AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSO TYRIMO IR IMUNOHISTOCHEMINIŲ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Gintarė Linkevičiūtė

AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSO TYRIMO IR IMUNOHISTOCHEMINIŲ

ŽYMENŲ REIKŠMĖ MELANOCITŲ KILMĖS ODOS NAVIKŲ

DIAGNOSTIKAI

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

medicina (06B)

Kaunas, 2018

Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Odos ir venerinių ligų klinikoje.

Mokslinė vadovė prof. dr. Skaidra Valiukevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. dr. Elona Juozaitytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Nariai: prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B) prof. dr. Algidas Basevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B) doc. dr. Rūta Gancevičienė (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B) prof. habil. dr. Jacek C. Szepietowski (Vroclovo medicinos universi-tetas (Lenkija), biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Disertacija bus ginama viešame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdy-je 2018 m. birželio 21 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto „Santakos“ slėnio Naujausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro 202 auditorijoje.

Adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50162 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Gintarė Linkevičiūtė

THE SIGNIFICANCE OF HIGH FREQUENCY ULTRASOUND AND

IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS FOR DIAGNOSIS OF

MELANOCYTIC SKIN TUMOURS

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

Medicine (06B)

Kaunas, 2018

The Dissertation has been prepared at the Department of Skin and Venereal Diseases of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.

Scientific Supervisor: Prof. Dr. Skaidra Valiukevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson Prof. Dr. Elona Juozaitytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Members: Prof. Habil. Dr. Vaiva Lesauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Prof. Dr. Algidas Basevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Assoc. Prof. Dr. Rūta Gancevičienė (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Prof. Habil. Dr. Jacek C. Szepietowski (Wroclaw Medical University (Poland), Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on the 21st of June, 2018 at 1.00 PM in the auditorium 202 of the Lithuanian University of Health Sciences “Santakos” Valley Latest Pharmaceutical and Health Technology Center.

Address: Sukilelių 13, LT-50162 Kaunas, Lithuania.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ............................................................................................. 7

ĮVADAS ........................................................................................................ 9

1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI .................................................. 11 1.1. Darbo tikslas ................................................................................ 11 1.2. Uždaviniai .................................................................................... 11 1.3. Darbo mokslinis naujumas .......................................................... 11

2. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................. 12 2.1. Odos melanoma ir jos gylio vertinimo svarba ligos išplitimo

prognozei ..................................................................................... 12 2.2. Melanocitų kilmės odos navikų gylio ir struktūros tyrimai

aukšto dažnio ultragarsu .............................................................. 13 2.3. Patologijos tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmė

melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai ............................... 21

3. TYRIMO METODIKA ........................................................................ 24 3.1. Pasirengimas tyrimui ................................................................... 24 3.2. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo etapai ...................................... 24 3.3. Tyrimo eiga ................................................................................. 27

3.3.1. Melanocitų kilmės odos naviko klinikinių požymių įvertinimas ....................................................................... 27

3.3.2. Ultragarsinis tyrimas ........................................................ 28 3.3.3. Melanocitų kilmės odos naviko išpjovimas ..................... 31 3.3.4. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimai .................... 31

3.4. Statistinis duomenų vertinimas .................................................... 35

4. DARBO REZULTATAI ....................................................................... 39 4.1. Aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir

histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio sąsaja priklausomai nuo naviko morfologinių požymių .... 39

4.2. Melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumai priklausomai nuo jų histologinės sandaros .................................. 50

4.3. Imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų gyliui matuoti ................................................................... 56

6

5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS ................................................ 62

IŠVADOS .................................................................................................... 68

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ................................................................... 70

PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ................................................. 76

SUMMARY ............................................................................................... 108

PRIEDAI .................................................................................................... 137 1 priedas .............................................................................................. 137 2 priedas .............................................................................................. 139 3 priedas .............................................................................................. 140 4 priedas .............................................................................................. 142

CURRICULUM VITAE ............................................................................ 143

PADĖKA .................................................................................................... 144

7

SANTRUMPOS

AJCC – Amerikos jungtinis vėžio komitetas bendr. – bendraautoriai GS – galimybių santykis IH – imunohistocheminis (-iai) K1 – pirmasis 25 proc. kvartilis K3 – trečiasis 75 proc. kvartilis Kauno klinikos – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU)

ligoninė Kauno klinikos kt. – kita, kitas, kiti KTU UI – Kauno technologijos universiteto prof. K. Baršausko

Ultragarso mokslo institutas LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MA – melanocitų kilmės apgamas MN – melanocitų kilmės odos navikas MRN – matavimo rezultatų nesutapimas N – tyrime dalyvavusių pacientų skaičius n – tirtų melanocitų kilmės odos navikų skaičius OM – odos melanoma OVLK – LSMU MA Odos ir venerinių ligų klinika p – reikšmingumo lygmuo, statistinis patikimumas,

tikimybė pBG – naviko gylis pagal Breslau, išmatuotas histologinio

tyrimo metu pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas hematoksilinu ir eozinu

dažytuose histologiniuose preparatuose pBG (S100) – naviko gylis, išmatuotas S100 žymeniu dažytuose

histologiniuose preparatuose pBG (derinys) – naviko gylis, išmatuotas trijų imunohistocheminių

žymenų deriniu dažytuose histologiniuose preparatuose

PI – pasikliautinieji intervalai proc. – procentas (-ai) R² – determinacijos koeficientas |r| – Spirmeno koreliacijos koeficientas SLB – sarginio limfmazgio biopsija SN – standartinis nuokrypis rT – naviko gylis, nustatytas rankiniu būdu ultragarsinio

tyrimo metu

8

aT – naviko gylis, nustatytas automatiškai ultragarsinio tyrimo metu

UG – ultragarsas z – z kriterijus χ2 – chi kvadrato kriterijus Δ BG 1 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (S100) Δ BG 2 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (derinys)

9

ĮVADAS

Odos melanoma (OM) – piktybinis melanocitų kilmės navikas (MN), kuris sukelia didžiausią mirtingumą lyginant su kitais piktybiniais odos navikais pažengusioje ligos stadijoje [40]. Todėl OM ankstyvoji diagnosti–ka, naudojant neinvazines odos vaizdinimo technologijas, yra labai aktuali. Daugiau nei pusės OM pirmtakas yra gerybinis melanocitų kilmės pigmen-tinis apgamas (MA). Lietuvoje OM paplitimas nėra aukštas, todėl šiame tyrime kaip ir kituose tyrimuose [13, 38, 42, 71] analizuoti OM ir MA atvejai kartu.

Vienas iš svarbiausiųjų OM prognozės veiksnių yra naviko gylis pagal Breslau (pBG), nustatytas histologinio tyrimo metu hematoksilinu – eozinu (HE) dažytame preparate [29]. Odos melanomos pBG (HE) yra sarginio limfmazgio biopsijos (SLB) atlikimo ar neatlikimo kriterijus, nes mikrome-tastazių suradimas sarginiame limfmazgyje yra reikšmingas ligos išplitimui įvertinti [40]. Rekomenduojama atlikti SLB, kai OM yra ≥1 mm gylio.

Klinikinių tyrimų duomenimis, MN gylio parametrai išmatuoti aukšto dažnio 20–100 MHz ultragarsu (rT) ir histologinio tyrimo metu (pBG (HE)) turi patikimą tarpusavio sąsają [38, 42, 50, 67, 71]. Tačiau tiriant <1 mm gylio MN nustatytas silpnesnis rT ir pBG (HE) ryšys [62, 81, 92]. Daugu-moje tyrimų [38, 67, 92] buvo pastebėtas MN gylio pervertinimas matuojant jį aukšto dažnio ultragarsu (UG) lyginant su pBG(HE). Iki šiol nėra pilnai aiški šio rT ir pBG nesutapimo priežastis. Vieni tyrėjai rT ir pBG (HE) nesutapimą sieja su naviko aplinkos limfocitų infiltratu – tokiu atveju, tiriant UG, sunkiau surasti naviko apatinį kraštą. Kiti tyrėjai nustatė, kad už pBG (HE) didesnis rT dažnesnis tais atvejais, kai OM susiformavusios iš MA [20, 38, 59, 67, 92].

Kai kurie autoriai svarsto, kad odos priklausiniai, pvz., riebalų liaukos ar plaukų folikulai, taip pat galimai reikšmingi rT ir pBG matavimų nesutapimui, bet dar nėra moksliniais tyrimais pagrįsto bendro sutarimo tarp tyrėjų [20, 81]. Kitų autorių duomenimis, melanocitų dydis, forma ir pasi-skirstymas epidermyje ar dermoje, limfocitų infiltrato laipsnis ir lokalizacija bei melanofagų kiekis dermoje reikšmingai skiriasi priklausomai nuo MN rūšies ir displazijos laipsnio [11, 34, 48, 95]. Todėl šiame perspektyviniame tyrime siekta nustatyti rT ir pBG (HE) ryšio stiprumą bei šių parametrų nesutapimo sąsają su MN morfologiniais požymiais.

Kituose tyrimuose ir įprastai praktiniame darbe MN gylis matuojamas rankiniu būdu pažymint naviko ribas interaktyviais UG sistemos žymekliais. Rankiniu būdu naviko ribų žymėjimui UG atlikti reikia tyrimą atliekančio specialisto patirties ir prailgėja paties tyrimo atlikimo laikas. Šiame darbe

10

pirmą kartą MN gylis išmatuotas šio darbo autorės ir kitų sukurta automa-tine ultragarso B-tipo vaizdų analizės programa ir nustatyta rT ir automati-niu būdu (aT) atliktų matavimų sąsaja su pBG (HE).

Po naviko išpjovimo patologinės medžiagos dažymas HE yra iki šiol auksinis standartas OM gylio pagal Breslau (pBG) nustatymui [3]. Tyrimų duomenimis, OM gylio pagal Breslau (pBG) matavimo tikslumo tarp skir-tingų tyrėjų sutapimas svyruoja nuo 68,8 proc. iki 84,8 proc., priklausomai nuo patologo patirties [73]. Todėl 15,5 proc. OM atvejų, kurių pBG<1 mm gali būti klaidingai priskirtos OM in situ ar invazinei jos formai, kai BG išmatuojamas ≥1 mm [32]. Dėl MN ir OM morfologinių formų įvairovės pasitaiko atvejų, kai patyrę dermatopatologai neišvengia klaidingai neigia-mų išvadų diagnozuojant OM ar atvirkščiai. Imunohistocheminiai (IH) tyri-mai suteikia papildomos informacijos apie melanocitų brandumą ir padeda tiksliau nustatyti melanocitų displaziją bei jų skvarbą į dermą [79]. IH žymenų spalvinės reakcijos išryškina atsiskyrusius nuo naviko pavienius melanocitus ar smulkius jų lizdus dermoje bei melanocitus, kurie dėstosi išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos [27, 45]. Skirtingai, šių morfo-loginių požymių vertinimas HE preparatuose ribotas. Neretai MN preparate dažytame HE melanocitus būna sunku atskirti nuo histiocitų, melanofagų, ypač kai yra ryškus limfocitų infiltratas aplink naviką [27, 45]. Tyrimų duo-menimis, atliekant IH reakcijas, pirminė OM panašiu dažnumu reaguoja su polikloniniais antikūnais prieš S100 baltymą ir monokloniniais antikūnais prieš Melan-A, HMB-45 bei tirozinazę [78]. Tačiau OM audinių dažymas vienu metu keliais monokloniniais antikūnais („kokteiliu“) rodo aukštesnį tyrimo specifiškumą, nei vienu S100 žymeniu, diferencijuojant OM rūšį [78]. Iki šiol atlikta gana mažai tyrimų [27, 31] apie IH žymenų reikšmę MN gylio ir struktūros vaizdinimui histologiniame preparate. Atsižvelgiant į tai šiame tyrime pirmą kartą ištirta kelių IH žymenų (S100 bei jų derinio – HMB-5, Melan-A ir tirozinazė) svarba įvertinti MN gylį ir struktūros ypatu-mus, lyginant su standartinio histologinio tyrimo požymiais.

Disertacinio darbo tema OM diagnostikos srityje yra aktuali mokslinia-me ir praktiniame darbe. Gauti tyrimo rezultatai pateikia moksliškai naujas išvadas apie aukšto dažnio ultragarso tyrimo ir informacinių technologijų (automatinės naviko gylio vertinimo programos) svarbą neinvazinei OM diagnostikai. Iki šio nėra atlikta tyrimų, ar kelių imunohistocheminių žyme-nų naudojimas gali pagerinti MN gylio ir morfologinių ypatumų vaizdinimą, lyginant su standartiniu HE dažymu ir vertinimu histologiniame preparate. Disertacinio darbo išvados yra aktualios kelių sričių specialistams, vykdan-tiems klinikinę OM diagnostiką ir gydytojams patologams.

11

1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

1.1. Darbo tikslas

Įvertinti aukšto dažnio ultragarso tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmę melanocitų kilmės odos navikų (melanomos ir jos pirmtakų mela-nocitų kilmės apgamų) diagnostikai.

1.2. Uždaviniai

1. Įvertinti aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio sąsają priklausomai nuo naviko morfologinių požymių.

2. Ištirti melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumus (struktūra, kraštai, riba tarp naviko ir aplinkinių audinių) priklausomai nuo jų histologinės sandaros.

3. Nustatyti imunohistocheminių žymenų (S100 bei jų derinio, t. y. HMB-45, Melan-A ir tirozinazė) reikšmę melanocitų kilmės odos naviko gyliui ir sandaros ypatumams įvertinti, lyginant su požymiais histologiniame HE dažytame preparate.

1.3. Darbo mokslinis naujumas

Tai pirmasis disertacinis darbas Lietuvoje apie MN gylio ir struktūros vaizdinimą, panaudojant aukšto dažnio ultragarsą ir imunohistoheminius žymenis.

Mūsų žiniomis, iki šiol nėra atlikta tyrimų apie MN gylio automatinį vertinimą UG tyrimo metu, kuris pritaikytas klinikinėje praktikoje. Anks-čiau atliktų tyrimų duomenimis, MN gylis matuojamas B-tipo vaizduose rankiniu būdu pažymint naviko ribas interaktyviais UG sistemos žymekliais. Rankiniu būdu naviko ribų žymėjimui UG atlikti reikia tyrimą atliekančio specialisto patirties ir prailgėja paties tyrimo atlikimo laikas. Todėl darbo autorės ir bendraautorių buvo sukurta klinikinei praktikai tinkama UG vaiz-dinamo naviko ribų aptikimo ir gylio vertinimo automatinė programa [65] ir šiame darbe atliktas jos tikslumo tyrimas.

Šiame darbe iškėlėme ir tikrinome prielaidas, ar OM ir MA ultragarso vaizdo ir gylio ypatumai turi ryšį su jų morfologiniais požymiais, ar skiriasi pBG matavimo rezultatai MN histologiniuose preparatuose, dažytuose stan-dartiniu dažymu HE bei kelių IH žymenų deriniu (HMB-45, Melan-A ir tirozinaze). Mūsų žiniomis, apie tai iki šiol nėra paskelbta tyrimo duomenų.

12

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Odos melanoma ir jos gylio vertinimo svarba ligos išplitimo prognozei

Odos melanoma (OM) – tai piktybinis, linkęs metastazuoti navikas, kuris formuojasi iš pakitusių melanocitų ir dažniausiai aptinkamas odoje [40]. Pagrindiniai rizikos veiksniai yra genetiniai (paveldimumas, šviesi oda) ir išoriniai (ultravioletinė spinduliuotė) [40, 98]. Sergamumo OM rodikliai tarp baltaodžių pasaulyje [33, 40] ir Lietuvoje [75] sparčiai auga. Europoje diagnozuojama <10–25/100 000 gyventojų naujų OM atvejų. Palyginus su Europos regionu, Lietuvos gyventojų iki 55 metų amžiaus sergamumas odos melanoma yra vidutinis (10,5 naujų atvejų iš 100 000 gyventojų), tačiau dažniau diagnozuojama vėlyvesnėse stadijose. 2012 metų duomenimis, I stadijos OM sudaro 41,1 proc. visų naujų ligos atvejų mūsų šalyje [75], todėl labai svarbi yra ankstyva jos diagnostika. Sergančiųjų OM 10 metų išgyvenamumas svyruoja nuo 75 iki 85 proc. jei diagnozuojamas ir pradedamas gydyti pirminis neišplitęs navikas, o jei aptinkama sritinių limf-mazgių metastazių – nuo 20 iki 40 proc. OM stadija nustatoma pagal Amerikos jungtinio vėžio komiteto (AJCC) TNM klasifikaciją. Remiantis 7–ojo leidimo AJCC klasifikacija, svarbiausieji OM prognozės veiksniai yra per patologijos tyrimą nustatytas pirminio naviko gylis pagal Breslau (pBG), jo išopėjimas ir mitozių skaičius [29]. Nuo 2018 m. įsigaliojo 8-ojo leidimo AJCC klasifikacija, pagal ją pT1 (pirminio naviko patologinė stadija) kategorija turi dvi subkategorijas, kurios pagal pBG suskirstytos atitinkamai pT1a – ≤0,8 mm ir pT1b – nuo 0,8 iki 1,0 mm [3].

Pirminės OM chirurginis gydymas turi būti radikalus ir jos operacijos planas priklauso nuo naviko gylio (pBG). Įprastai odos melanomos pBG vertinamas naviko histologiniame preparate, dažytame hematosklinu – eozi-nu. Kai histologinio tyrimo metu nustatomas OM gylis ≤2,0 mm, per operaciją sveikų audinių kraštai turi būti ne mažiau nei 1 cm nuo pirminio naviko ar jo rando, jei melanoma operuojama per du etapus, tai yra pirma, atliekama jos diagnostinė ekscizija, antrame etape – radikali operacija. Atitinkamai jei OM pBG >2,0 mm, sveikų audinių ribos per operaciją turi būti 2 cm nuo naviko ar jo rando kraštų, jei taip plačiai išoperuoti leidžia anatominė naviko sritis [40].

Odos melanomos gylis pagal Breslau – pBG (HE) yra sarginio limf-mazgio biopsijos (SLB) atlikimo ar neatlikimo kriterijus, nes šio tyrimo rezultatas (mikrometastazių suradimas sarginiame limfmazyje, kai kliniškai ir ultragarsu jų nematyti) yra reikšmingas ligos išplitimui įvertinti [40].

13

Sarginis limfmazgis – tai vienas ar keli sritiniai limfmazgiai, kurie pirmieji per aferentines limfagysles surenka naviko limfą [52]. Jei OM pBG (HE) rodmuo yra gilesnis nei 1 mm, rekomenduojama atlikti SLB dėl mikrome-tastazių (pagal AJCC klasifikacijos 8-ąjį leidimą nuo 0,8 mm gylio).

Vidutiniškai 25–33 proc. OM vystosi iš jos pirmtakų melanocitų kilmės apgamų (MA) [22, 63]. MA – tai gerybinis odos navikas atsirandantis dėl melanocitų proliferacijos [22]. MA ir OM vystymąsi sieja tokie patys rizikos veiksniai [70], todėl, iki šiol MA, kurie dažniau paplitę nei OM, daugelio mokslininkų naudojami kaip modelis OM klinikiniuose tyrimuose [22].

Displazinis MA yra nustatomas, remiantis histologinių požymių klasifi-kacija, kuri neretai kelia prieštaravimų dėl žemos patologinės displazijos lapsnio apibrėžties koreliacijos tarp skirtingų patologų [94]. Vis dar išlieka tarp tyrėjų galutinai neapibrėžta displazinio MA klinikinė diagnostika ir gydymo taktika, taip pat ir reikšmė OM išsvystymui [101]. Todėl šiame darbe nesiekta nustatyti displazinio MA klinikinės ir patologinės displazijos laipsnio, bet vadovautasi gydytojo patologo išvada apie MA displaziją, yra ji ar nėra (žr. 31 psl.).

2.2. Melanocitų kilmės odos navikų gylio ir struktūros tyrimai aukšto dažnio ultragarsu

Pirmą kartą ultragarso (UG) tyrimas (15 MHz) odos navikų tyrimui ir įsiskverbimo į odą gylio matavimui pasiūlytas naudoti 1979 m. [1]. Išski-riami UG tyrimo dermatologjoje privalumai – neinvazinis, greitai atlieka-mas, nebrangus tyrimas, kuris suteikia informaciją apie tiriamą objektą realiu laiku [50].

Odos vaizdą tiriant UG nulemia kolageno skaidulų savybės, keratinas ir vandens kiekis. Odos kolageno kiekis, jo tipas lemia dermos (tikrosios odos) echogeniškumą. Echogeniškumas (angl. echogenicity) yra audinio gebėjimas atspindėti UG signalą kitų audinių atžvilgiu [2, 49]. Jei audinių struktūros yra skirtingo echogeniškumo, skirtingai jos atvaizduojamos ir UG vaizde. Audiniai, kurie gerai atspindi UG bangas vadinami „hiperechogeniniais“, jie yra šviesesnės spalvos lyginant su aplinkiniais UG tyrimo vaizde. Priešingai, silpniau atspindintys UG bangas, mažesnio echogeniškumo audiniai vadinami „hipoechogeniniais“ ir dažniausiai būna tamsesni (žr. 28–29 psl.) [2, 49]. Tiriant odą UG, ypač gerai atspindi storas keratinas (echogeniškumas didėja), o vanduo dermoje prastai atspindi UG bangas (echogeniškumas mažėja). Ultragarso sklindimo greitis odoje vidutiniškai siekia 1580 m/s [50, 58].

14

Tyrimų duomenimis, aukšto dažnio (20–100 MHz) UG keitikliai turi 16–80 μm skiriamąją gebą ir įsiskverbia į odą apytiksliai nuo 1 iki 6 mm. Didinant ultragarso dažnį gerėja vaizdo raiška ir geba atskirti struktūras, tačiau didelis UG dažnis sumažina ultragarso bangos skvarbą [50, 103]. Odos audinių vaizdinimas ir skvarbos gylis priklausomai nuo ultragarso dažnio pateiktas 2.2.1 lentelėje.

2.2.1 lentelė. Odos audinių vaizdinimas ir skvarbos gylis priklausomai nuo ultragarso dažnio [50]

Dažnis, MHz Apytikslis skvarbos gylis, cm Vaizdinimas 7,5 >4 Poodis, limfmazgiai

13,5–15 3,0–0,3 Epidermis, dermis 20 0,6–0,7 Epidermis, dermis

50–100 0,3–0,015 Epidermis

Komercinėse aukšto dažnio UG sistemose naudojamas vieno elemento fokusuotas keitiklis, kuris mechaniškai judėdamas užregistruoja dvimatį (2D) odos pjūvio vaizdą (B-tipo) [50, 58]. Sveikos odos aukšto dažnio UG vaizde matoma aiškių ribų hiperechogeninė juosta, kuri yra tarp keitiklio ir odos paviršiaus, vadinama epidermio „įėjimu“ (angl. entry echo). Po juo – tikroji oda, kuri atvaizduojama kaip hiperechogeninis sluoksnis su smulkiais hipoechogeniniais ploteliais, kurie atsiranda dėl plaukų folikulų, krauja–gyslių ir riebalinių liaukų. Giliau stebimas poodis – hipoechogeninė zona su hiperechogeniniais jungiamojo audinio intarpais, skiriančiais riebalinio audinio skilteles. Dar giliau, priklausomai nuo UG dažnio gali būti matoma paviršinė raumeninį audinį dengianti fascija, kuri atrodo kaip aiški hiper–echogeninė linija (2.2.1 pav.) [2, 68].

15

2.2.1 pav. Sveikos odos B-tipo vaizdas nuskenuotas aukšto dažnio 22 MHz

ultragarsu (vaizdas užregistruotas šio darbo autoriaus)

Ankstesni klinikiniai tyrimai parodė, kad 14 MHz UG tyrimas, lyginant su patologijos tyrimo metu įvertintu pBG (HE), tiksliau nustato gilesnių nei 2 mm OM įsiskverbimą į odą nei plonesnių OM. Todėl šis rodmuo gali būti patikimas atrankinis kriterijus OM operacinio gydymo planavimui [51, 60].

Šio darbo autoriaus ir bendraautorių literatūros apžvalgos [50] bei naujesnių klinikinių tyrimų duomenimis, MN gylio parametrai išmatuoti aukšto dažnio 20–100 MHz UG (rT) ir histologinio tyrimo metu (pBG (HE)) turi patikimą tarpusavio sąsają (2.2.2 lentelė). Tačiau silpnesnis rT ir pBG (HE) ryšys nustatytas tiriant <1 mm MN [62, 81, 92]. Vertinant plonus (<1 mm) MN, UG tyrimo metu išmatuotas gylis 15 proc. buvo didesnis lyginant su pBG(HE), ir atvirkščiai – storų (>1 mm) MN gylis – 7 proc. mažesnis nei histologinio tyrimo metu įvertintas pBG (HE) [50]. Daugumo-je tyrimų buvo pastebėtas MN gylio pervertinimas matuojant jį aukšto dažnio UG lyginant su pBG (HE). Nėra pilnai aiški šio rT ir pBG nesuta-pimo priežastis. Galimai tai sietina su limfocitų infiltratu ar tarp OM ir greta jos esančio MA skiriamųjų ribų vertinimo netikslumais UG tyrimo metu [20, 38, 59, 67, 92]. Patologijos tyrimo metu odos naviko audiniai fiksuo-jami 10 proc. formalino tirpale bei parafine, todėl audiniai gali susitraukti ir atsiranda raginio sluoksnio pažaida – galimai reikšmingi veiksniai rT ir pBG matavimų nesutapimui [38]. Dar vienas svarbus veiksnys, galintis paaiškinti skirtumus tarp rT ir pBG(HE) matavimų neatitikimo, tai natūralus odos susitraukimas po ekscizijos [38, 82]. Kai kurie autoriai svarsto, kad odos priklausiniai, pvz., riebalų liaukos ar plaukų folikulai, taip pat galimai reikšmingi rT ir pBG matavimų nesutapimui, bet dar nėra moksliniais tyrimais pagrįsto bendro sutarimo tarp tyrėjų [20, 81].

16

Kai kurios OM yra per plonos (0,1 mm), kad būtų galima jų rT išmatuoti 20 MHz UG [13, 35]. Gambichler ir bendraautoriai teigia, kad 100 MHz dažnio UG keitiklis, kurio skvarbos gylis siekia iki 1,5 mm, turi didesnę vaizdo skiriamąją gebą lyginant su 20 MHz. Tyrėjai nustatė, kad rT ir pBG(HE) parametrai sutampa tiksliau, kai 100 MHz UG tiriama mažo įsiskverbimo į odą OM, nei 20 MHz UG [38]. Guitera ir bendraautorių atlik-to tyrimo duomenimis, 75 MHz dažnio keitikliu OM in situ rT ir pBG(HE) parametrų koreliacija silpnesnė lyginant su invazine OM [42]. Manoma, kad stipriausias ryšys tarp UG ir histologinio tyrimo metu įvertinto MN gylio nustatomas, kai matuojamas gilesnis kaip 0,75 mm navikas [92].

Literatūros duomenimis, UG sistemos matavimų paklaidos, įskaitant hidrofonų (prietaisų akustinėms bangoms priimti vandenyje) kalibravimą ir erdvinį vidurkinimą, taip pat gali sąlygoti neatitikimą tarp rT ir pBG rezultatų [76].

2.2.2 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų gylio, išmatuoto 20–100 MHz ultragarsu ir histologinio tyrimo metu, koreliacija, remiantis klinikinių tyrimų apžvalga

Autorius, tyrimo metai

Ultra-garso dažnis (MHz)

Tirtų melanocitų kilmės odos

navikų tipas ir skaičius

Koreliacijos koeficientas (r) ar sutapimas pagal Bland-Altman*

Tyrėjų skaičius rT pBG(HE)

Serrone ir kt., 2002 [92]

20 Melanoma (n=139)

r=0,95 – –

Pellacani ir kt., 2003 [81]

20 Melanoma (n=40) r=0,89 – –

Bessound ir kt, 2003 [13]

20 Melanocitų kilmės odos navikai (n=130)

r=0,96 – –

Gambichler ir kt., 2007 [38]

20 and 100

Melanoma (n=13), melanocitų kilmės apgamai (n=37)

r>0,99 (toks pat su abiem dažniais), 20 MHz ultragarsu nustatytos didesnės sutapimo ribos nei 100 MHz*

Vienas –

Guitera ir kt., 2008 [42]

75 Melanoma (n=52), melanocitų kilmės apgamai (n=36)

r=0,91 Du –

Machet ir kt., 2009 [67]

20 Melanoma (n=31) Vidutinis sutapimas* (0,18 mm; sutapimo ribos nuo -1,4 iki 1,8 mm)

Keturi Du

2.2.2 lentelės tęsinys Autorius,

tyrimo metai Ultra-garso dažnis (MHz)

Tirtų melanocitų kilmės odos

navikų tipas ir skaičius

Koreliacijos koeficientas (r) ar sutapimas pagal Bland-Altman*

Tyrėjų skaičius rT pBG(HE)

Hayashi ir kt., 2009 [43]

30 Melanoma (n=68) r=0,89 – Skirtingi patologai, skaičius nenuro-dytas

Crisan ir kt., 2013 [20]

20 Bazalinių ląstelių karcinoma (n=18); melanoma (n=28)

Tiesinė regresija ir koreliacija 98,4 proc.

– –

Meyer ir kt., 2014 [71]

25 Melanoma (n=67), melanocitų kilmės apgamai (n=54)

Labai geras* (-0,01 mm; 95 proc. PI: nuo -0,157 iki 0,137 mm)

Du –

Botar-Jid ir kt., 2016 [17]

40 Melanoma (n=42) Labai geras* (-0.05 mm; 95 proc. PI: nuo -0,24 iki 0,13 mm)

Vienas –

Varkentin ir kt., 2016 [99]

100 Melanocitų kilmės odos navikai (n=32)

Labai geras* (-0,07 mm; sutapimo ribos nuo -0,43 iki 0,29 mm)

– –

rT – naviko gylis nustatytas rankiniu būdu ultragarsinio tyrimo metu; pBG(HE) – naviko gylis išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; (–) – nenurodyta; r – koreliacijos koeficientas; n – atvejų skaičius.

Anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, MN gylis matuojamas B-tipo vaizduose rankiniu būdu pažymint naviko ribas interaktyviais UG sistemos žymekliais. Rankiniu būdu naviko ribų žymėjimui UG atlikti reikia tyrimą at-liekančio specialisto patirties ir prailgėja paties tyrimo atlikimo laikas. Šio darbo autorė kartu su bendraautoriais 2016 m. sukūrė ir pritaikė patikimą automatinį algoritmą, paremtą 22 MHz UG ultragarsinių radiodažninių signa-lų analize eksperimentinėje aplinkoje, kurio jautrumas – 90 proc., o specifiš-kumas – 73 proc. matuojant plonų (<1 mm) MN gylį, lyginant su pBG. Ta-čiau šis automatinis algoritmas kol kas dar nepritaikytas klinikinėje prak-tikoje.

UG tyrimas suteikia papildomos informacijos tikslinant odos naviko klinikinę diagnozę ir padeda atskirti kai kurių odos navikų rūšis – gerybinį ne kraujagyslinės kilmės naviką nuo hemangiomos [103]. Atliktas didelės apimties (n=4338) retrospektyvinis odos navikų UG vaizdo ir patologinės diagnozės sutapimo tyrimas parodė, kad odos naviko klinikinės diagnozės

17

18

tikslumas padidėja nuo 73 iki 97 proc., naudojant UG kaip papildomą diagnostinį metodą [103].

Tačiau tyrimų, susijusių su UG galimybe atskirti OM nuo MA ir kitų odos navikų atlikta tik keletas [24, 30, 44, 87]. Naudodami seborėjinės keratozės, MA ir OM B-tipo UG vaizdus, Harland ir bendraautoriai nustatė, kad UG tyrimo specifiškumas diferencijuoti OM nuo MA yra 30 proc., kai tyrimo jautrumas – 100 proc. [44]. Samimi ir bendraautoriai diferencijavo mėlynąjį apgamą nuo melanomos metastazių odoje ir nustatė, kad UG tyrimo jautrumas yra 70,8 proc., specifiškumas – 94 proc [87]. Šis metodas taip pat naudingas atskiriant hemangiomas nuo OM [24].

Nustatyta, jog tiriant ultragarsu MN vaizdas būna simetriškas ir aiškių ribų, hipoechogeniškos struktūros, kurioje matyti dauginiai smulkūs hiperechogeniš-ki šešėliai [44]. Skirtingai, tiriant ultragarsu OM vaizdas yra homogeniškas ir turi stipriau išreikštą hipoechogenišką struktūrą, lyginant su MN [44].

K. Andrekutės ir bendraautorių tyrimo duomenimis, aukšto dažnio UG bangų sklidimas per MN gali priklausyti nuo melanocitų displazijos laipsnio bei kitų odos morfologinių požymių [4]. Kitų autorių duomenimis, melano-citų dydis, forma ir pasiskirstymas epidermyje ar dermoje, limfocitų infiltra-to apie naviką pobūdis bei melanofagų kiekis dermoje reikšmingai skiriasi priklausomai nuo MN rūšies ir displazijos laipsnio [11, 34, 48, 95].

Atsižvelgiant į tai šiame darbe iškėlėme ir tikrinome prielaidą, ar OM ir MA ultragarso gylio ir vaizdo ypatumai turi ryšį su jų morfologiniais požy-miais. Mūsų žiniomis, iki šiol nėra atlikta tyrimų apie MN gylio automatinį vertinimą UG tyrimo metu. Todėl darbo autorės ir bendraautorių buvo sukurta klinikinei praktikai tinkama UG vaizdinamo naviko ribų aptikimo ir gylio vertinimo automatinė programa paremta UG B-tipo vaizdo (logoritmuotos signalo gaubtinės) analize [65] ir šiame darbe atliktas jos tikslumo tyrimas.

MN struktūros pokyčių in vivo vaizdininimui yra naudojamos ir kitos technologijos, ne tik aukšto dažnio ultragarasas. Apibendrintai jų vaizdi-nimo rezultatus, kurie turi teigiamą prognostinę reikšmę OM diagnostikai, lyginat su patologijos tyrimo rezultatais, galima suskirstyti į kelias kate-gorijas: 1) tyrimo metodai, kurie vaizdina MN gylį ir vertiklaus dviejų ar trijų dimensijų vaizdo struktūrą (aukšto dažnio ultragarasas, koherentinė to-mografija); 2) MN anatominių struktūrų ir jų skvarbą charakterizuojantys vaizdiniai tyrimai (spektrofotometrinė intrakutaninė analizė (sin. SIAskopija) ir konfokalinė lazerinė mikroskopija); 3) MN anatominių struktūrų vaizdinė charkteristika (dermatoskopija). Šių tyrimų metodų apžvalga, jautrumas ir specifiškumas bei trūkumai pateikti 2.2.3 lentelėje.

2.2.

3 le

ntel

ė. O

dos

vaiz

dini

mo

in v

ivo

tyri

mo

met

odų,

rem

iant

is T

. Al

lison

ir

bend

raau

tori

ų [7

6] a

pžva

lga,

m

odifi

kuot

a ši

o da

rbo

auto

riau

s

Tyr

imo

met

odas

(n

audo

jimo

prad

žia,

m.)

Vei

kim

o m

echa

nizm

as

Jaut

rum

as /

Spec

ifišk

umas

O

M d

iagn

ostik

ai*

Priv

alum

ai

Trū

kum

ai, k

itos

past

abos

Der

mat

osko

pija

(1

878)

[53]

Pa

virš

inių

odo

s stru

ktūr

ų op

tinis

pa

didi

nim

as

77 p

roc.

/ 99

pro

c.

Padi

dina

klin

ikin

io ty

rimo

tiksl

umą

ir su

maž

ina

nere

ikal

ingų

bi

opsi

jų ir

eks

cizi

jų sk

aiči

ų

Rib

ota

gile

snių

odo

s sl

uoks

nių

apži

ūra,

prik

lau-

so n

uo d

erm

atol

ogo

patir

ties,

nele

idži

a įv

ertin

ti od

os n

avik

o gy

lio

Sias

kopi

ja (1

997)

[5

3]

Skirt

ingo

ban

gos i

lgio

opt

inia

i šv

ieso

s šal

tinia

i, sk

leid

žia

raud

o-ną

, mėl

yną,

žal

ią a

r inf

rara

udo-

nųjų

spin

dulių

spek

tro šv

iesą

, ku-

rią su

geria

(iki

2 m

m g

ylio

) odo

s au

dini

ų ch

rom

ofor

ai (m

elan

inas

, he

mog

lobi

nas i

r kol

agen

as)

82,7

pro

c.

(70,

3–90

,6 p

roc.

) /

80,1

pro

c.

(75,

1–84

,2 p

roc.

)

Padi

dina

klin

ikin

io ty

rimo

tiksl

u-m

ą ir

sum

ažin

a ne

reik

alin

gų

biop

sijų

ir e

ksci

zijų

skai

čių,

lei-

džia

įver

tinti

mel

anin

o at

sidė

jimą

epid

erm

yje

ir de

rmoj

e (p

agal

tai

galim

a pr

ogno

zuot

i dar

inio

gyl

į)

Rib

ota

gile

snių

odo

s sl

uoks

nių

apži

ūra,

pri-

klau

so n

uo d

erm

atol

ogo

patir

ties

Kon

foka

linė

laze

-rin

ė m

ikro

skpi

ja

(199

7) [6

6]

Vai

zdo

kont

rasta

s ats

irand

a dė

l sk

irtin

gos l

ąste

lių ir

org

anel

ių

stru

ktūr

os ir

geb

os a

tspi

ndėt

i šv

iesą

, nes

jų šv

ieso

s ban

gos l

ū-ži

o ro

dikl

is d

ides

nis n

ei v

ande

ns

97,3

pro

c. /

83 p

roc.

Su

maž

ina

nere

ikal

ingų

ger

ybin

ių

mel

anoc

itų k

ilmės

apg

amų

eksc

i-zi

jų sk

aiči

ų, k

urie

der

mat

osko

piš-

kai g

ali b

ūti p

anaš

ūs į

mel

anom

ą

Rib

otas

skva

rbos

gyl

is

(api

e 20

0 µm

), pr

ikla

uso

nuo

tyrė

jo p

atirt

ies,

tyri-

mas

ilga

i tru

nka,

reik

ia

pagi

lintų

odo

s his

tolo

gi-

nės s

anda

ros ž

inių

ir

patir

ties

19

2.2.

3 le

ntel

ės tę

siny

s T

yrim

o m

etod

as

(nau

dojim

o pr

adži

a, m

.)

Vei

kim

o m

echa

nizm

as

Jaut

rum

as /

Spec

ifišk

umas

O

M d

iagn

ostik

ai*

Priv

alum

ai

Trū

kum

ai, k

itos

past

abos

Opt

inė

kohe

ren-

tinė

tom

ogra

fija

(199

7) [1

6, 3

9, 4

6,

71, 9

9]

Aud

inia

i sug

eria

ir a

tspi

ndi i

nfra

-ra

udon

osio

s švi

esos

spin

duliu

s, ta

ip g

auna

mas

odo

s ske

rspj

ūvio

va

izda

s

74 p

roc.

/ 92

pro

c.

(tači

au o

dos m

ela-

nom

os ty

rimo

duo-

men

ų nė

ra p

akan

-ka

mai

)

Dėl

did

elės

vai

zdo

raišk

os ir

sk

varb

os g

ylio

iki 1

mm

nau

do-

jam

as m

orfo

logi

nių

odos

stru

ktū-

rų v

aizd

inim

ui, p

lonų

(<1

mm

) od

os n

avik

ų gy

lio m

atav

imui

Rib

otas

skva

rbos

gyl

is,

netik

slia

i mat

uoja

≥1

mm

gy

lio o

dos n

avik

us, p

ri-kl

auso

nuo

tyrė

jo p

atirt

ies,

ribot

a pr

ieig

a ir

ilgas

ty

rimo

laik

as

Trijų

dim

ensi

jų

ultra

gars

as (1

993)

[9

, 84]

Sum

uoja

nt d

augi

nius

B-ti

po

ultra

gars

o va

izdu

s, su

kuria

mas

va

izda

s lyg

iagr

ečio

je o

dos p

avir-

šiui

plo

kštu

moj

e

Nen

urod

oma

Nep

rikla

uso

nuo

tyrė

jo p

atirt

ies,

nes k

eitik

lis d

omin

anči

oje

viet

oje

laik

omas

stab

iliai

, per

6 s

nusk

e-nu

ojam

as p

lota

s sie

kia

4×4

cm

Rib

ota

prie

iga,

nep

akan

-ka

mai

duo

men

ų ap

ie d

ia-

gnos

tikos

spec

ifišk

umą,

ilg

a ty

rimo

trukm

ė *l

ygin

ant s

u pa

tolo

gijo

s tyr

imo

rezu

ltata

is

20

21

Pagrindinis neinvazinis tyrimas naudojamas melanocitų kilmės odos navikų (MN) klinikinei diferencinei diagnostikai yra dermatoskopija, kuri padidina OM diagnostikos tikslumą 10–27 proc., lyginant su klinikiniu ištyrimu (tikslumas 60 proc.), kuris labai priklauso nuo tyrėjo patirties [6, 100]. Klaidingai teigiama OM ar displazinio MA dermatoskopinė diagnozė padidina nereikalingų ekscizijų skaičių, tačiau klaidingai neigiama diag-nozė, daug pavojingensė [80].

Todėl ne mažiau svarbi kitų MN vaizdinimo metodų (UG tyrimas, ko-herentinė kompiuterinė tomografija, konfokalinė lazerinė mikroskopija) skvarbos į odą (gylio) tikslumo vertinimo tyrimai bei kelių generuojamų optinių ir fizinių vaizdų, gaunamų šiomis medicinos technologijomis pro-graminio vertinimo junginys.

2.3. Patologijos tyrimo ir imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai

Odos melanomos gylis pagal Breslau yra svarbus patologijos tyrimo parametras, kuris nulemia ligos išplitimo prognozę [40]. Šio parametro vertinimą hematoksilinu ir eozinu (HE) dažytame histologiniame preparate įdiegė A. Breslau – 1970 m. [18]. Breslau rodiklis – tai didžiausias OM storis, išmatuotas statmenai odos paviršiui nuo epidermio raginio ir grū-dėtojo sluoksnių ribos iki giliausio naviko išplitimo taško tikrojoje odoje ar poodyje [18]. HE dažymo metodas yra iki šiol auksinis OM išplitimo standartas [3].

Tyrimų duomenimis, OM gylio pagal Breslau (BG) matavimo tikslumo tarp skirtingų tyrėjų sutapimas svyruoja nuo 68,8 proc. iki 84,8 proc., priklausomai nuo patologo patirties [73]. Todėl 15,5 proc. OM atvejų, kurių pBG<1 mm gali būti klaidingai priskirtos OM in situ ar invazinei jos formai, kai BG išmatuojamas ≥1 mm [32].

Dėl didelės MN ir OM morfologinių formų įvairovės pasitaiko atvejų, kai patyrę dermatopatologai neišvengia klaidingai neigiamų išvadų diagno-zuojant OM ar atvirkščiai. Imunohistocheminiai (IH) tyrimai suteikia pa-pildomos informacijos apie melanocitų brandumą ir padeda tiksliau nu-statyti melanocitų displaziją ir jų skvarbą į dermą [79]. IH žymenų spalvinės reakcijos išryškina atsiskyrusius nuo naviko pavienius melanocitus ar smulkius jų lizdus dermoje bei melanocitus, kurie dėstosi išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos [27, 45]. Skirtingai, šių morfologinių požymių vertinimas HE preparatuose ribotas. Neretai MN preparate dažytame HE melanocitus būna sunku atskirti nuo histiocitų, melanofagų, ypač kai yra ryškus limfocitų infiltratas aplink naviką [27, 45]. Tyrimų duomenimis,

22

atliekant IH reakcijas, pirminė OM panašiu dažnumu reaguoja su poli-kloniniais antikūnais prieš S100 baltymą ir monokloniniais antikūnais prieš Melan-A, HMB-45 bei tirozinazę [78]. Tačiau OM audinių dažymas vienu metu keliais monokloniniais antikūnais („kokteiliu“) rodo aukštesnį tyrimo specifiškumą, nei vienu S100 žymeniu, diferencijuojant OM rūšį [78] bei sarginių limfmazgių mikrometastazes [93]. Nustatyta, jog polikloniniu S100 žymeniu dažosi ne tik melanocitai, bet ir nervų dangalų, lygiųjų raumenų, Langerhanso ląstelės, todėl šio žymens IH reakcijos specifiškumas yra mažesnis (75–87 proc.) nei jautrumas (98–100 proc.) [79]. Pavienių mono-kloninių IH žymenų naudojimas yra ribotas diferencijuojant gerybinius ir piktybinius MN. Pagrindiniai melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai naudojami imunohistocheminiai žymenys pateikiami 2.3.1 lentelėje.

Beltraminelli ir bendraautoriai nustatė, jog Melan-A žymeniu klaidingai teigiamai nusidažo lichenoidinio (juostos tipo) limfocitų infiltrato ląstelės ir tai apsunkina OM in situ diagnostiką lėtinio saulės poveikio srityse [10]. Kitų autorių duomenimis, Melan-A žymuo reikšmingai pervertina melano-citų tankumą epidermyje, lyginant OM in situ ir saulės šlako histologinį preparatą, nudažytą hematoksilinu ir eozinu (HE) [55].

Drabeni ir bendraautoriai rado reikšmingą pBG matavimo skirtumą ≥0,2 mm gylio OM (n=99) preparatuose tarp dviejų dažymo metodų HE ir IH žymeniu Melan-A, atsižvelgiant į tai, kad IH žymenimis pavyko išryš-kinti pavienių ar mažų melanocitų telkinius dermos speneliniame sluoksnyje [27]. Eng ir bendraautoriai nustatė IH žymens S100 vertę desmoplastinių OM (n=21) ir sveikų audinių atskyrimui bei pBG vertinimui, lyginant su HE dažytu histologiniu preparatu [31].

23

2.3.1 lentelė. Imunohistocheminiai žymenys dažniausiai naudojami melano-citų kilmės odos navikų diagnostikai [79]

Žymuo Diagnostinė vertė Kita informacija S100 Jautrumas: 93–100 proc.;

specifiškumas: 75–87 proc. Imunohistocheminė reakcija: branduolinė, citoplazminė, membraninė. Teigiamas beveik visais melanomų, įskai-tant ir desmoplastinių, atvejais. Nervų dan-galų, lygiųjų raumenų, Langerhans’o ląste-lės taip pat teigiamos šiam žymeniui, todėl turi būti naudojamas kartu su kitais melano-citų kilmės odos navikų žymenimis

HMB-45 Jautrumas: 70–90 proc; specifiškumas: 77–100 proc.

Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Tik 10 proc. desmoplastinių melanomų tei-giamos šiam žymeniui. Skaidrių ląstelių kar-cinoma, perivaskulinių epitelioidinių ląstelių navikai; melanocitinės švanomos, meningi-nės melanocitomos; kai kurie kiaušidžių steroidiniai navikai bei inkstų navikai su t(6;11)(p29;q12) mutacija taip pat ekspresuo-ja šį žymenį. Gali būti naudojamas diferenci-nei melanocitų kilmės apgamų nuo melano-mos diagnostikai

Melan-A (MART-1)

Jautrumas: 85–97 proc. pirminės melanomos, 57–92 proc. metastatinės melanomos atvejais; specifiškumas: 95–100 proc.

Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Perivaskulinių epitelioidinių ląstelių navikai ir kai kurios skaidrių ląstelių karcinomos, A103 klonas (Melan-A) taip pat dažo ant-inksčių žievės ir lytinių organų steroidinius navikus

Tirozinazė Jautrumas: 80–90 proc.; specifiškumas: 97–100 proc.

Imunohistocheminė reakcija: citoplazminė. Tik apie 6 proc. desmoplastinių melanomų, beveik visos skaidrių ląstelių karcinomos ir pigmentinės neurofibromos, apie 20 proc. angiolipomų teigiamos šiam žymeniui.

Šiame darbe iškėlėme prielaidą patikrinti, ar skiriasi pBG matavimo

rezultatai MN histologiniuose preparatuose, dažytuose standartiniu dažymu HE bei skirtingais IH dažymo metodais – žymeniu S100 ir kelių žymenų deriniu (HMB-45, Melan-A ir tirozinaze). Mūsų žiniomis, apie tai iki šiol nėra paskelbta tyrimo duomenų.

24

3. TYRIMO METODIKA

3.1. Pasirengimas tyrimui

Klinikinis tyrimas vykdytas bendradarbiaujant LSMU MA Odos ir ve-nerinių ligų, Patologinės anatomijos, Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoms bei Kauno technologijos universiteto prof. K. Baršausko Ultra-garso mokslo institutui. Tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedi-cininių tyrimų etikos komiteto leidimas (2014–11–04, Nr. P2-BE-2-25/2009) ir Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimas dėl asmens duomenų tvarkymo veiksmų (2015–07–15, Nr. 2R–4137 (2.6–1.)) (1 ir 2 priedai). Tyrimą iš dalies finansavo LSMU Mokslo fondas vykdant LSMU ir KTU jungtinį projektą SkinTech.

3.2. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo etapai

Norint įgyvendinti pirmąjį ir antrąjį tyrimo uždavinius, tiriamųjų imčiai apskaičiuoti taikyta formulė esant pasirinktai tyrimo jėgai β = 0,8 ir pasi-kliovimo lygmeniui α = 0,05. Tiriamųjų imtis apskaičiuota pasikliautinuoju tikimybės intervalu [88]. Generalinės aibės pasikliautinasis vidurkio inter-valas yra toks:

.nstxm

nstx +<<−

Tenkina vidurkio įvertinimo tikslumas ∆ – 0,05, t. y.

.∆+<<∆− xmx

Šiuo atveju taikyta formulė:

2

22

∆=

szn ,

kur n – atvejų skaičius atrankinėje grupėje; z – koeficientas, surandamas iš Stjudento pasiskirstymo lentelių pagal pasirinktą patikimumą 95 proc. (p = 0,05), z = 1,96; s – imties vidutinis kvadratinis nuokrypis; Δ (delta) – leistinas netikslumas, t. y. skirtumas tarp atrankinės grupės ir generalinės aibės vidurkio, laisvai pasirenkamas rodiklis.

25

Tiriamųjų imtis pirmajam uždaviniui įgyvendinti apskaičiuota remiantis G. Pellacini ir kitų autorių tyrimo rezultatais [81]. Tyrėjai nustatė, jog odos melanomos (n = 88) gylio, išmatuoto histologiniu tyrimu, vidurkis yra 1,14 ± 1,4 mm (± – standartinė paklaida). Didžiausia galima matavimo paklaida pasirinkta 0,1 mm. Apskaičiuota, jog, norint palyginti UG ir histologiniu tyrimu nustatytus MN gylio matavimo rezultatus (0,1 mm sutapimo tikslumu), reikia ištirti ne mažiau kaip 75 MN atvejus.

Kadangi literatūros šaltinių apie MN gylio matavimą skirtingais IHC dažymo metodais nėra (tokių publikacijų [27, 31] rasta tik apie OM), tiriamųjų imtis nustatyta remiantis bandomojo tyrimo, kurį atliko darbo autorė, duomenimis. Apskaičiuota, jog MN (n = 30) gylio, išmatuoto imu-nohistocheminių žymenų deriniu dažytuose histologiniuose preparatuose, vidurkis yra 1,00 ± 0,87 mm (± – standartinė paklaida). Didžiausia galima matavimo paklaida pasirinkta 0,2 mm remiantis M. Drabeni ir bendraautorių tyrimo rezultatais [27]. Nustatyta, jog, norint palyginti MN gylį, išmatuotą skirtingais histologiniais dažymo metodais, reikia ištirti ne mažiau kaip 72 atvejus.

Į tyrimą įtraukti Kauno klinikų Odos ir venerinių ligų klinikos pacien-tai, kuriems po gydytojo dermatologo apžiūros ir dermatoskopinio tyrimo suplanuota atlikti vieno ar daugiau MN eksciziją.

Įtraukimo į tyrimą kriterijai: 1. Vyresni nei 18 metų vyrai ir moterys. 2. Rašytinis tiriamojo sutikimas dalyvauti tyrime. 3. Oda aplink MN nepažeista, anksčiau netaikytas kitas gydymas. 4. MN susiformavęs tose odos srityse, kur atliekant UG tyrimą

galimas tiesioginis sąlytis su ultragarso keitikliu, t. y. ne plaukuoto-joje galvos dalyje, nago plokštelėje ar kitoje vietoje, kai tiesioginis sąlytis neįmanomas.

5. MN paviršius plokščias ir neišopėjęs. 6. MN skersmuo mažesnis nei 2 cm.

Neįtraukimo į tyrimą kriterijai: 1. Tiriamasis dėl kalbinių ar psichologinių kliūčių nesupranta Infor-

muotojo asmens sutikime pateikiamos informacijos ar atsisako pasirašyti sutikimą dalyvauti tyrime.

2. Tiriamasis yra administracinio ar teisminio tyrimo subjektas. 3. Tiriamoji yra nėščia ar žindo. 4. Tiriamasis neturi socialinio sveikatos draudimo, reikalaujamo pagal

sveikatos priežiūros įstaigų įstatymą.

26

Pacientai išsamiai supažindinti su tyrimo eiga naudojant Asmens infor-

mavimo formą (3 ir 4 priedai). Tiriamojo asmens duomenys koduoti ketur-ženkliu skaitmeniniu kodu.

Perspektyviojo tyrimo pradžia – 2014-09-01, pabaiga – 2015-09-01. Ty-rimo imtis ir etapai pateikti 3.2.1 paveiksle.

Į tyrimą įtraukti 136 pacientai, kuriems UG ištirti ir po to išoperuoti 165 MN. Iš jų, remiantis histologinio tyrimo išvada, patvirtintos MA (n = 128) ir OM (n = 37) diagnozės. Po histologinių preparatų peržiūros MN, kurių dermoje nebuvo melanocitų ir jų vaizdas netilpo į mikroskopo skaitmeninės kameros regėjimo lauką, padidintą 4 kartus (pBG (HE) > 3,5 mm), neįtrauk-ti į galutinį tyrimo rezultatų vertinimą (n = 30; 28 MA ir 2 OM). Į tolesnius tyrimo etapus įtraukta 20 OM atvejų, ištirtų retrospektyviai pagal tą patį klinikinio tyrimo protokolą, vykdant 2009–2013 m. EUROSTARS projektą „Odos vėžio diagnostika informacinėmis bei komunikacijų technologi-jomis“ (SkinMonitor: Nr. E!4846).

Taigi, analizuojant statistinį ryšį tarp UG ir histologiniu tyrimu išmatuoto MN gylio rezultatų, ištirti 155 MN (3.2.1 pav.).

Lyginant rT ir aT parametrų sąsają, ištirti 145 MN, nes 10 atvejų aT rodiklis neišmatuotas dėl UG artefaktų.

Siekiant nustatyti imunohistocheminių (IH) tyrimų papildomą naudą ma-tuojant naviko gylį, lyginant su histologiniu tyrimu, ištirti MN atvejai, kurie nuosekliai atrinkti iš bendros tyrimo imties (20 OM ir 87 MA). Toks atvejų skaičius buvo pakankamas remiantis imties tūrio skaičiavimu (žr. 24 psl.).

Vykdant bendrą LSMU ir KTU Mokslo fondo finansuotą projektą „SkinTech“, 52 atvejų MN ultragarso vaizdai ir pBG histologinio vertinimo duomenys išanalizuoti KTU UI sukurta automatine radiodažninių signalų analizės programa, rezultatai paskelbti Journal of Ultrasound in Medicine žurnale (citavimo indeksas – 1,547) (žr. 76 psl.)

27

3.2.1 pav. Tyrimo imtis ir etapai

OM (n = 20) atvejai įtraukti retrospektyviai.

3.3. Tyrimo eiga

3.3.1. Melanocitų kilmės odos naviko klinikinių požymių įvertinimas Pagal klinikinio tyrimo protokolą įvertinti šie MN požymiai: spalva,

ribos, dydis (mm) pagal ilgiausią X ir Y ašis. Nustatyta MN anatominė sritis pagal t-SNOMED nomenklatūrą (angl. topography – Standardised Nomen-clature of Medicine) [86] bei klinikinė diagnozė pagal Tarptautinį ligų klasifikatorių (TLK-10-AM). MN vaizdas papildomai ištirtas skaitmeniniu dermatoskopu FotoFinder (padidinančiu vaizdą 20 kartų). Skaitmeniniai dermatoskopiniai MN vaizdai archyvuoti DICOM (angl. Digital Imaging and Communications in Medicine) formatu PACS (angl. Picture Archiving and Communication System) serveryje [36, 37]. Vieno tiriamojo apžiūra truko nuo 10 iki 20 minučių.

28

3.3.2. Ultragarsinis tyrimas Rankiniu ir automatiniu būdu atliktas MN tyrimas. MN ištirtas ultragar-

su DUB-USB (Taberna Pro Medicum, Vokietija) aukšto dažnio (22 MHz) fokusuoto mechaninio skenavimo keitikliu su vandens talpykla, kuri skirta vienodam atstumui iki tiriamo odos paviršiaus garantuoti. UG duomenų registravimo metu keitiklis laikytas statmenai MN paviršiui, vaizdo langas parinktas rankiniu būdu. Aukšto dažnio UG signalų registravimo tiriant MN schema pateikta 3.3.2.1 paveiksle.

3.3.2.1 pav. Aukšto dažnio ultragarso duomenų surinkimo sistema [5, 83]

Tiriant MN, kad būtų nustatytas didžiausias vertikalus gylis nuo naviko viršutinės ribos iki giliausio hipoechogeninio taško, užregistruoti mažiausiai du dvimačiai B-tipo vaizdai (3.3.2.2 pav. A). MN gylis (0,01 mm tikslumu) UG rankiniu būdu (rT) išmatuotas vieno tyrėjo (darbo autorės) naudojant UG gamintojo programos interaktyvius žymeklius (3.3.2.2 pav. A). Papildo-mai įvertinti UG vaizdo ypatumai: MN struktūra (homogeninė, nehomo-geninė), kraštai (taisyklingi, netaisyklingi), riba tarp MN ir aplinkinių audinių (aiški, neaiški, iš dalies aiški) [2]. Tirtų UG vaizdo ypatumų charak-teristikos pateiktos 3.3.2.3 paveiksle.

Kitas tyrėjas dermatologas papildomai ištyrė 15 proc. (22 iš 155) atsi-tiktinai pasirinktų MN ultragarso vaizdų. Dviejų tyrėjų registruotų rT rezul-tatų sutapimo duomenys pateikti 40 psl.

29

Užregistruoti UG vaizdai išsaugoti d4w formatu kietajame kompiuterio diske ir Meddream programoje („Softneta“, Lietuva) DICOM formatu PACS serveryje. Naviko UG vaizdo matmenų erdvinė analizė atlikta specializuota LSMU ir KTU mokslininkų sukurta programine įranga, skirta automatiniam odos naviko gyliui ultragarsiniuose B-tipo vaizduose matuoti. Ši programa sukurta vykdant LSMU ir KTU UI projektus „SkinTech“ (2014 m.) bei „SkinTechSoft“ (2015 m.), finansuotus LSMU Mokslo fondo. Naudojant šią programą darbo autorė automatiniu būdu išmatavo MN gylį (aT) skaitmenizuotuose UG vaizduose (3.3.2.2 pav. B) ir palygino jį su rT bei pBG (HE) matavimo rezultatais. Programa integruota į darbinį kompiu-terį, jos veikimo algoritmas aprašytas 3.3.2.1 lentelėje. Vieno paciento ultragarsinis tyrimas truko nuo 15 iki 30 minučių.

3.3.2.2 pav. Odos melanomos gylis, išmatuotas 22 MHz ultragarsu B-tipo

vaizduose rankiniu būdu (A) ir naudojant automatinę programą (B) Balta ir gelsva rodyklės žymi didžiausią odos melanomos gylį.

30

3.3.2.3 pav. Melanocitų kilmės odos naviko ultragarso vaizdo ypatumų

charakteristikos: struktūra – (A) homogeninė, (B) nehomogeninė; kraštai – (A) taisyklingi, (B, C) netaisyklingi; riba tarp MN ir aplinkinių audinių – (A) aiški, (B) neaiški, (C) iš dalies aiški

3.3.2.1 lentelė. Pagrindiniai B-tipo ultragarso vaizdo apdorojimo automati-niu segmentavimo algoritmu etapai* [65]

Etapas Aprašymas 1. Vaizdo paruošimas Vaizdo triukšmo mažinimas, vaizdo glotninimas panaudojant

amplitudės slenkstį ir erdvinį slenkančio vidurkio lango filtrą (branduolio dydis – 3×3)

2. Odos paviršiaus aptikimas

Dvimačio MN vaizdo skenavimas adaptyviu binarizavimo algoritmu eilutė po eilutės [89], viršutinės MN ribos aptikimas ir kontūro linijos apskaičiavimas [26] 3. MN viršutinio krašto

aptikimas 4. MN apatinio (pagrindo)

krašto aptikimas Vaizdo išplėtimas, sutraukimas, glotninimas panaudojant amplitudės slenkstį ir erdvinį slenkančio vidurkio lango filtrą (branduolio dydis – 3×3) [41]

5. MN formos vertinimas pagal aptiktus kraštus

Kartotinis MN ribų atkūrimas, apibrėžimas ir segmentacija

6. MN pjūvio ploto bei gylio matavimas

Pjūvio ploto apskaičiavimas standartiniu daugiakampio ploto apskaičiavimo algoritmu. Didžiausio atstumo tarp kontūro taškų aptikimas X ašyje. Maksimalus atkarpos ilgis laikomas didžiausiu MN gyliu

MN – melanocitų kilmės odos navikas. *2014–2015 m. LSMU ir KTU UI sukurta programinė įranga.

31

3.3.3. Melanocitų kilmės odos naviko išpjovimas Laikantis LSMU ligoninės darbo instrukcijų, tiriamiesiems MA

ekscizija atlikta OVLK, o OM operacinis gydymas – LSMU MA Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinikoje. Atvejų skaičius pateiktas 3.2.1 pa-veiksle (žr. 27 psl.).

3.3.4. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimai MN histologinis ir IH tyrimai atlikti LSMU MA Patologinės anatomijos

klinikoje, laikantis šių tyrimų atlikimo procedūros aprašo. MN mėginys padalytas į 2 dalis statmenai ilgajai naviko ašiai ir įlietas į parafino bloką. Iš parafine įlieto MN storiausios dalies mikrotomu atpjautas 3 µm storio prie-paratas nudažytas hematoksilinu-eozinu (HE). Iš likusios dalies atpjauti 3 papildomi 3 µm storio preparatai, kurie perkelti ant objektinių stiklelių SuperFrost Plus („Thermo Fisher Scientific“, JAV), skirtų IH reakcijoms atlikti su dviem skirtingais melanocito raiškos specifiniais žymenimis: poli-kloniniu triušio antikūnu S100 (CONFIRM anti-S100 (Polyclonal, Roche, JAV) ir trijų IH žymenų deriniu (Melanoma Triple Cocktail, Roche, JAV), sudarytu iš antimelanosominių (HMB-45), anti-MART-1/Melan-A (A103) ir antitirozinazės (T311) pelių monokloninių antikūnų. IH žymenų baltymų raiškos analizei naudotas Ventana BenchMark Ultra dažymo automatas („Ventana Medical Systems“, JAV). Antigenų epitopai atkurti Ventanos ląstelių kondicionavimo tirpalu CC1 (pH 8,5) 95 °C temperatūroje nustatytu laiku (S100 – 36 min., žymenų derinys – 60 min.). Vėliau, naudojant Ventana Ultraview DAB detekcijos sistemą, MN preparatai inkubuoti su monokloniniais antikūnais (S100: 36 °C temperatūroje – 20 min., tirpalo skiedimo santykis – 1:200; žymenų derinys: 37 °C temperatūroje – 28 min.).

Patyręs patologas (J. M.) nustatė MA, displazinio MA ar OM diagnozę remdamasis morfologiniais požymiais [97].

MN gylis pagal Breslau (pBG) išmatuotas nuo epidermio raginio ir grūdėtojo sluoksnių ribos iki giliausiai dermą ar poodį infiltruojančių naviko ląstelių (3.3.4.1 pav. A), preparate, dažytame HE, – pBG (HE), žymeniu S100 – pBG (S100) ir trijų IH žymenų deriniu – pBG (derinys) [64]. Šiems matavimas atlikti naudotas Olympus BX43 (Japonija) mikroskopas su 10 kartų didinančiu okuliaru. Mažiausia okuliare įmontuoto mikrometro padala – 0,01 mm. Nepriklausomas patyręs patologas (G. S.) Olympus BX51 (Japonija) mikroskopu (0,1 mm tikslumu, mikrometras integruotas mikrosk-opo stalelyje) papildomai išmatavo BG (HE) 15 proc. atsitiktinai atrinktų MN preparatų. Skirtingų tyrėjų gautų pBG (HE) rezultatų sutapimo duome-nys pateikti 56 psl. Pasitelkus skaitmenizuotus histologinių preparatų vaiz-dus, Q-Imaging MicroPublisher 5.0 RTV mikroskopo kamera (raiška –

32

5 mln. pikselių 2560×1920) BG (HE), BG (S100) ir BG (derinys) išma-tuotas antrojo tyrėjo (G. L.). Matavimai atlikti QCapture Pro 7 programa padidinus 10 kartų. Kai visas MN gylis mikroskopo kameros regėjimo lauke netilpo, vaizdas didintas 4 kartus (3.3.4.1 pav. B).

3.3.4.1 pav. Odos melanomos gylis pagal Breslau,

išmatuotas HE preparate patyrusio patologo (raudona rodyklė) (A) ir automatine QCapture Pro 7 programa (mėlyna rodyklė) (B)

L1 – žymeklis (mikrometrais) jungia 2 taškus nuo raginio sluoksnio apačios iki giliausio naviko krašto. Vaizdas padidintas 4 k., nes navikas gilus ir netelpa

į mikroskopo kameros regėjimo lauką.

Bendru dviejų tyrėjų (J. M. ir G. L.) sutarimu, HE dažytame preparate vertinta:

• Limfocitų infiltrato laipsnis: a) nėra ar nedidelis, kai matyti pavie-niai limfocitai, išsidėstę perivaskuliariai dermoje (3.3.4.2 pav. A), b) didelis – vienas prie kito išsidėstę limfocitai naviko stromoje ar aplink naviką bent viename mikroskopo regėjimo lauke, c) vidutinis, kai jų kiekio negalima priskirti nei a, nei b kategorijoms (3.3.4.2 pav. B, C).

• Melanofagų kiekis dermoje: a) nėra ar pavieniai (3.3.4.2 pav. A), b) gausus – glaudžiai juostos forma išsidėstę naviko stromoje arba naviko apatiniame krašte (3.3.4.2 pav. B) bent viename mikroskopo regėjimo lauke c) vidutinis – kai negalima priskirti nei a, nei b kategorijoms (3.3.4.2 pav. C).

• Vyraujančio limfocitų infiltrato lokalizacija MN – stroma (3.3.4.2 pav. B) ar aplink naviką (3.3.4.2 pav. C).

33

3.3.4.2 pav. Melanocitų kilmės odos naviko morfologinių požymių

vertinimas histologiniame preparate: A) HE ×10, mišrus displazinis melanocitų kilmės apgamas: limfocitų infiltratas – nėra ar nedidelis,

melanofagai – nėra ar pavieniai; B) HE ×10, mišrus melanocitų kilmės apgamas: limfocitų infiltratas – vidutinis, lokalizuotas naviko stromoje,

gausu melanofagų; C) HE ×10, mišrus melanocitų kilmės apgamas: limfocitų infiltratas – didelis, lokalizuotas aplink naviką,

vidutinis kiekis melanofagų dermoje Raudonas kvadratas – limfocitų infiltratas, mėlynas kvadratas – melanofagai.

• Melanocitų išsidėstymo dermoje pobūdis: a) atskiros ląstelės – atskiri melanocitai, supami dermos, b) lizdai – atskira melanocitų grupelė, supama dermos, c) susiliejantys lizdai – susiliejančios melanocitų grupelės, supamos dermos, d) difuzinis – melanocitai išsidėstę labai glaudžiai, neįmanoma atskirti, tai atskiros ląstelės ar lizdai (3.3.4.3 pav. A–D).

3.3.4.3 pav. Melanocitų išsidėstymas dermoje

34

HE ir IH žymenimis dažytame MN preparate nustatyti išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę (3.3.5.4 pav. A–C) arba nuo naviko atsiskyrę melanocitai (3.3.4.4 pav. D–F).

3.3.4.4 pav. Melanomos (A–C, ×4) ir mišraus melanocitų kilmės apgamo (D–F, ×10) gylio pagal Breslau vertinimas milimetrais (raudona rodyklė) histologinio preparato skaitmenizuotuose vaizduose: dažymas HE (A, D),

dažymas žymeniu S100 (B, E) ir kelių žymenų deriniu (C, F) išryškino išilgai plauko folikulo išsidėsčiusius melanocitus (A–C) ir mažus melanocitų

lizdus dermoje (D–F)

35

3.4. Statistinis duomenų vertinimas

Gauti tyrimo duomenys sukaupti skaitmeninėje duomenų bazėje naudo-jant Microsoft Excel 2003 programą. Duomenų aprašomąją statistiką atliko šio darbo autorė, padedama LSMU Informacinių technologijų centro inži-nierės programuotojos Eglės Šepetauskienės. Statistinis duomenų apdoroji-mas atliktas SPSS programine įranga, versija 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV) ir MedCalc programine įranga (MedCalc Software, Mariakerke, Bel-gija).

Statistinės analizės uždaviniai ir metodai.

Požymių aprašymas • Kiekybiniai požymiai, kurių reikšmių skirstinys populiacijoje buvo

normalusis (Gauso), aprašyti pateikiant jų reikšmių vidurkį bei standartinį nuokrypį.

• Kiekybiniai požymiai, kurie neturėjo normaliojo skirstinio pagal Kolmogorovo-Smirnovo kriterijų, aprašyti pateikiant jų reikšmių medianą ir pirmą (K1) bei trečią (K3) kvartilius. Mediana yra didė-jimo tvarka surikiuotų duomenų vidurys, kuris daug mažiau nei aritmetinis vidurkis priklauso nuo skirstinio asimetrijos. Tarp pirmo ir trečio kvartilių yra 50 proc. skaitinių duomenų reikšmių.

• Kokybiniams nominaliesiems ir ranginiams požymiams aprašyti naudotos proporcijos (proc.)

Grupuotų požymių palyginimas • Hipotezėms apie vidurkių skirtumus lyginamosiose nepriklausomo-

se grupėse (dviejų lyginamų grupių atveju) taikytas parametrinis hipotezių tikrinimo Stjudento t kriterijus [88].

• Skirtumas tarp dviejų nepriklausomų grupių (kiekybiniai nenorma-lieji požymiai) nustatytas pagal Manno-Vitnio kriterijų [88].

• Kokybinių požymių kelių grupių sąsajoms nustatyti taikytas susiju-sių požymių lentelių metodas ir skaičiuotas chi kvadrato (χ²) krite-rijus [88]. Dviejų proporcijų palyginimui naudotas z kriterijus [88].

Tiesinio ryšio vertinimas Tiesiniam ryšiui tarp dviejų kintamųjų įvertinti esant kiekybiniams

nenormaliems kintamiesiems (rT, aT ir pBG palyginimui) taikytas Spirmeno koreliacijos koeficientas (|r|) (3.4.1 lentelė) [96].

36

3.4.1 lentelė. Koreliacijos koeficiento reikšmių vertinimas Koeficiento |r| reikšmė Interpretacija

0,9 |r| 1 Labai stipri tiesinė koreliacija 0,7 |r| <0,9 Stipri tiesinė koreliacija

0,5 |r| <0,7 Vidutinė tiesinė koreliacija

0,3 |r| <0,5 Silpna tiesinė koreliacija

0 |r| <0,3 Labai silpna koreliacija arba jokios

|r| – Spirmeno koreliacijos koeficientas.

Dviejų tyrimo metodų duomenų sutapimo vertinimas Dviem skirtingiems tyrimo metodams, naudojamiems klinikinėje

praktikoje, palyginti taikyta Blando-Altmano grafinė analizė [14]. Matavimų rezultatų sutapimui įvertinti apskaičiuotos skirtumų vidurkio 95 proc. PI ribos: d±1,96 SN. Sutapimo ribų tikslumui įvertinti apskaičiuoti 95 proc. PI sutapimų riboms: apatinei (d–1,96 SN)±1,96 SN (3/n)½ ir viršutinei (d+1,96 SN)±1,96 SN (3/n)½, kur d – vidurkių skirtumas, n – matavimų porų skaičius (imties didumas).

UG tyrimo tikslumo nustatymas matuojant melanocitų kilmės odos naviko gylį rankiniu būdu ir automatine programa Šiame tyrimo etape tirti MN sugrupuoti į plonus (gylis <1 mm) ir storus

(gylis ≥1 mm), nes tokia naviko gylio skiriamoji riba reikšminga OM prognozei ir operacinio gydymo taktikai (žr. 9 psl.).

UG tyrimo jautrumas, specifiškumas, teigiama ir neigiama prognozinė vertė bei tikslumas matuojant plonų ir storų MN gylį pBG (naviko gylis išmatuotas pagal Breslau histologinio tyrimo metu) atžvilgiu nustatyti pagal toliau pateiktas skaičiuotes:

Jautrumas (angl. sensitivity) – tikimybė, kad, esant <1 mm gylio MN, histologiniu ir UG tyrimais nustatytas naviko gylis sutaps. Jautrumas apskaičiuotas pagal formulę:

caa+

,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, a + c – histologiniu tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius [8].

37

Specifiškumas (angl. specificity) – tikimybė, kad, esant ≥1 mm gylio MN, histologiniu ir UG tyrimais nustatytas gylis sutaps. Specifiškumas apskaičiuotas pagal formulę:

bdd+

,

kur d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, d+b – histologiniu tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius [8]. Teigiama prognozinė vertė (angl. positive predictive value) – tikimybė, kad matuojant UG tikrai bus nustatytas <1 mm gylio MN. Ji apskaičiuota pagal formulę:

baa+

,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, a+b – visų tik UG tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius [8]. Neigiama prognozinė vertė (angl. negative predictive value) – tikimybė, kad matuojant UG bus nustatytas ≥1 mm gylio MN. Šis rodiklis apskai-čiuotas pagal formulę:

dcd+

,

kur d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, c+d – visų tik UG tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius) [8]. Tikslumas (angl. accuracy) – rodiklis, apibūdinantis diagnostikos metodo tikslumą ir rodantis teisingai identifikuotų atvejų santykį su visais tiriamais atvejais. Tyrimo tikslumas apskaičiuotas pagal formulę:

dcbada+++

+ ,

kur a – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, b – histologiniu tyrimu nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius, c – histologiniu tyrimu nustatytų <1 mm gylio MN skaičius, d – UG ir histologiniu tyrimais nustatytų ≥1 mm gylio MN skaičius [8].

38

Dviejų tyrėjų matavimo rezultatų sutapimo vertinimas Dviejų tyrėjų vertintų parametrų tarpklasinės koreliacijos koeficientas

(angl. intra-class correlation coefficient (ICC)) apskaičiuotas pagal kieky-binių matavimų sutapimą. Šio koeficiento reikšmės gali kisti nuo -1 iki 1. Kuo ICC arčiau 1, tuo dviejų tyrėjų matavimo rezultatų sutapimas didesnis [55].

Reikšmės prognozavimas pagal kitų kintamųjų reikšmes Daugiamatės logistinės regresinės analizės duomenimis, taikant statisti-

nio modelio atrankos pažingsnę (angl. stepwise) metodiką [19], nustatytas ryšys tarp MN ultragarso vaizdo ypatumų ir jų morfologinių požymių. Taip pat apskaičiuotas pBG (HE) ir pBG, matuoto IH dažymo metodais, rezultatų nesutapimo (MRN) galimybių santykis (GS), kai skirtumas tarp šių para-metrų buvo ≥0,1 mm. Tas pats modelis taikytas ir nustatant ryšio stiprumą tarp MN gylio, išmatuoto UG ir histologiniu tyrimais, rezultatų nesutapimo (nepakankamai įvertintas ir pervertintas UG gylis sutapusio su pBG (HE) atžvilgiu) priklausomai nuo morfologinių požymių.

Logistinės regresijos lygties koeficientai tikrinti pagal nuliškumo hipo-tezes. Atskirų požymių reikšmingumas nustatytas pagal GS dydį, exp(B) = GS ir jo pasikliautinuosius intervalus. Taikant determinacijos koeficientą R² ir modelio atitikimo kriterijų, atrinkti optimalūs požymių deriniai, kurie teisingai apibrėžė tiriamą dažnumą. Logistinė regresinė analizė modeliuota taip, kad koeficientas B būtų teigiamas, o modelio atitikimo kriterijaus reikšmingumas būtų p<0,05.

Analizės rezultatų pateikimas Statistinės duomenų analizės rezultatai pateikiami lentelėmis ir grafikais. Išvadoms apie statistinių hipotezių tikrinimo rezultatus pateikti naudo-

tos p reikšmės: ryšys laikytas statistiškai reikšmingu, kai p<0,05 [88].

39

4. DARBO REZULTATAI

4.1. Aukšto dažnio ultragarsu (rankiniu bei automatiniu būdais) ir histologiniu tyrimu išmatuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio

sąsaja priklausomai nuo naviko morfologinių požymių

Įgyvendinant šį uždavinį, ištirti 155 MN, kurie buvo išoperuoti 94 mote-rims (69 proc.) ir 42 vyrams (31 proc.). OM ir MN diagnozių dažnumas pagal tiriamųjų lytį nesiskyrė (χ² = 0,23; p = 0,63). Tiriamųjų amžius svyravo nuo 18 iki 87 metų, amžiaus vidurkis – 47,46 ± 17,2. Vyrų ir moterų amžius nesiskyrė (p = 0,68). Daugiausiai (56 proc.) išoperuotų MN buvo susiformavę liemens odoje. Tirtų MN lokalizacijos, UG vertinto gylio bei morfologinių požymių charakteristika pateikta 4.1.1 lentelėje.

4.1.1 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų lokalizacijos, ultragarsu išma-tuoto gylio ir vaizdo ypatumų bei morfologinių tipų, nustatytų histologiniu tyrimu, apibūdinimas

Požymiai N Proc. MN lokalizacija Liemuo 87 56

Viršutinės galūnės 27 17 Apatinės galūnės 38 25

MN klasifikavimas pagal gylį, išmatuotą UG

Ploni (<1 mm) 118 76 Stori (≥1 mm) 37 24

MN gylio nustatymas UG programiniu būdu*

Išmatuotas 145 93 Neišmatuotas 10 7

MN struktūra ultragarso tyrimo metu

Homogeninė 84 54 Nehomogeninė 71 46

Riba tarp MN ir aplinkinių audinių ultragarso tyrimo metu

Aiški 80 52 Neaiški 6 4 Iš dalies aiški 69 44

MN kraštai ultragarso tyrimo metu

Taisyklingos 95 61 Netaisyklingos 60 39

40

4.1.1 lentelės tęsinys Požymiai N Proc.

MN morfologiniai tipai Paviršiumi plintanti OM 33 60 Mazginė OM 1 2 Lentigo maligna melanoma 8 15 Pailgųjų ląstelių OM 3 5 Akralinė lentiginozinė OM 6 11 Piktybinė OM, neklasifikuota

4 7

Mišrus melanocitų kilmės apgamas, nedisplazinis

55 55

Mišrus melanocitų kilmės apgamas, displazinis

45 45

Iš viso 155 100 *Odos navikų automatinė UG gylio vertinimo programa sukurta KTU ir LSMU mokslininkų grupės vykdytuose jungtinės veiklos projektuose (žr. 29 psl.). OM – odos melanoma; MN – melanocitų kilmės odos navikas

Į galutinę MN gylio, nustatyto ultragarsu rankiniu (rT) ir automatiniu (aT) būdais, lyginamąją analizę įtraukti 145 iš 155 MN tyrimų rezultatai. Dešimt atvejų (7 proc.), t. y. vienos OM ir devynių melanocitų kilmės apgamų (MA), gylis automatine programa neišmatuotas dėl vaizdinimo artefaktų, tokių kaip UG vaizdo triukšmas ir nepakankamas ryškumas.

Apskaičiavus dviejų dermatologų nustatytų rT rezultatų sutapimą, tarpklasinės koreliacijos koeficientas buvo 0,98 (95 proc. PI nuo 0,96 iki 0,99). Rankiniu (rT) būdu ultragarsu išmatuotas OM gylis svyravo nuo 0,41 iki 2,83 mm, o automatiniu būdu (aT) – nuo 0,29 iki 3,72 mm. MA gylis, išmatuotas rankiniu būdu, svyravo nuo 0,13 iki 1,86 mm, aT – nuo 0,18 iki 2,55 mm. Odos melanomos rT mediana buvo 0,96 mm (K1–K3: 0,65–1,52), o aT – 0,98 mm (K1–K3: 0,62–1,65). Melanocitų kilmės apgamų rT ir aT mediana – atitinkamai 0,51 mm (K1–K3: 0,37–0,67) ir 0,50 mm (K1–K3: 0,36–0,74). Tarp rT ir aT rezultatų, gautų ištyrus OM ir MA gylį, nustatytas stiprus ryšys, atitinkamai r = 0,84 ir r = 0,87 (4.1.2 lentelė).

41

Remiantis Blando-Altmano analizės metodu (4.1.1, 4.1.2 pav.), rT ir aT reikšmių vidurkis, vertinant OM gylį, skyrėsi 0,08 mm (95 proc. PI nuo -0,01 mm iki 0,18 mm ), MA atvejais – vidurkio skirtumas -0,03 mm (95 proc. PI nuo 0 iki 0,07 mm).

4.1.1 pav. Odos melanomos (n = 54) gylio, vertinto ultragarsu rankiniu (rT) ir automatiniu būdais (aT), skirtumas Blando-Altmano analizės duomenimis aT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu automatiniu būdu; rT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu rankiniu būdu; SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo aT ir rT rodmenų skirtumo vidurkį (jis yra 0,08 mm), žalia linija – šio skirtumo 95 proc. pasikliautinojo intervalo (PI) ribas, raudona linija – aT ir rT vidurkio 95 proc. sutapimo ribas.

42

4.1.2 pav. Melanocitų kilmės apgamų (n = 91) gylio, vertinto ultragarsu rankiniu (rT) ir automatiniu būdais (aT), skirtumas Blando-Altmano

analizės duomenimis aT – naviko gylis nustatytas automatiniu būdu ultragarso tyrimo metu; rT – naviko gylis nustatytas rankiniu būdu ultragarso tyrimo metu; SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo aT ir rT rodmenų skirtumo vidurkį (jis lygus 0,03 mm), žalia linija – šio skirtumo 95 proc. pasikliautinojo intervalo (PI) ribas, atitinkamai raudona linija – aT ir rT vidurkio 95 proc. sutapimo ribas.

Spirmeno koreliacijos koeficientas, apskaičiuotas tiriant ryšį tarp MN gylio, išmatuoto UG vaizduose rankiniu, automatiniu būdais ir histologiniu tyrimu, pateikiamas 4.1.2 lentelėje.

Iš 4.1.3 lentelės matyti, jog rT ir aT mediana OM atveju yra didesnė nei MA. Ultragarsu rankiniu ir automatiniu būdais išmatuotas OM gylis stipriau susijęs su pBG (HE) nei MA (4.1.2 lentelė).

43

4.1.2 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 145) gylio, išmatuoto ultragarsu rankiniu bei automatiniu būdais, palyginimas su histologinio tyrimo duomenimis

MN n Gylio matavimo rezultatai (mm) r1 r2 Mediana (tarpkvartilinis plotis K1–K3)

rT aT pBG (HE) OM 54 0,96*(0,65–1,52) 0,98* (0,62–1,65) 0,97*(0,66–1,62) 0,86 0,80

MA 91 0,51 (0,37–0,67) 0,50 (0,36–0,74) 0,69 (0,46–1,01) 0,64 0,60 MN – melanocitų kilmės odos navikas; OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamas; n – atvejų skaičius; rT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu rankiniu būdu; aT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu automatiniu būdu; pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; r1 – Spirmeno koreliacijos koeficientas lyginant rT ir pBG (HE) (p<0,001); r2 – Spirmeno koreliacijos koeficientas lyginant aT ir pBG (HE) (p<0,001); K1 – pirmasis kvartilis; K3 – trečiasis kvartilis; *statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp OM ir MA gylio medianų.

Kadangi ultragarsu rankiniu ir automatiniu būdais nustatyto MN gylio duomenys statistiškai reikšmingai nesiskyrė, tolesnėje šio darbo rezultatų analizėje naudotas rT parametras ir vertinta jo sąsaja su pBG (HE). Atsižvel-giant į OM morfologinę formą, stiprus ryšys tarp rT ir pBG (HE) nustatytas akrolentiginozinės ir paviršiumi plintančios OM atveju (r = 0,96 ir r = 0,76). Vertinant kitų morfologinių formų OM, ryšio tarp rT ir pBG (HE) negalėta nustatyti dėl mažo atvejų skaičiaus. Apskaičiuota, kad stiprus ryšys tarp rT ir pBG (HE) matavimo rezultatų yra tiriant MN iš viršutinių bei apatinių galūnių (r = 0,86 ir r = 0,74), vidutiniškai stiprus – iš liemens srities (r = 0,63).

Blando-Altmano analizės duomenimis, OM atveju rT ir pBG (HE) mata-vimo rezultatų vidurkis skiriasi mažiau nei MA (4.1.3, 4.1.4 pav.). Daugiau nei puse (73 iš 91) MA atvejų rT buvo mažesnis nei pBG (HE) (p<0,001). Priešingai, trečdaliu OM atvejų (27 iš 54) pastebėta tendencija, kad rT buvo didesnis nei pBG (HE), tačiau šie skirtumai statistiškai nereikšmingi.

44

4.1.3 pav. Odos melanomos (n = 54) gylio, vertinto ultragarsu

rankiniu būdu (rT) ir histologiniu tyrimu, skirtumas Blando-Altmano analizės duomenimis

rT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu rankiniu būdu; pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo rT ir pBG (HE) vidurkio skirtumą, kuris yra -0,07 mm, žalia linija – šio skirtumo 95 proc. pasikliautinojo intervalo (PI) ribas nuo -0,018 iki 0,04 mm, raudona linija – rT ir pBG (HE) vidurkio 95 proc. sutapimo ribas.

45

4.1.4 pav. Melanocitų kilmės apgamo (n = 91) gylio, vertinto ultragarsu

rankiniu būdu (rT) ir histologiniu tyrimu skirtumas Blando-Altmano analizės duomenimis

rT – naviko gylis nustatytas ultragarsu rankiniu būdu; pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo rT ir pBG (HE) vidurkio skirtumą, kuris yra -0,29 mm, žalia linija – šio skirtumo 95 proc. pasikliautinojo intervalo (PI) ribas nuo -0,039 iki -0,2, raudona linija – rT ir pBG (HE) vidurkio 95 proc. sutapimo ribas.

UG tyrimo tikslumui, lyginant su pBG (HE), nustatyti rankiniu ir automatiniu būdais išmatuotas naviko gylis suskirstytas į dvi kategorijas (<1 mm ir ≥1 mm). Iš 4.1.3 lentelės matyti, jog po histologinio tyrimo dešimtadaliu atvejų MN gylis <1 mm, išmatuotas UG rankiniu ir automa-tiniu būdais, perėjo į ≥1 mm gylio kategoriją. Remiantis 4.1.3 lentelės rezul-tatais, apskaičiuota UG tyrimo prognozinė vertė, MN klasifikuoti į plonus (<1 mm) ir storus (≥1 mm).

46

4.1.3 lentelė. Plonų (<1 mm) ir storų (≥1 mm) melanocitų kilmės odos navikų, išmatuotų ultragarsu rankiniu bei automatiniu būdais ir histologiniu tyrimu, pasiskirstymas (n = 145)

Naviko gylis pBG (HE) <1 mm ≥1 mm

rT

<1 mm 90 18 ≥1 mm 5 32

aT <1 mm 86 20 ≥1 mm 10 29

pBG (HE) – naviko gylis, išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu dažytuose preparatuose; rT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu rankiniu būdu; aT – naviko gylis, nustatytas ultragarsu automatiniu būdu.

Automatinės UG tyrimo programos tikslumas vertinant MN gylį yra 80 proc., jautrumas ir specifiškumas – atitinkamai 90 proc. (95 proc. PI nuo 85 iki 95 proc.) ir 60 proc. (95 proc. PI nuo 50 iki 67 proc.). Šios programos teigiama prognozinė vertė – 80 proc., o neigiama – 74 proc. Rankiniu būdu UG matuojamo MN gylio tikslumas siekia 84 proc., jautrumas – 95 proc. (95 proc. PI nuo 91 iki 98 proc.), specifiškumas – 64 proc. (95 proc. PI nuo 56 iki 72 proc.), teigiama ir neigiama prognozinė vertė – atitinkamai 83 proc. ir 87 proc. (rezultatai apskaičiuoti pagal 36–37 psl. pateiktas formules).

Gylio, išmatuoto ultragarsu ir histologiniu tyrimu, nesutapimas priklau-somai nuo MN morfologinės sandaros. UG vaizde išmatuoto MN gylio (rT) ne-sutapimas su gyliu histologiniame preparate (pBG (HE)) vertintas 0,1 mm tiks-lumu. Kad rT pervertintas laikyta tais atvejais, kai rT>pBG (HE), o nepakan-kamai įvertintu – kai rT<pBG (HE). Tyrimo duomenys pateikti 4.1.4 lentelėje. Iš jos matyti, kad matuojant UG vaizde MN gylis dažniau nustatomas mažesnis (67,1 proc.), o ne didesnis (z = 5,65, p<0,001). Atsižvelgiant į naviko rūšį, UG vaizde mažesnis gylis dažniau išmatuojamas tiriant MA nei OM (4.1.4 lentelė).

47

4.1.4 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų gylio, išmatuoto ultragarsu ir histologiniu tyrimu, nesutapimas (0,1 mm tikslumu) atsižvelgiant į naviko rūšį

Gylių grupės OM (n = 55) MA (n = 100) Iš viso (n = 155) Nepakankamai įvertintas rT (rT<pBG (HE))

26 (47,3) 78 (78,0)* 104 (67,1)

Pervertintas rT (rT>pBG (HE)) 17 (30,9)* 7 (7,0) 24 (15,5) Tapatus rT (rT = pBG (HE)) 12 (21,8) 15 (15,0) 27 (17,4) OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamas; n – odos navikų skaičius; rT – odos naviko gylis, išmatuotas ultragarsu rankiniu būdu; pBG (HE) – odos naviko gylis, išmatuotas histologinio tyrimo metu hematoksilinu ir eozinu; *p reikšmingumo lygmuo, lyginant pagal melanocitų kilmės odos navikų rūšį.

Morfologinių MN požymių pasiskirstymas rT ir pBG (HE) atitikimo grupėse (0,1 mm tikslumu) pateiktas 4.1.5 lentelėje. Iš jos matyti, kad dau-giau kaip pusė (68,3 proc.) navikų, kurių gylis UG vaizde įvertintas nepa-kankamai, neturi infiltrato limfocitais, lyginant su tais, kurių rT pervertintas. Esant pervertintam rT, dažniau (43,3 proc.) nei kitose rT ir pBG (HE) atitikimo grupėse nustatyti išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai. Tais atvejais, kai rT sutapo su pBG (HE), dažnesnis morfologinis požymis histologiniame preparate buvo lizdais išsidėstę mela-nocitai dermoje (18,5 proc.), lyginant su kitokio pobūdžio melanocitų išsi-dėstymu, retesnis – difuziškai išsidėstę melanocitai (4.1.5 lentelė).

4.1.5 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 155) gylio, išmatuoto ultragarsu ir histologiniu tyrimu, nesutapimas (0,1 mm tikslumu) atsižvel-giant į naviko morfologinius požymius

MN morfologiniai požymiai histologiniame preparate

Perv

ertin

tas r

T

(rT

>pB

G (H

E)),

n (p

roc.

)

Tap

atus

rT

(r

T =

pBG

(HE

)),

n (p

roc.

)

Nep

akan

kam

ai

įver

tinta

s rT

(r

T<p

BG

(HE)

),

n (p

roc.

)

Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 11 (45,8) 16 (59,3) 71 (68,3)* Tarp naviko ląstelių 7 (29,2) 7 (25,9) 28 (26,9) Naviko apačioje 6 (25,0) 4 (14,8) 5 (4,8)*

Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 11 (45,8) 16 (59,3) 71 (68,3)* Vidutinis 4 (16,7) 3 (11,1) 20 (19,2) Didelis 9 (37,5) 8 (29,6) 13 (12,5)*

Melanofagų kiekis dermoje Nėra 11 (45,8) 14 (51,9) 55 (52,9) Vidutinis 9 (37,5) 6 (22,2) 37 (35,6) Gausus 4 (16,7) 7 (25,9) 12 (11,5)

48

4.1.5 lentelės tęsinys MN morfologiniai požymiai

histologiniame preparate

Perv

ertin

tas r

T

(rT

>pB

G (H

E)),

n (p

roc.

)

Tap

atus

rT

(r

T =

pBG

(HE

)),

n (p

roc.

)

Nep

akan

kam

ai

įver

tinta

s rT

(r

T<p

BG

(HE)

),

n (p

roc.

)

Melanocitai išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos

Nėra 22 (91,7) 25 (92,6) 59 (56,7)* Yra 2 (8,3) 2 (7,4) 45 (43,3)*

Melanocitų išsidėstymo dermoje pobūdis

Atskiros ląstelės 6 (25,0) 8 (29,6) 15 (14,4) Lizdai 0 (0,0) 5 (18,5)* 11 (10,6) Susiliejantys lizdai 10 (41,7) 10 (37,0) 41 (39,4) Difuzinis 8 (33,3) 4 (14,8)* 37 (35,6)

Nuo naviko atsiskyrę pavieniai melanocitai ar smulkūs jų lizdai

Nėra 22 (91,7) 20 (74,1) 85 (81,7) Yra 2 (8,3) 7 (25,9) 19 (18,3)


Atskiros ląstelės 6 (25,0) 8 (29,6) 15 (14,4) Lizdai 0 (0,0) 5 (18,5)* 11 (10,6) Susiliejantys lizdai 10 (41,7) 10 (37,0) 41 (39,4) Difuzinis 8 (33,3) 4 (14,8)* 37 (35,6)


Nėra 22 (91,7) 20 (74,1) 85 (81,7) Yra 2 (8,3) 7 (25,9) 19 (18,3)

*p<0,001, lyginant UG vaizde nepakankamai įvertintą (rT<pBG (HE)), pervertintą (rT>pBG (HE)) ir tapatų (rT = pBG (HE)) gylį; n – atvejų skaičius; rT – MN gylis, išma-tuotas ultragarsu rankiniu būdu; pBG (HE) – MN gylis, išmatuotas histologinio tyrimo me-tu hematoksilinu ir eozinu.

Daugiamatės logistinės regresinės analizės duomenimis (4.1.6 lentelė), kai melanocitai išsidėstę išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos, tikimy-bė nepakankamai įvertinti rT padidėja aštuonis kartus, o kai melanocitai išsidėstę dermoje difuziškai – penkis kartus. Kiti MN morfologiniai požy-miai (limfocitų infiltrato lokalizacija bei laipsnis, melanofagų kiekis der-moje, nuo naviko atsiskyrę pavieniai melanocitai ar jų smulkūs lizdai) ne-susiję su nepakankamai įvertintu MN gyliu UG vaizde.

49

4.1.6 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 155) gylio nesutapimas (nepakankamai įvertintas gylis ultragarsu atsižvelgiant į sutapusį su išma-tuotu histologiniu tyrimu) atsižvelgiant į naviko morfologinius požymius

MN morfologiniai požymiai histologiniame preparate GS (95 proc. PI) p reikšmė Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 1 –

Naviko stroma 0,98 (0, 20–4,74) 0,98 Aplink naviką 0,87 (0,17–2,54) 0,34

Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 1 Vidutinis 1,43 (0,32–6,33) 0,64 Didelis 0,53 (0,14–1,99) 0,35

Melanofagų kiekis dermoje

Nėra 1 Vidutinis 3,09 (0,90–10,62) 0,07 Gausus 0,80 (0,21–3,05) 0,75


Nėra 1 – Yra 8,87 (1,94–40,48) 0,005


Nėra 1 – Yra 1,72 (0,52–5,65) 0,37


Atskiros ląstelės 1 – Lizdai 0,82 (0,20–3,46) 0,79 Susiliejantys lizdai 2,44 (0,79–7,50) 0,12 Difuzinis 5,35 (1,37–20,85) 0,016

GS – galimybių santykis, koreguotas pagal amžių, PI – pasikliautinasis intervalas, p – reikš-mingumo lygmuo, statistiškai reikšminga, kai p≤0,05; modelio tinkamumo determinacijos koeficientas R2 = 0,20; modelio prognozės tikslumas – 82,6 proc.

Nė vienas tirtas MN morfologinis požymis (limfocitų infiltrato lokaliza-cija bei laipsnis, melanofagų kiekis dermoje, išilgai plauko folikulo ar ekri-ninės liaukos išsidėstę melanocitai, nuo naviko atsiskyrę pavieniai melano-citai ar jų smulkūs lizdai, melanocitų išsidėstymo dermoje pobūdis) su pervertintu rT nebuvo susijęs.

50

4.2. Melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumai priklausomai nuo jų histologinės sandaros

Tiriant UG nustatyta, kad visi ištirti MN yra hipoechogeninės struk-tūros. MN ultragarsinę struktūrą apibūdinantys terminai pateikti 14–15 psl. Didesnė dalis OM nei MA buvo homogeninės struktūros (χ² = 4,355; p = 0,037) ir netaisyklingais kraštais (χ² = 17,156; p<0,0001). Puse atvejų riba tarp MN kraštų ir aplinkinių audinių buvo aiški. MN ultragarso vaizdo ypatumų pasiskirstymas pateiktas 4.2.1 lentelėje.

4.2.1 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n=155) ultragarso vaizdo ypatumai

Požymiai OM, n (proc.) MA, n (proc.) Reikšmingumo lygmuo

Struktūra Homogeninė 36* (65,5) 48 (48) p = 0,037; χ² = 4,355 Nehomogeninė 19 (34,5) 52* (52)

Riba tarp MN ir aplinkinių audinių

Aiški 29 (52,7) 51 (51) p = 0,61; χ² = 0,965 Neaiški 1 (1,8) 5 (5)

Iš dalies aiški 25 (45,5) 44 (44) Kraštai Taisyklingi 22* (38,9) 73 (73) p<0,0001;

χ² = 17,156 Netaisyklingi 33 (61,1) 27* (27) OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamai; *p<0,05, lyginant odos mela-nomų ir melanocitų kilmės apgamų ultragarso vaizdo ypatumus.

Daugiamatės logistinės regresinės analizės duomenimis (4.2.2 lentelė), kai MN ultragarso vaizde yra homogeninės struktūros ir turi netaisyklingus kraštus, penkis kartus padidėja tikimybė diagnozuoti OM, lyginant su MA.

4.2.2 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 155) ultragarso vaizdo ypatumų sąsaja su jų morfologiniu tipu (odos melanoma atsižvelgiant į melanocitų kilmės apgamą)

MN ultragarso vaizdo ypatumai GS (95 proc. PI) p reikšmė Struktūra Nehomogeninė 1 –

Homogeninė 4,78 (1,87–12,20) 0,01 Kraštai Taisyklingi 1 –

Netaisyklingi 5,60 (2,26–13,92) <0,001 MN – melanocitų kilmės odos navikas; GS – galimybių santykis, koreguotas pagal amžių, PI – pasikliautinasis intervalas, p – reikšmingumo lygmuo, statistiškai reikšminga, kai p≤0,05; modelio tinkamumo determinacijos koeficientas R2 = 0,45; modelio prognozės tikslumas – 80,6 proc.

51

Įvertinus MN preparatus, dažytus HE, nustatyta, kad MA atvejais daž-niau nei OM nėra limfocitų infiltrato (χ2 = 29,53; p<0,001) ir melanofagų dermoje (χ2 = 14,67; p = 0,001). OM atvejais dažniau nei MA yra didelis limfocitų infiltratas (χ2 = 29,53; p<0,001) ir gausu melanofagų dermoje (χ2 = 14,67; p = 0,001). Išilgai odos priklausinių išsidėstę melanocitai dažniau nustatomi esant MA nei OM (χ2 = 14,06; p<0,001). Penktadalis (16 proc.) OM susiformuoja iš MA (4.2.3 lentelė).

4.2.3 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (MN) morfologinių požymių charakteristika (n = 155)

Požymiai OM, n (proc.) MA, n (proc.) OM vystėsi iš apgamo Ne 46 (84) –

Taip 9 (16) – Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 22 (40) 76 (76)*

Naviko stroma 23 (42)* 19 (19) Aplink naviką 10 (18)* 5 (5)

Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 22 (40) 76 (76)* Vidutinis 10 (18) 17 (17) Didelis 23 (42)* 7 (7)


Nėra arba pavieniai 21 (38) 59 (59)* Vidutinis 18 (33) 34 (34) Gausus 16 (29)* 7 (7)


Nėra 48 (87)* 59 (59) Yra 7 (13) 41 (41)*


Atskiros ląstelės 12 (22) 17 (17) Lizdai 2 (4) 14 (14) Susiliejantys lizdai 24 (44) 37 (37) Difuzinis 17 (30) 32 (32)


Nėra 47 (85) 80 (80) Yra 8 (15) 20 (20)

OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamas; p < 0,001, lyginant melanomos ir melanocitų kilmės apgamo požymių grupes.

52

MN ultragarso vaizdo ypatumų ir jų morfologinių požymių, išanalizuotų histologiniame preparate, sąsajos tyrimo rezultatai pateikti 4.2.4 lentelėje. UG vaizde daugeliu atvejų (73,2 proc.) MN matomas nehomogeninės struktūros, kai nėra limfocitų infiltrato ar jis nedidelis (p = 0,048). Kai UG vaizde MN yra homogeninės struktūros, histologiniu tyrimu dažniau nenustatoma nuo naviko atsiskyrusių pavienių melanocitų ar smulkių jų lizdų nei nehomogeninės struktūros MN atvejais (p = 0,03). Kai UG vaizde MN matomas nehomogeninės struktūros, histologiniu tyrimu dažniau, lyginant su homogeninės, nustatomi atskiromis ląstelėmis ar lizdais išsidėstę melanocitai, o kai homogeninės struktūros – dažniau išsidėstę difuziškai (p<0,00001).

Netaisyklingi MN kraštai UG vaizde, lyginant su taisyklingais, dažnesni, kai tiriant histologiškai nustatoma šių morfologinių naviko požymių: gausu melanofagų dermoje, nuo naviko atsiskyrusių pavienių melanocitų ar smul-kių jų lizdų ir atskiromis ląstelėmis išsidėsčiusių melanocitų (4.2.4 lentelė).

UG vaizde iš dalies aiški riba tarp MN ir aplinkinių audinių, lyginant su aiškia, dažniau matoma tais atvejais, kai histologiniu tyrimu nustatoma, kad navike melanocitai pavieniai ar yra smulkių jų lizdų arba išsidėstę atskiro-mis ląstelėmis ar lizdais, o ne difuziškai (4.2.4 lentelė).

4.2.

4 le

ntel

ė. M

elan

ocitų

kilm

ės o

dos

navi

kų (

n =

155

) ul

trag

arso

vai

zdo

ypat

umų

skir

stin

ys a

tsiž

velg

iant

į na

viko

m

orfo

logi

nius

pož

ymiu

s his

tolo

gini

ame

prep

arat

e

Mor

folo

gini

ai p

ožym

iai t

irti

hist

olog

inia

me

MN

pre

para

te,

dažy

tam

e H

E

MN

stru

ktūr

a M

N k

rašt

ai

Rib

a ta

rp M

N ir

apl

inki

nių

audi

nių

Hom

oge-

nišk

a N

ehom

oge-

nišk

a T

aisy

klin

gi

Net

aisy

klin

gi

Aiš

ki

Nea

iški

Iš

dal

ies

aišk

i L

imfo

citų

infil

trat

o lo

kaliz

acija

Ta

rp M

N st

rukt

ūros

: p =

0,0

6; χ

² = 5

,650

. Tar

p M

N k

rašt

ų: p

= 0

,61;

χ² =

0,9

81. T

arp

MN

ribo

s nuo

ap

linki

nių

audi

nių:

p =

0,5

2; χ

² = 3

,249

; N

ėra

46 (5

4,8)

* 52

(73,

2)

62 (8

6,0)

35

(58,

3)

46 (5

7,5)

4

(66,

7)

48 (6

9,6)

N

avik

o st

rom

a 28

(33,

3)

14 (1

9,7)

24

(25,

5)

18 (3

0,0)

24

(30,

0)

2 (3

3,3)

16

(23,

2)

Apl

ink

navi

ką

10 (1

1,9)

5

(7,0

) 8

(8,5

) 7

(11,

7)

10 (1

2,5)

0

(0,0

) 5

(7,2

) L

imfo

citų

infil

trat

o la

ipsn

is Ta

rp M

N st

rukt

ūros

: p =

0,0

48; χ

² = 5

,934

. Tar

p M

N k

raštų

: p =

0,0

7; χ

² = 5

,281

. Tar

p M

N ri

bos n

uo

aplin

kini

ų au

dini

ų : p

= 0

,34;

χ² =

4,5

33.

Nėr

a ar

ned

idel

is

46 (5

4,8)

* 52

(73,

2)

62 (6

6,0)

35

(58,

3)

46 (5

7,5)

4

(66,

7)

48 (6

9,6)

V

idut

inis

17 (2

0,2)

10

(14,

1)

19 (2

0,2)

8

(13,

3)

15 (1

8,8)

2

(33,

3)

10 (1

4,5)

Did

elis

21 (2

5,0)

9

(12,

7)

13 (1

3,8)

* 17

(28,

3)

19 (2

3,8)

0

(0,0

) 11

(15,

9)

Mel

anof

agų

kiek

is d

erm

oje

Tarp

MN

stru

ktūr

os: p

= 0

,54;

χ² =

1,3

33. T

arp

MN

kra

štų:

p =

0,0

05; χ

² = 1

0,65

. Tar

p M

N ri

bos n

uo

aplin

kini

ų au

dini

ų: p

= 0

,47;

χ² =

3,5

55.

Nėr

a ar

ba p

avie

niai

45

(53,

6)

35 (4

9,3)

53

(56,

4)

27 (4

5,0)

41

(51,

3)

2 (3

3,3)

37

(53,

6)

Vid

utin

is 25

(29,

8)

27 (3

8,0)

34

(36,

2)

17 (2

8,3)

27

(33,

8)

4 (6

6,7)

21

(30,

4)

Gau

sus

14 (1

6,7)

9

(12,

7)

7 (7

,4)*

16

(26,

7)

12 (1

5,0)

0

(0,0

) 11

(15,

9)

Mel

anoc

itai i

šilga

i pla

uko

folik

ulo

ar e

krin

inės

liau

kos

Tarp

MN

stru

ktūr

os: p

= 0

,4; χ

² = 0

,719

. Tar

p M

N k

raštų

: p =

0,0

7; χ

² = 3

,26.

Tar

p M

N ri

bos n

uo

aplin

kini

ų au

dini

ų: p

= 0

,6; χ

² = 1

,037

. N

ėra

55 (6

5,5)

51

(71,

8)

59 (6

2,8)

46

(76,

7)

56 (7

0,0)

3

(50,

0)

47 (6

8,1)

Y

ra

29 (3

4,5)

20

(28,

2)

35 (3

7,2)

14

(23,

3)

24 (3

0,0)

3

(50,

0)

22 (3

1,9)

53

4.2.

4 le

ntel

ės tę

siny

s M

orfo

logi

niai

pož

ymia

i tir

ti hi

stol

ogin

iam

e M

N p

repa

rate

, da

žyta

me

HE

MN

stru

ktūr

a M

N k

rašt

ai

Rib

a ta

rp M

N ir

apl

inki

nių

audi

nių

Hom

oge-

nišk

a N

ehom

oge-

nišk

a T

aisy

klin

gi

Net

aisy

klin

gi

Aiš

ki

Nea

iški

Iš

dal

ies

aišk

i M

elan

ocita

i išil

gai p

lauk

o fo

likul

o ar

ekr

inin

ės li

auko

s Ta

rp M

N st

rukt

ūros

: p =

0,4

; χ² =

0,7

19. T

arp

MN

kra

štų: p

= 0

,07;

χ² =

3,2

6. T

arp

MN

ribo

s nuo

ap

linki

nių

audi

nių:

p =

0,6

; χ² =

1,0

37.

Nėr

a 55

(65,

5)

51 (7

1,8)

59

(62,

8)

46 (7

6,7)

56

(70,

0)

3 (5

0,0)

47

(68,

1)

Yra

29

(34,

5)

20 (2

8,2)

35

(37,

2)

14 (2

3,3)

24

(30,

0)

3 (5

0,0)

22

(31,

9)

Nuo

nav

iko

atsi

skyr

ę pa

vien

iai

mel

anoc

itai a

r sm

ulkū

s jų

lizda

i Ta

rp M

N st

rukt

ūros

: p =

0,0

3; χ

² = 4

,701

. Tar

p M

N k

rašt

ų: p

= 0

,03;

χ² =

4,7

57. T

arp

MN

ribo

s nuo

ap

linki

nių

audi

nių:

p =

0,0

2; χ

² = 7

,705

. N

ėra

74 (8

8,1)

53

(74,

6)*

82 (8

7,2)

44

(73,

3)

72 (9

0,0)

* 5

(83,

3)

50 (7

2,5)

Y

ra

10 (1

1,9)

18

(25,

4)*

12 (1

2,8)

16

(26,

7)*

8 (1

0)

1 (1

6,7)

19

(27,

5)*

Mel

anoc

itų iš

sidės

tym

o po

būdi

s Ta

rp M

N st

rukt

ūros

: p<0

,000

01; χ

² = 3

3,55

2. T

arp

MN

kra

štų:

p =

0,0

08; χ

² = 1

1,77

. Tar

p M

N ri

bos

nuo

aplin

kini

ų au

dini

ų: p

= 0

,001

; χ² =

22,

769.

A

tski

ros l

ąste

lės

7 (8

,3)

22 (3

1,0)

* 10

(10,

6)*

19 (3

1,7)

7

(8,8

)*

2 (3

3,3)

20

(29,

0)

Lizd

ai

2 (2

,4)*

14

(19,

7)

9 (9

,6)

7 (1

1,7)

3

(3,8

)*

1 (1

6,7)

12

(17,

4)

Susi

lieja

ntys

lizd

ai

37 (4

4,1)

24

(33,

8)

40 (4

2,6)

20

(33,

3)

38 (4

7,5)

1

(16,

7)

22 (3

1,9)

D

ifuzi

nis

38 (4

5,2)

* 11

(15,

5)

35 (3

7,2)

14

(23,

3)

32 (4

0,0)

* 2

(33,

3)

15 (2

1,7)

54

55

Daugiamatės regresinės logistinės analizės duomenimis (4.2.5 lentelė), kai UG vaizde MN yra homogeninės struktūros, lyginant su nehomogenine, histologiškai tiriant dažnesni šie požymiai: didelis limfocitų infiltratas navi-ko stromoje ir aplink naviką ir keletą kartų dažnesnis difuzinis melanocitų išsidėstymas dermoje (4.2.5 lentelė).

UG vaizde netaisyklingi kraštai, lyginant su taisyklingais, penkis kartus dažnesni, kai histologiniu tyrimu nustatomas gausus melanofagų kiekis dermoje ir tris kartus dažnesni kai randami nuo naviko atsiskyrę pavieniai melanocitai ar smulkūs jų lizdai (4.2.5 lentelė).

4.2.5 lentelė. Daugiamatė logistinė regresinė analizė ryšio stiprumui tarp melanocitų kilmės odos navikų (n = 155) ultragarso vaizdo ypatumų ir morfo-loginių požymių nustatyti

Požymis GS (95 proc. PI) p reikšmė Homogeninė MN struktūra (R2 = 0,32) Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 1 –

Naviko stroma 2,97 (1,20–7,32) 0,02 Aplink naviką 4,17 (1,12–15,47) 0,03

Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 1 – Vidutinis 2,08 (0,85–5,09) 0,11 Didelis 3,04 (1,22–7,58) 0,02


Nėra 1 – Yra 0,38 (0,16–0,91) 0,03


Atskiros ląstelės 1 – Lizdai 0,27 (0,05–1,37) 0,11 Susiliejantys lizdai 2,68 (1,19–6,07) 0,18 Difuzinis 8,68 (3,29–22,93) >0,001

Netaisyklingi MN kraštai (R2 = 0,27) Melanofagų kiekis dermoje

Nėra ar pavieniai 1 – Vidutinis 1,13 (0,49–2,58) 0,78 Gausus 5,14 (1,61–16,50) 0,006


Nėra 1 – Yra 3,16 (1,18–8,46) 0,02


Atskiros ląstelės 1 – Lizdai 0,27 (0,06–1,15) 0,08 Susiliejantys lizdai 0,23 (0,08–0,66) 0,006 Difuzinis 0,25 (0,09–0,72) 0,01

GS – galimybių santykis, koreguotas pagal amžių, PI – pasikliautinasis intervalas, p – reikš-mingumo lygmuo, statistiškai reikšminga, kai p≤0,05; R2 – modelio tinkamumo determina-cijos koeficientas.

56

Daugiamatės logistinės regresinės analizės duomenimis, nė vienas iš tirtų naviko morfologinių požymių (limfocitų infiltrato lokalizacija, limfocitų infiltrato laipsnis, melanofagų kiekis dermoje, išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai, nuo naviko atsiskyrę pavieniai melanocitai ar smulkūs jų lizdai, melanocitų išsidėstymo dermoje pobūdis) neturi ryšio su ribos tarp MN ir aplinkinių audinių aiškumu UG vaizde. Su MN ultragarso vaizdo ypatumais nebuvo susiję ir išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai naviko histologiniame preparate.

4.3. Imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų gyliui matuoti

Lyginant dviejų patyrusių patologų tirto pBG (HE) rezultatų sutapimą, apskaičiuotas tarpklasinės koreliacijos koeficientas yra 0,94 (95 proc. PI nuo 0,86 iki 0,97). Lyginant, kaip sutapo patyrusio patologo ir tyrėjo (dermato-logo), vertinusių MN gylį skirtingais metodais dažytuose preparatuose (pBG HE), pBG (S100) ir pBG (derinys)), matavimo rezultatai, apskaičiuoti tarpklasinės koreliacijos koeficientai atitinkamai yra tokie: 0,93 (95 proc. PI nuo 0,91 iki 0,95), 0,97 (95 proc. PI nuo 0,96 iki 0,98) ir 0,97 (95 proc. PI nuo 0,96 iki 0,99).

Tirtų odos navikų pBG (HE) svyravo nuo 0,2 mm iki 2,8 mm, pBG (S100) – nuo 0,2 mm iki 2,93 mm bei pBG (derinys) – nuo 0,21 mm iki 3,9 mm. 4.3.1 lentelėje pateikiami skirtingais histologinio tyrimo metodais išmatuoto MN gylio mediana.

4.3.1 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų gylio, išmatuoto HE, S100 ir kelių imunohistocheminių žymenų deriniu dažytuose preparatuose, kiekybi-nių požymių pasiskirstymas (n = 107)

Gylis (mm) Mediana (tarpkvartilinis plotis K1–K3) OM (n = 20) MA (n = 87) Iš viso (n = 107)

pBG (HE) 1,33 (0,88–1,65) 0,70 (0,45–1,04) 0,81 (0,50–1,25) pBG (S100) 1,32 (0,94–1,56) 0,70 (0,48–1,10) 0,82 (0,51–1,38) pBG (derinys) 1,28 (0,89–1,59) 0,69 (0,47–1,08) 0,82 (0,50–1,32)

OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamas; pBG – naviko gylis pagal Breslau; n – atvejų skaičius; K1 – pirmasis kvartilis; K3 – trečiasis kvartilis; HE – hematok-silinas-eozinas.

57

Nustatyta stipri koreliacija tarp šių parametrų: pBG (HE) ir pBG (S100), pBG (HE) ir pBG (derinys), pBG (S100) ir pBG (derinys), atitinkamai – 0,93 (p<0,001), 0,89 (p<0,001) ir 0,95 (p<0,001).

Blando-Altmano analizės rezultatai lyginant MN gylius, išmatuotus nau-dojant HE ir IH žymenimis dažytus preparatus, pateikti 4.3.1 ir 4.3.2 paveiks-le. Tirtų odos navikų Δ BG 1 ir Δ BG 2 vidurkis yra -0,045 mm (95 proc. PI nuo -0,09 iki 0) bei -0,028 mm (95 proc. PI nuo -0,087 iki 0,029).

4.3.1 pav. Skirtumai tarp melanocitų kilmės odos navikų gylio, išmatuoto HE ir žymeniu S100 dažytuose preparatuose, Blando-Altmano analizės

duomenimis (n = 107) pBG – naviko gylis pagal Breslau; Δ BG 1 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (S100); SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo Δ BG 1 vidurkį, kuris yra -0,045 mm, žalia linija – Δ BG 1 95 proc. pasikliautinojo intervalo ribas nuo -0,09 iki 0, raudona linija – pBG (HE) ir pBG (S100) vidurkių 95 proc. sutapimo ribas.

58

4.3.2 pav. Skirtumai tarp melanocitų kilmės odos navikų gylio,

išmatuoto HE ir kelių IH žymenų deriniu dažytuose preparatuose, Blando-Altmano analizės duomenimis (n = 107)

pBG – naviko gylis pagal Breslau; Δ BG 2 – vidurkio skirtumas tarp pBG (HE) ir pBG (derinys); SN – standartinis nuokrypis. Mėlyna linija rodo Δ BG 2 vidurkį, kuris yra -0,028 mm, žalia linija – Δ BG 2 95 proc. pasikliautinojo intervalo ribas nuo -0,087 iki 0,029, raudona linija – pBG (HE) ir pBG (derinys) vidurkių 95 proc. sutapimo ribas.

Vertinant OM ir MA gylio nesutapimą 0,1 mm tikslumu HE ir IH žyme-nimis dažytuose preparatuose (4.2.3 lentelė), reikšmingo skirtumo nenusta-tyta. Iš 4.3.2 lentelės matyti, jog MN gylis 38,3 proc. atvejų (41 iš 107) S100 dažytuose preparatuose nustatytas didesnis nei HE. Δ BG1 svyruoja nuo 0,1 iki 1,1 mm. Pusės tirtų MN (51 proc.) Δ BG 1 yra ≥0,1 mm, ketvir-tadalio (24 proc.) – ≥0,2 mm.

Toks pat skaičius gilesnių MN (41 iš 107) nustatytas preparatuose, dažytuose IH žymenų deriniu, nei pBG (HE) (Δ BG 2 nuo 0,1 iki 1,5 mm). IH žymenų deriniu dažyti MN preparatai 76 proc. atvejų išmatuoti ≥0,2 mm gilesni, lyginant su pBG (HE).

pBG (HE) ir BG (S100) bei pBG (HE) ir BG (derinys) matavimų rezulta-tai sutapo atitinkamai 36 (33,6 proc.) ir 34 (31,8 proc.) atvejais. Pasitaikė atvejų, kai pBG (HE) išmatuoti MN buvo gilesni, lyginant su BG (S100) (n = 30) ir pBG (derinys) (n = 32) (Δ BG1 svyruoja nuo 0,1 iki 0,7 mm, o Δ BG 2 – nuo 0,1 iki 1,3 mm).

59

4.3.2 lentelė. Odos melanomos (n = 20) ir melanocitų kilmės apgamų (n = 87) gylio, išmatuoto S100 žymeniu ir kelių imunohistocheminių žymenų deriniu dažytuose preparatuose, pasiskirstymas (0,1 mm tikslumu)

Gylio grupės OM, n (proc.)

*p MA, n (proc.)

**p Iš viso (proc.)

***p

pBG vertinimas HE ir S100 dažytuose preparatuose pBG (HE) < BG (S100) 6 (30,0)

0,82 35 (39,5)

0,27 41 (38,3)

0,43 pBG (HE) = BG (S100) 6 (30,0) 30 (34,9) 36 (33,6) pBG (HE) > BG (S100) 8 (40,0) 22 (25,6) 30 (28,1) pBG vertinimas HE ir IH žymenų deriniu dažytuose preparatuose pBG (HE) < BG (derinys) 5 (25,0) 0,52 36 (41,8) 0,25 41 (38,3) 0,48 pBG (HE) = BG (derinys) 9 (45,0) 25 (29,0) 34 (31,8) pBG (HE) > BG (derinys) 6 (30,0) 26 (29,2) 32 (29,9)

OM – odos melanoma; MA – melanocitų kilmės apgamas; *p – reikšmingumo lygmuo lyginant OM grupes; **p – lyginant melanocitinių apgamų grupes; ***p – lyginant visus tirtus melanocitų kilmės odos navikus; pBG – naviko gylis pagal Breslau; n – atvejų skaičius; simbolių reikšmės: (<) matavimo reikšmė mažesnė, lygi (=), didesnė (>).

Iš 4.3.3 lentelės matyti, jog po tyrimo S100 žymeniu penkių MN gylis, o po žymenų deriniu – keturių pakito: jis buvo didesnis (≥1 mm) nei nustatytas pBG (HE) (<1 mm).

4.3.3 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų gylio, vertinto preparatuose, dažytuose HE, S100 bei kelių IH žymenų deriniu, pasiskirstymas (n = 107)

Naviko gylis BG (S100) <1 mm ≥1 mm

pBG (HE) <1 mm 65 5 ≥1 mm 3 34 BG (derinys) <1 mm 66 4 ≥1 mm 5 32

pBG – naviko gylis pagal Breslau.

Galutiniame etape sudarytas logistinės analizės modelis reikšmingiems MN gylio nesutapimo (kai Δ BG 1 ir Δ BG 2 yra ≥0,10 mm) prognoziniams veiksniams atrinkti (4.3.4, 4.3.5 lentelės). Gauti rezultatai rodo, kad išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai penkis kartus padidina tikimybę, jog pBG (HE) ir IH žymenimis matuoto gylio rezultatai nesutaps. Šio nesutapimo pavyzdys pateikiamas 3.3.4.4 pav. A–C.

60

4.3.4 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 107) gylio, tirto HE ir S100 žymeniu dažytuose preparatuose, matavimo rezultatų nesutapimo (MRN)* ryšys su morfologiniais požymiais

Požymis GS (95 proc. PI) p reikšmė Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 1


Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 1 Vidutinis 1,77 (0,35–8,97) 0,49 Didelis 0,718 (0,11–4,88) 0,73




Nėra 1 Yra 5,13 (1,55–16,0) 0,007


Nėra 1 Yra 1,45 (0,40–5,29) 0,57

GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinasis intervalas, p – reikšmingumo lygmuo, statistiškai reikšminga, kai p≤0,05; modelio tinkamumas – determinacijos koeficientas R2 = 0,212; modelio prognozės tikslumas – 69,7 proc.; *MRN priskirti MN atvejai, kai Δ BG 1≥0,1 mm.

4.3.5 lentelė. Melanocitų kilmės odos navikų (n = 107) gylio, tirto HE ir IH žymenų deriniu dažytuose preparatuose, matavimo rezultatų nesutapimo (MRN)* ryšys su morfologiniais požymiais

Požymis GS (95 proc. PI) p reikšmė Limfocitų infiltrato lokalizacija Nėra 1


Limfocitų infiltrato laipsnis Nėra ar nedidelis 1 Vidutinis 1,36 (0,29–6,42) 0,70 Didelis 1.36 (0,29–6,42) 0,70



61

4.3.5 lentelės tęsinys Požymis GS (95 proc. PI) p reikšmė Melanocitai išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos

Nėra 1 Yra 5,27 (1,72–16,19) 0,004


Nėra 1 Yra 1,37 (0,40–4,63) 0,62

GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinasis intervalas, p – reikšmingumo lygmuo, statistiškai reikšminga, kai p ≤ 0,05; modelio tinkamumas – determinacijos koeficientas R2 = 0,22; modelio prognozės tikslumas – 71,7 proc.; *MRN priskirti MN atvejai, kai Δ BG 2 ≥0,1 mm.

Kiti MN morfologiniai požymiai (limfocitų infiltrato lokalizacija bei laipsnis, melanofagų kiekis dermoje, nuo naviko atsiskyrę pavieniai melano-citai ar jų smulkūs lizdai) nesusiję su pBG (HE) ir IH žymenimis, nesvarbu, S100 ar IH žymenų deriniu, matuoto gylio rezultatų nesutapimu.

62

5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS

Aukšto dažnio ultragarso reikšmė vertinant melanocitų kilmės odos naviko gylio ir vaizdo ypatumus.

Aukšto dažnio (20 MHz ir daugiau) UG padeda išmatuoti OM ir MA gylį in vivo, bet matavimo tikslumas priklauso nuo tyrėjo patirties [5, 20, 42]. Todėl Wortsman ir bendr. rekomenduoja UG tyrimą atlikti gydytojui derma-tologui ar radiologui [102]. Guitera ir bendr. bei Meyer ir bendr. Duomeni-mis, dviejų patyrusių dermatologų ultragarsu rankiniu būdu išmatuotas MN gylis (rT) reikšmingai nesiskiria [42, 71]. Mūsų tyrime, lyginant dviejų patyrusių tyrėjų dermatologų rT rezultatus, tarpklasinės koreliacijos koefi-cientas taip pat yra didelis (žr. 40 psl.). Be to, nustatyta, kad ultragarsu ran-kiniu būdu išmatuotas MN gylis (rT) nuo išmatuoto automatine programa (aT) reikšmingai nesiskiria. Taigi, darbo autorės ir bendraautorių sukurtas bei šiame tyrime patikrintas automatinis MN gylio vertinimo algoritmas (aT – tikslumas 80 proc.) gali būti naudojamas praktikoje mažiau patyrusių tyrėjų.

Šio darbo autorė kartu su bendraautoriais 2016 m. sukūrė ir pritaikė auto-matinį algoritmą, pagrįstą 22 MHz UG ultragarso radiodažninių signalų ana-lize, kuris naudojamas eksperimentinėje aplinkoje. Tiriant plono (<1 mm) MN gylį, jo jautrumas yra 90 proc., o specifiškumas – 73 proc., lyginant su pBG. Nustatyta, kad tiriant plonus MN, rT ir aT dažniau išmatuojamas mažesnis, t. y. įvertinamas nepakankamai, lyginant su pBG (HE). Tačiau šis automatinis algoritmas kol kas klinikinėje praktikoje netaikomas, skirtingai nuo mūsų tyrime validuoto UG algoritmo. Šio tyrimo duomenimis, tiriant plonus MA, kurių pBG (HE) mediana <1 mm, ultragarsu naviko gylis taip pat įvertinamas nepakankamai, lyginant su histologinio tyrimo duomenimis (rT ir aT<pBG (HE)) (žr. 47 psl.). Priešingai, tiriant OM, pastebėta tenden-cija, kad trečdaliu atvejų rT ir aT išmatuojamas didesnis nei pBG (HE), tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas. Literatūros duomenys apie rT ir pBG (HE) matavimo rezultatų atitiktį yra prieštaringi. Crisan ir bendr., Pellacani ir bendr. tyrimų duomenimis, tiriant melanocitų kilmės odos navikus rT įvertinamas nepakankamai, lyginant su pBG (HE) [20, 81]. Priešingai, daugumos kitų tyrimų duomenimis, tiriant OM ar visus MN, rT mediana esti didesnė nei pBG (HE) [38, 67, 92]. Daroma tokio matavimo rezultatų nesutapimo prielaida – B-tipo UG vaizdas registruojamas, kai UG keitiklis vedžiojamas odos naviko paviršiumi, kol tyrėjas suranda referen-cinį (giliausią) UG skerspjūvio vaizdą. Mūsų manymu, tai gali turėti įtakos tam, kad rT ir aT nesutampa su pBG (HE). Matavimo rezultatų atitikčiai svarbūs ir MN morfologiniai ypatumai. Vieni tyrėjai rT ir pBG (HE) nesuta-

63

pimą sieja su naviko aplinkos limfocitų infiltratu – tokiu atveju, tiriant UG, sunkiau surasti naviko apatinį kraštą. Kiti tyrėjai nustatė, kad už pBG (HE) didesnis rT dažnesnis tais atvejais, kai OM susiformavusios iš MA [20, 38, 59, 67, 92].

Mūsų tyrimo duomenimis, kai rT<pBG (HE), MN histologiniame prepa-rate limfocitų infiltrato nebūna dažniau (daugiau nei pusė atvejų) nei esant rT>pBG (HE). Tačiau nei mūsų, nei kituose tyrimuose rT ir pBG (HE) atitiktis nebuvo susijusi su uždegimo infiltratu aplink naviką ir jo lokaliza-cija. Kai kurių autorių duomenimis, odos priklausinių (riebalų liaukų, plau-kų folikulų), pavienių melanocitų ar smulkių jų lizdų buvimas dermoje gali būti reikšmingi veiksniai rT nustatyti mažesnį nei pBG [5, 20, 81]. Tačiau kol kas galutinai pagrįsto vieningo tyrėjų sutarimo šiuo klausimu dar nėra. Šiame tyrime MA atvejais, palyginti su OM, už pBG (HE) mažesnis rT nustatytas dažniau nei didesnis. Tyrimo duomenimis, išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos ir difuziškai dermoje išsidėstę melanocitai tikimybę, kad rT bus išmatuotas mažesnis nei pBG (HE), padidina keletą kartų.

Berritto ir bendr. duomenimis, naudojantis įprastiniu UG keitikliu, sunku atskirti odos priklausinius, todėl jie rekomenduoja 70 MHz UG sistemą, kuri padeda įžvelgti smulkias anatomines struktūras [12].

Šio tyrimo duomenimis, OM grupėje rT ir pBG (HE) rezultatų korelia-cijos koeficientas yra didesnis tais atvejais, kai pBG (HE) mediana ≥1 mm, palyginti su plonesniais navikais. Panašiai ir kiti autoriai, tyrę 20 MHz dažnio ultragarsu, nustatė, kad matuojant plonų (<1 mm) MN gylį, rT ir pBG (HE) ryšys yra silpnesnis [92]. Kai kurie tyrėjai rekomenduoja plonų (<1 mm) MN gylį vertinti 75–100 dažnio MHz ultragarso keitikliu [38, 42, 99]. Vis dėlto, Schmid-Wendtner, Dill-Muller ir bendr. duomenimis, 100 MHz dažnio UG bangos per audinius skverbiasi blogiau, todėl galimos MN gylio matavimo paklaidos [25, 90]. Wortsman ir bendr. duomenimis, derma-tologijos patologijai tirti optimalus UG keitiklio dažnis yra 15 MHz ar aukštesnis [102]. Kai kurie autoriai nustatė stiprų ryšį tarp rT ir pBG (HE), kai naudojamas 12–15 MHz dažnio UG keitiklis, tačiau tik tiriant storus (≥1 mm) MN [51, 60, 74].

Analizuojant UG naviko formos ir struktūros požymių vaizdo ypatumus reikšmingų skirtumų tarp gerybinių ir piktybinių odos navikų iki šiol nebu-vo nustatyta [47]. Harland ir bendr. duomenimis, UG tyrimo specifiškumas diferencijuojant OM ir MA pagal šiuos požymius yra gan menkas, tesiekia 30 proc. Nustatyta, jog, tiriant ultragarsu, MA dažniau nei OM matomas simetriškas, aiškių ribų, hipoechogeninės struktūros su dauginiais smulkiais hiperechogeniniais šešėliais, o OM, lyginant su MA, priešingai – dažniau homogeniniai ir turi ryškesnę hipoechogeninę struktūrą [44].

64

Mūsų tyrime nustatyta, jog ultragarsu tiriami MN yra hipoechogeninės struktūros. Tačiau didesnė dalis OM, palyginti su MA, turi hipoechogeninę bei homogeninę struktūrą (65,5 proc.) ir netaisyklingus kraštus (61,1 proc.). Pusė tirtų MA (51 proc.) ir OM (52,7 proc.) turi aiškią riba tarp naviko ir aplinkinių audinių. Šiame tyrime nesiekta įvertinti UG tikslumą atskiriant MA nuo OM, tik išanalizuoti UG vaizdo ypatumai pagal MN rūšį ir jų sąsaja su tiriamo naviko morfologiniais požymiais histologiniame preparate.

Ankstesnių tyrimų duomenimis, UG su spalviniu dopleriu padeda patikimai atskirti OM nuo MA [91, 103]. Lassau ir bendr. nedidelėje atvejų imtyje (n = 27) nustatė ryšį tarp OM gylio ir naviko audinių vaskuliariza-cijos laipsnio [62]. Nustatytas stiprus ryšys tarp 20 MHz UG su spalviniu dopleriu ir histologinio tyrimo rezultatų matuojant OM gylį, kuris svyravo nuo 0,26 iki 8 mm [61]. UG su spalviniu dopleriu gali būti naudojamas kraujagyslių susiformavimui (angiogenezei) įvertinti. Tai padeda atskirti didelės metastazavimo rizikos OM [61]. Reikalingi geriau suplanuoti aukšto dažnio UG su spalviniu dopleriu MN struktūros vaizdinimo ypatumų tyrimai.

Palyginus aukšto dažnio UG ir optinės koherentinės tomografijos (OKT) tyrimų rezultatus, nustatyta, kad dėl silpnesnės skvarbos į audinius OKT tikslumas matuojant ≥1 mm gylio MN yra menkesnis nei UG [46, 71, 99]. Be to, tiriant UG geriau matoma riba tarp odos naviko ir aplinkinių audinių, lyginant su OKT [99]. Taigi aukšto dažnio UG yra patikimas tyrimas OM gyliui prieš operaciją įvertinti ir padeda atskirti in vivo MA nuo OM.

Šis tyrimas neišvengė apribojimų. Naudotas vieno (22 MHz) dažnio UG keitiklis be spalvinio doplerio, todėl negalėta palyginti plonų navikų rT, aT ir pBG (HE) matavimo rezultatų ryšio su aukštesnio dažnio UG keitikliais. Be to, retrospektyviai į tyrimą įtraukta 20 odos melanomos UG vaizdų, kad būtų suformuota statistiškai patikima imtis. Nepaisant šių trūkumų, mūsų tyrimo duomenimis, aukšto dažnio UG vaizdo analizė rankiniu būdu ir jos pagrindu sukurtas automatinis algoritmas geba patikimai prognozuoti MN gylį in vivo, lyginant su histologinio tyrimo rezultatais. Tikimybę ultragarsu išmatuoti mažesnį melanocitų kilmės odos naviko gylį nei histologiniu tyrimu padidina išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos (GS – 8,87; 95 proc. PI: 1,94–40,48) ir difuziškai dermoje išsidėstę melanocitai (GS – 5,35; 95 proc. PI: 1,37–20,85). Nustatyti skirtumai tarp OM ir MA homoge-niškumo UG vaizde galės būti panaudoti kaip papildomi kokybiniai požy-miai tobulinant UG automatinį algoritmą MN klasifikuoti, neapsiribojant vien tik naviko gylio analize.

65

Melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumai priklausomai nuo jų morfologinių požymių.

Ultragarso bangų sklaida biologiniuose audiniuose priklauso nuo įvairių fizinių veiksnių. Iš jų svarbiausi yra UG bangos atspindys, refrakcija (garso bangų sklidimo krypties aplinkoje pokytis), sugertis ir išsisklaidymas [2]. Aukšto dažnio UG bangų sklidimas per MN gali priklausyti nuo melanocitų displazijos laipsnio bei kitų odos morfologinių požymių [4].

MN morfologijos tyrimų duomenimis, melanocitų dydis, forma ir pasi-skirstymas epidermyje ar dermoje, limfocitų infiltrato pobūdis bei melano-fagų kiekis apie naviką reikšmingai skiriasi priklausomai nuo MN rūšies ir displazijos laipsnio [11, 34, 48, 95]. Displazija – tai MN ląstelių ir architek-tonikos atipija. Skiriami šie displazijos laipsniai: lengvas, vidutinis, sunkus [7, 21, 97].

MN histologinių preparatų, dažytų HE, tyrimo duomenimis, didesnė dalis OM nei MA turi didelį limfocitų infiltratą ir gausų kiekį melanofagų der-moje, o išilgai odos priklausinių išsidėstę melanocitai MA atveju nustatomi dažniau nei OM (žr. 51 psl.).

Zonios ir bendr. išanalizavo MN (n = 1379) melanino šviesos sugerties (absorbcijos) spektrą naudodami spektrinę atspindžio vaizdinimo sistemą. Jie nustatė, kad MA melanino optinės savybės skiriasi nuo OM [105]. Mela-ninas yra sunkiai šviesą absorbuojantis endogeninis odos pigmentas, kurį sintetina melanocitas. Jo cheminė struktūra, sudėtis ir optinės savybės nėra iki galo ištirtos [72]. Melanino šviesos bangos optinės sugerties spektras priklauso nuo šviesos bangos ilgio [72, 104]. Melaninas skiriamas į du tipus: eumelaniną, juodos ar tamsiai rudos spalvos pigmentą, ir feomelaniną, geltonos ar rausvai rudos spalvos pigmentą. Melanocitų kilmės odos navi-kuose eumelanino ir feomelanino gali būti kartu [69, 85]. Pastebėta tenden-cija, kad tais atvejai, kai OM formuojasi iš MA, mažėja feomelanino ir daugėja eumelanino [69]. Galima daryti prielaidą, kad melanino cheminės bei fizinės savybės svarbios UG bangos sklidimui MN audiniuose.

Mūsų tyrimo duomenimis, didesnė dalis OM nei MA tiriant ultragarsu yra homogeninės struktūros ir netaisyklingų kraštų, o histologiniame OM preparate dažniau nei MA nustatomas didelio laipsnio limfocitų infiltratas ir gausus kiekis melanofagų dermoje (žr. 51 psl.). Tais atvejais, kai MN ultra-garso vaizde yra homogeninės struktūros, histologiniame preparate dažniau randamas difuzinis melanocitų išsidėstymas dermoje. Priešingai, didesnė dalis MN (73,2 proc.), kurie UG vaizde matomi nehomogeninės struktūros, histologiniame preparate tris kartus dažniau neturi limfocitų infiltrato dermoje ar jis nedidelis (GS – 3,04; 95 proc. PI: 1,22–7,58). Mūsų duomeni-mis, melanocitų išilgai odos priklausinių dažniau nustatoma tiriant MA nei OM. Tai gali lemti, kad tiriant ultragarsu MA dažniau nei OM matomi

66

nehomogeninės struktūros. UG vaizde netaisyklingi naviko kraštai, lyginant su taisyklingais, dažnesni, kai MN histologiniame preparate nustatomas gausus melanofagų kiekis dermoje ir nuo naviko atsiskyrę pavieniai me-lanocitai ar smulkūs jų lizdai (žr. 55 psl.).

Taigi, mūsų tyrimo duomenys rodo, jog MN morfologiniai požymiai gali sąlygoti UG bangų atspindžio, refrakcijos, sugerties ir išsisklaidymo skirtu-mus. Tai lemia skirtingą MN ir OM struktūrą UG vaizde. Šio tyrimo rezul-tatų negalima palyginti su kitų tyrėjų duomenimis, nes literatūroje apie tai nėra paskelbta duomenų.

Reikalingi tolesni tyrimai išsiaiškinti UG bangų sklidimo per MN audinius fizinių veiksnių (atspindžio, refrakcijos, sugerties ir išsisklaidymo) skirtumus didesnėje OM imtyje atsižvelgiant į skirtingą UG keitiklio dažnį. Šio tyrimo duomenys rodo, kad homogeninės struktūros MN tiriant 22 MHz UG keletą kartų dažniau nei nehomogeninės histologiniame preparate turi limfocitų infiltratą naviko stromoje ir aplink naviką. Kai dermoje melano-citai išsidėstę difuziškai, tikimybė UG vaizde matyti homogeninę struktūrą yra daugiau nei aštuonis kartus didesnė, lyginant su nehomogenine.

Imunohistocheminių žymenų ir kitų morfologinių požymių reikšmė

melanocitų kilmės odos navikų gylio matavimui. Šio ir kitų autorių tyrimų duomenimis, kai OM susiformavusi iš MA ar

turi bepigmentę (regresinę) zoną [27, 32, 73], išilgai plauko folikulo arba ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai [32, 64, 73], pavieniai melanocitai ar smulkūs jų lizdai dermoje [27] trukdo tiksliai įvertinti MN gylį HE dažytuo-se preparatuose.

W. Eng ir bendr. palygino HE ir IH žymeniu S100 dažytų desmoplazinių OM gylį. Tyrėjai nustatė, kad HE dažytuose preparatuose OM gylis dažniau išmatuojamas mažesnis, lyginant su pBG (S100) [31]. IH reakcijos su žyme-nimis S100, HMB-45, Melan-A ir tirozinaze yra specifiškos atskirti OM nuo kitų odos navikų [79], tačiau kasdienėje praktikoje MN gyliui nustatyti jos netaikomos. Iki šiol MN gylio matavimas naudojant IH žymenis ir standar-tinį dažymą HE lygintas tik dviem tyrimais [27, 31]. M. Drabeni ir bendr. duomenimis, daugiau nei pusės (59,6 proc.) tirtų OM gylis IH žymeniu Melan-A nustatytas didesnis nei HE dažytame preparate. Šiame tyrime nau-dojant IH žymenis daugiau nei trečdalis (42,4 proc.) MN išmatuoti 0,2 mm gilesni nei dažant HE, o vienas OM atvejis klaidingai priskirtas aukštesnei ligos stadijai [27]. Tačiau šį skirtumą reikia vertinti atsargiai, nes mūsų tyrime po dažymo S100 žymeniu ir IH žymenų deriniu atitinkamai penkių ir keturių MN gylis pakito: priskirtas ≥1 mm grupei, lyginant su <1 mm gyliu, nustatytu dažant HE (žr. 59 psl.). Mūsų tyrimo duomenimis, pastebėta tendencija, kad IH žymeniu ar jų deriniu MN gylis išmatuojamas didesnis

67

(38,3 proc.), lyginant su pBG (HE) (žr. 59 psl.), bet skirtumas statistiškai nereikšmingas galimai dėl mažo atvejų skaičiaus.

Tyrimų duomenimis, IH žymenų reakcijos geriau nei dažymas HE išryškina atsiskyrusius nuo naviko melanocitus ar smulkius jų lizdus der-moje bei melanocitus, išsidėsčiusius išilgai plauko folikulo arba ekrininės liaukos [27, 45]. Galimybės įvertinti šiuos morfologinius požymius HE preparatuose yra ribotos, nes sunku atskirti pavienius melanocitus ar jų lizdus nuo histiocitų, melanofagų, ypač kai aplink naviką yra didelis limfo-citų infiltratas [27, 45]. Mūsų tyrime didelis limfocitų infiltratas OM atveju nustatytas dažniau nei MA (55,0 ir 8,1 proc.), tačiau jis neturėjo įtakos naviko gylio vertinimui HE ir IH žymeniu ar jų deriniu dažytame preparate. Priežastis gali būti ta, kad į tyrimą įtrauktos ne tik OM, bet ir MA, kuriems, priešingai nei OM, didelis limfocitų infiltratas ir melanofagai nebūdingi. Mūsų rezultatai rodo, jog tikimybę, kad HE ir vienu IH žymeniu S100 ar kelių deriniu dažyto naviko gylis nesutaps, padidina tik vienas MN morfologinis požymis – išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos išsidėstę melanocitai.

Šiame (n=30) ir kituose tyrimuose (n=17) [27, 31] pasitaikė atvejų, kad pBG (HE) buvo didesnis nei išmatuotas IH žymenimis dažytame preparate. Gali būti, kad priežastis ta, jog IH žymenimis apdorota toji naviko pjūvio dalis, kuri liko po dalies preparato paėmimo dažymui HE [27, 31].

Taigi, mūsų tyrime nustatyta, kad MN gylis HE dažytame preparate, lyginant su IH žymenimis, išmatuojamas 92 proc. tikslumu. Todėl naviko morfologinei struktūrai vaizdinti ir gyliui matuoti nenaudingas dažymas nei vienu IH žymeniu, nei kelių deriniu, išskyrus pavienius atvejus, kai naviko preparate melanocitai išsidėstę išilgai odos priklausinių.

68

IŠVADOS

1. Tarp aukšto dažnio ultragarsu (22 MHz) ir histologiniu tyrimu išma-tuoto melanocitų kilmės odos naviko gylio rezultatų yra stiprus ryšys, kai matuojama rankiniu ar automatiniu būdais. Išimtis – atvejai, kai melanocitai išsidėstę dermoje difuziškai ar išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos. Tada didesnė tikimybė, kad ultragarsu bus išmatuotas mažesnis melanocitų kilmės odos naviko gylis nei histologiniu tyrimu.

2. Priklausomai nuo histologinės sandaros nustatėme šiuos melanocitų kilmės odos navikų ultragarso vaizdo ypatumus: • Ultragarsu tiriamos odos melanomos, keletą kartų dažniau nei

melanocitų kilmės apgamai, turi homogeninę struktūrą ir netaisyk-lingus kraštus.

• Kai naviko histologiniame preparate randamas didelio laipsnio limfocitų infiltratas ir/ar melanocitai dermoje išsidėsto difuziškai, ultragarsu tiriamas melanocitų kilmės odos navikas dažniau yra homogeninės nei nehomogeninės struktūros.

• Kai naviko histologiniu tyrimu nustatomas gausus melanofagų kiekis dermoje ir nuo jo atsiskyrę pavieniai melanocitai ar smulkūs jų lizdai, ultragarso tyrimo metu matomi naviko kraštai dažniau yra netaisyklingi, lyginant su taisyklingais.

• Nė vienas iš tirtų melanocitų kilmės odos naviko histologinių po-žymių neturi ryšio su naviko skiriamąja riba tarp aplinkinių audinių ultragarso vaizde.

3. Imunohistocheminis žymuo S100 ar kelių žymenų derinys tiksliau vaiz-dina morfologinę naviko struktūrą ir gylį histologiniuose preparatuose, kai melanocitai išsidėstę išilgai odos priklausinių, lyginant su standar-tiniu dažymu hematoksilinu – eozinu.

69

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remdamiesi atlikto darbo rezultatais ir jų palyginimu su kitų autorių duomenimis, teikiame šias praktines rekomendacijas: 1. Skirtingų dažnių ultragarso keitiklis turėtų būti parenkamas atsižvel-

giant į odos melanomos gylį. Vertinant ≥1 mm gylio odos melanomas geriausia naudoti 20–30 MHz ultragarsą. Plonoms (<1 mm) odos mela-nomoms vertinti reikalingas aukštesnio dažnio (50–100 MHz) ultra-garsas.

2. Tarp aukšto dažnio (22 MHz) ultragarsu rankiniu būdu (rT) ir histolo-giniame preparate išmatuoto naviko gylio yra stiprus ryšys, todėl tyrimas ultragarsu rankiniu būdu padeda patikimai atrinkti pacientus, kuriems nustatyta klinikinė ir dermatoskopinė odos melanomos diag-nozė, operacijai su sarginio limfmazgio biopsija.

3. Automatinės ultragarso tyrimo metu gaunamo B-tipo vaizdo analizės programos jautrumas ir specifiškumas vertinant melanocitų kilmės odos naviko gylį (≥1 mm) yra atitinkamai 90 proc. ir 60 proc. Todėl automa-tinė melanocitų kilmės odos naviko gylio vertinimo programa (sukurta šio darbo autorės ir bendr.) gali būti komercinė priemonė mažiau patyrusiems tyrėjams naudoti praktikoje.

4. Aukšto dažnio ultragarsas, kaip papildoma priemonė, gali būti naudo-jamas atskirti odos melanomą nuo melanocitų kilmės apgamo atsižvel-giant į naviko ultragarso struktūrą ir kraštus.

5. Melanocitų kilmės odos navikų morfologiniai požymiai, tokie kaip limfocitų infiltrato laipsnis ir lokalizacija, melanocitų išsidėstymas ir melanofagų kiekis dermoje bei nuo naviko atsiskyrę pavieniai mela-nocitai ar smulkūs jų lizdai gali būti naudojami automatiniam ultragarso navikų diferencinės diagnostikos algoritmui sukurti.

6. Kai aplink odos melanomą yra didelis limfocitų infiltratas, gausus kiekis melanofagų, imunohistocheminių žymenų reakcijos geriau nei hematoksilinu-eozinu dažytame preparate išryškina atsiskyrusius nuo naviko melanocitus ar smulkius jų lizdus dermoje ir melanocitus, išsi-dėsčiusius išilgai plauko folikulo ar ekrininės liaukos. Tokiais atvejais odos melanomos gylį rekomenduojama matuoti imunohistocheminiu žymeniu S100 ar žymenų deriniu dažytuose preparatuose.

70

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS

1. Alexander H, Miller DL. Determining skin thickness with pulsed ultra sound. J Invest Dermatol. 1979; 72:17–19.

2. Altmeyer P, Gammal S, Hoffman K. Ultrasound in dermatology. Springer-Verlag, Berlin (1992).

3. Amin MB, Edge S, Greene F, Byrd DR, Brookland RK, Washington, et al. AJCC Cancer Staging Manual, 8th edition. Springer, 2017.

4. Andrekute K, Linkeviciute G, Raisutis R, Valiukeviciene S, Makstiene J. Automatic Differential Diagnosis of Melanocytic Skin Tumors Using Ultrasound Data. Ultrasound Med Biol. 2016;42(12):2834-2843.

5. Andrekute K. Ultragarsinių matavimo metodų, skirtų atlikti melanocitų kilmės odos navikų diagnostiką, sukūrimas ir tyrimas.

6. Argenziano G, Catricalà C, Ardigo M, Buccini P, De Simone P, Eibenschutz L, et al. Seven-point checklist of dermoscopy revisited. Br J Dermatol 2011; 164(4):785-790.

7. Arumi-Uria M, McNutt NS, Finnerty B. Grading of Atypia in Nevi: Correlation with Melanoma Risk. Mod Pathol 2003;16(8):764-771.

8. Baratloo A, Hosseini M, Negida A, El Ashal G. Part 1: Simple Definition and Calcu-lation of Accuracy, Sensitivity and Specificity. Emerg (Tehran) 2015; 3(2): 48–49.

9. Bard RL. High-Frequency Ultrasound Examination in the Diagnosis of Skin Cancer. Dermatol Clin 2017;35(4):505-511.

10. Beltraminelli H, El Shabrawi-Caelen L, Kerl H, Cerroni L. Melan-A-Positive “pseudomelanocytic nests”: a pitfall in the histopathologic and immunohistoche-mical diagnosis of pigmented lesions on sun-damaged skin. Am J Dermatopathol 2009;31:305–308.

11. Benz G, Hölzel D, Schmoeckel C. Inflammatory cellular infiltrates in melanocytic nevi. Am J Dermatopathol 1991;13(6):538-542.

12. Berritto D, Iacobellis F, Rossi C, Reginelli A, Cappabianca S, Grassi R. Ultra high-frequency ultrasound: New capabilities for nail anatomy exploration. J Dermatol 2017;44(1):43-46.

13. Bessoud B, Lassau N, Koscielny S, Longvert C, Avril MF, Duvillard P, et al. High-frequency sonography and color Doppler in the management of pigmented skin lesions. Ultrasound Med Biol. 2003; 29:875-879.

14. Bland JM, Altman DG. Measuring agreement in method comparison studies. Stat Methods Med Res 1999;8(2):135-160.

15. Blasco-Morente G, Garrido-Colmenero C, Pérez-López I, Carretero-Garcķa S, Martķn-Castro A, Arias-Santiago1 S, et al. Study of shrinkage of cutaneous surgical specimens. J Cutan Pathol 2015;42: 253–257.

16. Boone MA, Norrenberg S, Jemec GB, Del Marmol V. High-definition optical coherence tomography imaging of melanocytic lesions: a pilot study. Arch Dermatol Res 2014; 306:11–26.

17. Botar-Jid CM, Cosgarea R, Bolboacă SD, Şenilă SC, Lenghel LM , Rogojan L, Dudea SM. Assessment of Cutaneous Melanoma by Use of Very- High-Frequency Ultrasound and Real-Time Elastography. AJR Am J Roentgenol. 2016; 11:1-6. [Epub ahead of print]

18. Breslow A. Thickness, cross-sectional areas and depth of invasion in the prognosis of cutaneous melanoma. Ann Surg 1970;172(5):902–908.

71

19. Bursac Z, Gauss CH, Williams DK, Hosmer DW. Purposeful selection of variables in logistic regression. Source Code Biol Med 2008;3:17.

20. Crisan M, Crisan D, Sannino G, Lupsor M, Badea R, Amzica F. Ultrasonographic staging of cutaneous malignant tumors: and ultrasonographic depth index. Arch Dermatol Res. 2013; 305:305-313.

21. Culpepper KS, Granter SR, McKee PH. My approach to atypical melanocytic lesions. J Clin Pathol 2004;57(11):1121-1131.

22. Damsky WE, Bosenberg M. Melanocytic nevi and melanoma: unraveling a complex relationship. Oncogene 2017;36(42):5771-5792.

23. Dauendorffer JN, Bastuji-Garin S, Guéro S, Brousse N, Fraitag S. Shrinkage of skin excision specimens: formalin fixation is not the culprit. Br J Dermatol 2009;160(4): 810-4.

24. Dybiec E, Pietrzak A, Adamczyk M, Michalska-Jakubus M, Wawrzycki B, Lotti T, Rutkowski P, Krasowska D. High frequency ultrasonography of the skin and its role as an auxillary tool in diagnosis of benign and malignant cutaneous tumors: A comparison of two clinical cases. Acta Dermatovenerol Croat 2015;23:43–47.

25. Dill-Müller D, Maschke J. Ultrasonography in dermatology. J Dtsch Dermatol Ges 2007;5(8):689-707.

26. Douglas D, Peucker T. Algorithms for the reduction of the number of points required to represent a digitized line or its caricature. The Canadian Cartographer 1973;10:112-122.

27. Drabeni M, Lopez-Vilaró L, Barranco C, Trevisan G, Gallardo F, Pujol RM. Differences in tumor thickness between hematoxylin and eosin and Melan-A immu-nohistochemically stained primary cutaneous melanomas. Am J Dermatopathol 2013;35(1):56–63.

28. Dumas P, Benatar M, Cardot-Leccia N, Lebreton E, Chignon-Sicard B. Study of skin retraction applied to the treatment of skin tumors. Mapping of the human body. Ann Chir Plast Esthet 2012;57:118–124.

29. Edge SB, Compton CC. The American Joint Committee on Cancer: the 7th edition of the AJCC cancer staging manual and the future of TNM. Ann Surg Oncol 2010;17(6):1471-1474.

30. Edwards C, Al-Aboosi MM, Marks R. The use of A-scan ultrasound in the assessment of small skin tumours. Br J Dermatol 1989;121:297–304.

31. Eng W, Tschen JA. Comparison of S-100 versus hematoxylin and eosin staining for evaluating dermal invasion and peripheral margins by desmoplastic malignant melanoma. Am J Dermatopathol 2000;22(1):26–29.

32. Eriksson H, Frohm-Nilsson M, Hedblad MA. Interobserver variability of histopatho-logical prognostic parameters in cutaneous malignant melanoma: impact on patient management. Acta Derm Venereol 2013;93(4):411–416.

33. Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JW, Comber H, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer 2013;49(6):1374-1403.

34. Fernandez-Flores A, Saeb-Lima M. The inflammatory infiltrate of melanocytic nevus. Rom J Morphol Embryol. 2014;55(4):1277-1285.

35. Fornage BD, McGavran MH, Duvic M, Waldron CA. Imaging of the skin with 20 MHz US. Radiology 1993; 189:69–76.

36. Gale DR, Gale ME, Schwartz RK, Muse VV, Walker RE. An automated PACS workstation interface: a timesaving enhancement. AJR Am J Roentgenol 2000; 174(1):33-36.

72

37. Gale ME, Gale DR. DICOM modality worklist: an essential component in a PACS environment. J Digit Imaging 2000;13(3):101-108.

38. Gambichler T, Moussa G, Bahrenberg K, Vogt M, Ermert H, Weyhe D, et al. Preoperative ultrasonic assessment of thin melanocytic skin lesions using a 100-MHz ultrasound transducer: a comparative study. Dermatologic Surgery 2007,33: 818-824.

39. Gambichler T, Schmid-Wendtner MH, Plura I, Kampilafkos P, Stücker M, Berking CJ, et al. A multicentre pilot study investigating high-definition optical coherence tomography in the differentiation of cutaneous melanoma and melanocytic naevi. Eur Acad Dermatol Venereol. 2015;29(3):537-541.

40. Garbe C, Peris K, Hauschild A, Saiag Ph, Middleton M, Bastholt L, et al. Diagnosis and treatment of melanoma. European consensus-based interdisciplinary guideline e Update 2016. European Journal of Cancer 2016;63: 201-217.

41. Gonzales R, Woods R. Digital Image Processing. Prentice Hall, 3rd Edition, 2007; 627-787.

42. Guitera P, Li LX, Crotty K, Mellenbergh R, Pellacani G, Menzies SW. Melanoma histological Breslow thickness predicted by 75-MHz ultrasonography. Br J Dermatol. 2008; 159: 364−369.

43. Hayashi K, Koga H, Uhara H, Saida T. High-frequency 30-MHz sonography in prie-operative assessment of tumor thickness of primary melanoma: usefulness in determination of surgical margin and indication for sentinel lymph node biopsy. The International Journal of Clinical Oncology 2009,14: 426-430.

44. Harland CC, Kale SG, Jackson P, Mortimer PS, Bamber JC. Differentiation of com-mon benign pigmented skin lesions from melanoma by high-resolution ultrasound. Br J Dermatol 2000;143:281–289.

45. Helm TN, Helm KF. Breslow thickness determined with the use of immunohisto-chemical techniques could provide misleading information when used with prognostic models based on data obtained by conventional means. Am J Dermato-pathol 2014;36(9):757.

46. Hinz T, Ehler LK., Hornung T, Voth H, Fortmeier I, Maier T, et al. Assessment of Tumor Thickness in Melanocytic Skin Lesions: Comparison of Optical Coherence Tomography, 20-MHz Ultrasound and Histopathology. Acta Derm Venereol 2012;92(2), 132–137.

47. Hoffmann K, Happe M, Schuller S, Stucker M,Wiesner M, Gottlober P, et al. Ranking of 20 MHz sonography of malignant melanoma and pigmented lesions in routine diagnosis. Ultraschall Med 1999;20: 104–109.

48. Hussein MR. Tumour-associated macrophages and melanoma tumourigenesis: integra-ting the complexity. Int J Exp Pathol 2006;87(3):163-176.

49. Ihnatsenka B, Boezaart AP. Ultrasound: Basic understanding and learning the language. Int J Shoulder Surg 2010; 4(3): 55–62.

50. Jasaitiene D, Valiukeviciene S, Linkeviciute G, Raisutis R, Jasiuniene E, Kazys R. Principles of high-frequency ultrasonography for investigation of skin pathology. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2011; 25, 375–82.

51. Kaikaris V, Samsanavičius D, Maslauskas K, Rimdeika R, Valiukevičienė S, Makš-tienė J, et al. Measurement of melanoma thickness – comparison of two methods: ultrasound versus morphology. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2011;64(6):796-802.

52. Kaikaris V. Odos melanomos skirtingų diagnostikos būdų įvertinimas ir optimalaus chirurginio gydymo metodo paieška. Daktaro disertacija, Kaunas, 2009.

53. Kardynal A, Olszewska M. Modern non-invasive diagnostic techniques in the

73

detection of early cutaneous melanoma. J Dermatol Case Rep 2014;31(1): 1–8. 54. Kerns MJ, Darst MA, Olsen TG, Fenster M, Hall P, Grevey S. Shrinkage of

cutaneous specimens: formalin or other factors involved? J Cutan Pathol 2008: 35: 1093–1096.

55. Kim HY. Statistical notes for clinical researchers: Evaluation of measurement error 1: using intraclass correlation coefficients. Restor Dent Endod 2013;38(2):98-102.

56. Kim J, Taube J, McCalmont TH, Glusac EJ. Quantitative comparison of MiTF, Melan-A, HMB-45 and Mel-5 in solar lentigines and melanoma in situ. J Cutan Pathol 2011;38:775–779.

57. Kittler H, Pehamberger H, Wolff K, Binder M. Diagnostic accuracy of dermoscopy. Lancet Oncol. 2002 Mar;3(3):159-165.

58. Kleinerman R, Whang TB, Bard RL, Marmur ES. Ultrasound in dermatology: principles and applications. J Am Acad Dermatol 2012;67(3):478-487.

59. Krahn G, Gottlober P, Sander C, Peter RU. Dermatoscopy and high frequency sonography: two useful non-invasive methods to increase preoperative diagnostic accuracy in pigmented skin lesions. Pigment Cell Res 1998; 11:151–154.

60. Kucinskiene V, Samuleniene D, Gineikiene A, Raisutis R, Kazys R, Valiukeviciene S. Preoperative assessment of skin tumor thickness and structure using 14-MHz ultrasound. Medicina 2014;50(3):150-155.

61. Lassau N, Koscielny S, Avril MF, Margulis A, Duvillard P, De Baere T, Roche A, Leclère J. Prognostic value of angiogenesis evaluated with high-frequency and color Doppler sonography for preoperative assessment of melanomas. AJR Am J Roentgenol 2002;178(6):1547-1551.

62. Lassau N, Lamuraglia M, Koscielny S, Spatz A, Roche A, Leclere J, Avril MF. Prognostic value of angiogenesis evaluated with high-frequency and colour Doppler sonography for preoperative assessment of primary cutaneous melanomas: correla-tion with recurrence after a 5 year follow-up period. Cancer Imaging. 2006; 6: 24–29.

63. Lin WM, Luo S, Muzikansky A, Lobo AZ, Tanabe KK, Sober AJ, et al. Outcome of patients with de novo versus nevus-associated melanoma. J Am Acad Dermatol 2015; 72: 54–58.

64. Linkeviciute G, Makstiene J, Sabaliauskas G, Raisutis R, Andrekute K, Valiuke-viciene S. Imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų gylio matavimui. Lietuvos bendrosios praktikos gydytojas 2017; 21(5):318–326.

65. Linkeviciute G, Raisutis R, Sakalauskiene K, Makstiene J, Guzaitis J, Pilipaityte L, et al. Verification of new method for automatic thickness measurement of melano-cytic skin tumours by high frequency ultrasound. Journal of Vibroengineering 2018;20(1):651–661.

66. Longo C, Pellacani G. Melanomas. Dermatol Clin 2016 ;34(4):411-419. 67. Machet L, Belot V, Naouri M, Boka M, Mourtada Y, Giraudeau B, Laure B,

Perrinaud A, Machet MC, Vaillant L. Preoperative measurement of thickness of cutaneous melanoma using high-resolution 20 MHz ultrasound imaging: A mono-center prospective study and systematic review of the literature. Ultrasound Med Biol. 2009; 35:1411–1420.

68. Mandava A, Ravuri PR, Konathan R. High-resolution ultrasound imaging of cutaneous lesions. Indian J Radiol Imaging 2013;23(3):269-277.

69. Marchesini R, Bono A, Carrara M. In vivo characterization of melanin in melano-cytic lesions: spectroscopic study on 1671 pigmented skin lesions. J Biomed Opt 2009;14(1):014–027.

74

70. Martín-Gorgojo A, Nagore E. Melanoma Arising in a Melanocytic Nevus. Actas Dermosifiliogr, 2017 [Epub ahead of print].

71. Meyer N, Lauwers-Cances V, Lourari S, Laurent J, Konstantinou MP, Lagarde JM, Krief B, Batatia H, Lamant L, Paul C. High-frequency ultrasonography but not 930-nm optical coherence tomography reliably evaluates melanoma thickness in vivo: a prospective validation study. Br J Dermatol. 2014; 171: 799−805.

72. Meredith P, Sarna T. The physical and chemical properties of eumelanin. Pigment Cell Res 2006;19:572–594.

73. Murali R, Hughes MT, Fitzgerald P, Thompson JF, Scolyer RA. Interobserver variation in the histopathologic reporting of key prognostic parameters, particularly clark level, affects pathologic staging of primary cutaneous melanoma. Ann Surg. 2009;249(4):641-647.

74. Music MM, Hertl K, Kadivec M, Pavlović MD, Hocevar M. Pre-operative ultrasound with a 12–15 MHz linear probe reliably differentiates between melanoma thicker and thinner than 1 mm. J Eur Acad Dermatol Venereol 2010;24(9):1105-1108.

75. Nacionalinis vėžio institutas. Vėžio registras. Vėžys Lietuvoje 2012 metais. Vilnius, 2015.

76. Nagle SM, Sundar G, Schafer ME, Harris GR, Vaezy S, Gessert JM, Howard SM, Moore MK, Eaton RM; US Food and Drug Administration. Challenges and regula-tory considerations in the acoustic measurement of high-frequency (>20 MHz) ultra-sound. J Ultrasound Med 2013;32:1897-1911.

77. O'Donnell AT, Kim CC. Update and clinical use of imaging technologies for pigmented lesions of the skin. Semin Cutan Med Surg 2012;31(1):38-44.

78. Orchard G. Evaluation of melanocytic neoplasms: application of a pan-melanoma antibody cocktail. Br J Biomed Sci. 2002;59(4):196–202.

79. Ordóñez NG. Value of melanocytic-associated immunohistochemical markers in the diagnosis of malignant melanoma: a review and update. Hum Pathol 2014;45(2): 191–205.

80. Papageorgiou V, Apalla Z, Sotiriou E, Papageorgiou C, Lazaridou E, Vakirlis S, et al. The limitations of dermoscopy: false-positive and false-negative tumours. J Eur Acad Dermatol Venereol 2018 Jan 5 [Epub ahead of print].

81. Pellacani G, Seidenari S. Preoperative melanoma thickness determination by 20-MHz sonography and digital videomicroscopy in combination. Arch Dermatol 2003; 139:293-298.

82. Potter GK. Re: Kerns MJJ, Darst MA, Olsen TG, Fenster M, Hall P, Grevey S. Shrinkage of cutaneous specimens: formalin or other factors involved? J Cutan Pathol 2009;36:1030.

83. Raisutis R, Jasiuniene E, Jasaitiene D, Valiukeviciene S. Investigation of human skin using pulse-echo ultrasonic technique: review and development. Ultragarsas (Ultrasound) 2010;65(1):37-41.

84. Rallan D, Bush NL, Bamber JC, Harland CC. Quantitative discrimination of pig-mented lesions using three-dimensional high-resolution ultrasound reflex transmis-sion imaging. J Invest Dermatol 2007;127:189–195.

85. Riley PA. Melanogenesis and melanoma. Pigment Cell Res 2003;16(5):548-552. 86. Rothwell DJ, Cote RA, Cordeau JP, Boisvert MA. Developing a standard data

structure for medical language – the SNOMED proposal. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care 1993:695-699.

75

87. Samimi M, Perrinaud A, Naouri M, Maruani A, Perrodeau E, Vaillant L, MacHet L. High-resolution ultrasonography assists the differential diagnosis of blue naevi and cutaneous metastases of melanoma. Br J Dermatol 2010;163:550–556.

88. Sapagovas J, Šaferis V, Jurėnienė K, Jurkonienė R, Šimatonienė V, Šimoliūnienė R. Statistikos ir informatikos pagrindai. Kaunas: KMU; 2007.

89. Sauvola J, Pietikainen M. Adaptive document image binarization. Pattern Recogni-tion 2000;33:225-236.

90. Schmid-Wendtner MH, Dill-Müller D. Ultrasound technology in dermatology. Semin Cutan Med Surg 2008;27(1):44-51.

91. Scotto di Santolo M, Sagnelli M, Mancini M, Scalvenzi M, Delfino M, Schonauer F, Molea G, Ayala F, Salvatore M. High-resolution color Doppler ultrasound for the study of skin growths. Arch Dermatol Res 2015;307(7):559-566.

92. Serrone L, Solivetti FM, Thorel MF, Eibenschutz L, Donati P, Catricalà C. High frequency ultrasound in the preoperative staging of primary melanoma: a statistical analysis. Melanoma Res 2002; 12: 287–290.

93. Shidham VB, Qi D, Rao RN, Acker SM, Chang CC, Kampalath B, et al. Improved immunohistochemical evaluation of micrometastases in sentinel lymph nodes of cutaneous melanoma with 'MCW melanoma cocktail'--a mixture of monoclonal antibodies to MART-1, Melan-A, and tyrosinase. BMC Cancer, 2003;3:15.

94. Shors AR, Kim S, White E, Argenyi Z, Barnhill RL, Duray P, et al. Dysplastic naevi with moderate to severe histological dysplasia: a risk factor for melanoma. Br J Dermatol. 2006;155(5):988-993.

95. Smoller BR. Histologic criteria for diagnosing primary cutaneous malignant mela-noma. Mod Pathol 2006;19(Suppl 2):34–40.

96. Spearmen C. The proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol 2010;39(5):1137-1150.

97. Stalioraitytė E. Patologinė anatomija. Kaunas: Naujasis Lankas, 2001. 98. Testa U, Castelli G, Pelosi E. Melanoma: Genetic Abnormalities, Tumor Progres-

sion, Clonal Evolution and Tumor Initiating Cells. Med Sci 2017; 20; 5(4). pii: E28. 99. Varkentin A, Mazurenka M, Blumenröther E, Meinhardt-Wollweber M, Rahlves M,

Broekaert SMC, et al. Comparative study of presurgical skin infiltration depth measurements of melanocytic lesions with OCT and high frequency ultrasound. J Biophotonics 2017;10(6-7):854-861.

100. Vestergaard ME, Macaskill P, Holt PE, Menzies SW. Dermoscopy compared with naked eye examination for the diagnosis of primary melanoma: a meta-analysis of studies performed in a clinical setting. Br J Dermatol 2008; 159(3):669-676.

101. Wall N, De'Ambrosis B, Muir J. The management of dysplastic naevi: a survey of Australian dermatologists. Australas J Dermatol 2017;58(4):304-307.

102. Wortsman X, Alfageme F, Roustan G, Arias-Santiago S, Martorell A, Catalano O, et al. Guidelines for performing dermatologic ultrasound examinations by the DERMUS group. J Ultrasound Med 2016;35:577-580.

103. Wortsman X, Wortsman J. Clinical usefulness of variable-frequency ultrasound in localized lesions of the skin. J Am Acad Dermatol. 2010; 62:247-56.

104. Zonios G, Dimou A, Bassukas I, Galaris D, Tsolakidis A, Kaxiras E. Melanin absorption spectroscopy: New method for noninvasive skin investigation and melanoma detection. J. Biomed Opt 2008;13:014 - 017.

105. Zonios G, Dimou A, Carrara M, Marchesini R. In vivo optical properties of mela-nocytic skin lesions: Common nevi, dysplastic nevi and malignant melanoma. Photochem Photobiol 2010; 86:236–240.

76

PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA

Straipsnių, kuriuose buvo paskelbti disertacijos tyrimų rezultatai, sąrašas: 1. Linkeviciute G, Raisutis R, Sakalauskiene K, Makstiene J, Guzaitis J,

Pilipaityte L, et al. Verification of new method for automatic thickness measurement of melanocytic skin tumours by high frequency ultra-sound. Journal of Vibroengineering 2018;20(1):651–661 (IF 0,66).

2. Andrekute K, Valiukeviciene S, Raisutis R, Linkeviciute G, Makstiene J, Kliunkiene R. Automated Estimation of Melanocytic Skin Tumor Thickness by Ultrasonic Radiofrequency Data. J Ultrasound Med 2016; 35(5):857–865 (IF 1,547).

3. Linkeviciute G, Makstiene J, Sabaliauskas G, Raisutis R, Andrekute K, Valiukeviciene S. Imunohistocheminių žymenų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų gylio matavimui. Lietuvos bendrosios praktikos gydytojas 2017; 21(5):318–326.

Konferencijų, kuriose buvo paskelbti disertacijos tyrimų rezultatai, sąrašas: 1. Linkeviciutė Gintare, Jurgita Makstiene, Gintaras Sabaliauskas,

Renaldas Raisutis, Kristina Andrekute, Skaidra Valiukeviciene. The significance of immunohistochemical markers in thickness evaluation of melanocytic skin tumours. 26th EADV (European Academy of Dermatology and Venerology) congress [elektroninis išteklius] : 13-17 September 2017, Geneva, Switzerland : abstracts on USB / European Academy of Dermatology and Venereology - EADV. Krailling ; Lugano : JMarquardt Technologies GmbH ; EADV Headquarters, 2017. ISBN 9788894255218. p. 1-1, no. P0928.

2. Linkeviciute Gintare, Valiukeviciene Skaidra, Raisutis Renaldas, Andrekute Kristina, Makstiene Jurgita. A Validation of the algorithm for automatic depth measurement of melanocytic skin tumors in ultrasound images. Official Journal of the Euro-Asian Association of Dermatovenerologists: 5th EAAD Congress "United for Dermatology" : 18-20 September, 2015, Riga, Latvia : programme and abstracts book, p. 60-60, no. A-61.

3. Linkeviciute G, Raisutis R, Guzaitis J, Makstiene J, Valiukeviciene S. A comparison between manual and automated measurements of the thickness of melanoma and melanocytic nevi using high frequency ultrasound. 13th EADV spring symposium "Moving Boundaries" : final

77

programme : 19-22 May, 2016, Athens, Greece / European Academy of Dermatology and Venerology ; [JEADV Editor Ring Johannes]. Athens: European Academy of Dermatology and Venerology, 2016. (12. Cutaneous Oncology.). p. 1-1, no. P0210.

4. Andrekute Kristina, Raisutis Renaldas, Linkeviciute Gintare, Valiukeviciene Skaidra. The Classification of melanocytic skin lesions using ultrasonic data. Biomedical Engineering - 2015: Proceedings of 19th International conference: [Kaunas, Lithuania, 26-2 November 2015] / Kaunas University of Technology. Biomedical Engineering Institute. Lithuanian Society of Biomedical Engineering. Kaunas: Technologija. ISSN 2029-3380. 2015, p. 56-60.

5. Linkevičiūtė Gintarė; Raišutis Renaldas; Andrėkutė Kristina; Makštienė Jurgita; Valiukevičienė Skaidra. Melanocitų kilmės odos navikų morfologijos ir ultragarsinio tyrimų rezultatai. VIII nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija "Mokslas – sveikatai" : konferencijos pranešimų tezės [skirta] Pasaulinei sveikatos dienai paminėti, kuri minima balandžio 7-ąją. Šių metų tema – “Maisto sauga” : 2015 m. balandžio 10 d, Kaunas / Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. [LSMU Doktorantų taryba. LSMU Mokslo centras. LSMU Mokslo fondas ; Org. Vaiva Lesauskaitė]. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Leidybos namai, 2015. (Onkologija ir genetika.), ISBN 9789955153863 (978-9955-15-386-3). p. 81-82.

6. Andrėkutė Kristina, Raišutis Renaldas, Linkevičiūtė Gintarė, Valiukevičienė Skaidra, Makštienė Jurgita. Automatizuotas plonų melanocitų kilmės odos navikų storio matavimas naudojant ultragarso radiodažninius duomenis. VIII nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija "Mokslas – sveikatai" : konferencijos pranešimų tezės [skirta] Pasaulinei sveikatos dienai paminėti, kuri minima balandžio 7-ąją. Šių metų tema – “Maisto sauga” : 2015 m. balandžio 10 d, Kaunas / Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. [LSMU Doktorantų taryba. LSMU Mokslo centras. LSMU Mokslo fondas ; Org. Vaiva Lesauskaitė]. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Leidybos namai, 2015. (Onkologija ir genetika.), ISBN 9789955153863 (978-9955-15-386-3). p. 72-73.

7. Hamburg : European School of Dermato-Oncology, 2013. (P - Late-breaking abstracts - Poster.). 1 skelb, no. P-305.

78

Kitos publikacijos: Straipsniai: 1. Andrekute K, Linkeviciute G, Raisutis R, Valiukeviciene S, Makstiene

J. Automatic Differential Diagnosis of Melanocytic Skin Tumours Using Ultrasonic Data. Ultrasound Med Biol. 2016 Dec; 42(12):2834-2843.

2. Linkeviciute G, Petkevicius A,.Makstiene J, Gudinaviciene I, Valiuke-viciene S, Mahrle G. Intravascular Histiocytosis Associated with Bacte-rial Endocarditis. Akt Dermatol 2014; 40(10): 401-403.

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

SUMMARY

Abbreviations CI – confidence interval CM – cutaneous melanoma IHC – immunohistochemistry, immunohistochemical IQR – interquartile range KK – Hospital of Lithuanian University of Health Sciences

Kauno klinikos KTU – Kaunas University of Technology LSMU – Lithuanian University of Health Sciences MMR – the mismatch of measurement results MN – melanocytic nevus MST – melanocytic skin tumours mT – manually measured US thickness OR – odds ratio p – significance level of the test, statistically significant

when p≤0.05 pBD – tumor depth according to the Breslow pBD (comb) – tumor depth according to the Breslow measured on

histological specimen stained with a combination of immunohistochemical markers (Melan-A, HMB-45 and tyrosinase)

pBD (HE) – tumor depth according to the Breslow measured on histological specimen stained with hematoxylin-eosin

pBD (S100) – tumor depth according to the Breslow measured on histological specimen stained with S100 marker

Q1 – 25% quartile Q3 – 75% quartile R2 – determination coefficient of logistic regression SLB – sentinel lymph node biopsy US – ultrasound z – z criterion χ2 – chi-square criterion

109

1. Introduction Cutaneous melanoma (CM) is a malignant melanocytic skin tumour

(MST) which causes the highest mortality at an advanced stage of the di-sease compared with other malignant skin tumours [40]. Therefore, the early diagnosis of CM using non-invasive skin imaging techniques can provide a relevant information about the tumour. Melanocytic nevi (MN) are the precursors of CM in more than a half cases. In our study, the same as in other studies [13, 38, 42, 71], we analysed the cases of MN together with CM because the prevalence of CM is not very high in Lithuania.

One of the most important prognostic factors of CM is the tumor depth according to the Breslow (pBD) measured on histological specimen stained with hematoxylin-eosin (HE) [29]. Sentinel lymph node biopsy (SLB) has been introduced as a valuable staging tool in order to allow the evaluation of the first draining lymph node in the regional lymphatic system. This procedure appropriate for patients in whom neither palpation nor lymph node sonography has suggested the presence of lymph node metastases. It is recommended to perform SLB when the CM is ≥1 mm in depth [40].

The recent studies [3, 8, 9–16] showed a good correlation between pBD and manually measured US thickness (mT) of MST using a 20–100 MHz transducer [38, 42, 50, 67, 71]. However, some authors found a weaker correlation between mT and pBD (HE) in cases of MST thinner than 1 mm by using 20 MHz US [62, 81, 92]. An overestimation of mT resulting from the impossibility of differentiating lymphocytic infiltrate or underlying melanocytic nevus cells from CM tissue has been reported in most studies [20, 38, 59, 67, 92].

Some authors reflected that cutaneous appendages such as sebaceous glands or hair follicles might affect the differences between mT and pBD (HE), but there is still no research-based agreement among the researchers [20, 81]. According to other authors, the size, shape and distribution of the melanocytes in epidermis and dermis, the degree and predominant location of lymphocytic infiltrate as well as the amount of dermal melanophages depends on the type and the degree of atypia of MST [11, 34, 48, 95]. Therefore, the aim of this prospective study is to determine the influence of MST morphological features on the correlation between mT and pBD (HE) parameters.

As far as we know, in all previously described studies, US thickness of MST was measured manually by marking the boundaries with electronic calipers on B-scan images. The limitation of this technique is that such procedure requires highly experienced operators, and image analysis is time- consuming. The author of this study in collaboration with colegues under

110

the united LSMU and KTU project SkinTech developed an automatic algo-rithm based on the processing of 22 MHz US B-scan images. In this work for the first time in clinical practice this algorithm was adapted for measu-ring the thickness of MST. The results were compared with mT and pBD values.

Although subtle interobserver differences have been reported, the Breslow thickness measured in histopathological sample stained with conventional hematoxylin and eosin (HE) is commonly considered a highly reproducible and accurate parameter [3]. According to the literature, the interobserver variability between the pathologists, comparing the results of CM thickness, ranges from 68.8% to 84.8% and depends on experience of the pathologist [73]. Therefore, approximately 15.5% of CM <1 mm are re-classified either as melanoma in situ or melanomas >1 mm after review [32]. Sometimes even experienced dermatopathologists do not avoid false negative diagnosis of CM and MN. Immunohistochemistry (IHC), however, remains the most frequently used and most effective additional technique in CM diagnosis, especially when estimating the maturation of melanocytes, the degree of melanocytic atypia and the dermal invasion of melanocytes [79]. IHC markers permit the identification of individual intraepidermal or dermal melanocytes and the presence of periadnexal extension of melanocytes that can be easily overlooked in conventional HE stains [27, 45]. IHC staining seems to be especially useful in those thin melanoma cases, presenting extensive fibrotic changes or regression phenomena in the papillary and superficial reticular dermis and/or large clusters of melanincontaining histiocytic cells or melanophages, showing dense dermal or dermal–epidermal lymphohistiocytic inflammatory infiltrates, both of which may obscure the presence of dermal melanocytic cells [27, 45]. According to data of several studies, primary CM reacts with polyclonal antibodies against the protein S100 and monoclonal antibodies against Melan-A, HMB-45 and tyrosinase with similar accuracy [78, 79]. However, the application of melanoma marker „cocktails“ increase the sensitivity of the immunostaining for detecting melanocytic differentiation when compared with that obtained with an individual marker [78].

Still there are just a few research on evaluation of the results obtained by measuring the Breslow depth using the conventional HE staining techni-que and IHC markers [27, 31]. Considering this, for the first time in this study, we evaluated the significance of several IHC markers (S100 and a combination of HMB-45, Melan-A and tyrosinase) for the estimation of the depth and morphological structure of MST, in comparison with conventio-nal HE staining.

111

The subject of dissertation – early diagnostics of CM – is relevant to scientific and practical work. The results of this study provide scientifically new conclusions on the significance of high-frequency US and the infor-mation technology (automatic segmentation algorithm) for non-invasive diagnostics of CM. Until now, there is no available data about the value of the IHC marker „cocktail“ in measuring the depth and evaluating morpho-logical features of MST in comparison with conventional HE staining. The conclusions of the dissertation are relevant not only for dermatologists but for pathologists and other specialists who works on the field of CM diagnostics as well.

2. Aim and objectives

The aim of the study To evaluate the significance of high-frequency ultrasound and immuno-

histochemical markers for the diagnosis of melanocytic skin tumours (melanoma and its precursors melanocytic nevi).

The objectives of the study 1. To evaluate the relationship between the results of high-frequency

ultrasound (assessed manually and automatically) and histology in measuring the thickness of melanocytic skin tumours.

2. To estimate the correspondence of the features (structure, borders, boundary between the tumour and surrounding tissues) in B-scan ultrasound image to histological structure of melanocytic skin tumours.

3. To assess the significance of immunohistochemical markers (S100 and a combination of HMB-45, Melan-A and tyrosinase) for the estimation of the thickness and morphological features of melano-cytic skin tumours, in comparison with conventional HE staining.

Scientific Novelty This is the first doctoral dissertation about the imaging of the thickness

and the structure of melanocytic skin tumours using high frequency ultrasound and immunohistochemical markers in Lithuania.

To our knowledge there are still no studies based on the automatic assessment, implemented in clinical practice, of melanocytic skin tumours thickness in B-scan ultrasound images. As far as we know, in all previously described studies, ultrasound thickness of melanocytic skin tumours was measured manually by marking the boundaries with electronic calipers on

112

B-scan images. The limitation of this technique is that such procedure requires highly experienced operators, and image analysis is time – consuming. Therefore, the author of this study in collaboration with cole-gues under the united LSMU and KTU project SkinTech developed an auto-matic algorithm based on the processing of 22 MHz ultrasound B-scan images. It was adapted for measuring the thickness of MST for the first time in clinical practice.

We estimated the correspondence of the features in B-scan ultrasound image to histological structure of melanocytic skin tumours in this research. For the first time in this study, we evaluated the significance of several immunohistochemical markers (S100 and a combination of HMB-45, Melan-A and tyrosinase) for the estimation of the depth and morphological structure of MST, in comparison with conventional hematoxylin-eosine stai-ning. To the best of our knowledge, so far there have been no data published on that approach.

3. Methodology of the study The study was performed at the Department of Skin and Venereal

Diseases of LSMU in collaboration with the Departments of Pathological Anatomy and Plastic and Reconstructive Surgery of LSMU and prof. K. Baršauskas Ultrasound Research Institute of KTU. It was approved by the regional Kaunas Ethics Committee for Biomedical Research (4 April, 2014, No. P2-BE-2-25/2009). The State Data Protection Inspectorate issued the permission to manage the personal information of the participants of this study (15 July, 2015, No. 2R -4137 (2.6-1.)). This work was partially spon-sored by the Scientific Foundation of LSMU under the united LSMU and KTU project SkinTech.

The Contingent and the Scheme of the Study The sample size was calculated by confidence interval according to the

following equation:

2

22

∆=

szn ,

where n – number of cases; z – quantile of the normal distribution (when probability p = 0.05, z = 1.96); s – standard deviation of the sample; Δ – ma-ximum error defined by an investigator.

113

In case of the first objective – s = 1.4 mm, standard deviation was determined based on literature data [81], ∆ = 0.1 mm. It was estimated that at least 75 cases should be investigated in order to compare the results of the MST thickness measured by ultrasound and histology (evaluated with an accuracy of 0.1 mm).

As there are no literature data on the measurement of MN depth using different IHC markers (such publications [27, 31] are only found in CM cases), to calculate the sample size for the second objective, we chose s value based on the data of a pilot study performed by the author of this work. The median thickness of MST (n = 30) in the histological samples stained with a mixture of IH markers was estimated to be 1.00±0.87 mm (± standard deviation). The maximum possible measurement error was determined to be 0.2 mm based on the results of the research by Drabeni M et al [27]. It was calculated that at least 72 cases should be investigated to compare the thickness of MST measured in histological samples stained with HE and IH markers.

After the consultation of dermatologist and planning the excision of one or more MST, the patients were included in the study.

Inclusion criteria: 1. Men and women older than 18 years. 2. Written consent form to participate in the study. 3. The skin around MST is healthy, no other treatment was previously

applied. 4. MST is not localized on the scalp or other areas that prevent full

contact with a US transducer. 5. MST without exophytic growth and ulceration. 6. MST diameter is less than 2 cm.

Exclusion criteria: 1. Refusal to sign in the consent form. 2. The patient is under police investigation. 3. Pregnancy or nursing. 4. The pacient does not have the social health insurance required by

the health care institutions.

114

All enrolled patients had been given an informed consent. The personal data of the patient was encoded with a numeric code containing four digits.

The study began at at the 14th of January, 2014, and ended till the 15th of September, 2015. Twenty cases of CM whose US images and histological samples had been collected during 2013–2014 were additionally included retrospectively (EUROSTARS project: SkinMonitor: No. E 4846).

After histological examination, 27 cases of MST were excluded due to the lack of the intradermal component of melanocytic cells and 3 cases were excluded because it was impossibile to digitize MST at 4×magnification (pBD (HE)>3.5 mm).

Therefore, 155 MST (100 MN and 55 CM) were included in the relation-ship analysis between the results of mT and pBD (HE). After the automatic MST thickness evaluation, 10 cases of images were excluded because of artifacts in the processing of US images (Fig. 3.1).

In order to evaluate the additional value of IHC markers for tumour thickness estimation in comparisson with conventional HE staining, MST (n=107) cases were sequentially selected from the general sample size (20 CM and 87 MN). Such number of cases was sufficient according to the calculation of the sample size (see pages 112–113).

The thickness of 52 MST measured by ultrasound and histology were evaluated using an automatic algorithm based on radiofrequency data ana-lysis developed under the united Lithuanian University of Health Sciences and Kaunas University of Technology project SkinTech. The results are published in the Journal of Ultrasound in Medicine (Andrekute K, Valiuke-viciene S, Raisutis R, Linkeviciute G, Makstiene J, Kliunkiene R. Automated Estimation of Melanocytic Skin Tumor Thickness by Ultrasonic Radiofre-quency Data. J Ultrasound Med 2016; 35(5): 857-865, IF-1,547).

The scheme of the study is presented in Fig. 3.1.

115

Fig. 3.1. Scheme of the study

The cases of CM (n = 20) included retrospectively.

3.1. The Course of the Study

3.1.1. Estimation of the clinical features of melanocytic skin tumours Color, margins, size in millimetres (X and Y axis) of MST were

evaluated according to the clinical examination protocol. The anatomical region of MST was determined by the Topography–Standardised Nomen-clature of Medicine (t-SNOMED) and the clinical diagnosis according to the International Classification of Diseases (ICD-10-AM).

3.1.2. Ultrasonic examination Manually and automatically performed ultrasonic examination of MST.

US images of MST were acquired by a single dermatologist using a US scanner and a broadband mechanically steered single-element focused transducer with 22 MHz central frequency (DUB-USB, Taberna Pro Medi-cum, Germany). US velocity of 1580 m/s was set during the scanning. Each

116

skin tumor was scanned along the longitudinal axis with the US transducer applied perpendicular to the MST. At least two B-scans were acquired for each case in order to define the highest thickness from the surface of the MST to its deepest point. The scheme of US signal registration in MST is presented in Fig. 3.1.2.1.

Fig. 3.1.2.1. The registration system of high-frequency ultrasonic data

The author of this work evaluated the depth of MST measured in ultrasound B-scan images (mT) with 0.01 mm accuracy using interactive markers of the original imaging and analysis software supplied by the manufacturer (Fig. 3.1.2.2). Another dermatologist estimated the mT of 15% (22 out of 155) of randomly selected B-scan images of the MST. The characteristics of MST such as structure (homogeneous, non-homogeneous), borders (regular, irregular), margin between the tumour and adjacent tissues (clear, unclear, partly clear) were evaluated additionally in US images. The characteristics of MST analyzed in US images are shown in Fig. 3.1.2.3.

The raw US data were converted to the digital B-scan image in the Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) format, and were sent to the automated Picture Archiving and Communication System (PACS) workstation using Meddream software (Softneta, Lithuania). In order to perform the automated analysis of the spatial dimensions of the MST within the acquired US B-scan images, the software based on

117

thresholding, spatial filtering, and contour detection of the MST was developed by the author of this study in collaboration with colegues under the united LSMU and KTU project SkinTech. Using this program, the author measured the thickness of MST automatically (aT) in digitized US images (Fig. 3.3.2.2 B) and compared it with mT and pBD (HE) measurements. The main steps of US image processing for estimation of aT of the MST are listed in Table 3.1.2.1.

Fig. 3.1.2.2. The depth of cutaneous melanoma estimated in B-type images

manually (A) and automatically (A) using 22 MHz ultrasound White and yellow arrows indicate the thickest part of CM.

Fig. 3.1.2.3. The characteristics of melanocytic skin tumours analyzed in ultrasound images: structure – (A) homogeneous, (B) non-homogeneous;

borders – (A) regular, (B, C) irregular; margin between MST and adjacent tissues – (A) clear, (B) unclear, (C) partly clear

118

Table 3.1.2.1. Steps of B-scan image processing by an automatic segmen-tation algorithm for measuring the thickness of melanocytic skin tumours*

Steps Description Image pre-processing Noise reduction, thresholding, application of

spatial mean filter (size 3×3) Detection of the skin surface Procedure of adaptive image binarization, edge

detection and estimations of contour line Detection of the first boundary (beginning) of the MST Detection of the second boundary (bottom) of the MST

Thresholding, iterative application of spatial dilation, erosion and mean filters (size 3×3)

Evaluation of the lesion’s shape according to the detected boundaries

Iterative reconstruction of the shape region, contouring and segmentation

Estimation of thickness, size and contour of the MST

Evaluation of the area and the widest and deepest cross-sections of the reconstructed contour. Indication of estimates and visualization of the contour

MST – melanocytic skin tumours. *the software developed by the author of this study in collaboration with colegues under the united LSMU and KTU project SkinTech in 2014–2015.

3.1.3. The surgical excision of melanocytic skin tumour Excisions of MN were performed in the Department of Skin and

Venereal Diseases, whereas all patients with CM underwent surgery in the Department of Plastic and Reconstructive Surgery according to the Kauno klinikos protocol of surgical procedures.

3.1.4. Histological and immunohistochemical examinations Histological and immunohistochemical (IHC) examinations of the MST

were conducted at the LSMU Clinical Department of Pathological Anatomy according to the description of the procedure of such examinations. The MST sample was divided into two parts perpendicular to the long axis of the tumour, and was embedded in a paraffin block. A 3 µm thick slice was cut off the thickest part of the paraffin-embedded MST sample, and was stained with hematoxylin-eosin (HE). From the remaining part of the sample, three additional 3 µm thick slices were cut and were placed on SuperFrost Plus microscope slides (Thermo Fisher Scientific, USA) for IHC reactions using two different specific markers of melanocyte expression: the Rabbit Polyclonal Antibody S100 (CONFIRM anti-S100 (Polyclonal, Roche, USA) and a combination of three IHC markers (Melanoma Triple Cocktail, Roche,

119

USA) composed of anti-melanosome (HMB-45), anti-MART-1/Melan-A (A103), and anti-tyrosinase (T311) mouse monoclonal antibodies. The IHC marker analysis of protein expression was performed by using the Ventana BenchMark Ultra automatic staining instrument (Ventana Medical Systems, USA). Antigen epitope retrieval was performed by using the Ventana cell conditioning solution CC1 (pH 8.5) at the temperature of 95 °C during a set time (S100 – 36 min, and the marker combination – 60 min). Subsequently, using the Ventana Ultraview DAB detection system, MST samples were incubated with monoclonal antibodies (S100: at the temperature of 36 °C for 20 min, solution dilution ratio – 1:200; and the marker combination: at the temperature of 37 °C for 28 min).

An experienced immunologist (J. M.) diagnosed a melanocytic naevus (MN), a dysplastic MN, or cutaneous melanoma (CM) based on the morpho-logical characteristics [97].

The MST depth according to Breslow (pBD) was measured from the margin between stratum corneum and stratum granulosum to the deepest infiltration of tumour cells into the dermis or the subcutaneous tissue (Fig. 3.1.4.1 A), and was indicated as the following: in the sample stained with HE – as pBD (HE), with the marker S100 – as pBD (S100), and in the sample stained with the combination of three IHC markers – as pBD (comb) [64]. These measurements were preformed using an Olympus BX43 (Japan) microscope with a 10x magnification eyepiece. The smallest graduation on the micrometer in the eyepiece was 0.01 mm. An independent experienced pathologist (G. S.) additionally measured BD (HE) with an Olympus BX51 (Japan) microscope (a micrometer with the accuracy 0.1 mm integrated into the microscope stage) in 15% randomly selected MST samples. Using digitalised images of histological samples, BD (HE), BD (S100), and BD (comb) were measured by the second investigator (G. L.) using a Q-Imaging MicroPublisher 5.0 RTV microscope camera (resolution – 5 million pixels, 2560 x 1920). The measurements were performed using the QCapture Pro 7 software under 10× magnification. In cases when the total depth of the MST did not fit into the field of view of the microscope camera, the magnification was set at 4× (Fig. 3.1.4.1 B).

120

Fig. 3.1.4.1. The depth of cutaneous melanoma according to the Breslow

estimated in histological sample stained with HE by the experienced pathologist (red arrow) (A) and QCapture Pro 7 software (blue arrow) (B)

L1 – cursor (in micrometres) connects 2 points from the top of the granular layer of the epidermis to the deepest margin of the tumour. The magnification of the image is set at 4× because the tumour is deep and does not fit into the field of view of the microscope camera

By the decision of both investigators (J. M. and G. L.), the following characteristics were evaluated in the HE-stained sample:

• The degree of lymphocytic infiltration: a) absent or mild, when solitary lymphocytes in perivascular distribution within the dermis are visible (Fig 3.1.4.2 A), b) pronounced – closely grouped lymphocytes in the tumour stroma or around the tumour in at least one field of vision of the microscope, c) moderate, when the number of lymphocytes does not fall into either a or b categories (Fig. 3.1.4.2 B, C).

• Melanophage count in the dermis: a) none or solitary (Fig. 3.1.4.2 A), b) abundant – a closely packed band-shaped distribution of the melanophages in the stroma or the lower margin of the tumour (Fig. 3.1.4.2 B) in at least one field of vision of the microscope c) moderate – when the number of melanophages does not fall into either a or b categories (Fig. 3.1.4.2 C).

• The location of the predominant lymphocytic infiltrate in the MST – the stroma (Fig. 3.1.4.2 B) or around the tumour (Fig. 3.1.4.2 C).

121

Fig. 3.1.4.2. Evaluation of morphologic characteristics in histological

samples of melanocytic skin tumours: (A) HE×10, compound dysplastic nevus, with an absent or mild lymphocytic infiltrate and absent or several

dermal melanophages, (B) HE×10, compound nevus with a moderate lymphocytic infiltrate in the stroma and abundant dermal melanophages,

(C) HE×10, compound nevus with a pronounced lymphocytic infiltrate in the surroundings of the tumour and dermal melanophages in moderate numbers

Red square – inflammatory lymphocytic infiltrate, blue square – dermal melanophages.

• The distribution of the melanocytes in the dermis: a) solitary cells – individual melanocytes surrounded by dermis, b) clusters – solitary groups of melanocytes surrounded by dermis, c) merging clusters – merging groups of melanocytes surrounded by dermis, d) diffuse – the melanocytes are grouped very tightly, and it is impossible to determine whether these are individual cells or cell clusters (Fig. 3.1.4.3).

Fig. 3.1.4.3. The distribution of dermal melanocytes

122

In MST samples stained with HE and IHC markers, the detected melanocytes were either distributed along the hair follicle or an eccrine sweat gland (Fig. 3.1.4.4 A–C) or were separated from the tumour (Fig. 3.1.4.4 D–F).

Fig. 3.1.4.4. The Breslow depth of cutaneous melanoma (A–C, 4×

magnification) and melanocytic nevus (D–F, 10× magnification) in millimeters (red arrow) estimated in the digitized images of the histological

samples. Staining with HE (A, D), polyclonal marker S100 (B, E) and a mixture of monoclonal antibodies (C, F) highlighted periadnexal

(hair follicle) extension of the melanocytes (A–C) and small clusters or isolated dermal melanocytes (D–F)

123

3.1.5. Applied Methods of Mathematical Statistics The obtained data of the study were stored in a digital database using

Microsoft Excel 2003 software. The descriptive statistics of the data was performed by the author of this work with the help of Eglė Šepetauskienė, an engineer programmer of the LSMU Information Technology Centre. Statistical data processing was performed using SPSS v. 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and MedCalc software (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium).

Objective and methods of statistical analysis

Description of the characteristics • Quantitative attributes, the distribution of whose values in the

population was normal (Gaussian), were described by presenting the mean value and standard deviation of their values.

• Quantitative attributes that did not have the normal distribution according to the Kolmogorov-Smirnov criterion, were described by presenting the median and the first (Q1) and the third (Q3) quartiles of their values. The median is the middle value of data arranged in an increasing order, and is significantly less dependent on the asymmetry of the distribution, compared to the arithmetic mean. The quartiles were selected because 50% of numerical data values fall between the first and the third quartiles.

• Proportions (%) were used to describe qualitative nominal and rank attributes.

Comparison of grouped characteristics • The parametric Student’s t criterion for hypothesis verification was

applied to hypotheses about the differences in mean values between the compared independent groups (when comparing two groups) [88].

• The difference between two independent groups (quantitative non-normal attributes) was evaluated by applying the Mann-Whitney criterion [88].

• Associations of qualitative attributes between several groups were evaluated by applying the two-way table and by calculating the chi-squared (χ²) criterion [88]. The z criterion was used to compare two proportions [88].

124

Evaluation of linear correlation To evaluate linear correlation between two variables in case of quan-

titative non-normal variables (for the comparison of rT, aT, and pBD), we applied Spearman’s correlation coefficient (|r|) [96].

Evaluation of the agreement between findings of two different examination techniques To compare two different examination techniques used in clinical

practice, we used the Bland-Altman graphic analysis [14].

Evaluation of the accuracy of ultrasonography (US) in the manual and automatic measurement of the depth of a melanocytic skin tumour During this stage of the study, the examined MST were grouped into

thin (depth <1 mm) and thick (depth ≥1 mm) tumours because this resolution of the tumour depth was important for the prognosis and the surgical treatment of CM.

The sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values and accuracy of the US examination in measuring tumour depth with respect to the pBD (tumour depth according to Breslow during histological examination) were calculated using the following equations:

Sensitivity was the probability that in case of <1 mm deep MST, tumour depth measured histologically and by US would coincide. The sensitivity was calculated using the following equation:

caa+

,

where a – the number of MST<1 mm deep detected during US and histological examination, and a + c – the number of MST<1 mm deep detected during histological examination [8].

Specificity was the probability that in case of ≥1 mm deep MST, tumour depth measured histologically and by US would coincide. The specificity was calculated using the following equation:

bdd+

,

where d – the number of MST≥1 mm deep detected during US and histological examination, and d + b – the number of MST≥1 mm deep detected during histological examination [8].

125

Positive predictive value was the probability that US would definitely detect a<1 mm deep MST. It was calculated using the following equation:

baa+

,

where a – the number of MST<1 mm deep detected during US and histological examination, and a + b – the number of MST<1 mm deep detected during US examination alone [8].

Negative predictive value was the probability that US would detect a≥1 mm deep MST. It was calculated using the following equation:

dcd+

,

where d – the number of MST≥1 mm deep detected during US and histological examination, and c + d – the number of MST≥1 mm deep detected during histological examination alone [8].

Accuracy was the index describing the accuracy of the diagnostic technique and indicating the ratio between correctly identified cases and all the examined cases. The accuracy of the examination was calculated using the following equation:

dcbada+++

+ ,

where a – the number of MST<1 mm deep detected during US and histo-logical examination, b – the number of MST≥1 mm deep detected during histological examination, c – the number of MST<1 mm deep detected during histological examination, d – the number of MST≥1 mm deep detec-ted during US and histological examination [8].

Evaluation of the agreement between measurement results of two examiners The intra-class correlation coefficient (ICC)) between the parameters

evaluated by two investigators was calculated according to the agreement of quantitative parameters. The values of this coefficient ranged from -1 to 1. The closer the ICC was to 1, the greater was the agreement between the results of the two investigators’ measurements [55].

126

Prediction of significance based on the values of other variables Based on the data of the multiple regression analysis and by applying

the stepwise technique of the statistical model selection [19], a relationship was found between the peculiarities of MST ultrasound images and their morphological characteristics. We also calculated the odds ratio (OR) of the mismatch of measurement results (MMR) between pBD (HE) and pBD measured using IHC staining techniques, when the difference between these parameters was ≥0.1 mm. The same model was also applied when eva-luating the strength of the relationship between the mismatch of the mea-surement results (underestimated or overestimated tumour depth on US with respect to the depth coinciding with pBD (HE)) obtained during US and histological examination, depending on the morphological characterristics.

The logistic regression equation coefficients were verified according to the null hypotheses. The significance of individual characteristics was determined according to the OR value, exp(B) = OR and its confidence intervals. Using the determination coefficient R² and the model agreement criterion, we selected optimal combinations of characteristics, which cor-rectly defined the examined frequency. The logistic regression analysis was modelled so that the coefficient B would be positive, and the significance of the agreement criterion of the model would be p <0.05.

Presentation of the results of the analysis The results of the statistical data analysis are presented in Tables and

Figures. Conclusions about the results of the verification of statistical hypothe-

ses were presented using p-values: the relationship was considered to be statistically significant when p<0.05 [88].

4. Results of the study

4.1. The relationship between the results of high-frequency ultrasound (assessed manually and automatically) and histology in measuring the

thickness of melanocytic skin tumours. The main characteristics of the study are thoroughly described in the

article at Journal of Vibroengineering (Linkeviciute G. et al, 2018). The value of the intra-class correlation coefficient of mT compared

between two dermatologists was 0.98 (95% CI 0.96 to 0.99). The inter-observer variability between pT and pT1 (measurement by using the soft-ware) was equal to 1, and between pT and pT2 (measurement performed by

127

independent pathologist) – 0.94 (95% CI 0.86 to 0.97). Therefore, we used pT values as the reference measurement.

The median thickness of mT and aT in cases of CM was, correspond-dingly, 0.96 mm (IQR: 0.65–1.52) and 0.98 mm (IQR: 0.62–1.65), and in MN – 0.51 (IQR: 0.37–0.67) and 0.50 mm (IQR: 0.36–0.74), accordingly. A strong correlation was detected between mT and aT in cases of CM (r=0.84) and MN (r=0.87). We found a very good agreement of mT and aT with the bias of 0.08 mm and relatively small range (95% CI -0.01 to 0.18) in CM; in MN, it was 0.03 mm (95% CI 0.00 to 0.07 mm). As the difference between mT and aT was non-significant in CM and MN, we used manual US thickness as a reference parameter in comparison with pT.

The Bland-Altman plots revealed the mean difference of manually estimated US thickness to be -0.07 mm (95% CI -0.18 to 0.04 mm) in reference with pT in cases of CM. In contrast, we found greater mean difference of -0.29 mm (95 % CI -0.39 to -0.20) between mT and pT in cases of MN. Manual US thickness in 73/91 cases of MN was underesti-mated comparing with pT (p<0.001). We found 27/54 underestimated and 27/54 overestimated mT in reference with pT in cases of CM, but this difference was not statistically significant.

We evaluated the sensitivity and specificity to demonstrate the accuracy of the thickness measurement methods (manual and automatic compared with histologic). We divided MST into 2 groups: thin (<1 mm) and thick (≥1 mm). The results were calculated according to the equations given on pages 102–103): We calculated that the accuracy for the automated algorithm to evaluate the MST thickness comparing with histology was 80%. The sensitivity and specificity values were 90% (95% PI from 85% to 95%) and 60% (95% of PI from 50 to 67%), respectively. The positive and negative predictive values of this program, accordingly – 80% and 74%. The values were almost similar to those for the manually measured US thickness. Approximately 10% of MST <1 mm measured automatically and manually by ultrasound were re-classified as MST≥1 mm after histological examination.

The association between disagreement of the tumour thicknesses mea-sured by ultrasound and histological examination and morphological structure of melanocytic skin tumour. If the difference between mT and BD (HE) was <0.1 mm complete agreement between those values was recorded. We named overestimated mT when mT>pBD (HE). In contrast, underesti-mated mT – when mT<pBD (HE). The results are listed in Table 4.1.1. It shows that underestimated mT is found more frequently (67.1%) than overestimated mT (z = 5.65, p<0.001) and more often MN thickness than CM thickness in ultrasound images are underestimated in comparison with histology (Table 4.1.1).

128

Table 4.1.1. Disagreement of the melanocytic skin tumour thicknesses measured by ultrasound and histological examination (with an accuracy of 0.1 mm) according to the diagnosis

Groups of the thickness CM (n = 55) MN (n = 100) In total (n = 155) Underestimated mT (mT < pBD (HE)) 26 (47.3%) 78 (78.0%)* 104 (67.1%) Overestimated mT (mT > pBD (HE)) 17 (30.9%)* 7 (7.0%) 24 (15.5%) Identical mT (mT = pBD (HE)) 12 (21.8%) 15 (15.0%) 27 (17.4%)

СM – cutaneous melanoma; MN – melanocytic nevi; n – number of cases; mT – manually measured ultrasound thickness; pBD (HE) – histologically measured thickness according to the Breslow in samples stained with HE; * p significance level when comparing between the types of melanocytic skin tumours.

The logistic analysis was performed to identify the OR of each semi-quantitative histological finding for the disagreement between mT and pBD (HE), comparing with the identical mT values. The underestimation of mT was significantly associated with the periadnexal extension of melanocytes (OR=8.87) as well as with diffusely distributed dermal melanocytes (OR=5.35) (Table 4.1.2). The rest of morphological characteristics such as intensity and predominant location of lymphocytic infiltrate, the amount of dermal melanophages and solitary dermal melanocytes or their small clusters separated from the tumour had no associations with underestimated mT of MST.

Table 4.1.2. The associations between the underestimated thickness of the melanocytic skin tumour (n = 155) measured by ultrasound and their morphological characteristics (compared with identical values between ultrasound and histology)

Morphological characteristics of melanocytic skin tumours

OR (95% CI) p value

Predominant location of lymphocytic infiltrate

Absent 1 – Stroma 0.98 (0.20–4.74) 0.98 The surroundings of the tumour 0.87 (0.17–2.54) 0.34

The intensity of lymphocytic infiltrate

Absent or mild 1 – Moderate 1.43 (0.32–6.33) 0.64 Pronounced 0.53 (0.14–1.99) 0.35

The amount of dermal melanophages

Absent or several 1 – In moderate numbers 3.09 (0.90–10.62) 0.07 Abundant 0.80 (0.21–3.05) 0.75

129

Table 4.1.2. Continued Morphological characteristics of melanocytic skin tumours

OR (95% CI) p value

Periadnexal extension of the melanocytes

Absent 1 – Present 8.87 (1.94–40.48) 0.005

Solitary dermal melano-cytes or their small clusters separated from the tumour

Absent 1 –

Present 1.72 (0.52–5.65) 0.37

Distribution of dermal melanocytes

Solitary cells 1 – Clusters 0.82 (0.20–3.46) 0.79 Merging clusters 2.44 (0.79–7.50) 0.12 Diffuse 5.35 (1.37–20.85) 0.016

OR – odds ratio adjusted according to age, CI – confidence interval, p – significance level, statistically significant when p≤0.05; determination coefficient of logistic regression R2 = 0.20; overall percentage of model accuracy – 82.6%.

None of the examined morphological characteristics of MST was associated with overestimated mT.

4.2. The correspondence of the features (structure, borders, boundary between the tumour and surrounding tissues) in B-scan ultrasound

image to histological structure of melanocytic skin tumours Multivariate logistic regression analysis showed that CM by 5 times

more frequently has a homogeneous structure and irregular borders, comparing to MN (Table 4.2.1).

Table 4.2.1. Association between the ultrasonic features and the morpholo-gical type of melanocytic skin tumour (n = 155) (cutaneous melanoma regarding melanocytic nevus)

Ultrasonic features of melanocytic skin tumours OR (95% CI) p value Structure Non-homogeneous 1 –

Homogeneous 4.78 (1.87–12.20) 0.01 Borders Regular 1 –

Irregular 5.60 (2.26–13.92) <0.001


130

After evaluating the histological samples stained with HE we found that MN more often than CM had no lymphocytic infiltrate (χ2 = 29,53; p<0,001) and dermal melanophages (χ2 = 14,67; p = 0,001). The pronounced lympho-cytic infiltrate was found more frequently in CM cases, comparing with MN (χ2 = 29,53; p<0,001) as well as abundant amount of dermal melanophages (χ2 = 14,67; p = 0,001). Periadnexal extension of the melanocytes were obser-ved more often in MN than in CM cases (χ2 = 14,06; p<0,001). Appro-ximately 16% of CM arised from prie-existing MN (Table 4.2.2).

Table 4.2.2. Morphological characteristics of melanocytic skin tumours (n = 155)

Morphological characteristics of melanocytic skin tumours CM, n (%) MN, n (%) CM arised from prie-existing MN

No 46 (84) – Yes 9 (16) –


Absent 22 (40) 76 (76)* Stroma 23 (42)* 19 (19) The surroundings of the tumour 10 (18)* 5 (5)


Absent or mild 22 (40) 76 (76)* Moderate 10 (18) 17 (17) Pronounced 23 (42)* 7 (7)


Absent or several 21 (38) 59 (59)* In moderate numbers 18 (33) 34 (34) Abundant 16 (29)* 7 (7)


Absent 48 (87)* 59 (59) Present 7 (13) 41 (41)*

Distribution of dermal melanocytes

Single cells 12 (22) 17 (17) Nests 2 (4) 14 (14) Confluent nests 24 (44) 37 (37) Diffuse 17 (30) 32 (32)

Solitary dermal melano-cytes or their small clus-ters separated from the tumour

Absent 47 (85) 80 (80)

Present 8 (15) 20 (20)

CM – cutaneous melanoma; MN – melanocytic nevus; p<0.001, comparing the morphological characteristics in the groups of melanoma and melanocytic nevus

Table 4.2.3 shows the relationship between the ultrasonic features and morphological characteristics of melanocytic skin tumours determined after multivariate logistic regression analysis. Homogeneous MST in US images by 3 times frequently have pronounced lymphocytic infiltrate and by 8 times

131

frequently diffusely distributed dermal melanocytes, in comparison with non-homogeneous (Table 4.2.3).

Irregular borders of MST in US images are more frequent than regular when abundant dermal malanophages and solitary dermal melanocytes or their small clusters separated from the tumour are observed in histological examination (Table 4.2.3).

Table 4.2.3. Relationship between the ultrasonic features and morpholo-gical characteristics of melanocytic skin tumours (n = 155)

Characteristics of melanocytic skin tumours OR (95% CI) p value Homogeneous structure of melanocytic skin tumour (R2 = 0.32) Predominant location of lymphocytic infiltrate

Absent 1 – Stroma 2.97 (1.20–7.32) 0.02 The surroundings of the tumour

4.17 (1.12–15.47) 0.03

The intensity of lymphocytic infiltrate Absent or mild 1 – Moderate 2.08 (0.85–5.09) 0.11 Pronounced 3.04 (1.22–7.58) 0.02

Solitary dermal melanocytes or their small clusters separated from the tumour

Absent 1 –

Present 0.38 (0.16–0.91) 0.03

Distribution of dermal melanocytes Single cells 1 – Nests 0.27 (0.05–1.37) 0.11 Confluent nests 2.68 (1.19–6.07) 0.18 Diffuse 8.68 (3.29–22.93) >0.001

Irregular borders of melanocytic skin tumour (R2 = 0.27)

The amount of dermal melanophages Absent or several 1 – In moderate numbers

1.13 (0.49–2.58) 0.78

Abundant 5.14 (1.61–16.50) 0.006 Solitary dermal melanocytes or their small clusters separated from the tumour

Absent 1 –

Present 3.16 (1.18–8.46) 0.02

Distribution of dermal melanocytes Single cells 1 – Nests 0.27 (0.06–1.15) 0.08 Confluent nests 0.23 (0.08–0.66) 0.006 Diffuse 0.25 (0.09–0.72) 0.01

OR – odds ratio adjusted according to age, CI – confidence interval, p – significance level, statistically significant when p≤0.05; R2 – determination coefficient of logistic regression.

132

None of the examined histological characteristics of melanocytic skin tumours had any relationship with the margin between the tumour and adjacent tissues on ultrasonography.

4.3. The significance of immunohistochemical markers (S100 and a combination of HMB-45, Melan-A and tyrosinase) for the estimation of the thickness and morphological features of melanocytic skin tumours,

in comparison with conventional HE staining We found a strong correlation between the results of BD (HE) and BD

(S100), BD (HE) and BD (comb) as well as between BD (S100) and BD (comb), respectively – 0.93 (p<0.001), 0.89 (p<0.001) and 0.95 (p<0.001). The quantitative characteristics of melanocytic skin tumour depth (n = 107) measured in histological samples stained with HE, S100 and a combination of immunohistochemical markers are shown in Table 4.3.1.

Table 4.3.1. Quantitative characteristics of melanocytic skin tumour depth (n = 107) measured in histological samples stained with HE, S100 marker and a combination of immunohistochemical markers

Depth (mm) Median (interquartile range Q1–Q3) CM (n = 20) MN (n = 87) In total (n = 107)

pBD (HE) 1.33 (0.88–1.65) 0.70 (0.45–1.04) 0.81 (0.50–1.25) pBD (S100) 1.32 (0.94–1.56) 0.70 (0.48–1.10) 0.82 (0.51–1.38) pBD (comb) 1.28 (0.89–1.59) 0.69 (0.47–1.08) 0.82 (0.50–1.32)

CM – cutaneous melanoma; MN – melanocytic nevus; pBD – Breslow depth; n – number of cases; Q1 – first quartile; Q3 – third quartile; HE – hematoxylin-eosine.

The Bland-Altman plots revealed the mean differences of BD (HE) in reference with BD (S100) and BD (comb) to be -0.045 mm (95% CI -0.09 to 0.00 mm) and -0.028 mm (95% CI -0.087 to 0.029), respectively. If the difference between BD (HE) and BD (S100) or BD (comb) was <0.1 mm complete agreement between BD values was recorded. MST thickness determined in 38% (41/107) samples stained with each IHC method was higher (≥0.1 mm) than BD (HE) values. In 33.6% and 31.8% of cases of BD (S100) and, accordingly BD (comb), complete agreement with BD (HE) was recorded (Table 4.3.2).

133

Table 4.3.2. Distribution of the depth measured in histological samples stained with S100 marker and a combination of immunohistochemical markers (with an accuracy of 0.1 mm), comparing with HE staining

Depth groups CM, n (%)

*p MN, n (%)

**p In total, %

***p

Estimation of pBD in samples stained with HE and S100 marker pBD (HE) < BD (S100) 6 (30.0)

0.82 35 (39.5)

0.27 41 (38.3)

0,43 pBD (HE) = BD (S100) 6 (30.0) 30 (34.9) 36 (33.6) pBD (HE) > BD (S100) 8 (40.0) 22 (25.6) 30 (28.1) Estimation of pBD in samples stained with HE and a combination of IHC markers pBD (HE) < BD (comb) 5 (25.0)

0.52 36 (41,8)

0.25 41 (38.3)

0.48 pBD (HE) = BD (comb) 9 (45.0) 25 (29,0) 34 (31.8) pBD (HE) > BD (comb) 6 (30.0) 26 (29,2) 32 (29.9)

CM – cutaneous melanoma; MN – melanocytic nevus; IHC – immunohistochemical; *p – the significance level in CM groups; **p – the significance level in MN groups; ***p – the significance level in MST groups; pBD – Breslow depth; n – number of cases; meanings of the symbols: (<) lower measurment value, complete agreement between the values (=), higher measurement value (>).

The difference between BD (HE) and BD (S100) or BD (HE) and BD (comb) was significantly associated only with the periadnexal extension of melanocytes – correspondingly, OR= 5.13 and OR=5.27, compared with the complete agreement of BD values (Table 4.3.3, 4.3.4).

Table 4.3.3. Associations between the depth dissagreement measured in histological samples stained with HE and S100 marker and morphological characteristics of melanocytic skin tumours, in comparison with the complete agreement


OR (95% CI) p value


Absent 1 Stroma 1.38 (0.18–10.44) 0.76 The surroundings of the tumour

0.82 (0.14–2.34) 0.27


Absent or mild 1 Moderate 1.77 (0.35–8.97) 0.49 Pronounced 0.72 (0.11–4.88) 0.73


Absent or several 1 In moderate numbers 1.77 (0.46–6.80) 0.49 Abundant 0.73 (0.10–4.86) 0.73

134

Table 4.3.3. Continued Morphological characteristics of melanocytic skin tumours

OR (95% CI) p value


Absent 1 Present 5.13 (1.55–16.0) 0.007


Absent 1

Present 1.45 (0.40–5.29) 0.57


Table 4.3.4. Associations between the depth dissagreement measured in histological samples stained with HE and a combination of immunohisto-chemical markers and morphological characteristics of melanocytic skin tumours, in comparison with the complete agreement


OR (95% CI) p value


Absent 1 Stroma 1.21 (0.14–11) 0.86 The surroundings of the tumour

0.52 (0.13–2.09) 0.36


Absent or mild 1 Moderate 1.36 (0.29–6.42) 0.70 Pronounced 1.36 (0.29–6.42) 0.70


Absent or several 1 In moderate numbers 2.45 (0.75–7.98) 0.14 Abundant 0.64 (0.14–2.88) 0.57


Absent 1 Present 5.27 (1.72–16.19) 0.004


Absent 1

Present 1.37 (0.40–4.63) 0.62


135

CONCLUSIONS

1. A strong relationship was detected between the results of manual and automatic measurements of melanocytic skin tumour depth by applying high frequency ultrasound (22 MHz) and histological examination. Exceptions were cases with periadnexal extension of melanocytes in histological sample of the tumour. In such cases, there was a higher probability that the depth of the melanocytic skin tumour measured by ultrasound would be lesser than that evaluated histologically.

2. We identified the following ultrasonic features depending on the histological structure of melanocytic skin tumors: • On ultrasonography, cutaneous melanoma by several times more

frequently had a homogeneous structure and irregular borders, compared to melanocytic nevi.

• Melanocytic skin tumours more frequently had homogeneous that non-homogeneous structure on ultrasonography when a pronoun-ced lymphocytic infiltrate was detected in the histological sample of the tumour and/or when melanocytes were diffusely distributed in the dermis.

• The tumour borders on ultrasonography were more frequently irregular than regular when the histological examination of the tumour sample revealed abundant amount of melanophages in the dermis and solitary dermal melanocytes or their small clusters separated from the tumour.

• None of the examined histological characteristics of melanocytic skin tumours had any relationship with the margin between the tumour and adjacent tissues on ultrasonography.

3. Imaging of the morphological structure or measurements of tumour thickness did not benefit from the use of either one or several immunohistochemical markers, except for cases where periadnexal extension of melanocytes were seen in the histological sample.

PRACTICAL RECOMMENDATIONS Based on the results of the study and their comparison with data obtain-

ned by other authors, we present the following practical recommenddations: 1. Ultrasound transducers of different frequencies should be selected

depending on the depth of cutaneous melanoma. When evaluating ≥1 mm cutaneous melanoma, the frequency of 20–30 MHz is most

136

effective, whereas the evaluation of thin (<1 mm) cutaneous melanoma requires higher frequency (50–100 MHz) ultrasound.

2. A strong relationship was detected between the tumour depth evaluated on high frequency (22 MHz) ultrasonography and the depth measured in a histological sample, and thus ultrasonography helps in the reliable selection of patients with clinically and dermatoscopically diagnosed cutaneous melanoma for surgery with sentinel lymph node biopsy.

3. The sensitivity and specificity of the automatic ultrasound examination software in the evaluation of melanocytic skin tumour thickness (≥1 mm) was, accordingly, 90% and 60%. For this reason, the auto-matic software for the evaluation of melanocytic skin tumour thickness developed by the author of this study and her co-authors might be a commercially available tool for use in clinical practice by less experien-ced examiners.

4. High frequency ultrasound as a supplementary tool may be used in the differentiation of cutaneous melanoma from melanocytic nevi based on the tumour borders and structure.

5. Morphological characteristics of melanocytic skin tumours, such as the intensity and predominant location of lymphocytic infiltrate, distribu-tion of dermal melanocytes and the amount of dermal melanophages, and solitary melanocytes or their small clusters separated from the tumour, could be used in the development of an automatic ultrasound algorithm for the differential diagnostics of tumours.

6. When cutaneous melanoma is surrounded by a pronounced lymphocytic infiltrate and abundant melanophages, reactions of immunohistoche-mical markers are superior to hematoxylin-eosine-stained samples in highlighting solitary melanocytes or their small clusters separated from the tumour in the dermis and periadnexal extension of melanocytes. In such cases, we recommend measuring the depth of cutaneous melanoma in histological samples stained with S100 marker or a combination of immunohistochemical markers.

137

PRIEDAI

1 priedas

138

139

2 priedas

140

3 priedas

ASMENS INFORMAVIMO FORMA

Gerbiamas Paciente, Maloniai kviečiame Jus dalyvauti tyrime „Neinvazinių tyrimų reikšmė odos navikų

diagnostikai“. Tyrimą vykdo Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Odos ir venerinių ligų klinika, Patologinės anatomijos klinika, Plastinės ir rekonstrukcinės chirurgijos klinika ir Kauno technologijos universiteto Prof. K. Baršausko ultragarso mokslo institutas. Šiam tyrimui pritaria Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komitetas.

Tyrimo tikslas. Įvertinti ultragarso tyrimų reikšmę melanomos ir kitų melanocitų

kilmės navikų diagnostikai. Tyrimo aktualumas. Paskutiniaisiais metais Lietuvoje dvigubai išaugo sergamumas

piktybiniais odos navikais. Taip pat du kartus padidėjo sergamumas odos melanoma ir mirtingumas nuo jos dėl pavėluotos diagnostikos. Atsižvelgiant į tai, vykdome šį tyrimą, kuriuo siekiama pagerinti piktybinių odos navikų diagnostiką.

Tyrimo dalyviai. Į tyrimą kviečiame dalyvauti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

ligoninės Kauno klinikų Odos ir venerinių ligų klinikos 18 metų ir vyresnius pacientus, kuriems bus operuojamas pigmentinis apgamas ar melanoma. Tyrime galite dalyvauti, jei Jūs nedalyvaujate kitame klinikiniame tyrime, esate draustas privalomuoju sveikatos draudimu, raštu patvirtinę sutikimą dalyvauti tyrime, suprantantys jo eigą bei nesantys administracinio ar teisminio tyrimo subjektai. Tyrime negali dalyvauti pacientai, alergiški ultragarsinio tyrimo metu naudojamam geliui; pacientai, kuriems greta odos naviko atlikta kosmetologinė ar chirurginė procedūra, operacija, taikytas gydymas rentgeno spinduliais ar vietiniais vaistais.

Tyrimo eiga. Pirmojo tyrimo etapo metu gydytojas dermatovenerologas Jums ištirs

odos naviką skaitmeniniu dermatoskopu ir ultragarsu. Išpjautas odos navikas bus tiriamas standartiniais histologiniais tyrimais. Per tyrimą Jūsų bus prašoma patogiu laiku atvykti kontrolei. Kol bus gauti ir pateikti Jums galutiniai tyrimo rezultatai, tyrimas gali užtrukti iki 3–4 savaičių.

Antrame tyrimo etape yra numatyta Jūsų odos naviko biopsinę medžiagą pagilintai ištirti ultragarso mikroskopu, jei Jūs savo sutikimą patvirtinsite parašu. Tokiu atveju Jūsų biopsinė medžiaga bus tyrėjų saugiai nugabenta į Kauno technologijos universiteto Ultragarso instituto laboratoriją. Po tyrimo ji bus parvežta atgal į Patologinės anatomijos kliniką pagilintai imunohistocheminių žymenų diagnostikai. Šie tyrimai, lyginant su standartiniu histologiniu tyrimu, nustato tiksliau odos naviko storį ir pakitusių (navikinių) lastelių aktyvumą. Tai ypač svarbu įvertinti melanomos atveju.

Tyrimo nutraukimas. Dalyvaudamas tyrime Jūs bet kuriuo metu galėsite nutraukti

dalyvavimą jame, nenurodydamas savo apsisprendimo priežasties. Jei nuspręsite nedalyvauti tyrime, prašome informuoti apie tai tyrėją, kad Jūs būtumėte apžiūrėtas ir supažindintas su tyrimo rezultatais. Tyrimo eigoje gydytojas ar gydymo įstaigos vadovas bet kuriuo metu gali nuspręsti nutraukti tyrimą be tiriamojo sutikimo, jeigu, jų manymu, toks sprendimas yra pagrįstas.

141

Tyrimo nauda. Jums bus atlikti neskausmingi, išorinio poveikio (neinvaziniai) tyrimai, kurie pagerins tiriamo odos naviko diagnostiką. Sukaupti bei apibendrinti tyrimo duomenys bus naudingi medikams ir moksline prasme.

Su tyrimu susiję nepatogumai ir galima žala. Tyrimo dalyviai žalos nepatirs, nes bus

atliekami tik neinvaziniai tyrimai, reikalingi odos naviko diagnozės tikslinimui pacientams, kurie patys atvyksta į kliniką tirtis ir (ar) gydytis odos navikus. Pagrindiniai planuojamo tyrimo nepatogumai tiriamiesiems – papildomai sugaištas laikas.

Kompensacija už dalyvavimą tyrime. Finansinė kompensacija už sugaištą laiką ir

patirtas kelionės išlaidas nebus teikiama. Konfidencialumas. Tyrimo rezultatai bus apibendrinti anonimiškai, be tiriamųjų

pavardžių. Prieš tyrimą Jums bus suteiktas kodas, pagal kurį bus galima identifikuoti Jūsų vardą, pavardę, kontaktinį adresą ir telefoną, kad prireikus Jus būtų galima pakviesti pakartotinai konsultacijai. Visi Jūsų asmens duomenys bus konfidencialūs ir saugomi pagal Lietuvos Respublikos Biomedicininių tyrimų etikos įstatymo 9 – ą straipsnį.

Tiriamojo teisės. Dalyvavimas tyrime yra savanoriškas. Jūs bet kuriuo tyrimo etapu

galite atsisakyti dalyvauti tolesniame tyrime, neprivalėdamas nurodyti savo sprendimo priežasties. Nusprendus nebedalyvauti tyrime, reikėtų apie savo sprendimą kuo greičiau informuoti tyrėją, kad šis galėtų imtis reikiamų priemonių, jei tik tokių reikia, Jūsų sveikatos saugumui užtikrinti.

Papildoma su tyrimu susijusi informacija. Dėl papildomos informacijos ir iškilusių klausimų prašome kreiptis į tyrėją ........................................................................., Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Odos ir venerinių ligų klinika, Eivenių g. 2, LT-50009, tel.: ......................................... Nuoširdžiai Jums dėkojame, kad perskaitėte pateiktą informaciją ir sutinkate dalyvauti šiame tyrime. Dėl klausimų, susijusių su tyrimu prašome kreiptis į: Pagrindinis tyrėjas Prof. dr. Skaidra Valiukevičienė Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Odos ir venerinių ligų klinika Eivenių g. 2, LT-50009 Kaunas Tel./faks.: 8 37 326246 El. paštas: [email protected] Dėl etinių klausimų, susijusių su tyrimu, prašome kreiptis į: Kauno regioninis biomedicininių tyrimų etikos komitetas Eivenių g. 2, LT-50009 Kaunas Tel. 8 37 326889 El. pastas: [email protected]

142

4 priedas

143

CURRICULUM VITAE

Name, surname: Gintarė Linkevičiūtė Address: Department of Skin and Venereal Diseases of the Medical Academy

of the Lithuanian University of Health Sciences, Eiveniu 2, LT-50161 Kaunas, Lithuania.

Mobile phone +370 657 82824 Work phone: +370 37 326026 E-mail: [email protected]

Medical education:

2001–2007 Studies at the Faculty of Medicine, Medical Academy, the Lithuanian University of Health Sciences (former Kaunas University of Medicine)

2007–2008 Primary internship at Alytus S. Kudirkos hospital 2008–2013 Residency in dermatovenereology at the Lithuanian University of

Health Sciences, Medical Academy, Department of Skin and Venereal Diseases

2013–2018 Doctoral studies at the Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Department of Skin and Venereal Diseases

Work experience:

Since 2013 Assistant at the Department of Skin and Venereal Diseases, the Lithuanian University of Health Sciences

Since 2013 Dermatovenereologist at the Department of Skin and Venereal Diseases, the Hospital of the Lithuanian University of Health Sciences

Since 2014 Junior researcher at the Lithuanian University of Health Sciences Department of Skin and Venereal Diseases (performing of the investigations, international, nacional and regional scientific projects)

Membership at professional societies:

Kaunas Region Society of Dermatovenereology, European Academy of Dermatology and Venereology

Projects:

2009–2013 Eurostars Skinmonitor international project. 2012–2014 FP7 Skindetector international project. 2014 04–2014 12 United LSMU–KTU regional project Skintech. 2015 04–2015 12 United LSMU–KTU regional project Skintech Soft. 2016 04–2016 12 United LSMU–KTU regional project Image Fusion. Since 2017 National project of Research Council of Lithuania: Skin Image Fusion.

144

PADĖKA

Dėkoju daugybei puikių žmonių vienaip ar kitaip padėjusiems šiame darbe. Esu labai dėkinga visiems už bendradarbiavimą, patarimus ir palai-kymą. Taip pat ir už sunkumus, kurie irgi įkvėpė, suteikė galimybę kurti, stiprino ir be kurių šis darbas nebūtų toks koks yra dabar.

Ypatingai dėkoju savo mokslinei vadovei profesorei daktarei Skaidrai Valiukevičienei už įkvėpimą, tikėjimą, pasitikėjimą manimi, skatinimą tobulėti, už mokslines idėjas, visokeriopą pagalbą, suteiktas žinias ir pata-rimus.

Dėkoju Odos ir venerinių ligų klinikos kolektyvui už pagalbą ir pata-rimus. Džiaugiuosi galėdama dirbti ir tobulėti kartu su jumis.

Dėkoju Patologinės anatomijos klinikos kolektyvui už sklandų bendra-darbiavimą atliekant histologinius ir imunohistocheminius tyrimus. Nuo-širdžiai dėkoju docentei daktarei Jurgitai Makštienei už patarimus ir visokeriopą pagalbą.

Dėkoju kolegoms iš KTU Ultragarso instituto – Mokslų daktarei Kristi-nai Sakalauskienei ir profesoriui daktarui Renaldui Raišučiui už mokslines idėjas, nuoširdų bendradarbiavimą ir visokeriopą pagalbą.

Dėkoju LSMU Informacinių technologijų centro darbuotojai Eglei Šepe-tauskienei, už jos vertingus patarimus, konsultacijas, galimybę dirbti kartu.

Dėkoju LSMU Mokslo fondui už suteiktą finansavimą imunohisto-cheminių žymenų ir reagentų įsigijimui, vykdant jungtinį LSMU–KTU projektą SkinTech „Aukšto dažnio ultragarso ir informacinių technologijų reikšmė melanocitų kilmės odos navikų diagnostikai“.

Dėkoju visiems pacientams, be kurių šis darbas būtų neišvydęs dienos šviesos. Te šis darbas teikia visokeriopai geriausią naudą, kokią tik gali suteikti gydant žmones, susidūrusius su šia sudėtinga patologija.

Dėkoju savo šeimai, visiems artimiesiems ir draugams už palaikymą, įkvėpimą ir pagalbą.

Dėkoju savo dukrelei Vakarei ir Gediminui, už kasdienę šilumą, meilę ir kantrybę.

Dėkoju savo mamytei Rimai Linkevičienei, jos ugdymo ir pavyzdžio dėka esu tai kas esu. Dėkoju už jos tikėjimą mano pasirinkimu, už palai-kymą ir pagalbą įveikiant iškilusias kliūtis ir stiprybę, kurios semiuosi iš jos gyvenimo pavyzdžio.

Dėkoju Jums už viską!

Documents

AUKŠTO DAŽNIO ULTRAGARSO TYRIMO IR IMUNOHISTOCHEMINIŲ