ARTÍCULO ORIGINAL

El ácido acetilsalicílico inhibe la inflamación de las vías respiratorias por Th17 mediante el bloqueo de la retroalimentación positiva de IL-6 e IL-17

Las respuestas de las células T-helper (Th) 17 son importantes para el desarrollo de la enfermedad inflamatoria neutrofílica. Recientemente, se encontró que el ácido acetilsalicílico (ASA) inhibió la inflamación de las vías respiratorias por Th17 en un modelo de asma ratón inducido por la sensibilización con lipopolisacárido (LPS)conteniente de alérgenos. Para investigar el mecanismo (s) de los efectos inhibitorios de ASA en el desarrollo de la inflamación de las vías respiratorias por las Th17, un modelo de asma neutrofílica de ratón fue generado por la sensibilización intranasal con LPS más ovoalbúmina (OVA) y luego se expuso solamente con OVA.Parámetros inmunológicos y la inflamación de las vías respiratorias se evaluaron 6 y 48 h después de la última exposición a la ovalbúmina. El ASA inhibe la producción de interleucina (IL) -17 de células T de pulmón, así como la polarización de Th17 in vitro inducida por la IL-6.Además, el ASA, pero no el ácido salicílico, suprimió la inflamación de las vías respiratorias por Th17, lo cual fue asociado con el decremento de la expresión de la acetil-STAT3 ( involucrada en cascada de señalización de la IL-6) en el pulmón.Por otra parte, la producción de IL-6 a partir de células inflamatorias, inducida por la IL-17, es inhibida por el tratamiento con ASA, mientras que la inducida por LPS no lo era. En total, el ASA, probablemente a

través de su resto acetilo, inhibe la inflamación de las vías respiratorias por Th17 por el bloqueo de la retroalimentación positiva de IL-6 e IL-17.

INTRODUCCIÓN

El asma es un síndrome complejo con muchos fenotipos clínicos; sus principales características incluyen un grado variable de obstrucción al flujo aéreo, la hiperreactividad de las vías respiratorias, y la inflamación eosinofílica o no eosinofílica. La persistencia severa y / o de dificultad para controlar el asma puede estar asociada con la inflamación neutrofilica de las vías respiratorias , mientras que el asma leve y moderado puede estar relacionado con inflamación eosinofílica de vías respiratorias, en términos de inmunopatogénesis del asma, la inflamación de las vías respiratorias en pacientes asmáticos puede clasificarse de acuerdo a la participación de determinados subconjuntos de células T CD4 +, incluyendo T-helper (Th) 1, Th2 y Th17.

En los últimos años, la respuesta de las células Th17 se ha destacado como un participante clave en la inflamación neutrófilicas de las vías respiratorias ; y la sobreexpresión de interleuquina (IL) -17 en las células epiteliales de las vía aérea se ha relacionado con la inflamación neutrófilica de las vías respiratorias Además, la exposición de las vías respiratorias a lipopolisacárido (LPS) contenedores de alérgenos que induce la inflamación neutrófilica de las vías respiratorias dependiente de IL-17. La IL-6 es un inductor clave de las respuestas de células Th17 en el

pulmón. En términos de polarización Th17, el transductor de señal y activador de células T (STAT) 3 y el receptor huérfano relacionado a retinoide RORγT son factores de transcripción importantes.La inducción de RORγT es dependiente de la señalización de STAT3, que se activa preferentemente por la IL-6. El ácido acetilsalicílico (AAS) o aspirina, se ha prescrito para el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias durante varias décadas. ASA inhibe la ciclooxigenasa (COX), enzimas que están relacionados con la producción de metabolitos del ácido araquidónico proinflamatorias. Sin embargo, se han propuesto varios mecanismos de los efectos anti-inflamatorios de ASA, distinta de la inhibición de la COX: ASA inhibe la actividad de la quinasa IkB , impidiendo de este modo la activación de NFkB , que está implicado en la patogénesis de la inflamación; ASA desencadena el anti-inflamatorio 15-epi-lipoxina A y la inducción de la apoptosis de las células inflamatorias a través de la proteína quinasa activada por mitógenos; y además inhibe la acumulación de células inflamatorias en una manera dependiente de adenosina.

Anteriormente, se demostró que el ASA inhibe inflamación por Th17, pero mejoró la inflamación por Th2 en el pulmón. En el presente estudio, tenía como objeto determinar el mecanismo (s) de los efectos inhibitorios de la ASA en el desarrollo de inflamación de las vías por Th17 por medio de la inducción por alérgenos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ratones

De tipo salvaje (WT) y el interferón IFNγ C57BL / 6 ratones fueron adquiridos de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME, EE.UU.). IL-17 y OT-II C57BL / 6 ratones fueron amablemente donados por YC Sung (Universidad Pohang de Ciencia y Tecnología (UMSNH), Pohang, Corea del Sur). Estos ratones fueron criados en un laboratorio animal en la UMSNH. Se utilizaron ratones con edad y sexo similares para el control de experimentos con animales . Protocolos de estudios y el uso con animales fueron aprobadas por el Comité de POSTECH Institucional Cuidado de Animales.

Productos químicos, proteínas recombinantes y drogas

LPS y ovoalbúmina (OVA) se adquirió de Calbiochem (Darmstadt, Alemania) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), respectivamente. Recombinante de IL-6 (RIL-6), RIL-12 y rTGF-b1se compraron de R & D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). ASA (aspirina-lisina) se adquirió de Ilyang Pharmaceutical Co. (Yongin-si, Gyeonggi-do, Corea del Sur), y el ácido salicílico (SA) y celecoxib (un COX2inhibitor) fue adquirido de Sigma-Aldrich.

Protocolo para la generación de un modelo de asma neutrofílica de ratón.

Como un alérgeno, OVA se utilizó después de la depleción de LPS a partir del antígeno de la OVA, como se describió previamente. Un modelo de asma neutrofílica de ratón fue generado como se describió anteriormente. En resumen, los ratones de 6 semanas de

edad fueron sensibilizados con OVA por vía intranasal (75 mg) y LPS (10 mg) los días 0, 1, 2 y 7 y después se expusieron por vía intranasal solo con OVA (50 mg) en los días 14, 15, 21 . y 22 Como control negativo, los ratones fueron sensibilizados únicamente con OVA (75 mg) y después se expusieron con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 30 ml). Drogas (ASA, SA y celecoxib) se administraron por vía intraperitoneal en los días 14, 15, 21 y una vez en el día 22 inmediatamente después de la exposición a OVA.

Fluidos de celularidad por lavado broncoalveolar (BAL)

Se obtuvieron fluidos de BAL como se ha descrito anteriormente. En pocas palabras, los ratones fueron anestesiados con ketamina, y la tráquea se aisló mediante disección roma. Un tubo de pequeño calibre fue insertado y asegurado en la vía aérea. Dos volúmenes sucesivos de 0,75 ml de PBS se instilaron y suavemente se aspiraron, y estos dos volúmenes se combinaron. Cada muestra BAL se centrifugó, y los sobrenadantes se almacenaron a 70 1C hasta su uso. El número total de células inflamatorias se contó después de la re-suspensión de los sedimentos celulares con 100 ml de PBS. Después de la tinción de Diff-Quick (Dade Behring, Inc., Newark, DE, EE.UU.) de las células de BAL en una preparación de citospina, los tipos de células inflamatorias fueron determinadas 300 células por recuento, que se clasificaron como macrófagos, linfocitos, neutrófilos o eosinófilos , y se calcularon los porcentajes de cada tipo de célula.

Tinción intracelular de las células T en los tejidos del pulmón y drenaje de ganglios linfáticos de pulmón (LN)

Las células fueron aisladas de los tejidos del pulmón y LN regional (4 106 ml de 1) y se incubaron en placas de 48 pocillos recubiertas con anti-CD3 más anticuerpos anti-CD28 (Abs; 1 mgml 1 cada uno; eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) a 37.1 C durante 6 horas y después se re-estimularon con Brefeldina A (10 mgml 1) durante 2 h. Las células fueron teñidas con superficie-proteína específica Abs (aloficocianina-conjugadas anti-CD3, fluoresceína (FITC)-conjugado anti-CD4 y ficoeritrina Cy5-conjugado anti-CD8, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) durante 30 minutos a 4 1C y después se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente. Las células se incubaron con ABS a las citoquinas candidatos (anti-IL-17-PE, BD Biosciences) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) y usando el programa informático CellQuest (BD Biosciences). El número de células en el pulmón fue determinado multiplicando el número total de células de pulmón por el porcentaje de células CD4þIL-17Aþ T.

La producción de citocinas de células T después de la estimulación con alérgeno específico y alérgeno no específico.

Se prepararon suspensiones de una sola célula de bazo, los tejidos del pulmón o

de pulmón LN-drenaje. Se incubaron las células con estímulos no específicos (anti-bCD3 más anticuerpos anti-CD28 (ABS)) durante 12 h, y con OVA (100 mgml 1) durante 72 h. Se midieron los niveles de citoquinas en los sobrenadantes.

Prueba de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA)

Los niveles de IFN-g, IL-17, IL-6, FNT-α y monocitos quimiotáctico proteína-1 , se cuantificaron mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (R & D Systems).

Preparación de células dendríticas de médula ósea (BMDCs)

BMDCs se prepararon siguiendo los métodos de Lutz et al. En resumen, se prepararon células de médula ósea y se cultivaron en placas de Petri durante 3 días con factor estimulante de colonias granulocitos / macrófagos (GM-CSF; 20 ng ml 1). Tres días más tarde, se añadió medio de cultivo de 10 ml. En los días 6 y 8, se recogieron los sobrenadantes del cultivo y después se centrifugaron. Las células se volvieron a suspender en medios de cultivo que contienen GM-CSF (20 ngml 1). En el día 10, las células se recogieron por centrifugación y luego se resuspendieron en medio de cultivo con GMCSF (5 ngml 1)

Absorción de antígeno por las células inmunes.

El análisis de captación del antígeno se realizó en células RAW 264.7 (líneas celulares de macrófagos) y BMDCs utilizando OVA-FITC (Invitrogen, Life

Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) y el citómetro de flujo FACSCalibur .

Diferenciación in vitro

Los esplenocitos de WT, OT-II e IFN-g / ratones se prepararon como suspensiones unicelulares. Células CD4 + T, células OT-II CD4þ T y CD11cþ DCs fueron aislados por autoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) de los esplenocitos de WTand IFN-g / mice. Para diferenciar Th1 y Th17 subtipos, las células se cultivaron con el ratón de rIL-12 (10 ngml 1), ratón IL-6 (20 ng ml 1) y TGF-b1 humana (10ngml 1) en un anti-CD3 (1mgml 1) anticuerpo recubierto con placa de cultivo durante 3 días. Todos Abs fueron adquiridos de R & D Systems. La producción de IL-17A se ensayó por ELISA, y la presencia de células CD4 + IL-17Aþ T se confirmó usando el citómetro de flujo FACSCalibur

Western blotting y ensayo de inmunoprecipitación

Los tejidos pulmonares se homogeneizaron con tampón RIPA enfriado con hielo (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1% de NP-40, 0,25% de Na-desoxicolato, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, inhibidor de la proteasa). Las concentraciones de proteína se determinaron por el kit de ensayo de proteína DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Los lisados de pulmón

Análisis estadístico

Las diferencias significativas entre los tratamientos se evaluaron utilizando T-test, el análisis de varianza de Student o

la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Para comparaciones múltiples, se utilizó primero el análisis de la varianza, y si No se encuentran diferencias significativas, las pruebas t individuales o Wilcoxon. A continuación, se realizaron pruebas de la suma de rangos de pares de grupos.

Resultados

Efectos del ASA en la inflamación pulmonar mediada por Th17 en ratones deficientes de INF-y

En la evidencia experimental se demostró que el tratamiento con ASA inhibió la inflamación mediada por Th17 durante la exposición al alérgeno, pero no inhibió la inflamación mediada por Th1, lo cual ocasiona un modo de asma neutrofílica inducida por la sensibilización de las vías respiratorias con LPS alérgenos.14

Para definir con mayor precisión el efecto del ASA en el desarrollo de la inflamación pulmonar mediada por Th17, el modelo de asma neutrofilica se desarrollo en ratones con y sin tratamiento con ASA (18mgkg-1) que presentan INF-y -/- y IL-17A-/- .

En el presente estudio, el análisis de celularidad BAL 24 horas después de la última exposición a OVA mostro que la inflamación pulmonar de células inflamatorias inducidas por sensibilización con LPS que contiene OVA fue significativamente menor en IFN-γ en ratones tratados con ASA que en INF-γ en ratones tratados con un control simulado, mientras que este fenotipo fue similiar en IL17A en los

ratones WT tratados con ASA, en comparación con el tratamiento de control simulado. (Figura 1ª).

Basado en el hallazgo del efecto inhibidor de ASA en el desarrollo de la inflamación pulmonar fue prominente en ratones INF-y-/-, que induce el análisis de los efectos terapéuticos del ASA en ratones INF-y -/-.

El análisis de celularidad por BAL 48 horas después de la última prueba con OVA, mostro que la infiltración de macrófagos, linfocitos, neutrofilos y eosinofilos en los pulmones inducida por la sensibilización con OVA que contiene LPS, fue significativamente inhibida por el tratamiento con ASA en comparación con el tratamiento placebo. (Figura 1b).

En el estudio se mostro que los niveles de IL17A en los sobrenadantes de de cultivo de células pulmonares de ratones después de la estimulación con Anti-CD3, Anti-CD28 y también con OVA se aumentaron, en comparación con los ratones expuestos con PBS; este aumento de la producción se inhibió significativamente con el tratamiento con ASA. (Figura 1c).

Además, el número de células Th17 en el tejido pulmonar, expuesto a OVA , se redujo significativamente por el tratamiento con ASA, pero no con el tratamiento simulado. (Figura 1d).

En conclusión estos hallazgos indican que el tratamiento ASA, suprime la infiltración pulmonar y la inflamación inducida de TH17, especialmente en un estado donde hay deficiencia de INF-y.

Efectos de la ASA en el desarrollo de la polarización de Th17 inducida por IL-6.

IL-6, junto con el TGF-b1, es un mediador clave bien reconocido de la polarización de Th17.8 El objetivo fue evaluar el efecto del ASA en la polarización de las TH17 de las células T vírgenes. Para probar esto se aislaron esplenocitos vírgenes en ratones de WT y INF-y-/- , y IL6 (20ngml-1) y r-TGF-B1 (10ngml-1) , seguido de una incubación con un anti-CD3 (1mg) recubriendo la placa por tres días.

En términos del efecto del AAS en la polarización Th1 , el presente estudio mostró que la producción de IFN - g a partir de esplenocitos WT fue mejorada por la rIL - 12 ( 10 ng ML1 ) , pero no se vio afectada por el Tratamiento con ASA. A continuación, se aislaron las células CD4 + T a partir de esplenocitos WT y después se cultivaron las células con rIL- 6 ( 20 ng ML1 ) y el rTGF - B1 ( 10 ng ML1 ) con o sin tratamiento con AAS ( 1000 nM) en anti-CD3- (anticuerpo) recubierto en placas durante 3 días. Los datos sugirieron que la producción de IL -17A de Células CD4 + T, inducida por la IL - 6 y TGF - b1 , fue significativamente inhibida por el tratamiento ASA ( Figura 2c ) . Además, CD4 + Las células T se aislaron a partir de esplenocitos OT- II y CD11cþ, y en países en desarrollo fueron aisladas de IFN - g / esplenocitos , y luego CD4þ T células, CD11cþ DCs y SIINFEKL ( un péptido específico OT- II ; 10 mg) fueron co -cultivadas en condiciones Th17 - conducidos para 3 días.

La Producción de IL -17A a partir de células OT- II T CD4 + fue

significativamente reforzada por las condiciones de polarización Th17 - , y esto ha mejorado la producción significativamente inhibida por el tratamiento ASA (Figura 2d). Además, se encontró que el número de células Th17 para ser mejorada por el TGF - b1 y la IL- 6 ; este aumento fue abolido por el tratamiento ASA (Figura 2e ) . Colectivamente, estos datos sugieren que el AAS suprime la polarización Th17 inducida por la IL - 6 y TGF - b1 , pero no la polarización Th1 inducida por la IL - 12 .

Efectos de la fracción acetilo de ASA sobre el desarrollo de Respuestas de las células Th17

El primer mecanismo de acción conocido de ASA fue la inhibición de COX1 y COX2 a través de la acetilación de estas enzimas. Para investigar el efecto de la inhibición de la COX2 por el acetil fracción de ASA (dice actyl moietyl of ASA) en el desarrollo de las vías respiratorias Th17, la inflamación , el efecto terapéutico de la SA , sin acetil moietyl , y de celecoxib ( un inhibidor de la COX2 selectivo ) se evaluó en el modelo de asma neutrofílica . SA ( 15 mg kg 1 ) y se les administró celecoxib ( 10 mg KG1 ) por vía intraperitoneal durante eldesafío OVA de IFN - g / mice . El Análisis celular BAL mostró que la infiltración pulmonar de células inflamatorias, especialmente neutrófilos, fue notablemente inhibida por ASA, parcialmente inhibida por el celecoxib , pero no afectada por el tratamiento SA ( Figura 3a ) . Del mismo modo, la producción anti-CD3/CD28-inducido por IL - 17A a partir de células T en los

pulmones de drenaje LN se encontró que se redujo significativamente por ASA o el tratamiento con celecoxib , pero no por SA ( Figura 3b ) . estos datos sugieren que el resto de acetilo de ASA era importante en la inhibición de la inflamación de las vías respiratorias Th17 , posiblemente a través La inhibición de la COX2 .

También se evaluaron los efectos de estos fármacos sobre la expresión de RORgt , STAT3 , pSTAT3 y acetil - STAT3 en tejidos pulmonares de IFN - g / ratones después de desafio OVA , como se muestra en la Figura 3c . Este estudio mostró que el AAS inhibe la la expresión de la acetil - STAT3 , pero no de pSTAT3 o RORgt . Además, el celecoxib se encontró disminuida la expresión de acetil- STAT3 y también de pSTAT3 y RORgt . En contraste, la expresión de la acetil - STAT3 , pSTAT3 y RORgt no era afectada por el tratamiento SA , aunque la expresión de STAT3 fue mejorada . En resumen , estos resultados sugieren que la acetil resto de ASA inhibe la respuesta de las células Th17 posiblemente a través regulación a la baja de la expresión -acetil STAT3 .

Efecto del AAS en la producción in vitro de IL-6 inducida por LPS o IL-17

Entre las células inmunes innatas, países en desarrollo orquestan el destino de ingenuos células CD4 + T en Th1, Th2, Th17 o Treg cells.18 Para

Efecto del AAS en la producción in vivo de Il-6 inducida por LPS o IL-17

Sobre la base de los datos anteriores, se evaluó el efecto del AAS en la el

desarrollo in vivo de la respuesta inmune innata inducidas por LPS. Para probar esto, LPS (10 mg)) se administró por vía intranasal en las vías respiratorias de ratónes durante 3 días, con y sin tratamiento de ASA (18 mg kg -1) una vez al día, y después los ratones fueron evaluado 24 h más tarde. El análisis celularidad BAL mostró que la infiltración pulmonar de células inflamatorias se mejoró por LPS, pero no es afectada por el tratamiento ASA (Figura 5a). Además, la IL-6 producción, mejorada por LPS, no fue inhibida por el tratamiento ASA (Figura 5b). Por otra parte, el presente estudio mostró que la expresión de moléculas co-estimuladora (CD11b, CD80 y CD86) por las DC de pulmón, mejorada por LPS, no fue inhibida por el tratamiento ASA (Figura 5c). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el AAS no modulan in vivo respuestas inmunes innatas inducidas por la exposición de las vías respiratorias a LPS. Por último, se evaluó el efecto del AAS en el desarrollo in vivo de la inflamación de las vías respiratorias y la IL-6 inducida por la exposición de las vías respiratorias a RIL-17. Para probar esto, LPS (10 mg) fue administrado por vía intranasal en las vías respiratorias del ratón con o sin RIL-17A (2,5 mg kg- 1). Análisis de la celularidad BAL mostró que la infiltración pulmonar de neutrófilos fue significativamente mayor por la exposición LPS más RIL-17A en lugar de por la exposición LPS solos. Curiosamente, la infiltración de neutrófilos inducida por rIL-17A, pero no por LPS, se inhibió completamente por el tratamiento ASA (Figura 5d). Del mismo modo, el estudio actual mostró que la IL-6 inducida por rIL-17A, pero no por LPS, se inhibió por el tratamiento ASA (Figura

5e). Colectivamente, estos datos sugieren que el ASA inhibe la inflamación de las vías respiratorias Th17, en parte a través de regulación negativa de la IL-6 en la producción de macrófagos inducidos por las células Th17.

Figura 4 La producción in vitro de la interleucina (IL) -6 inducida por la IL-17A, pero no por lipopolisacárido (LPS), es inhibida por el tratamiento con ácido acetilsalicílico (ASA). (a) Antígeno (ovoalbúmina (OVA)) absorción por las células dendríticas de la médula ósea (BMDCs) después de la estimulación con LPS y diferentes dosis de ASA. b) Análisis citométrico de flujo de maduración de BMDC. BMDCs se estimularon con LPS (10 ngml? 1) y ASA y luego teñidas con anti-CD11c, anticuerpos anti-MHCII, anti-CD11b, y anti-CD80. c) Nivel de IL-6 en los sobrenadantes de cultivo de BMDCs estimulada con LPS (10 ng ml-1) y ASA. d) Nivel de IL-6 en los sobrenadantes de cultivo de células RAW 264.7 activados por LPS (10 ngml- 1), rIL-17A (50 ng ml- 1) o ASA. FITC, fluoresceína. * Po0.05. MFI, intensidad media fluorescente.

DISCUSION

Desde que se destacó en la literatura hace varios años, varias enfermedades se han explicado por la inflamación por Th17, tales como la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, asma e incluso ciertos tipos de cáncer. Nuestros datos anteriores demostraron que la inflamación de las vías respiratorias ASA inhibe Th17. En el presente estudio, que tuvo como objetivo dilucidar el mecanismo(s) de la acción

del efecto inhibitorio de la ASA en el desarrollo de la inflamación Th17 en el pulmón inducida por alérgenos. El presente estudio demostró que el AAS inhibe la inflamación bronquial Th17 mediante la supresión de la retroalimentación positiva de la IL-6 e IL-17 , es decir, IL-6 induce la polarización de Th17 y células Th17 induce la producción de IL-6.

En los seres humanos, la IL-1b, IL-6 e IL-23 son las principales citoquinas que inducen la polarización Th17, mientras que la IL-1b, IL-6 y TGF-b1 son cruciales en ratones. Además, la IL-21, IL-22 e IL-23 son importantes para el mantenimiento de las respuestas de células Th17 en los seres humanos y los ratones. En las condiciones de conducción de polarización Th17 en las vías respiratorias del ratón, la IL-6 conduce a la inducción de una respuesta de células Th17. Un estudio anterior indicaba también que la exposición a LPS de las vías respiratorias que contienen alérgenos induce respuestas de células Th17 través de la vía de VEGF-IL-6. En el presente estudio, ASA fue encontrado para inhibir la polarización Th17 inducida por la IL-6, aunque la IL-6 inducida por LPS no fue alterada por el tratamiento ASA. Colectivamente, estos datos indican que ASA inhibe la polarización Th17 inducida por la IL-6.

Figura 5 En la producción in vivo de la interleucina (IL) -6 inducida por la IL-17A, pero no por lipopolisacárido (LPS), es inhibida por el tratamiento ácido acetilsalicílico (ASA). (a-c) LPS se administró en las vías respiratorias de

tipo salvaje ratones durante 3 días con y sin tratamiento intraperitoneal con ASA. a) El lavado broncoalveolar (LBA). b) BAL niveles IL-6 . (c) análisis de citometría de flujo de pulmón de células dendríticas (DC) de maduración. Pulmón DC se tiñeron con anti-CD11c, anti-CD11b, anti-CD80 y anti-CD86 Abs. (d, e) LPS y RIL-17 se administraron en ratones WT vías respiratorias durante 3 días con y sin tratamiento intraperitoneal con ASA. d) BAL celularidad. (e) de IL-6 en el líquido de BAL. PBS, solución salina tamponada con fosfato. * Po0.05.

STAT3 es conocido por ser un jugador principal en la vía de cascada de la IL-6. pSTAT3 es la forma activa de la molécula, que induce la pro-inflamatoria de la expresión génica. Por lo tanto, pSTAT3 ha sido considerado como un marcador del desarrollo de Th17. Por otro lado, los mecanismos de acción de RORα, β y γ, además de sus funciones fisiológicas y el papel potencial en varias patologías, fueron aclarados en los últimos años. Entre los miembros de la familia ROR, RORγt es una molécula de señalización descendente STAT3 y esencial para la especificación de linaje de células CD4 + T ingenuas en células Th17. Sin embargo, el presente estudio mostró que ASA no afectó la expresión de pSTAT3 o RORγt. Estos hallazgos sugieren que ASA inhibe la polarización Th17 inducida por IL-6 a través de vías distintas de pSTAT3 y RORγt.

El resto de acetilo de ASA es conocido para inhibir las funciones de las enzimas COX a través de acetilación. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de la fracción acetilo de ASA en el desarrollo de la inflamación de las vías respiratorias Th17 en comparación con

SA. Los datos sugirieron que el AAS inhibe las respuestas de células Th17 inducida por IL-6, mientras que SA no lo hizo. Recientemente, acetil-STAT3 se ha sugerido que es también una forma activa de STAT3. La acetilación de STAT3 en Lys685 puede ser inducida por la IL-6 a través de la activación de PI3K/Akt. Curiosamente, el estudio actual mostró que la expresión de la acetil-STAT3 fue disminuida por el tratamiento ASA, pero no por SA. En resumen, estos datos sugieren que el resto de acetilo de ASA inhibe las respuestas de células Th17 inducida por IL-6, posiblemente a través de bloqueo de la expresión de STAT3-acetil.

IL-6 es también un mediador corriente abajo de la célula Th17 responses.IL-17A interactúa con IL-17RA o IL-17RC, que transmite señales a las vías TRAF-6-dependiente o independiente. El presente estudio demostró que la producción de IL-6, que se ve reforzada por la IL-17A, fue suprimida por el tratamiento ASA. Tomando en consideración el hecho de que ASA inhibe inducida por IL-6 polarización Th17, los datos anteriores indican que ASA inhibe el desarrollo de la inflamación de las vías respiratorias Th17 mediante el bloqueo de la IL-6 e IL-17A retroalimentación positiva.

En resumen, el presente estudio indica que el AAS suprime selectivamente la inflamación Th17 de las vías respiratorias, pero no la inflamación mediada por TH1, en un modelo de asma neutrofílica. Además, ASA inhibe la polarización Th17 inducida por IL-6, que está relacionado con la regulación a la baja de la expresión STAT3-acetil. Además, ASA bloquea la inflamación y la

IL-6, la producción de IL-17A-inducidos. Por lo tanto, ASA se puede utilizar para tratar el asma neutrofílica-Th17 dominante.