11/4/2013

1

Apsorpciona Apsorpciona Apsorpciona Apsorpciona infracrvena infracrvena infracrvena infracrvena

spektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrija

2

Molekulska spektroskopija

Vibraciona spektroskopija

� Apsorpcija energije u infracrvenom području (2500 nm do 20000

nm) nije dovoljna za ekscitaciju elektrona - prelazak na viši energetski

nivo, već izaziva samo promene u energiji vibracije.

� Atomi u molekuli neprekidno vibriraju pri čemu dolazi do promene u

dužini veze i orjentaciji atoma.

� Vibracije u molekulu zavise od:

1) mase atoma,

2) prostornog rasporeda i

3) jačine veze.

� Prema ovim osobinama razlikujemo jednu molekulsku vrstu od

druge, iz čega sledi da je IR spektar jedinstvena karakteristika za

pojedinu molekulsku vrstu.

11/4/2013

2

3

� Identifikacija farmaceutskih supstanci (“otisak prsta”) u rutinskoj kontroli lekova.

� Tokom razvoja postupka sinteze farmaceutskih supstanci za:

���� potvrdu prisustva/odsustva karakterističnih funkcionalnih grupa (npr. karbonilne grupe),

���� ispitivanje tipa hemijske veze,

���� praćenje hemijskih reakcija i kinetike hemijskih procesa.

� Za karakerizaciju farmaceutskih preparata, npr. tablete i kremovi.

� Za proveru kvaliteta plastične ambalaže.

� Za potvrdu prisustva/odsustva polimorfizma.

Primena IR spektrofotometrije u farmaceutskoj analizi

4

Prednosti

☺ Daje potpunu potvrdu hemijske strukture ispitivanih supstanci na osnovu, za svaku supstancu jedinstvenog, IR spektra.

☺ Softverska podrška omogućava poređenje dobijenog spektra ispitivane supstance sa spektrom standardne supstance koji se čuva u bazi podataka.

Nedostaci

� Retko se primenjuje u kvantitativnoj analizi zbog složene pripreme uzorka i složenosti spektra koji se dobija.

� Ne može se primeniti za identifikaciju pojedinačnih nečistoća -registruje se prisustvo ukupnih nečistoća.

� Za pripremu uzorka potrebno iskustvo.

� Za tumačenje spektara potrebno veliko iskustvo.

� Metoda nije robusna, jer rukovanje uzorkom može značajno uticati na izgled spektra.

11/4/2013

3

5

� Hemijske veze analita apsorbujusvetlost talasne dužine od 2500 nm do 20000 nm (frekvencije od 4000 cm-1 do 500 cm-1). Usled toga veze se istežu (eng. strech) ili savijaju (eng. bend).

� Frekvencija (talasni broj) svetlosti, koju uzorak apsorbuje,karakteristična je za određene hemijske veze u molekuli analita.

� Trake koje se u IR spektru javljaju na određenoj frekvenciji (talasnom broju) karakretistične su za određene hemijske veze.

Princip IR spektroskopije

istezanje savijanje

6

Opseg Daleka IR oblast Središnja IR oblast Bliska IR oblast

Talasnih dužina λ (µm)

500 – 1000 2,5 - 50 0,8 - 2,5

Talasnih brojeva ν (cm-1)

200 - 10 4000 - 200 12500 - 4000

� U farmaceutskoj analizi najviše se primenjuje središnja IR oblast.

� Svetlost u ovoj oblasti talasnih dužina dovodi do promene u vibracijama hemijskih veza.

� Veza apsorbuje svetlost na frekvenciji koja odgovara frekvenciji prirodne vibracije te veze pri čemu dolazi do povećanja amplitude vibracije veze.

� Kao posledica apsorpcije svetlosti javlja se karakteristična traka na odgovarajućem talasnom broju.

Veza između talasne dužine i talasnog broja je:

µµµµm=104/talasni broj talasni broj=104/µµµµm

11/4/2013

4

7

� Uticaće samo na hemijske veze koje su dipoli – imaju dipolni momenat koji se menja u funkciji vremena na frekvenciji upadnog IR zračenja.

� Na simetrične organske molekule (O2, N2 i sl.) nema uticaja, tj. simetrične veze ne apsorbuju zračenje u IR oblasti.

� Vibracije koje izaziva zračenje u IR oblasti složene su čak i kod malih organskih molekula.

� Dve osnovne vrste vibracija u IR aktivnim molekulima suistezanje (eng. strech) i savijanje (eng. bend).

8

� Savijanje se može javiti usled savijanja-ljuljanja (eng. rocking), klanjanja (eng. wagging), uvrtanja (eng. twisting) ili seckanja (eng. scissoring).

� Osnovne vrste vibracija prikazane su na primeru metilenske grupe:

Simetrično istezanje Asimetrično istezanje Seckanje

Savijanje-ljuljanje Klanjanje Uvrtanje

11/4/2013

5

9

Simetrično istezanje

Asimetrično istezanje

Seckanje

Savijanje-ljuljanje

Klanjanje

Uvrtanje

U RAVNI IZVAN RAVNI

10

� Farmaceutske supstance – molekuli složene strukture imaće veoma složene IR spektre.

� Svaka supstanca ima jedinstveni IR spektar i on predstavlja njegov “otisak prsta” koji omogućava identifikaciju sa potpunom sigurnošću.

� Frekvencija (talasni broj) koju neka veza apsorbuje zavisi od:

���� njenog dipolnog momenta,

���� jačine veze i

���� mase atoma između kojih je ta veza formirana.

� Kovalentne veze ne treba zamišljati kao štapiće, već kao elastične opruge.

11/4/2013

6

11

� Molekule koje imaju dva atoma ponašaju se kao harmonični oscilatori i to ponašanje može se prikazati Hukovim zakonom.

µπν k

c2

1=

21

21

mm

mm

+=µ

� Jednačina prikazuje zavisnost talasnog broja ( ) od jačine veze (k) i

atomskih masa (µµµµ).

- talasni broj (1/λλλλ)

k – konstanta jačine veze

µ - zavisi od mase atoma

c – brzina svetlosti

ν

ν

12

� Veza između dva atoma većih masa (veće µµµµ) vibrira na nižim frekvencijama.

� Povećanjem mase atoma koji je vezan za C atom opada talasni broj (vibrira na nižim frekvencijama).

� Jača veza (veće k) vibrira na većim frekvencijama, a slabija veza (manje k) na nižim frekvencijama.

� Trostruka veza između dva atoma, jača je od dvostruke ili proste veze pa joj odgovara veći talasni broj (vibrira na većim frekvencijama).

11/4/2013

7

13

� Rezonantni efekat pomera apsorpciju ka nižim frekvencijama.

-C=O

1715 cm-1

1675 -1680 cm-1

� Rezonantni efekat menja karakteristike –C=O veze i ona poprima karakter proste veze (manje k).

14

11/4/2013

8

15

� Najveći broj karakterističnih traka odgovara talasnim brojevima većim od 1500 cm-1.

� Trake na talasnim brojevima ispod 1500 cm-1 veoma je teško tumačitii sa sigurnošću odrediti kojoj funkcionalnoj grupi odgovaraju.

16

Primer razlikovanja funkcionalnih grupa u IR spektru:

� Svi alkoholi apsorbuju u području talasnih brojeva od 3300 cm-1

do 3500 cm-1.

� Razlikuju se u području deformacionih vibracija:

1°°°° alkohol – 1050 cm-1

2°°°° alkohol – 1100 cm-1

3°°°° alkohol – 1150 cm-1

fenolna grupa – 1200 cm-1

11/4/2013

9

17

1) IR svetlost propušta se kroz analizirani uzorak.

2) Analizom propuštene svetlosti (eng. transmittance) utvrđuje se koliko energije je apsorbovano i na kojoj talasnoj dužini (talasnom broju) tj. dobija se IR spektar.

100 % T uzorak ne apsorbuje svetlost

0 % T uzorak je potpuno apsorbovao svetlost

Snimanje IR spektra

18

� Postoje dve vrste uređaja za snimanje IR spektara:

���� Uređaj sa monohromatorom kod koga se podešava u kom opsegu će se talasne dužine menjati, a talasni brojevi na kojima se odigrava apsorpcija se kontinuirano registruju.

���� FT-IR (eng. Furier transform) uređaj sa interferometrom kod koga se apsorbancija meri na svim talasnim dužinama istovremeno.

� Intenzitet IR trake

s – jak (niska transmisija)

m – srednji

w – slab (visoka transmisija)

Snimanje spektra

11/4/2013

10

19

Priprema uzorka za snimanje spektra

Primenom transmisije

Primenom difuzne refleksije

Primenom prigušene totalne refleksije

Priprema uzorka

20

Metoda I - snimanje spektra primenom transmisije:

� Tečnosti se ispituju u vidu filma između dve pločice koje su transparentne za IR svetlost ili u ćeliji odgovarajuće dužine putanje, takođe transparentnoj za IR svetlost.

�Gasovi se ispituju u kiveti koja je transparentna za IR svetlost; kiveta se vakuumira, a zatim kroz ventil ispuni ispitivanim gasom.

11/4/2013

11

21

�Čvrste supstance u rastvoru - pripremljene u odgovarajućem rastvaraču, ispituju se u ćeliji odgovarajuće dužine putanje transparentnoj za IR svetlost.

� Čvrste supstance ispituju se:

���� Pripremom “mull” suspenzije sa minimalnom količinom tečnog parafina; smeša se nanosi između dve pločice transparentne za IR svetlost.

���� Pripremom halidnog diska – ispitivana supstanca se izmeša sa fino sprašenim i osušenim KCl ili KBr, u odgovarajućem kalupu u vakuumu formira se halidni disk. Loši diskovi mogu nastati zbog: prekomernog ili nedovoljnog usitnjavanja, vlage ili drugih onečišćenja u KCl ili KBr (disperzionom medijumu).

Priprema uzorka

22

Metoda II - snimanje spektra primenom difuzne refleksije(eng. diffuse reflectance infrared Furier transform – DRIFT):

�Pripremi se triturat od ispitivane čvrste supstance i fino sprašenog i osušenog KCl ili KBr.

� Fino sprašeni i pomešani triturat sipa se u metalnu posudu.

� Upadna IR svetlost odbija (reflektuje) se od dna metalne posude i prolazi kroz pripremljeni uzorak.

� Dobija se IR spektar sličan onome koji se dobija sa halidnim diskom.

� Ovakav način snimanja spektra preporučuje se kod ispitivanja polimorfizma.

� Kompresija kod pripreme halidnog diska može dovesti do interkonverzije polimorfnih oblika.

Priprema uzorka

11/4/2013

12

23

Metoda III - snimanje spektra primenom prigušene totalne refleksije (eng. attenuated total reflection - ATR)

� Koristi se svetlost reflektovana od strane odgovarajućeg medijuma tzv. unutrašnji reflektujući element kao što su dijamant, germanijum, cink-selenid, talijum-bromid, talijum-jodid ili neki drugi materijal koji ima visok indeks refrakcije.

� Metoda pogodna za ispitivanje gelova ili kremova koji se mogu direktno naneti na unutrašnji reflektujući element.

� Pogodna za karakterizaciju polimorfnih oblika.

Priprema uzorka

24

HO

� Jedinjenja se razlikuju samo po konfiguraciji -CH3 grupe na položaju C16.

� I ovako mala mala razlika u strukturi je dovoljna da IR spektri ove dve supstance izgledaju potpuno drugačije.

� Čak se i trake na 1620 cm-1, koje odgovaraju istezanju –C – C – veze, očigledno razlikuju.

Identifikacija na osnovu karakterističnih traka - “otisak prsta”

β

α