fotosistemu I glavni pigment je molekul hrorofila a koji apsorbuje svetlost maksimalne

valne duţine 700nm (ozanačava se kao P700), dok je u fotosistemu II hlorofil a koji upija

svjetlost talasne duţine 680 (označava se kao P680). Oba fotosistema funkcionišu po istom

principu: apsorbuju sunčevu svjetlost i pretvaraju je u hemijsku energiju. Prema najnovijim

istraţivanjima makromolekulskih kompleksa tilakoidne membrane smatra se da su

fotosistemi nešto sloţenije graĎe i da obuhvataju kompleks, skraćeno nazvan LHC (Light

Harvesting Complex = kompleks koji žanje svetlost), u kome je skoncentrisano 99%

hlorofila, praktično sav hlorofil koji je vezan za tilakoidnu membranu.

LHC kompleks je izgraĎen od dva osnovna dela:

antene koja žanje sunčevu svjetlost i

reakcionog centra koji je hvata.

Funkcija fotosistema svodi se na slijedeće: u nivou antena se apsorbuje svjetlosna energija,

a zatim pomoću elektrotransportnog lanca (lanac prenosilaca elektrona) se prenosi do

reakcionog centra pri čemu dolazi do oslobaĎanja energije koja se iskoristi za izbacivanje

protona u lumen tilakoida. To pokreće sa jedne strane sintezu ATP, a sa druge strane

dovodi do redukcije NADP i oksidacije vode do molekulskog kiseonika koji se oslobaĎa u

atmosferu. Svaka vrsta hlorofila apsorbuje svetlost tačno odreĎene valne duţine u

zavisnosti od svog apsorpcionog spektra. Pri tome elektroni molekula hlorofila postaju

bogatiji energijom, koja je jednaka apsorbovanom kvantu svetlosti (fotonu) i prelaze u

pobuĎeno (ekscitovano) stanje, odnosno, na slijedeću orbitalu koja odgovara povišenoj

energiji. U molekulu hlorofila elektron moţe da preĎe na dijve moguće orbite pobuĎenog

stanja jednu koja odgovara fotonu crvene (niţa), a drugu koja odgovara fotonu plave

svetlosti (viša). Ekscitirani elektron napušta molekul hlorofila i prihvata ga akceptor

elektrona (feredoksin) koji se pri tome redukuje, dok sam molekul hlorofila ostaje

oksidovan (pozitivno naelektrisan). Oksidovani molekuli hlorofila izgubljene elektrone

nadoknaĎuju od tzv. donora (davaoca) elektrona. Hlorofili fotosistema II nadoknaĎuju

elektrone iz vode, a fotosistema I to čine iz fotosistema II.


65


Hlorofil iz biljnog materijala se kvantitativno ekstrahuje 96 % etanolom i u dobijenom

ekstraktu se kolorimetrijsi odreĎuje njegov sadţaj. OdreĎivanje koncentracije hlorofila u

ispitivanom uzorku moţemo odrediti na principu zavisnosti inteziteta propuštene svijetlosti

od koncentracije rastvora i debljine njegovog sloja.

Za pravljenje standardnog rastova upotrebljavaju se slijedeći spojevi: CuSO4, K2Cr2O7 i

NH4OH koji daju absorbciju koju bi dao rastvor 8,5 hlorofila u 100 mL 96% etanola.

Postupak: Uzeti 0,5-5 g biljnog materijala i staviti u čašu sa ključalom vodom kojoj je

dodato oko 0,1 g CaCO3. Posle kuhanja koje traje oko 1 minut, materijal se vadi i stavlja na

saharno stanko da se odstrani suvišna voda. Zatim, material prenjeti u tarionik u kome se

nalazi nešto kvarcnog pijeska i CaCO3 i paţljivo homogenizira uz dodavanje nekoliko

mililitara 96% etanola. Dobije ekstrakt se prenosi u lijevak sa filter papirom, a masi u

tarioniku dodaje se nova količina alkohola i nastavlja homogeniziranje i ekstrakcija.

Postupak se ponavlja sve dok se ne izgubi zelena boja ekstrakta koja otiče iz lijevka. Po

završenoj ekstrakciji filtrat se dopun 96% alkoholom do 100 mL. Taj rastvor sluţi da se u

njemu kolorimetrijski odredi sadrţaj hlorofila.

Kao standard sluţi rastvor koji u 100 mL sadrţi: 28,5 mL 1% rastvora CuSO4, 50 mL 2%

rastvora K2Cr2O7 i 10 mL 7% rastvora NH4OH i sve to dopuni destilovanom vodom do 100

mL. Ovakav rastvor po intezitetu boje odgovara rastvoru hlorofila (a+b) koncentracije 8,5

mg/100 mL.

Izračunati sadrţaj hlorofila kao mg/mL i kao sadrţaj mg hlorofila/ g biljnog materijala.


66

3. REZULTATI

- Koncentracija nepoznatog uzorka (rezultat izraziti kao mg hlorofila/ g biljnog

materijala)

OVJERA VJEŽBE


67

Vježba broj 11

PRIMJENA ADSORPCIONE HROMATOGRAFIJE U SEPARACIJI

BILJNIH PIGMENATA

1. TEORETSKI DIO

U osnovu adsorpcione hromatografije raznih spojeva prisutan je princip različite

polarnosti. Spojevi male i srednje polarnosti razdvajaju se najbolje od polarnih spojeva. Za

formiranje kolone koriste se razni adsorbensi, sa nejednakim adsorpcionim osobinama.

Takvi su silika gel, glina, kalcijum fosfat, aktivni ugalj (biljni ili ţivotinjski) i saharoza.

Adsorpciona sredstva pojedinih adsorbenasa mogu se u značajnom stepenu modificirati ili

izmjeniti putem raznog prethodnog tretiranja ili obradom, na primjer sa kiselinama ili

zagrijanjem. Ova obrada poznata je kao aktivacija ili aktiviranje adsobenasa.

Prije nanošenja uzorka redukovati nivo tečnosti u koloni neposredno iznad diska filter

papira. Koncentrovani uzorak pipetom paţljivo naneti na vrh kolone. Zatim dodati solvent

postepeno i uspostaviti jedan konstantni nivo tečnosti na vrhu kolone. Ako je brzina

proticanja solventa kroz kolonu suviše mala, ista se moţe povećati spajanjem vrha kolone i

vakuum pumpe. U takvom slučaju postupani paţljivo. Razdvajanje komponenata iz uzorka

nanetog na kolonu adsorbensa zavisi, izmeĎu ostalog, od izbora odgovarajućeg solventa za

svaki pojedinačni slučaj, što je u saglasnosti sa svim mogućim interakcijama izmeĎu tri

komponente sistema: rastvorena supstanca, solvent, adsorbens, a što se mora imati u vidu

pri svakom empirijskom zahvatu.

Eluirajuća moć solventa raste sa njihovom polarnošću. Ona se uopšteno moţe izraziti

sljedećim rasporedom:

voda ˃ etanol ˃ aceton ˃ hloroform ˃ petrol eter

Jačina adsorpcije komponente na koloni je u zavisnosti sa polarnošću. Više polarna

jedinjenja se jače adsorbuju. Ovo se moţe izraziti na slijedeći način: kiseline ˃ alkoholi ˃

ketoni ˃ ugljikovodici. Razdvajanje eluiranjem ostvaruje se u slučaju kad se solvent

adsorbuje mnogo slabije od komponente, te on u svom kretanju jednostavno „prekoračuje“

adsorbovane spojeve duţ kolone. Na ovaj način moţe se postići dobro razdvajanje

komponenti iz uzorka, ali je u sistemu „angaţovan“ samo jedan dio ukupnog kapaciteta

kolone.

Razdvajanje pomicanje (potiskivanjem) javlja se u slučaju mnogo jačeg adsorbovanja

solventa u poreĎenju sa spojevima, tako da se velike količine materijala mogu razdvojiti, a i

sama separacija je adekvanta.

Kod adsorpcione hromatografije obojenih spojeva obično se primjenjuje istiskivanje kolone

iz nosača nakon separacije traka, a zatim se ova isječe na sektore sa trakama, koji se

pomoću solventa eluiaju i spojevi odreĎuju na podesan način.


68


Razdvajanje pigmenata zelenih listova na koloni sa više asdorbenata

a) Ekstrakcija pigmenata

Suši se 4-5 svjeţih listova špinata 1-2 sata na 40°C ili 24 sata na 20°C. Listovi se izreţu na

trake i ekstrahuju 1 sat sa smjesom od 10ml benzena, 30m etanola i 90ml petroletera.

Filtritra se i filtrat ispere 4 puta vodom, suši natrij-sulfatom i upari na vodenom kupatilu do

zapremine od 5ml.

b) punjenje kolone

U erlenmajerovu tikvicu staviti 8g Al2O3 II stepena aktivnosti i 15 ml petroletera

U erlenmajerovu tikvicu staviti 5,3g kalcij-karbonata (sušenog na 150°C) i 30ml

petroletera

U erlenmajerovu tikvicu staviti 7g fino sprašene saharoze i 20 ml petroletera

Kolonu 1/18 dobro oprati, osušiti i na donjem dijelu staviti tampon od staklene vune.

Kolona se učvrsti na stativ da stoji okomito. Al2O3 se dobro izmješa sa petroleterom.

Dobivena suspenzija se ulije u kolonu tako da se sloj adsorbenta razmjesti ravnomjerno, a

nakon toga se na površinu adsorbenta stavi tačno izrezani kruţić filter papira. Zatim se na

isti način unosi suspenzija CaCO3 i filter papir, i kao zadnji adsorbent suspenzija saharoze.

Kod pakovanja kolone pri dodavanju svakog adsorbenta lupka se drvenim štapićem po

koloni da se adsorbent slegne. Gornji kraj adsorbenta na vrhu kolone mora biti potpuno

ravan jer je u protivnom hromatogram iskrivljen.

c) razvijanje hromatograma

Na kolonu se kroz čep postavi lijevak za odvajanjeu i u njega sipa 100-200ml petroletera,

pa polako propusti kroz kolonu. Drugi kraj kolone se spoji preko čepa sa vakuum bocom.

Kolona nikada ne smije biti suha. Nakon toga, aplicirati pripremljeni ekstrakt. Nakon toga

se razdvajanje hromatograma vrši propuštanjem smjese petroleer-benzen (4:1). U koloni se

pojavljuju obojene zone. Na gornjem dijelu sloja Al2O3 javlja se narandţasti sloj od

izdvojenih karotena; na CaCO3 ţuti sloj od ksantofila, a na saharozi dva sloja, plavo zelen

od hlorofila a i tamno zelen od hlorofila b. Kad se sve komponente dobro razdvoje, kolona

se odsisše pomoću vakuum pumpe i oprezno istrese istisne sadrţaj iz cijeli na filter papir.

Pojedine zone se mehanički odvoje, prenesu u elrenmajerice i ekstrahiraju pigmenti

smjesom eter-metanol (50:1). Adsorbenti se filtriratu, a rastvarač upari na vodenom

kupatilu.

Ako razdvajanje ksantofila i karotina ne bude potpuno, moguće ih je razdvojiti

ekstrakcjiom sa smjesom petroletera i 90% metanola. Karotin zaostaje u petroleteru, a

ksantofl prelazi u metanol.

Karotin – C40H56

Ksantofil – C40H56O2

Hlorofil a – C32H30N4OMg(COOCH3)COOC20H39

Hlorofil b - C32H28N4O2Mg(COOCH3)COOC20H39


69

3. REZULTATI

OVJERA VJEŽBE


70

Vježba broj 12

SPEKTROFLUORIMETRIJSKO ODREĐIVANJE

ANTIOKSIDATIVNOG KAPACITETA U UZORKU PĈELINJEG

MEDA

1. TEORETSKI DIO

Fluorimetrija je analitička metoda odreĎivanja supstanci zasnovana na

fluorescenticiji.Fluorescencija kao fizikalno-kemijski fenomen predstavlja proces koji se

dešava u vrlo kratkom vremenskom periodu (< 10-8

s) kada elektroni vraćajući se sa

najniţeg pobuĎenog energetskog nivoa u osnovno energetsko stanje emitiraju pri tome

energiju u vidu svjetlosti (fotona). Mnoge organske molekule apsorbiraju u UV ili pak

vidljivom valnom području, ali ne fluoresciraju. Ipak, većina od onih koje fluoresciraju, od

biološke su vaţnosti.

Dijagram energijskih razina koji pokazujeneke od energijskih promjena što se dogaĎaju pri (a) apsorpciji, (b)

relaksaciji bez pojave zračenja i (c) fluorescenciji molekulskih vrsta.

Supstance koje fluoresciraju traba da sadrţe fluoroforne grupe čijim je prisustvom

uslovljena fluorescencija. UvoĎenjem nekog supstituenta u jedinjenje moţe da pojača ili

oslabi intezitet fluorescencije. Supstituenti koji pojačavaju intezitet fluorescencije nazivaju

se auksofuori, a oni koji slabe intezitet diminofluori. Auksofluori su supstituenti koji se kad

se uvedu povećavaju delokalizaciju π elektrona. Obično se uvode ovi supstituenti sa orto i

para direkcionim grupama kao sto su fluoro, amino, alkilamino, dialkilamini, hidroksi,

metoksi grupe itd. Planarna rigidna struktura molekule ne dozvoljava pojavu vibracija i

rotacija koje rezultiraju bezemisionim gubitkom energije ekscitacije, kao što su trans

izomeri. Diminofluori djeluju kao meta direkcioni supstituenti koji pokazuju tendanciju da

lokaliziraju π elektrone kao što su karboksi, cijano, nitro i aldehidna grupa. Supstituenti kao

što su hlor, brom i jod, iako su orto i para direkcioni supstituenti, smanjuju intezitet

fluorescencije jer povećavaju unutar sistemsko ukrštanje.


71

Primjena fluorescencije je ograničena na spojeve koji posjeduju sistem dvostrukih

veza. Najintezivnije i najprimjenjljivie fluoresciraju spojevi koji imaju aromatske

prstenove, dok je veoma mali broj alifatskih i aromatskih jedinjenja sa karbonilnom grupom

koja mogu da fluoresciraju.

Razni faktori mogu uticati na intezitet fluorescencije a to su: koncentracija uzorka

koji fluorescira, prisustvo drugih supstanci koje fluoresciraju ili ne fluoresciraju, prisustvo

supstanci koje izazivaju gašenje fluorescencije, uticaj koncentracije vodikovih jona, uticaj

temperature, uticaj rastvarač, uticaj razgradnje uzorka.

Postoje dvije vrste instrumenata koje se koriste za ovu metodu: fluorimetri i

spektrofluorimetri. Razlika izmeĎu ova dva instrumenta je neznatna, fluorimetar ima filtere,

a spektrofluorometar ima prizme (monohromator) za selekciju valnih duţina pri

pobuĎivanju uzorka i prizme za selekciju valne duţine prilikom registriranja emisije

fluorescencije. Slika 2 prikazuje tipičan raspored sastavnih dijelova fluorimetra i

spektrofluorimetra.

Tipičan raspored sastavnih dijelova fluorimetra i spektrofluorimetra.

Fluorescencijski instrumenti su uglavnom dvosnopni instrumenti radi kompenzacije

fluktuacije zračenja izvora. Snop za uzorak najprije prolazi kroz primarni filter ili

monohromator , pri čemu se propušta zračenje koje uzrokuje fluorescenciju, a ograničuje ili

isključuje zračenje koje odgovara fluorescencijskim valnim duţinama. Fluorescencijsko

zračenje uzorka širi se u svim smjerovima, ali ga je najpogodnije posmatrati pod pravim

uglom u odnosu prema pobudnom snopu. Pri drugim uglovima raspršenje u otopini i na

stijenkama kivete moţe prouzročiti velike pogreške u mjerenjima inteziteta. Emitirano

zračenje nakon prolaza kroz sekundarni filter ili monohromator, kojima se za mjerenje

izolira fluorescencijski maksimum, dolazi do fotoelektričnog detektora. Referentni snop

prolazi prigušivačem kojime se postiţe smanjenje njegove snage na pribliţno onu

vrijednost koju ima fluorescencijsko zračenje. Signali referentnog fotodetektora i onog za

uzorak procesiraju se diferencijalnim pojačalom čiji se signal očituje na mjeraču ili pisaču.

Fluorimetri su osjetljiviji od spektrofluorimetara jer filteri imaju veću propustljivost

zračenja od monohromatora. Izvor i detektor se u jednostavnijim instrumentima mogu

smjestiti pono bliţe uzorku, čime se postiţe veća osjetljivost.

Širina primjene fluorimetrijskih metoda za analizu organskih tvari je veoma impresivna.


72

Fluorescencija kao pojava našla je primjenu npr. u medicini, forenzici, mineralogiji i

kristalografiji, proizvodnji svijetlećih tijela itd. Velike biomolekule mogu imati

fluorescentnu kemijsku grupu vezanu kemijskom reakcijom, a fluorescencija te grupe

omogućava vrlo osjetljivu detekciju molekule.


Potrebni reagensi:

- Uzorak za analizu-Pčelinji med

- Standardi-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina (troloks),

«Sigma Aldrich

» Chemie GmbH, Njemačka,(sintetski vodotopivi analog vitamina

E.

- fluorescein «FLUKA» Chemika GmbH, Steinheim, Germany;

- hidrogenperoksid, 33-35 %, ''Semikem'', Sarajevo

- bakar(II)-sulfat-pentahidrat, p.a. Kemična tovarna podnart Slovenija

Potrebna oprema i pribor:

- vaga

- menzura

- čašice ili posudice za vaganje

- odmjerni sudovi

- pH-metar

- mikropipete

- termostat

- kivete za uzorke

Za analizu će biti korištena metoda oksigen radikal apsorpcijskog kapaciteta

(ORAC). Ova metoda moţe kvantitativno mjeriti ukupni AC biološkog uzorka kao npr.

ljudskog i ţivotinjskog seruma, tkiva, poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda, sastojaka

hrane, farmaceutskih proizvoda itd. Metoda mjeri efektivnost različitih prirodnih

antioksidanata prisutnih u uzorku, u spriječavanju gubitka intenziteta fluorescencije

fluoresceina (FL) ili fluorescentnog marker proteina -pikoeritrina (beta-PE) tokom

njihovog izlaganja djelovanju FR.

Struktura fluoresceina

Rezultati ORAC metodom postiţu se dovodeći reakciju do kraja i integrirajući

površinu ispod kinetičke krive relativno prema reakciji slijepe probe koja ne sadrţi dodane

antioksidante. Površina ispod krive srazmjerna je koncentraciji svih antioksidanata

prisutnih u uzorku. Svaka reakcija se kalibrira upotrebom standarda troloksa (Trolox

), koji

je sintetski vodotopivi vitamin E analog.


73

Podaci se proslijeĎuju elektronski od Perkin-Elmer luminiscentnog spektrometra LS

55 na računarski sistem opremljen softverskim programom FL WinLab i analiziraju

programom Microsoft Excel 2000 primjenjujući jednačine (1) i (2) za površinu ispod

fluorescentne opadajuće krive:

..../, / PSSPSUgmolTE SSSSkORAC

gdje je : ORAC - oksigen radikal apsorpcijski kapacitet izraţen u troloks ekvivalentima

(TE, mol/g)

k - faktor razrijeĎenja otopine;

US - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak

..PSS - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za slijepu probu

SS - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za standard

Površina integrala ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak, standard ili slijepu probu

izračunava se po obrascu za izračunavanje površine trapeza na slijedeći način:

iiii ffttffttffttS 1112120101 ...2

1

gdje je:

S - površina integrala ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak, standard ili

slijepu probu

t - vrijeme inkubacije

f - relativni intenzitet fluorescencije

a) Priprema uzorka

U čistoj i suhoj čašici odvagati na analitičkoj vagi oko 1 g uzorka meda, zapisati tačnu

masu odvage, dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i miješati staklenim štapićem do

otapanja. Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje

čaše sa još 10 ml destilirane vode. Nakon što se i taj dio prenese u odmjerni sud, otopina se

protrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomoću špric balona. Od tako pripremljenog

uzorka uzeti 100 l, razrijediti ih sa 900 l destilirane vode i nakon miješanja na vorteksu

koristiti za analizu.

b) Priprema standarda, fluoresceina i generatora peroksidnih radikala

Pripremiti slijedeće otopine:

4,00 ml 1 mM otopine troloksa (na odvagu troloksa dodati 100 l etanola, a zatim

3,90 ml destilirane vode); zatim razrijeĎivanjem u vodi pripremiti 1,00 ml 20 M

otopine troloksa.


74

10,00 ml 0,64 M otopine fluoresceina (FL);

1,00 ml 2,2 M H2O2;

10,00 ml 72 mM CuSO4 u destiliranoj vodi.

c) Eksperimentalna procedura

U kivetu za mjerenje dodati 50,00 l 0,64 M otopine FL, 100 l 20 M otopine troloksa

ili uzorka meda (razrijeĎenog na odgovarajući način), 1750 l destilirane vode, 50 l 72

mM otopine Cu2+

, postaviti kivetu u aparat za mjerenje,a odmah zatim 50 l 2,2 M otopine

H2O2 i promješati sadrţaj. Nakon toga mjeriti intezitet fluorescencije svakih 10 minuta u

roku od sat vremena.

Slijepa proba:

50,00 l 0,64 M otopine FL, 1850 l destilirane vode i nakon termostatiranja 50 l 72

mM otopine Cu2+

+ 50 l 2,2 M otopine H2O2).

NAPOMENA

Prije rada upoznati se sa načinom rukovanja kemikalijama koje se koriste. Podaci o

štetnosti kemikalija, kao i načinu pruţanja prve pomoći nalaze se u laboratoriju

(konsultovati asistenta i laboranta)! Ovdje su navedene neke informacije za supstance

povećanog rizika:

- Hidrogenperoksid Hidrogenperoksid izaziva oštećenja na koži i stoga je upotreba zaštitnih rukavica obavezna pri radu sa ovom supstancom!

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Šta je fluorescencija, a šta fosforescencija?

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

2. Koji su glavni nedostaci spektrofluorimetrije kao metode?

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

3. Iz kojih razloga se Cu2+

i H2O2 u korištenoj metodi ne dodaju u smjesi već posebno?

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________


75

4. REZULTATI

OVJERA VJEŽBE

Slijepa

proba

Standard

Površina

ORAC

Documents

Anela Topĉagić Lejla Klepo Ismet Tahirović za organsku hemiju i... · 2020. 2. 21. · BIOHEMIJA II LABORATORIJSKE VJEŽBE (INTERNA SKRIPTA) Student:_____ Grupa:_____ Sarajevo,

Anela Topĉagić Lejla Klepo Ismet Tahirović za organsku hemiju i... · 2020. 2. 21. · BIOHEMIJA II LABORATORIJSKE VJEŽBE (INTERNA SKRIPTA) Student:_ Grupa:_ Sarajevo,