Apuntes Genetica Molecular

Apuntes de Gentica Molecular 2012

1 Prof. Alfonso Hernndez Monsalves

APUNTES GENTICA MOLECULAR

Caractersticas Generales del genoma eucarionte

A diferencia de la clula procarionte, las clulas eucariontes contienen su material gentico en un compartimento separado del resto de los elementos citoplasmticos, el ncleo. Este ncleo posee poros que lo comunican con el citoplasma.

A pesar de que el cido desoxirribonucleico (DNA) fue descubierto a finales de la dcada de 1870 (denominado inicialmente nuclena), su papel como portador de la informacin gentica solo fue comprobado en 1952, con los experimentos de Hershey y Chase, en donde se comprob que era el DNA y no las protenas el responsable de traspasar la informacin gentica.

La informacin para el desarrollo y las funciones especficas de las clulas y tejidos se almacena en los genes. Un gen es una

porcin de la informacin gentica, definibles de acuerdo a la estructura y la funcin. Los genes se encuentran en los cromosomas y se componen de DNA. Este consiste en una molcula larga y compleja, cuyos constituyentes estructurales bsicos son los nucletidos, los que a su vez se componen de un azcar (pentosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato.

Bases nitrogenadas

Son molculas derivadas de la pirimidina o de la purina. Existen 5 bases nitrogenadas que se encontraran tanto n DNA como en RNA

Bases Pricas: Adenina (A) y Guanina (G) Bases Pirimidnicas: Timina (T), Citosina (C), Uracilo (U)

El uracilo reemplaza a la timina en las molculas de RNA.



Pentosas

Corresponden a azucares de 5 carbonos. En los cidos nucleicos encontramos dos tipos:

Desoxirribosa: forma parte del DNA Ribosa, forma parte del RNA. Difiere de la desoxirribosa en que posee un grupo hidroxilo en

el carbono 2.

Fosfato

La presencia de un grupo fosfato en el carbono 5 de la pentosa (ya sea Desoxirribosa o Ribosa) permite la polimerizacin de varios nucletidos, formando la cadena caractica a travs de un enlace fosfodiester entre los carbonos 3 y 5 de la pentosa. Por lo tanto, al formarse una cadena simpe de DNA, siempre qudar un extremo 3 y un 5 libres.



Formacin de la doble cadena de DNA.

Las bases nitrogenadas tambin pueden asociarse entre s, permitiendo la formacin de la doble hlice. En este caso, una purina siempre va a asociarse con una pirimidina y viceversa. La citosina siempre va a asociarse con guanina, formando tres enlaces de hidrogeno entre ellas, mientras que adenina y timina forman dos enlaces de hidrgeno. No son posibles otras asociaciones de manera natural, por lo que siempre encontraremos los pares A-T y C-G. Es importante mencionar que al asociarse dos cadenas de DNA para formar la doble hebra, lo hacen de manera antiparalela, es decir que la secuencia de bases nucleotdicas en la cadena en direccin 5 a 3 es complementaria a la cadena 3 a 5



Replicacin del DNA

La replicacin del DNA es el proceso por el cual el DNA es duplicado y por lo tanto perpetuado.

Algunas caractersticas de la replicacin del DNA

Es un proceso semiconservativo, esto quiere decir que las molculas finales contienen una hebra nueva, recin sintetizada, y la complementaria, hebra antigua, que sirvi como templado (molde).

Este proceso transcurre de manera simultnea en varios sectores del DNA genmico.

Es un proceso secuencial, ya que una polimerasa no duplica todo el largo del cromosoma de una sola vez, sino que lo hace por segmentos

Ocurre en ambos sentidos de la doble cadena, por lo que es bidireccional.

Se inicia en sitios especficos de la secuencia de DNA a replicarse.

Tiene un carcter semidiscontinuo, por lo que una hebra se sintetiza sin interrupciones (hebra continua o lder), mientras que otra se sintetiza por fragmentos (hebra discontinua).

Al sitio donde se lleva cabo la replicacin se le conoce como horquilla de replicacin. Adems podemos reconocer otros componentes como: hebra lder, hebra discontinua y fragmentos de Okazaki.



El DNA es replicado por DNA polimerasas, las que utilizan una hebra como molde, sobre el cual realizan la sntesis de la hebra complementaria utilizando los desoxinucletidos trifosfatos adecuados. La cadena de DNA naciente siempre crece en sentido 5 a 3 *, es decir, el nucletido que se agrega une su fosfato al grupo 3-OH libre de la cadena en sntesis, este enlace ocurre entre las pentosas que componen los nucletidos.

(* No confundir, el sentido de crecimiento de la nueva hebra de DNA es siempre en sentido 5 a 3. El sentido de lectura de la hebra y en la cual avanza la DNA polimerasa es por el contrario, de 3 a 5.)

Por lo tanto, varios componentes son necesarios para la replicacin, tales como:

Cebador: Primer de RNA, aporta un grupo 3-OH libre a la cadena naciente. Desoxinucletidos trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTPP. Cofactores de la DNA polimerasa: Mg+2, Mn+2. Templado o molde: Hebra de DNA que ser replicada. Protenas (Enzimas):

o DNA polimerasa III: adiciona nucletidos a la cadena naciente. o DNA Helicasa: Rompe puentes H entre bases complementarias. o RNA Primasa: Sntesis Cebador de RNA. o Topoisomerasas: Liberan tensin de la molcula de DNA. o DNA Ligasa: Unen fragmentos de DNA adyacentes. o RPA Y SSBP: impide unin de hebras de DNA separadas por helicasa.



El proceso de replicacin del DNA consta de varias fases o etapas:

1. Inicio de la replicacin: a. Reconocimiento de los sitios de origen de la replicacin. b. Separacin de las hebras de DNA por la helicasa. c. Armado y posicionamiento de la maquinaria replicacional (replisoma).

2. Elongacin: a. Crecimiento bidireccional de las horquillas. b. Reemplazo del primer de RNA por DNA. c. Maduracin de los fragmentos de Okazaki en la hebra retrasada: la ligasa pega los

fragmentos resultantes de la hebra retrasada. 3. Trmino:

a. Reconocimiento de seales de trmino. b. Replicacin de las porciones finales de los cromosomas (telmeros). c. Desensamble del replisoma.

Flujo de la informacin gentica

Concepto de gen

La informacin gentica guardada en el DNA que codifica para las diferentes caractersticas de un individuo est contenida en porciones especficas de DNA. A dichas porciones se les denomina gen. Al conjunto de esas unidades de informacin, se le llama genoma, cuando se habla en forma general. Cuando hablamos de un individuo en especfico, al conjunto de genes propios de ese individuo le llamamos genotipo. Dichos genes codificarn para polipptidos que darn como resultados caractersticas propias de cada individuo. Dichas caractersticas son el resultado de la interaccin de los genes con el medio ambiente y se le llama fenotipo.

A la localizacin precisa de un gen en un cromosoma se le conoce como locus (plural loci). En los organismos diploides, cada gen posee dos formas alternativas, una heredada del padre y otra de la madre. A dichas formas se les denomina alelos y ocupan loci idnticos en cada cromosoma.

El cdigo gentico

La informacin gentica se encuentra en la secuencia de pares de bases de nucletidos (A-T o G-C). Una secuencia de tres pares de bases representa una palabra del cdigo (codn), que codifica para un aminocido. La secuencia del codn determina una secuencia correspondiente de aminocidos. Estos forman un polipptido (producto gnico).



La secuencia de las bases nucleotdicas se transfiere primero de una cadena de DNA a una molcula portadora de informacin de RNA mensajero (mRNA), en el proceso de transcripcin. A continuacin, la secuencia de bases de nucletidos del mRNA sirve como una plantilla para una secuencia de aminocidos que corresponden al orden de los codones (traduccin). Dicho orden fue descrito en la dcada de 1950 y se conoce como Cdigo gentico, el cual representa el abecedario, para traducir la informacin contenida en un codn a un aminoacido.

Genes y mutaciones

El DNA codificante y su correspondiente polipptido son colineales. Una alteracin (mutacin) de la secuencia de bases del DNA puede conducir a un codn diferente. La posicin de los cambios resultantes en la secuencia de aminocidos corresponde a la posicin de la mutacin. Estas alteraciones son estables en el tiempo y generalmente se expresan como un cambio fenotpico en el organismo dado. Un concepto que deriva del de mutacin es el de polimorfismo. Un polimorfismo se define como la existencia de mltiples alelos en un locus particular y que son independientes de la funcin gnica. Generalmente poseen una prevalencia mayor en la poblacin ( 1%).

Uno de los tipos de polimorfismos ms estudiados son los Polimorfismos de un solo Nucletido o SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), las cuales corresponden a cambios en un solo nucletido en un sitio particular en la secuencia de DNA. Por otra parte los microsatlites corresponden a secuencias cortas (2-5 bp) que se repiten de forma variable (tambin son



llamados STR, por Short Tandem Repeat, Repeticiones de secuencia corta), y los minisatelites son secuencias un poco ms largas (6-100 pb) que tambin se repiten de forma variable (tambin llamadas VNTR, Variable number of tndem repeat).

De acuerdo al tipo de mudificacin del DNA (mutaciones genticas), las mutaciones podemos clasificarlas en

Sustituciones (cambios de un nucletido por otro): Las sustituciones se denominan transiciones si suponen un cambio entre bases del mismo tipo qumico, o transversiones si son un cambio purina (A, G)

pirimidina (C, T) o pirimidina

purina. Deleciones o inserciones: son respectivamente la eliminacin o adicin de una determinada

secuencia de nucletidos, de longitud variable. Las grandes deleciones pueden afectar incluso a varios genes, hasta el punto de ser apreciables a nivel cromosmico con tcnicas de citogentica. Inserciones o deleciones de unas pocas pares de bases en una secuencia codificante pueden provocar desplazamiento del marco de lectura (frameshift), de modo que la secuencia de nucletidos del mRNA se lee de manera incorrecta.

Tambin podemos clasificar las mutaciones de acuerdo al impacto que tendrn en la cadena polipeptdica que codifican (mutacin gnica).



Cuando estas mutaciones se producen en un nucletido pero no afectan el cdigo de transformacin del codn, el aminocido resultante no cambiar. Por ejemplo, si tenemos el codn UGU, que codifica para cistena y ocurre una sustitucin de U por C en la tercera base, el codn resultante quedar como UGC, el cual tambin codifica para una cistena, por lo que no alterar la conformacin de la cadena polipeptdica. A dichas mutaciones se les conoce como mutaciones silenciosas, ya que su impacto sobre el polipptido puede pasar desapercibido.

Siguiendo con el ejemplo del codn UGU, si ahora ocurriera una mutacin de U por guanina en la tercera base, el codn resultante sera UGG, el cual codifica para triptfano. En este caso si ocurre una alteracin en la cadena polipeptdica, la cual puede impactar en la estructura secundaria y terciaria de la protena, y por lo tanto disminuir la actividad de dicha protena. A dichas mutaciones se les conoce como mutaciones de sentido perdido o de cambio de sentido (missense).

En el mismo caso del codn UGU, ahora ocurriera un cambio de U por A en el tercer nucletido, el codn resultante, UGA, es reconocido por la maquinaria traduccional como una seal para detener el proceso (Stop codon). A dichas mutaciones se les llama mutaciones sin sentido (nonsense), ya que la protena resultara truncada en su estructura, perdiendo su funcin.

Estructura de un gen

En un gen se reconoce varias porciones delimitadas:

Regin Promotora: una porcin del DNA situada al principio del gen y que, sin codificar ningn aminocido, sirve para que el complejo transcripcional reconozca el sitio de inicio del gen. En esta regin se unen varios protenas y factores de transcripcin, as como la RNA polimerasa.

Regin estructural: es la parte del gen que contiene la informacin para la sntesis de la protena. En la regin codificadora van a existir fragmentos de DNA que no contienen informacin traducible (una regin 5 no codificante o 5 UTR, los intrones y una regin 3 no tragducible o 3 UTR), y fragmentos que s que contienen informacin (exones). Considerando la hebra 5'->3', el principio de esta regin viene marcado por la secuencia de bases nitrogenadas ATG (codn de inicio, codifica para metionina) y el final por una un codn de parada o stop (TAA, TAG, TGA).

La regin terminadora. Marca el final del gen.



Transcripcin

La transcripcin de una hebra de DNA en una molcula de RNA complementario es el primer paso en la expresin gnica. Mltiples protenas (llamados factores de transcripcin) forma complejos de transcripcin, que se une al DNA. Aunque existen diferencias en la transcripcin en procariotas y eucariotas, gran parte del proceso bsico es el mismo. La transcripcin es catalizada por la RNA polimerasa, de la cual existen tres enzimas diferentes en eucariotas, que transcriben diferentes tipos de genes.

Tipos de RNA polimerasas eucariontes

El ncleo eucariota contiene tres tipos de RNA polimerasas, que difieren en los RNA que sintetizan:

RNA polimerasa I, localizada en el nuclolo, sintetiza los precursores de la mayora de los RNA ribosomales, 28S, 5.8S y 18S.

RNA polimerasa II, que est situada en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del mRNA y de ciertos RNA pequeos nucleares estables. Es la ms estudiada de las tres.

RNA polimerasa III, que tambin est presente en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del RNA ribosmico de 5S, de los RNA de transferencia y de una variedad de otros RNA pequeos nucleares y citoslicos.

Proceso de transcripcin

La transcripcin transcurre de manera secuencial en varias etapas:

1. Reconocimiento del molde: la transcripcin comienza con el reconocimiento de un sitio especfico por la RNA polimerasa.

2. Iniciacin: Aqu la doble hlice se abre y comienza a relajarse. Posteriormente comienza la sntesis de mRNA.

3. Elongacin: a medida que la polimerasa se mueve a lo largo del DNA, se sintetiza mRNA. El DNA que ha sido transcrito se rebobina en la doble hlice detrs de la RNA polimerasa.

4. Terminacin la RNA polimerasa se desacopla del DNA. En este punto, la formacin de la transcripcin primaria inestable del mRNA se ha completado (transcrito primario de mRNA). Debido a que es inestable, es posteriormente modificado (procesado) en eucariotas.



El mRNA en su forma nativa es muy propenso a sufrir degradacin en el citoplasma, debido a las enzimas que se encuentran en l y que cortan molculas de mRNA (RNasas). Estas enzimas funcionan como un mecanismo de defensa contra molculas de RNAs ajenas a la clula, como por ejemplo de virus. Por lo tanto, luego de la terminacin, el mRNA debe ser procesado en un proceso llamado maduracin, que consta de tres pasos:

1. Splicing o Corte y empalme: ocurre la remocin de los intrones del transcrito primario de mRNA, de manera de dejar slo los exones para que sean utilizados en la sntesis de protenas. Esto se realiza dentro del ncleo en las estructuras llamadas spliceosomas

2. Adicin de la capucha en extremo 5: Fijacin de un casquete, gorra o capucha (cap), formado por una 7-metil guanina trifosfato, en el extremo 5 del mRNA (5 cap), que promueve la traduccin del RNA y lo protege contra las exonucleasas (enzimas que degradan cidos nucleicos presentes en el citoplasma).

3. Poliadenilacin del extremo 3: Casi todos los RNAs terminan en una estructura de nucletidos AAUAA que induce la adicin de una larga cola de adeninas en el extremo 3, que protege al mRNA de la actividad de exonucleasas.

Transcrito de mRNA maduro



Traduccin

Durante la este proceso que ocurre en los ribosomas, la secuencia de codones formados por las bases de los nucletidos en el mRNA se convierten en una secuencia correspondiente de aminocidos. La traduccin ocurre en un marco de lectura que se define en el inicio de la traduccin (codn de iniciacin). Los aminocidos se unen en la secuencia determinada por las bases de nucletidos de mRNA de una clase adicional de RNA, llamado RNA de transferencia (tRNA). Cada aminocido tiene su propio tRNA, que posee una regin complementaria al codn del mRNA (anticodn). Los codones 1, 2, 3, y 4 del mRNA se traducen en la secuencia de aminocidos metionina (Met), glicina (Gly), serina (Ser) e isoleucina (Ile), etc El codn 1 es siempre AUG (codn de inicio).

Proceso de Traduccin

La traduccin o sntesis proteica en las clulas eucariotas se produce fuera del ncleo de la clula, en los ribosomas. Los ribosomas constan de subunidades de molculas RNA (RNA ribosomales, rRNA) y varias protenas asociadas. Este proceso ocurre en varias etapas:

1. Iniciacin: Se forma un complejo de iniciacin comprendiendo un mRNA, un ribosoma y tRNA. Esto requiere varios factores de iniciacin (IF1, IF2r IF3, etc.). La traduccin siempre iniciar en el codn AUG (Met)

2. Elongacin: un aminocido, determinado por el siguiente codn, se adjunta a la Metionina inicial. Luego, se desarrolla un ciclo de tres fases alargamiento, con reconocimiento del codn, unin del pptido al siguiente residuo de aminocido, y el desplazamiento (translocacin) del ribosoma tres nucletidos en direccin 3 del mRNA.

3. Terminacin: La traduccin termina cuando se alcanza uno de los tres codones de trmino (UAA, UGA o UAG). La cadena de polipptido formado sale del ribosoma y se disocia en sus subunidades. (Los procesos bioqumicos representados en la figura lateral se muestran simplificados).

OJO!: No olvidar estudiar tambin la clase Regulacin de la Expresin Gnica y la parte terica de las guas de laboratorio.

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