Dra. Ela Alvarado A.

CONTENIDO

1. Revisión de los ácidos nucleicos: organización, estructura y funciones.

2. ARN : transcripción y síntesis de proteínas

3. El gen: naturaleza y propiedades.

4. El código genético nuclear, propiedades.

5. El ADN mitocondrial: Características y propiedades. Mapa del ADNm.

6. Variación en la expresión de los genes : penetrancia y expresividad, pleitropía, heterogeneidad genética y expresividad de los genes y otros.

7. Métodos y técnicas del ADN :

* Técnicas de Southern Blood, PCR,

* El ADN recombinante : aplicaciones

8. El Genoma humano : Mapeo de cromosomas, mapa genético y mapa físico

9. Las mutaciones : Tasa de mutación, mutaciones a nivel molecular, clasificación de las mutaciones

MODELO DE UN CROMOSOMA HUMANO MOSTRANDO SUS NIVELES DE ORGANIZACIÓN

BASES:

CITOCINA

2-oxi-4-aminopirimidina

URACILO

(2,4-dioxipirimidina)

TIMINA

(5-metio-2,4-dioxipiridina)

ADENINA

(6-aminopurina)

GUANINA

(2-amino-6-oxipurina)

COMPONENTES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

A. PURICAS

B. PIRIMIDICAS

COMPONENTES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

AZUCARES

•DNA contiene desoxirribosa

•RNA contiene ribosa

FOSFATO

                                                          

       

DESDE LOS GENES A LAS PROTEINAS

UNIDAD DE TRANSCRIPCION DEL ADN (Cadena peptidica de la Globina Humana)

RNA SPLICING

TRADUCCIÓN Y SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

EL CODIGO GENETICO NUCLEAR

PROPIEDADES DEL CÓDIGO GENÉTICO

1. Es universal

2. Es degenerado

3. Es lineal

4. La unión de bases es específica

5. Es un código de tripletes

6. El codón que inicia un gen el AUG (metionina)

7. Los codones de terminación de un gen son: UUA, UAG, UGA.

8. Es variable

9. Es estable

10. Es una estructura totalmente decifrada (se basaron en la sínteiss de cadenas de polinuclótidos desiguales, ej. UUU- Phe-.

EL GEN: PROPIEDADES

Capacidad de dirigir la formación de una réplica exacta de sí mismos.

Capacidad de mutar, esto es, de sufrir alteraciones sin perder la capacidad de reproducirse.

Capacidad de dirigir la formación de enzimas u otras proteínas.

En cada operón se diferencian dos clases de genes

1. Genes estructurales codifican enzimas (E1, E2, E3, ...)

2. Gen regulador, codifica una proteína represora (PR) que puede encontrarse en la forma activa (PRa) o inactiva PRi). Agente que controla la expresión.

Además otras regiones:

Promotor (P), zona donde se une la ARN polimerasa.

Operador (O), zona reconocida por la proteina represora activa. Cuando la PRa

se une al O, bloquea el avance de la ARN polimerasa.

VARIACIONES EN LA EXPRESION DE LOS GENES

Penetrancia y Expresividad :

* Penetrancia : Capacidad del gen para alcanzar una

expresión.

Penetrancia reducida : Algunos individuos que

poseen el genotipo apropiado no expresan este

carácter.Ejm.Retinoblastoma (tumor ocular m.)HAD

* Expresividad : Gama de fenotipos que proceden de

un determinado genotipo.

Expresividad variable: Ejm. Neurofibromatosis tipo

I, Campodactilia, Fibrosis quística, Osteogénesis I.

RETINOBLASTOMA( Penetrancia reducida)

EXPRESIVIDAD VARIABLE:( Campodactilia )

EXPRESIVIDAD VARIABLE : Albinismo

Pleitropía : (Un gen varios efectos). * Genes pleitrópicos: Efectos fenotípicos múltiples causados por un solo gen mutante o por un par de genes. - Síndrome de Marfán (mutación de un solo gen produce patología en ojos esqueleto y sistema cardio vascular) Cromosoma 15q (gen codificador de la fibrilina). - Fibrosis quística: ( puede afectar glándulas sudoríparas pulmones y páncreas).Cromosoma 7q31 - Anemia de células falciformes.(eritrocitos ,hueso y bazo)

PLEITROPIA : S. de Marfan

Heterogeneidad genética : (Varios genes un solo efecto)

* Osteogénesis Imperfecta : ( AD y AR) Mutación de genes causa estructura anormal de la triple hélice del procolágeno.

Codificado por 2 genes ( crom.17 y otro en el crom.7 ).

• Síndrome de Waardenburg :(sordera profunda infantil con alteració pigmentarias causados por diferentes genes recesivos en diferentes loci.(padres recesivos tienen hijos de3 tipos : todos sordos, todos oyentes y otros sordos y oyentes).

• Heterogneidad en las diferentes distrofias musculares: - Duchenne y tipo Becker ligados a X, - Distrofia muscular risomélica AR , - Distrofia muscular facioescápulo humeral AD. (con formas frustradas, unas más severas que otras.)

HETEROGENEIDAD GENETICA:(varios genes un solo efecto) Osteogénesis I

HETEROGENEIDAD GENETICA( S. de Waardenburg )

HETEROGENEIDAD :(En las distrofias musculares)

CARACTERES INFLUIDOS POR EL SEXO : ( expresados en ambos sexos y con frecuencias diferentes)

Fenotipo Genetica Diferencia sexual

Calvicie AD en v

AR en mGran exceso en varones

Hiperplasia suprarrenal congenita

AR Se reconoce mas a menudo en mujeres

Hemocromatosis AD Exceso en varones

Hipogonadismo AR Limitado a varones

Miopía limitada a las mujeres

AD Limitado a mujeres

Pubertad precoz AD Limitado a varones

CARACTERES LIMITADOS POR EL SEXO ( Pubertad precoz )

Niños afectados son mas altos que los de su edad, pero pronto interrumpen su crecimiento y son bajos). Difícil de diferenciar de la HR ligada a X.

CARACTERES LIMITADOS POR EL SEXO (S. de Feminización testicular)

Fórmula cromosomica : 46, XY

Tipo de herencia: AR ligado a X

EDAD Y EXPRESION DE LOS GENES:

Muchos genes actúan antes del nacimiento o en las primeras fases del desarrollo Cuando el niño comienza su vida independiente puede ser afectado: fenilcetonuria, galactosemia (enfermedades metab.) Corea de Huntington : HAD, locus 4p 16.3, Gen CAG 30-35 (premutantes). repeticiones de 35 a 40 (mutantes).

ADN MITOCONDRIAL (ADN mt)

PROPIEDADES DEL “ADNmt”

Doble hélice pequeña de 16,579 pb.

Forma circular, contiene 37 genes para 22 ARNt.

Sus codones de terminación no están codificados por el propio ADNmt. Parece que codifica solo algunas proteínas mitocondriales.

Las enzimas implicadas en su replicación, transcripción y traducción son codificadas por genes nucleares.

Tiene distribución asimétrica de “G” y “C” generando:

Una cadena pesada (H) rica en “G”

Otra cadena ligera (L) rica en “C”.

DIFERENCIAS CON EL ADN NUCLEAR

UGA Codifica para triptofano y no para “terminación”

AUA Codifica para metionina en vez de isoleucina

AGA y AGG Actúan como codones de terminación en vez de codificar arginina.

AUA y AUU Actúan como codones de “inicio” junto a AUG

A=ATPasa; CO=Citocromo oxidasa; Citb=Citocromo b, ND=NADH-coenzima Q reducasa; OH, OL=Orígen de la replicación de las cadenas H y L; 12S, 16S=ARNr, N/C=Región no codificadora, ll=ARNt.

TECNICA DEL “SOUTHERN”

ELECTROFORESIS DE ADN

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Para amplificar cuanto se quiera, segmentos específicos de ADN situados entre los primers que se colocan a ambos lados de la zona que se quiera amplificar

ADN RECOMBINANTE

La técnica del ADN recombinante son métodos que permiten cartografiar los genes humanos sin necesidad de conocer la naturaleza del gen ni el producto del mismo. Consiste en la reunión artificial de moléculas de ADN o parte de esas moléculas que no se encuenran juntas en la naturaleza y provienen de diferentes organismos.

Se agrupan en dos áreas principales.

1. Las técnicas del clonado del ADN

2. Los métodos de análisis del ADN

REQUISITOS BÁSICOS PARA CLONAR “ADN”

1. Un método que permite colocar juntos a porciones de ADN procedentes de distintos organismos.

2. El empleo de una forma de autoreplicación del ADN conocido como vector de clonación que se une a un trozo de ADN que se va ha clonar.

3. El traslado de un vector que lleva una porción de ADN al interior de una célula donde tiene lugar la replicación.

4. Un método para identificar las células que contiene cualquier porción deseada del ADN.

ENZIMA BACTERIAROMPIMIENTO (*)

5’ 3’

Alul Athrobacter luteus AG*CT

Mspl Especies de Moraxella GC*CC

Hinfl Haemophilus influenzae Rf G*ANTC

BamHl Bacillus amyloliquefaciens H G*GATCC

EcoRI Escherichia coli RY13 G*AATTC

Pstl Providencia stuartii CTGCA*G

ENZIMAS DE RESTRICCIONBacterias de donde se obtienen y secudncias de ADN que reconocn(incluye el sitio donde lo rompen)

A=Adenina; C = Citocina; G = Guanina, T = Timina, N = cualquier base

VECTORES DE CLONACIÓN

PRINCIPALES VECTORES DE CLONACION

1. PLASMIDOS

2. FAGICOS

3. COSMIDOS

4. CROMOSOMAS ARTIFICIALES (YACS)

Agentes transportadores, son pequeñas moléculas de ADN con capacidad de autorreplicación que se utilizan para transferir segmentos de ADN extraños entre células huésped.

PLASMIDOSPLASMIDOS• Son organismos muy sencillos que se encuentran en el

citoplasma de las células bacterianas.

• Moléculas de ADN circular de tamaño menor que un cromosoma.

• Frecuentemente contienen 1 ó 2 genes que codifican resistencia a los antibióticos.

• Fueron los primeros vectores de donación fáciles de aislar y purificar, pueden ser reintroducidos en una bacteria por transformación.

• El plásmido más usado es el pBR322, contiene genes que codifican a la ampicilina y a la tetraciclina y muchos sitios de restricción.

PLASMIDOSPLASMIDOS• Son organismos muy sencillos que se encuentran en el

citoplasma de las células bacterianas.

• Moléculas de ADN circular de tamaño menor que un cromosoma.

• Frecuentemente contienen 1 ó 2 genes que codifican resistencia a los antibióticos.

• Fueron los primeros vectores de donación fáciles de aislar y purificar, pueden ser reintroducidos en una bacteria por transformación.

• El plásmido más usado es el pBR322, contiene genes que codifican a la ampicilina y a la tetraciclina y muchos sitios de restricción.

METODOS DE INTRODUCCION DEL VECTORMETODOS DE INTRODUCCION DEL VECTOR

1.1. Transformación Transformación

• La célula capta moléculas de ADN que se encuentra en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma

• Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.

Se observa:

(1) El virus se aproxima a la bacteria llevando un genoma con el gen que le interesa donar.

(2) El virus se pone en contacto con la bacteria donde se forma un poro.

(3) El virus inyecta su ADN al interiror de la célula bacteriana.

2. Transducción.

Consiste en introducir el ADN en una célula hospedadora mediante un

virus

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias se realiza mediante estos procesos:

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias se realiza mediante estos procesos:

El gen es insertado con una fina aguja fabricada por los científicos.

Métodos de introducción del vector.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES• Transportan grandes cantidades de material genético. Por

esto son muy útiles en la secuenciación del genoma.

Cromosoma artificial de levadura: (YACS)(Yeast artifitial chromom

* Es uno de los más utilizados.

* Los segmentos de ADN contienen todos los elementos

necesarios para propagar un cromosoma en levaduras.

* Contienen fragmentos de ADN de 100 a 2000 kb de tama

pueden introducirse en células de S. cereviciae y serán

replicados juntos con los cromosomas verdaderos.

Cromosoma artificial bacteriano:(BAC)(Bacterial artificial

chromome)

* Es un vector de donación alternativo, basados en

plásmidos de fertilidad de E. Coli.

* Facil de reproducir y manipular, no sufre

recombinación con la misma faciliad de los YACS.

* Se insertan un fragmento de ADN foraneo hasta de 30

kb de longitud mediante electroporación.

APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE

1. RFLP (Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción)

2. CARTOGRAFIA DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS

3. PROYECTO GENOMA HUMANO

4. DIAGNOSTICO DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS

5. TERAPIA GENICA

ANALISIS DE LOS RFLP• Son variedades de la longitud de los fragmentos de ADN

generados por una endonucleasa de restricción.

• Se heredan en forma codominante.

• Los RFLP se usan como marcadores de genes o cromosomas específicos.

• El fenotipo depende de la obtencion de los fragmentos de ADN que son de diferentes tamaños.

• Los fragmentos de RFLP se usan para cartografiar un determinado cromosoma empleando híbridos de cromosomas humanos en distintas combinaciones.

• Los RFLP son de diferentes longitudes en diferentes personas que pueden reconocerse por la movilidad alterada de los fragmentos en la electroforesis.

CARTOGRAFIA DE LOS PROCESOS HEREDITARIOS

Para asignar un gen en un determinado cromosoma, es necesario:

* Una gran familia a cuyo través se haya transmitido un proceso hereditario.

* Una colección de RFLP (almenos 1 de cada cromosoma humano)

PROCEDIMIENTO:

* Análisis del árbol genalógico para averiguar el tipo de herencia

del defecto genético y para identificar a los afectados.

* Pruebas a cada miembro de la familia para averiguar el modelo de

herencia de los marcadores de RFLP especificos de cada cromoso.

Ejm. DMD: Xp, HE: 4p, QF: 7q, NF1: 17q11.2 NF2: 22

PROYECTO GENOMA HUMANO

OBJETIVO: Determinar la localización de los genes que contiene el GH y analizar la estructura de esos genes a nivel de la secuencia de los nucleótidos.

PROCEDIMIENTO:

* Construir un mapa genético de alta resolución de cada uno de los cromosomas.

* Utlizando porciones del mapa genetico se elabora un mapa físico de alta resolución.

* A partir del mapa físico se obtendrá una serie de secuencias

yuxtapuestas del ADN clonado.

* Se determinará la secuencia de cada uno de esos clones y la secuencia de los nucleotidos conservados en un banco de datos de un ordenador.

EL GENOMA HUMANO

El mapa genetico humano como resultado del estudio conjunto de la investigaciónpública y privada con los 30,000 genes en los 23 pares de cromosomas

APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIA GENETICA

* Producción de proteínas de utilidad medica (como la somatostatina, la insulina, la hormona del crecimiento humano, los interferones).

* Utilización de plantas desarrolladas mediante ingeniería genética para producir vacunas orales.

* Vacunas sintéticas (por ejm: vacunas contra el paludismo y la rabia) mediante técnicas recombinantes.

CLONACION DE MAMIFEROS (OVEJA “DOLLY”)

1986: se autorizan las pruebas clínicas de la vacuna contra la hepatitis B obtenida mediante ingeniería genética.

1987: propuesta comercial para establecer la secuencia completa del genoma humano (proyecto Genoma), compuesto aproximadamente por 100.000 genes.

1989:comercialización de las primeras máquinas automáticas de secuenciación del ADN.

1994: se comercializa en California el primer vegetal modificado genéticamente (un tomate)

1997: Clonación del primer mamífero, una oveja llamada “Dolly”

MAPA GENETICO DEL CROMOSOMA 1

Marcadores genéticos: Son variedades moleculares obtenidos por tecnicas de ADN recombinante

cM

MAPA FISICODEL CROMOSOMA 11,990

CR

OM

OS

OM

A -

1 1

,995

MUTACION

Definición: Es todo cambio en el material genético que se debe a la variación genética de los seres humanos y de otros organismos.

• Tipos: Microscópica, Submicroscópica (mutaciones de punto) sustitución de una

base por otra en el DNA.

• Detección: ¿Cómo se produce una mutación?1.- En organismos inferiores se pueden diseñar experimentos.2.- En el genoma humano son indirectos y deducibles por inferencia (basándose en el Arbol Genealógico)

TASA DE MUTACIÓN

Definición: Número de veces que se producen alelos mutantes encada locus y en cada generación.

Frecuencia: En humanos es de 10-5 á 10-6 gametos por generación Se deben diferenciar : 1.- Mutaciones recientes , 2.- Mutaciones pre-existentes que se producen en el pasado, y permite un fenotipo normal porque: 2.1- Existen genes mutates al fenotipo normal heredado por

uno de los padres. 2.2- Las mutaciones dominantes no siempre tienen el 100% de penetrancia, por tanto algunas veces no se expresan.

2.3- Las mutaciones dominantes se detectan fácilmente porque se expresan en estado heterocigoto.

2.4 - Las mutaciones que el propio individuo acumula durante su existencia:

* Por mutación expontánea, debido a mecanismos normales en la duplicación o reparación del DNA.

* Por mutágenos: físicos, químicos y biológicos. Ejm. Radiaciones que producen transiciones o tranversiones, desaminación y metilación.

Estudios realizados demuestran que las mutaciones son fenómenos raros en el GH observados en 1/ 1’000,000 de copias que genera 6-7 millones de genes mutantes en cada generación.

Disminuye por factores como: * Naturaleza redundante del código genético, * Carácter recesivo de la mayoria de las mutaciones, * Tasa de muerte temprana que se asocia a muchas enfermedades hereditarias.

MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR

• Las mutaciones en la molécula del ADN han aportado pruebas que existe una unión directa entre el gen, la proteina y el fenotipo.

• Las mutaciones pueden aparecer expontáneamente como consecuencia de un error en la replicación del ADN o como resultado de cambio de los átomos en la base de los nucleótidos.

• La mutación por cambio de lectura produce una modificación en la lectura de los códones que suelen acarrear alteraciones espectaculares en la estructura y función de los péptidos elaborados.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FRECUENCIA DE MUTACIONES EN LOS GENES :

Variaciones se deben a:

1.- Tamaño del gen: DMD 2’000,000 de Pb . NF1 2,000 aa = 300,000 Pb

2.- Secuencia de los nucleótidos: Xfrágil CGG se repiten de 6 –50 veces en no afectados y en afectados > de 50.

3.- Modificaciones químicas expontáneas:Ej. HbA y Hb S

FRECUENCIA DE MUTACIONES EN EL SER HUMANO

Rasgos Mutantes/millón de gametos

Frecuencia de la

mutaciónAcondroplasia

Aniridia

Retinoblastoma

Osteogenesis imperfecta

Neurofibromatosis

Enfermedad poliquistica renal

Sindrome de Marfan

Sindrome de Von-Hippel-Landau

Distrofia Muscular de Duchenne

10

2.6

6

10

50-100

60-120

4-6

< 1

50-100

1 x 10 -5

2.6 x 10 -6

6 x 10 -6

1 x 10 -5

0.5-1 x 10 -4

6-12 x 10 -6

4-6 x 10 -6

1.8 x 10 -7

0.5-1 x 10 –4

Secuencia de los ocho primeros aminoácidos de las cadenas de la HbA y HbS. En posición 6 la HbS tiene Val en lugar de Glu, lo que se debe al cambio de un nucleótido del codón GGA en la HbA por GUA en la HbS.Codón Aminoácido Codón Aminoácido

HbA HbS

GUU Valina

CAU Histidina

UUA Leucina

ACU Treonina

CCU Prolina

GGA Acido glutámico

GAA Acido glutámico

AAA Lisina

GUU Valina

CAU Histidina

UUA Leucina

ACU Treonina

CCU Prolina

GUA Valina

GAA Acido glutámico

AAA Lisina

1. Respecto a su mecanismo de Producción

1.1 En punto Susticiones o Transiciones

Cambio de una base púrica o pirimidica por otra púrica o pirimidica.

Transversiones Cambio de una base púrica por una pirimidica o visceversa.

1.2 Fuera de fase

Adiciones Se adiciona 1, 2 o mas bases.

Deleciones o inserciones

Se suprimen 1, 2 o más bases.

CLASIFICACION DE LAS MUTACIONES

2. Respecto a su Expresión

2.1 Letales La preencia de la mutación es incompatible con la vida.

2.2 Subletales El cambio producido por la mutación permite la vida pero se presentan alteraciones estructurales o funcionales.

2.3 Condicionales El efecto de la mutación solo se observa en determinadas condiciones, es decir por exposición a farmacos.

2.4 Somaticas El cambio por la mutación afecta a algunas estructuras del organismo

2.5 Geneticas La mutación altera la informacion genetica de los gametos y los descendientes.

3. Respecto al efecto que producen en el organismo que las presenta

3.1 Positivo Confieren al organismo una nueva ventaja respecto a su ambiente, una mayor facilidad de adaptación o nuevas aptitudes respecto a otro.

3.2 Negativo Pueden restar capacidades de sobrivencia, de adaptación o estructura. Son los más frecuentes. Ej. Producen los padecimientos hereditarios (autosómicos recesivos).

3.3 Neutro Pueden o no conferir cambios.

MUTAGENOS

1. FISICOS

* RADIACIONES

- Radiaciones ionizantes (rayos X, rayos , , , etc)

- Luz ultravioleta

2. QUIMICOS (Tabaco, alcohol, alquitran, etc)

3. BIOLOGICOS

* Virus (retrovirus)