Bckhoa Luan(Tien)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

KHOA LÂM HỌC

----------------***------------------

BÁO CÁO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên khóa luận :

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

BACILLUS THURINGIENSIS CÓ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔN

TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG

NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 307

Giáo viên hướng dẫn : Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng

: Ths. Hồ Văn Giảng

Sinh viên thực hiện : Trần Văn Tiến

Khóa học : 2006 - 2010

Hà Nội, năm 2010

1

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ

môn Giống và Công nghệ Sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm

nghiệp đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện

khóa luận này.

T ôi xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp đã

giảng dạy cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc để có thể tiếp thu tốt

hơn những kiến thức khoa học mới và tạo cho tôi cơ hội học hỏi quý giá này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Hồ Văn Giảng đã đóng góp ý kiến quý giá

cho tôi để có thể hoàn thành bản báo cáo Khóa luận một cách tốt nhất( CHỖ

NÀY CÓ CHO VÀO KHÔNG CÔ).

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gứi tới toàn thể các thầy, cô và các anh,

chị trong Bộ môn Giống và Công nghệ Sinh học, gia đình, bạn bè, những

người đã giúp đỡ, dạy và động viên tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Sinh viên

Trần Văn Tiến

2

MỤC LỤC

3

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

STTKí hiệu

bảngTên bảng

Trang

1 Bảng 1.1Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng

2 Bảng 1.2Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm

3 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bt

4 Bảng 2.1 Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng

5 Bảng 2.2Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trường

ĐHLN

6 Bảng 3.1 Bt phân lập được từ các mẫu sâu

7 Bảng 3.2 Bt phân lập được từ các mẫu đất

8 Bảng 3.3Hình dạng, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các

chủng Bt

9 Bảng 3.4Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của các chủng

Bt

10 Bảng 3.5Số lượng bào tử/ml dịch lên men (thu hồi sau 60h lên

men)

11 Bảng 3.6Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu chết

bởi chế phẩm Bt

12 Bảng 3.7Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá cải bắp và su hào chết bởi

chế phẩm Bt

13 Bảng 3.8 Kết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập

4

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu viết tắt Giải thích

1 Bt Bacillus thuringiensis

2 G6 Hội trường G6

3 T5 Nhà thực hành T5

4 KTX Ký túc xá

5 KHV Kính hiển vi

6 Đk Đường kính

7 ĐC Đối chứng

8 h Giờ

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHÓA LUẬN

5

STTKí hiệu

hìnhTên hình Trang

1 Hình 1.1 Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

2Hình 1.2

Quá trình xâm nhập và gây độc của Bt

3 Hình 2.1 Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt

4 Hình 2.2 Hình ảnh về sâu thử hoạt tính

5 Hình 3.1 Một số hình ảnh trong quá trình phân lập Bt

6 Hình 3.2 Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc các chủng Bt

7 Hình 3.3Hình ảnh về hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa

hấu

8 Hình 3.4 Hình ảnh về hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào

ĐẶT VẤN ĐỀ

6

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, không khí với độ ẩm cao là điều

kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Khi muốn

bảo vệ năng suất cây trồng, theo thói quen, người nông dân thường sử dụng

thuốc hoá học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát.

Đối với cây lâm nghiệp, mỗi khi dịch xuất hiện ở vườn ươm, các cánh rừng

trồng thì số lượng hoá chất phải dùng là rất lớn. Trung bình mỗi ha cây trồng

phải phun từ 5 – 7 kg thuốc. Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòi

hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên

cứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịch

nhanh nhưng cũng là con dao hai lưỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi trường sống ở

khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người, làm

giảm số lượng sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những ký

sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…

Tác hại của việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã rất rõ ràng. Trong khi

đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus,

côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc,

không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật

có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông,

lâm sản...

Trong khi đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ

Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu

sinh học) vẫn chưa phổ biến. Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừ

sâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức người nông dân nước ta; thuốc trừ sâu sinh

học sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp; thuốc trừ

sâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá

học vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanh

hơn…

Bởi những lý do đó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựa

chọn hàng đầu của người nông dân khi muốn dập tắt nạn dịch sâu hại. Để đạt

7

được lợi ích kinh tế trước mắt, người nông dân thường sử dụng thuốc trừ sâu

hoá học. Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung và thuốc

trừ sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt nói riêng đến với người nông dân, thì việc

phổ biến nâng cao tầm nhận thức của người dân về thuốc trừ sâu sinh học kết

hợp với việc các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất được nhiều hơn các loại

thuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ là rất quan trọng.

Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật

giữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản phẩm

nên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quan

trọng. Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,

ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụng

thuốc trừ sâu Bt trong nông – lâm nghiệp.

Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập và lựa chọn các chủng Bacillus

thuringiensis có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn, tôi tiến hành

khoá luận “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có

hoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng”

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

8

1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) ra đời và

phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật của nhân loại, Bt được

nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau [21],[2].

Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật - khi đang

thực hiện một cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto gây chết

đột ngột, giết chết nhiều quần thể tằm, đã phân lập được một loại vi khuẩn

(chính là Bacillus thuringiensis) là nguyên nhân gây bệnh, và ông đã đặt tên

loại vi khuẩn đó là Bacillus sotto. Đây chính là lần đầu tiên con người phát hiện

ra vi khuẩn Bt.

Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức - đã phân lập

được vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour. Ông phát hiện ra đây chính là

loài vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, và đặt tên lại cho loài vi

khuẩn này là Bacillus thurigiensis (hay Bt), xuất phát từ địa danh Thurigia là

một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó.

Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố có

bản chất là protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính là

nguyên nhân khiến các con mối bị giết hại. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt

động của loại protein này vẫn chưa được khám phá.

Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước phát

triển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho cây trồng như một loại

thuốc phòng trừ sâu bệnh. Đặc biệt là nước Pháp, đã sớm bắt đầu chế tạo các

loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt, gọi là Sporine.

Năm 1956, Hannay, Fitz-James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra

tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân

tử protein được sản sinh trong cơ thể vi khuẩn Bt, từ đó mở ra hướng nghiên

cứu mới của các nhà khoa học về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt.

Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu

được sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt được đánh giá là

9

một loại thuốc trừ sâu thân thiện với con người và môi trường trong chiến lược

phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ môi trường EPA (Environmental

Protection Agency) của Mỹ. Năm 1977, đã có 13 loài vi khuẩn Bt được phát

hiện và công bố. Các nghiên cứu và khám phá về phổ kháng của Bt cho thấy Bt

không chỉ gây độc duy nhất với một giai đoạn nhất định của các con ấu trùng

của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh cứng.

Từ năm 1980 trở đi, ý thức của con người với vấn đề môi trường sống

tăng cao, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả các

loại cực độc như DDT và 666 … ngày càng gia tăng. Đồng thời, con người

cũng phát hiện được lượng tồn dư các hoá chất phòng trừ sâu hại được tích luỹ

và gia tăng dần trong môi trường sống gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới hệ sinh

thái và sức khoẻ con người. Để giải quyết những vấn đề đó, các chế phẩm

thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thể

độc do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh

chóng trong môi trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi ...

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 1000 sự biến dạng của

độc tố trong cơ thể Bt. Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng của sinh học

phân tử giúp các nhà khoa học ứng dụng công nghệ GMO (Genetically Modifie

Organisms) trong chuyển gen điều khiển sự sản sinh độc tố của Bt vào cơ thể

của cây trồng, giúp cây trồng chuyển gen có thể tiết độc tố diệt sâu ăn lá hoặc

đục thân. Ngô và lúa là hai giống cây trồng đầu tiên được chuyển gen Bt do tổ

chức EPA của Mỹ thực hiện năm 1995. Cho tới hiện nay, công nghệ GMO

chuyển gen kháng sâu đã ứng dụng thành công cho nhiều loại cây trồng khác

như: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu... [8],[2].

1.2. Đại cương về vi khuẩn Bacillus thurigiensis

1.2.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensis là vi khuẩn đất, gram (+), hô hấp hiếu khí hoặc

hiếu khí không bắt buộc. Tế bào hình que, kích thước khoảng 3 - 6µm, có tiêm

mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thành

chuỗi.

10

Bacillus thurigiensis có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc. Bào tử

hình trứng với kích thước khoảng 1,5 – 2 µm. Tinh thể độc có kích thước

khoảng 0,6 x 0,02 µm và có nhiều hình dạng như hình ô van, hình lập phương,

hình sao, hình trứng, hình kim ... Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử

và thể vùi được giải phóng (xem Hình 1.1) . Giống như bào tử của các loại vi

khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử của Bt rất bền, có khả năng kháng lại

nhiệt, bức xạ, hoá chất cao. Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bào

sinh dưỡng của Bt dưới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang học [1], [7].

1.2.2. Đặc tính sinh hóa của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensiss sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 – 30oC, pH 6,8 -

7,2. Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hoá thành phần đường của

môi trường thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất này lại được

cơ thể sử dụng tiếp. Do đó pH của môi trường lúc đầu thì tăng (pha logarit), về

sau thì giảm. Khả năng sinh bào tử của Bacillus thurigiensis phụ thuộc vào

nhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu tố dinh dưỡng. Vi khuẩn có khả năng nitrit

hoá, không có khả năng lên men đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triển

yếu trong môi trường kị khí [7],[3].

Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3. Các độc tố của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensiss có khả năng tạo 4 loại độc tố:

+ Ngoại độc tố α (α - exotoxin)

11

+ Ngoại độc tố β ( β - exotoxin)

+ Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin)

+ Nội độc tố δ (δ - exotoxin)

Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại

côn trùng và được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốc

sâu không độc hại với môi trường, con người và động vật [6],[2].

1.2.3.1. Ngoại độc tố α

Ngoại độc tố α được phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn

Bacillus thurigiensis vanenlesti bởi C. Toumaroff. Ngoại độc tố α còn gọi là

enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc

phospholipit của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập

vào các xoang trong cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme Leucintinase đã trực

tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột.

Ngoại độc tố α có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt trong nước, hoạt

động ở pH 6,6 – 7,2 và không bền nhiệt nên còn được gọi là ngoại độc tố không

bền nhiệt, tác động đặc hiệu đến các loài như: ong cắn lá, sâu thuộc bộ cánh

cứng, cánh vẩy ...[5], [9].

1.2.3.2. Ngoại độc tố β

Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thức

ăn chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi xử lý ở

120oC trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Cơ chế tác động của ngoại độc tố

β là cạnh tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt

động của enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein.

Mặt khác, khi ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiến

côn trùng chết nhanh chóng.

Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai

cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non. Ngoại độc tố β gây

cản trở sự lột xác của côn trùng. Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β còn

tiêu diệt cả trứng côn trùng [7].

1.2.3.3. Ngoại độc tố γ

12

Ngoại độc tố γ là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn

và một số axit amin tự do. Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không

khí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ chế

tác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [10].

1.2.3.4. Nội độc tố δ

Nội độc tố δ được hình thành trong khoảng 3h của pha cân bằng. Tinh

thể này bền nhiệt (tới 80oC), không tan trong nước, dung môi hữu cơ nhưng tan

tốt trong môi trường có pH kiềm. Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một hoặc hai tinh

thể độc. Khối lượng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lượng tế bào mang nó.

δ – exotoxin còn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinh

thể cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kị

nước. Về bản chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đó

chủ yếu gồm các loại như glutmic, asparaginic những axit amin này chịu trách

nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể. Cystein tuy chiếm tỷ lệ

thấp hơn nhưng nó góp phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể,

làm tinh thể không có khả năng hoà tan. Ngoài ra, trong tinh thể còn tạp lẫn

một số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6%. Về thành phần nguyên tố, toxin

chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm

tỷ lệ nhỏ hơn. Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ rất nhỏ, còn P hầu như không

có [11],[13],[2].

1.2.4. Tính đa dạng của Bt.

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại được một số lượng

lớn các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:

- Khả năng hình thành enzyme leucitinase.

- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc.

- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H).

- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết

thanh.

Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến. Theo

phương pháp này, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn người ta đã chia các

13

chủng Bt đã phân lập được ra làm 63 loài phụ (subspecies) [14],[3],[2] . Một số

type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng (xem Bảng 1.1).

Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng

Type huyết

thanh

Chủng đại

diện

Viết tắt Người nghiên cứu

1 B. thuringiensis THU Bliner (1915), Heimpel&

Angus (1958)

3a, 3b B. kurstaki KUR De Barjac & Lemill (1970)

4a, 4b B. sotto SOT Ishiwata (1905); Heimpel

& Angus (1958)

5a, 5b B. candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972)

8b, 8d B. nigeriensis NIG Weiser and prasertphon

(1984)

14 B. israelensis ISR De Barjac & Cs (1992)

30 B. medellin MED Orduz & Cs (1992)

33 B. leesis LEE Lee & Cs (1944)

46 B. chanpaisis CHA Chainpaisang (1994)

48 B. balearica BAL Iriate Garcia (1995)

49 B. muju MUJ Park (1995)

50 B. navarrersis NAV Iriate Garcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen, các nhà khoa học

đã giải mã được hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc. Từ cơ sở đó, một

phương pháp phân loại khác đã được đưa ra: phương pháp phân loại dựa vào

lớp gen Cry. Với phương pháp này, các nhà khoa học đã đưa ra 20 lớp gen với

các đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác nhau.

1.3. Các yếu tố hình thành tinh thể độc

14

Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi

khuẩn Bacillus thurigiensis như: nhiệt độ, nguồn C, N, P ... Điều kiện tối ưu

cho Bt sinh trưởng là 28 – 30oC. Nếu nhiệt độ là 15oC thì bào tử không hình

thành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể. Nguồn dinh dưỡng C, N,

P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc. Một số acid amin như

leucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lượng

tinh thể độc. Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình

thành bào tử, tinh thể độc. Các chủng đột biến mất khả năng sinh protease

ngoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15], [16].

1.4. Cơ chế tác động của tinh thể độc lên côn trùng

1.4.1. Quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào

biểu mô ruột giữa của côn trùng ở pH kiềm. Tinh thể tan vào môi trường kiềm

của ruột giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease.

Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ

60 kDa bền với protease. Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưa

bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc với côn trùng gọi là “protoxin" .

còn lõi 60 kDa gây độc vời côn trùng gọi là “toxin”. Quá trình biến đổi từ tinh

thể độc protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể độc.

Quá trình hoạt hoá tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liên

quan tới sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc. Giai đoạn này diễn ra do sự cắt

đứt các liên kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trường bởi các

nhân tố khử disulfua. Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin. Năm

1990 Choma và cs báo cáo rằng để biến phân tử protoxin CryIAc 135 kDa

thành lõi toxin 60 kDa phải trải qua bảy bước mà ở mỗi bước phân tử protoxin

sẽ bị mất đi một mảnh khoảng 10 kDa, trong quá trình này sự cắt bỏ diễn ra

không theo một trật tự nào. Tuy nhiên, đến nay cơ chế của sự cắt bỏ để biến

protoxin 135 kDa thành toxin 60 kDa vẫn chưa được làm sáng tỏ, và các nhà

khoa học vẫn chưa xác định được protoxin bị cắt từ cả hai đầu C và N hay bị

cắt tuần tự từ đầu C [17],[3].

15

1.4.2. Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng

Những nghiên cứu về hình thái sau khi bị chết bởi Bt của côn trùng cho

thấy ruột của côn trùng bị tổn thương. Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng trên

các tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của

ruột. Có ba mô hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin như sau:

- Mô hình 1, thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấu

keo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố. Khi độc

tố liên kết với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ. Phức hệ này

tạo nên một lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của

nhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng của

ruột [10], [14].

- Mô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất

cao đối với ion K+. Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển

axit amin phụ thuộc K+ bị ức chế bởi độc tố tinh thể. Cụ thể, những lỗ này dễ

cho K+ đi vào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận

chuyển amino axit trong cơ thể sâu [14], [17].

- Mô hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của tế

bào biểu mô ruột. Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K + tràn

vào không giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [19].

1.4.3. Tác động chọn lọc của độc tố Bt lên côn trùng

Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thể

độc sau khi xâm nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì

phải được hoạt hoá thành toxin và toxin phải gắn được lên tế bào biểu mô ruột.

Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và

hệ enzyme. Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc không giải phóng ra

protoxin. Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme không phù hợp

thì toxin cũng không được tạo ra. Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạt

hoá thành toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu

mô ruột, độc tố vô tác dụng. Ví dụ: sâu xám hại rau có pH ruột là 9,5 và có khả

năng hoạt hoá tinh thể độc nhưng không bị tiêu diệt, chúng hoàn toàn khoẻ

16

mạnh khi được nuôi với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì trên màng ruột của chúng

không chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [12]. Hình ảnh về quá trình

xâm nhập và gây độc của Bt( xem Hình 1.2).

Hình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độc của

Bt

1.5. Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu Bt

* Ưu điểm

- Không gây độc hại cho người và các động vật máu nóng vì pH đường

ruột của các đối tường này thấp không thể hoạt hoá được tinh thể độc.

- Tác động lên côn trùng một cách chọn lọc nên trong nhiều trường hợp

người ta có thể sử dụng những chủng Bt xác định để tiêu diệt côn trùng đích mà

không ảnh hưởng đến côn trùng vô hại khác.

- Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoá

học. Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lượng nông sản [21], [4].

* Nhược điểm

- Chế phẩm Bt không có khả năng diệt côn trùng bên trong thực vật

(thân, rễ...)

- Độc tố Bt lắng đọng nhanh trong nước và dễ dàng bị hấp thụ bởi các

hoạt chất hoá học làm cho lượng độc tố đến được côn trùng giảm đi.

17

- Khi độc tố rơi xuống đất dễ bị vi sinh vật phân giải; trong điều kiện bị

chiếu sáng và dưới tác động của một số nhân tố môi trường khác độc tố Bt rất

dễ bị mất hoạt tính.

- Hiệu quả chưa thật cao do diễn biến chậm khi gặp điều kiện thời tiết bất

lợi thì khó đạt kết quả tốt.

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quan ngắn thưòng từ 1

– 2 năm ở điều kiện lạnh khô.

- Giá thành cao [1], [2],[3].

1.6. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Bt đến con người, động vật và thực vật

1.6.1. Ảnh hưởng của Bt đến sức khoẻ con người

Khi các chế phẩm Bt được ra đời và ứng dụng rộng rãi, nảy sinh cho con

người một mối lo ngại do khi sử dụng Bt phần lớn sử dụng bình xịt thuốc hoặc

vãi, vì thế mà Bt dễ dàng tiếp xúc với da của người nông dân, giả thiết đặt ra là

người người phun một lượng thuốc đáng kể có thể gây ngộ độc. Ngoài ra còn

có thể gây phát tán bào tử. Tuy vậy, nhiều báo cáo nghiên cứu đã cho thấy

không hề có sự kích ứng đối với da của con người cũng như không xuất hiện

những ảnh hưởng không tốt đối với sức khoẻ của con người [20],[18].

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồm

các nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng. Cục Bảo vệ Môi trường

Hoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US-EPA) đã triển khai những

đánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn.

Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc

trừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm

trên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trong

các ngày khác nhau… không gây ra chứng bệnh gì. Những người ăn 1 gram

Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”.

Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày

(trong điều kiện phòng thí nghiệm) [Extoxnet, 1996].

18

Nhiều thí nghiệm trên con người với những người tình nguyện được thực

hiện bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trường thế giới (UNEP),

kết quả thu được cho thấy: mặc dù những người tình nguyện thường xuyên ăn

và hít vào một lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không hề thấy bất kỳ một

biểu hiện bất thường nào xảy ra trên cơ thể con người. Từ những nghiên cứu cụ

thể của các tổ chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã công nhận Bt và

công nghệ Bt hoàn toàn vô hại với con người và sức khoẻ cộng đồng.

Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý chất

hoá học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and

Agriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tác

phát triển kinh tế, chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản lý

chất thải có ảnh hưởng nguy hại tới đời sống của con người. Chương trình đã

khuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các loại thuốc trừ sâu hại hoá

học kinh điển khác.

1.6.2. Ảnh hưởng của Bt tới các loài động vật

Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hại

đối với côn trùng như các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các loại

mối mọt, muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu nhất

định đối với các loài nhất định và ngay cả một loài thì cũng chỉ gây độc ở một

giai đoạn sinh trưởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theo

nguyên tắc chìa khoá và ổ khoá. Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây hại

khi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối với các loại protein

không phù hợp khác thì sự không khớp được với loại protein của vật chủ làm

cho độc tố không phát huy được tác dụng. Thêm vào đó, môi trường khác nhau

trong thành ruột ở các loại sinh vật khác nhau và trong giai đoạn sinh trưởng

khác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của protein độc tố.

Trong lịch sử nghiên cứu về Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu trên các

loài động vật hoang dã đã được thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành các

nghiên cứu theo dõi tác động của Bt tới quần thể các loài động vật có vú nhỏ ở

một số khu rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada. Kết quả thu

19

được không hề có sự biến đổi số lượng quần thể này kể cả các loài thuộc bộ

gặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ ven rừng và

trong cánh đồng…

Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiến

hành những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim được chọn

nghiên cứu được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính toán sự biến động trong

quần thể. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng không hề có sự biểu hiện của bệnh

trên chim, và không có sự suy giảm số lượng cá thể chim trong quần thể.

Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên tiên

trên thế giới cũng đã tiến hành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt và

cây trồng mang gen Bt đối với các loài sinh vật đất và các loài côn trùng khác

được xem là có ích trong nông nghiệp. Kết quả phân tích trong một thời gian

dài đã cho thấy, Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không gây

ra ảnh hưởng bất lợi không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà còn với các

sinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi các

sinh vật này được xử lý Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thể

xảy ra trong điều kiện trồng trọt mà con người có thể đưa vào. Từ đó cho thấy

không có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sử

dụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử dụng [Donegan và cộng sự,

1995].

Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 được tiến hành trên chó,

chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim… cho thấy: protein Bt không

gây ra ảnh hưởng xấu hay biến đổi số lượng quần thể. Cũng cần nhấn mạnh

rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có ích

hoặc động vật ăn thịt như ong mật và bọ cánh cứng. Hầu hết các chế phẩm của

Bt như Bt, Btg, Btt, Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm tính với những

tác động bất lợi đến thế giới các loài động vật. Chỉ những loài động vật gây hại

chuyên biệt mới bị tác động của Bt, các loài động vật không phải là đích của Bt

thì không hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt [22].

1.6.3. Ảnh hưởng của Bt đến các loài thực vật

20

Khi công nghệ Bt hiện đại phát triển, cùng với sự phát triển của sinh học

phân tử và khoa học kỹ thuật đã cho phép con người chuyển gen sản sinh

protein đặc hiệu của Bt vào trong cơ thể của các loài cây trồng. Kỹ thuật này đã

được áp dụng trong các loại cây trồng như Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên vấn đề

đặt ra gây lo ngại cho con người ở đây chính là cây trồng mang gen Bt cho sản

phẩm chất lượng như thế nào, có ảnh hưởng tới hệ sinh thái và quần thể cây

trồng trên các cánh đồng không?

Vấn đề này trở thành một chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báo

cáo khoa học đã công bố về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô mang

gen Bt đến ấu trùng của loài bướm có lợi Monarch. Báo cáo này đưa ra đã gây

một mối quan tâm đặc biệt và lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen

Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên.

Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoa

học đã cho thấy loài ngô chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hưởng

không đáng kể đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng. Một chương

trình hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp

những thông tin nhằm xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh

hưởng của ngô Bt đối với quần thể bướm Monarch. Các nhà khoa học đi đến

kết luận rằng, ở hầu hết các giống lai thương mại thì protein độc tố Bt xuất hiện

với nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt phấn và không hề gây ảnh hưởng có hại

đến các loài bướm trên cánh đồng. Quần thể các loài sinh vật có ích và trung

lập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [22].

Như vậy, cây trồng sử dụng công nghệ cấy gen Bt (công nghệ GMO)

không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng như sản

phẩm của cây trồng Bt không gây tác động nào đối với các sinh vật sử dụng

chúng cũng như đối với con người.

1.7. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt

1.7.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên thế

giới

21

Từ khi phát hiện ra vi khuẩn Bt, con người ngày càng nhận thức được rõ

hơn về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này. Một loạt các nghiên cứu cấp

quốc tế và các nghiên cấp quốc gia đã và đang được đề ra nhằm phát triển công

nghệ sử dụng Bt một cách rộng rãi trong cộng đồng với mục đích bảo vệ môi

trường sống của con người và môi trường tự nhiên trong sạch [21], [3].

Năm 1938, chế phẩm Bt được sản xuất và bán ra đầu tiên từ phòng thí

nghiệm của Pháp. Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nước khác

trên thế giới sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thương phẩm

như: VMP, Pipel, Biobit…..

Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc trừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấn

năm 1983 lên 260 tấn 1986. Đến năm 1990 sản lượng đạt 900 tấn. Ở Nga từ

năm 1987 đã đạt sản lượng 6100 tấn/năm, đủ phục vụ cho 110 ha ruộng. Tại

Mỹ, lượng chế phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm. Ngoài việc

ứng dụng để bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước sử dụng trong

công tác vệ sinh dịch tễ như diệt trừ các loại muỗi, ruồi….. bảo vệ sức khoẻ

con người.

1.7.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt ở Việt

Nam

Bt được du nhập vào nước ta từ những thập niên 1970 nhưng do điều

kiện khách quan về kinh tế mà nước ta chưa có điều kiện áp dụng cũng như

quan tâm đến vấn đề này.

Trong vài năm trở lại đây, khi một loạt các vấn đề môi trường trong nông

nghiệp được khám phá gây nhiều dư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ con

người. Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt được xem như là một cứu cánh trong

lĩnh vực phòng trừ sâu hại. Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nước ta hiện nay còn

khá nhiều hạn chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nước ta còn rất thiếu các

điều kiện, phương tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi chuyên sâu

trong lĩnh vực này. Bên cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về công nghệ sinh học

của nước ta còn nhỏ hẹp, số lượng ít ỏi, đó là một trong nguyên nhân lớn dấn

đến sự hạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bt [21],

[16].

22

Về mặt quản lý, nước ta còn rất thô sơ và yếu trong công tác giống, công

tác kiểm định, tàng trữ đến nghiên phát triển, thu thập lai tạo … Mặt khác,

trong phân phối sản phẩm, nước ta lại quá quan tâm đến quảng bá cho các loại

hoá chất bảo vệ thực vật hoá học, do vậy việc quảng bá cho thương hiệu Bt

không được quan tâm đúng mức. Đồng thời trong công tác khuyến nông, những

hạn chế về tuyên truyền để người nông dân nâng cao hiểu biết còn yếu kém,

người nông dân chỉ muốn có hiệu quả tức thời và sử dụng thuận tiện, chính vì

thế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt.

Tuy nhiên, bước đầu các chuyên gia nước ta thuộc Viện công nghệ sinh

học (Viện Khoa học và công nghệ) đã tiến hành nghiên cứu và sản sản xuất

thành công nhiều thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn một

tương lai tốt đẹp cho nông sản Việt Nam. Sau đây là bảng thống kê các nghiên

cứu và một số chủng Bt chính được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ở Việt

Nam( xem Bảng 1.2 và Bảng 1.3).

Bảng 1.2: Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuất

chế phẩm

STT Tên gọi Ký hiệu 1 Bacillus thuringiensis Bt 2 Bacillus thuringiensis

subspecies aizawai Bta

3 Bacillus thuringiensis subspecies darmstadiensis

Btd

4 Bacillus thuringiensis subspecies entomocidus

Bte

5 Bacillus thuringiensis subspecies israelensis

Btk

6 Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki

Btko

7 Bacillus thuringiensis subspecies konkukian

Btt

8 Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis

Btte

9 Bacillus thuringiensis subspecies galleriae

Btg

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bt ( phần này em tìm mà không

được nhiều, cô có bổ sung cho em nhé! Em cảm ơn cô!)

23

STT Tên đề tài nghiên cứu Tác giả1 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi

khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. israelensis serotype H14 diệt lăng quăng muỗi

TS. Hồ Thị Hồng Nhung và cs - Viện

Pasteur TP.HCM

(2009)2 Phân lập các chủng B. thuringiensis var. kurstaki ở Việt

NamBùi Thị Hương

và cs – Viện sau thu hoạch

(2003)3 Phân loại B. thuringiensis bằng phương pháp định typ

huyết thanh của Ohba và Aizawai ở Việt NamĐinh Duy Kháng-

Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện

Công nghệ Sinh học (2003)

4 Đa dạng phân tử của Bacillus thuringiensis ở các tỉnh bắc bộ và bắc trung bộ

La Thị Nga và cs – Viện Công nghệ Sinh học

(2003)5 Phân loại các chủng Bt theo typ huyết thanh Lecadet va cs

(1999)6 Phân loại gen mã hóa nội độc tố Delta ở Bt và côn trùng

đích tương ứngHoft và

Whiteley (1989)

7 Phân loại gen mã hóa cho các protein độc tố diệt côn trùng

Hoft và Whiteley (1989)

CHƯƠNG 2

24

MỤC TIÊU – ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Phân lập được một số chủng Bt từ côn trùng bị vi khuẩn Bt ký sinh và

đất. Trên cơ sở đó chọn lọc được chủng có hoạt lực cao trong diệt sâu hại

cây trồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh trong bảo

vệ thực vật.

Mục tiêu cụ thể

+ Phân lập được các chủng Bt từ đất, côn trùng.

+ Xác định được một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập: hình

dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào, bào tử, tinh thể độc.

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập.

+ Tạo một bộ sưu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lưu trữ tại Trung tâm giống &

CNSH – Đại học Lâm nghiệp.

2.2. Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tồn tại trong:

+ 32 mẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệp - Xuân Mai -

Chương Mỹ - Hà Nội.

+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis xâm nhiễm

* Giới hạn của nghiên cứu

Do điều kiên thí nghiệm, thời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng như

trình độ bản thân còn hạn hẹp. Vì vậy, chưa xác định được chủng vi khuẩn Bt

đã phân lập thuộc loài, chi nào và việc xem xét một cách chính xác sự khác

nhau giữa các chủng Bt đã phân lập có sự trùng lặp nhau không chỉ là tương

đối. Khóa luận chỉ tập trung vào phân lập được chủng vi khuẩn Bt có hoạt lực

cao trong việc tiêu diệt côn trùng gây hại cây trồng.

2.3. Nội dung nghiên cứu

25

- Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đất

- Xác định đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Bt đã phân lập.

- Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc.

- Xác định hoạt lực diệt sâu dưa chuột của các chủng Bt đã phân lập.

- Bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập.

2.4. Vật liệu và thiết bị

2.4.1. Nguồn vi sinh vật

Nguồn vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được phân lập từ hai loại

mẫu:

- Mẫu côn trùng chết có các triệu trứng nghi là bị chết bởi vi khuẩn Bt

(xem Bảng 2.1), ( xem Hình 2.1).

- Các mẫu đất thu thập ở các địa điểm khác nhau trong Trường Đại học

Lâm nghiệp (xem Bảng 2.2), ( xem Hình 2.1).

Hình 2.1 : Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt

2.1-A : Hình ảnh mẫu tằm bệnh

2.1-B : Hình ảnh mẫu đất

26

A

B

Bảng 2.1: Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng

TT Loại sâu Tình trạngKý chủ thực vật

Địa điểm thu thập mẫu

Thời gian thu thập mẫu

1 Sâu đỏm Đã chết Cây Đỏm Lông

Núi Nuốt - ĐHLN Ngày 21/04/2009

2 Sâu keo Đã chết Keo tai tượng

Núi Nuốt - ĐHLN Ngày 02/05/2009

3 Sâu tằm Đã chết Cây DâuCơ sở sản xuất giống tằm Mai Lĩnh - Hà Nội

Ngày26/06/2009

Bảng 2.2: Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trường ĐHLN

TT Ký hiệu mẫu đất

Địa điểm thu thập mẫu (Trường ĐHLN)

Loại hình đất Thảm thực vật

1 H Khu vực hồ Đất thịt trung bình Long não2 T5 Nhà T5 Đất thịt trung bình Đa lá bóng3 G6 Hội trường G6 Đất thịt trung bình Re hương4 MS1 Vườn ươm Đất thịt nhẹ Sấu5 MS2 Vườn ươm Đất thịt trung bình Cau Bụng6 MS3 Khu chòi canh núi Nuốt Đất thịt trung bình Sưa7 MS4 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Dẻ Cau8 MS5 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Cẩm Lai Vú9 MS6 Khu KTX K13 Đất thịt trung bình Tô Hạp10 MS7 Khu TH Tin Đất thịt trung bình Keo Lá Tràm

11 MS8 Khu tập quân sự núi Nuốt

Đất thịt nhẹ Rừng keo

12 MS9 Khu giảng đường G1 Đất thịt trung bình Long não 13 MS10 Khu chòi canh núi Nuốt Đất thịt trung bình Rừng keo

14 MS11 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Rẻ cau

15 MS12 Khu tập quân sự núi Nuốt

Đất thịt trung bình Re hương

16 MS13 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

17 MS14 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Hoa sữa

18 MS15 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Rừng trẩu

19 MS16 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Xoan ta

20 MS17 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Lát hoa

27

21 MS18 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

22 MS19 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Khu vực ươm keo

23 MS20 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

24 MS21 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Cẩm lai vú

25 MS22 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Re hương

26 MS23 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Gội gác

27 MS24 Khu KTX K13 Đất thịt trung bình Nhội

28 MS25 Khu Bể nước Đất thịt nhẹ Trẩu

29 MS26 Khu Nghĩa trang Đất thịt trung bình Lim xẹt

30 MS27 Khu KTX K12 Đất thịt trung bình Keo Lá Tràm

31 MS28 Khu KTX K11 Đất cát pha Trẩu

32 MS29 Thư viện cũ Đất thịt trung bình Tếch

2.4.2. Sâu thí nghiệm

- Sâu ăn lá dưa chuột, dưa hấu Spodoptera litura Fabricius họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập ở các ruộng dưa của bà con nông dân

khu vực Nam Phương Tiến, Chương Mỹ, Hà Nội ( xem Hình 2.2).

- Sâu ăn lá cải bắp và su hào Plutella xylostella Linnaeus họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập tại các ruộng rau của bà con nông

dân khu vực Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội ( xem Hình 2.2).

Hình 2.2 : Hình ảnh về sâu thử hoạt tính

2.2 - A :Hình ảnh về sâu hại dưa chuột, dưa hấu

28

BA

2.2 - B : Hình ảnh về sâu hại cải bắp và su hào.

2.4.3. Hóa chất

29

- Pepton

- Thịt bò

- Cao nấm men

- Glucose

- Bột ngô

- Bột đậu tương

- Nước mắm

- Cồn

- Thuốc nhuộm fuchsin

- Agar

- Một số chất khoáng như: FeSO4, MgSO4, , ZnSO4....

2.4.4. Thiết bị - dụng cụ

* Thiết bị

- Box cấy vô trùng

- Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khí

- Tủ sấy

- Tủ lạnh

- Nồi hấp khử trùng

- Máy ổn nhiệt

- Máy lắc nuôi vi sinh vật

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Cân phân tích, cân điện tử

- Máy đo pH

30

* Dụng cụ

- Các dụng cụ thuỷ tinh như ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, pipet,

ống đong, cốc đong, đèn cồn, que cấy khuẩn, que gạt khuẩn, lam kính,

lamen......

2.4.5. Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

* Môi trường phân lập

- Môi trường phân lập đặc :

Thành phần g/l

Thịt bò 100g

Pepton: 10 g

Axetat natri: 35 g

Agar: 16 g

Nước cất : 1000 ml

pH 7

Hoá chất sau khi pha, chuẩn pH được đem khi khử trùng, để nguội đến

khoảng 600C được rót vào các đĩa petri, bọc giấy parafilm, để ở 24 giờ ở

điều kiện thường xem có nhiễm không, những đĩa thạch không bị nhiễm

mới sử dụng.

- Môi trường phân lập lỏng :

Thành phần g/l

Thịt bò 100g

Pepton: 10 g

Axetat natri: 35 g

Nước cất : 1000 ml

pH 7

Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích

100ml (mỗi bình 30ml). Khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút. Để

sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới

lấy ra sử dụng.

* Môi trường nhân giống

- Môi trường nhân giống cấp 1 :

Thành phần (g/l)

Thịt bò 100g

Pepton: 10 g

CaCl2: 0,01 g

KH2PO4.7H2O: 0,02 g

ZnSO4.7H2O: 0,001 g

Glucose: 10 g

Nước cất: 1000 ml

pH 7



sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới

lấy ra sử dụng.

- Môi trường nhân giống cấp 2:

Làm theo công thức của môi trường nhân giống cấp 1, đựng trong các

các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml).

* Môi trường giữ giống

Thành phần (g/l)

Pepton: 5 g

Glucose: 10 g

Cao nấm men: 3 g

Agar: 16 g


pH 7 Hòa tan hóa chất, chuẩn pH, đựng trong ống nghiệm rồi đem khử

trùng. Làm thạch nghiêng, để sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ

tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử dụng.

* Môi trường lên men

Thành phần (g/l)

Bột đậu tương: 15 g

Glucose: 7 g

Bột ngô: 10 g

ZnSO4: 0,01 g

MgSO4.7H2O: 0,3 g

FeSO4.7H2O: 0,01 g

KH2PO4.7H2O: 0,05 g


pH 7



sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng trước khi sử dụng.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp luận

- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức thí

nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng.

- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng nhất

giữa các công thức thí nghiệm.

- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30).

- Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.5.2.1. Phân lập Bacillus thuringiensis

a) Phân lập từ các mẫu đất

- Phương pháp thu thập mẫu đất

Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác nhau ở khu vực Trường Đại học

Lâm nghiệp. Cách thu thập mẫu đất như sau: Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 – 3

cm, dùng dụng cụ sạch thu lấy 100 gam đất. Mỗi điểm lấy 3 chỗ sau đó trộn đều

3 mẫu này trong túi nilon vô trùng. Lấy 100 gam đất cho vào túi vô trùng khác.

Dán kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp và khô ráo. Trên mẫu đất có ghi rõ địa điểm

thu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy mẫu.

- Phương pháp phân lập :

Mẫu đất lấy về cân 1gam cho vào các bình tam giác chứa môi trường lỏng.

Nuôi trên máy lắc ở 280C trong 4 giờ, sau đó lấy ra đặt vào bể ổn nhiệt ở 800C

trong 15 phút. Lấy 50µl cấy vào môi trường phân lập trên đĩa petri, nuôi ở 280C

trong 48 - 72 giờ. Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc Bacillus

thuringiensis nuôi tiếp trong 72 giờ. Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin và

kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính x100). Các mẫu có tế bào sinh

dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bt. Thuần khiết lại giống và bảo

quản giống.

b) Phân lập từ côn trùng bệnh

Côn trùng là đối tượng cảm nhiễm chủ yếu của Bt và là nguồn vật liệu

quan trọng để phân lập loại khuẩn này.

- Phương pháp thu thập côn trùng:

Khi côn trùng bị chết do vi khuẩn Bt, thân côn trùng thường treo ngược

trên phiến lá, quấn vào trong lá và rơi xuống đất, xác côn trùng có màu nâu đen.

Côn trùng mới chết, trên cơ thể bám nhiều các chất bẩn - đó là dịch thể do côn

trùng tiết ra trong thời kỳ nhiễm bệnh hoặc là chất bài tiết của nó. Côn trùng

nhiễm khuẩn chết là do có vi khuẩn sinh sản ở trong nên vách cơ thể rất mỏng và

giòn, khi thu thập mẫu từ côn trùng cần cẩn thận gắp côn trùng vào bình nhỏ vô

trùng hoặc túi nilon vô trùng. Trên túi nilon vô trùng ghi rõ địa điểm lấy mẫu,

trạng thái của côn trùng, loại thực vật bị tàn phá, thời gian thu thập mẫu.

Khử trùng: Mẫu côn trùng được khử trùng bề mặt. Vô trùng phần giữa của

côn trùng trong ethanol 600 (2 phút) và NaOCl 5% (3 - 5 phút). Rửa nhiều lần với

nước cất vô trùng.

Phân lập: Trong điều kiện vô trùng, dùng kéo cắt mở phần lưng, có thể có

dịch thể chảy ra. Dùng kéo ấn nhẹ một đầu côn trùng để ép dịch thể chảy ra. Phân

lập theo phương pháp pha loãng trên đĩa petri. Đặt các đĩa petri trong tủ ấm ở

280C trong 48 - 72 giờ. Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc Bacillus

thuringiensis nuôi tiếp trong 72 giờ. Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin và

kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính x100). Các mẫu có tế bào sinh

dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bt. Thuần khiết lại giống và bảo

quản giống.

2.5.2.2. Quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của vi khuẩn Bt

Tiến hành làm vết bôi sinh khối vi khuẩn trên lam kính. Nhuộm vết bôi với

thuốc nhuộm fuchsin đậm đặc trong 1 phút. Rửa nhẹ bằng ethanol 10%, sau đó

rửa với nước cất và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính x100.

2.5.2.3. Thử khả năng diệt sâu của các chủng vi khuẩn Bt trong phòng thí

nghiệm

Để xác định được độc lực của các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập được đối

với các loại sâu ăn lá cây dưa chuột, dưa hấu Spodoptera litura và sâu ăn lá su

hào, bắp cải Plutella xylostella (đều là những loại sâu là ký chủ đặc hiệu của vi

khuẩn Bt), tôi lần lượt thực hiện các thí nghiệm sau:

* Thí nghiệm 1: Nhân giống vi khuẩn Bt

Cấy giống và nhân giống cấp 1, cấp 2 trong các bình tam giác chứa 100ml

môi trường nhân giống vô trùng đã chuẩn bị từ trước. Tiến hành nhân giống mỗi

cấp ở 200 v/p, 28oC trong 24h.

* Thí nghiệm 2: Lên men tạo sinh khối vi khuẩn Bt

Lấy 5ml giống cấp 2 cấy sang các bình tam giác 250ml chứa 100ml môi

trường lên men (tỷ lệ tiếp giống 5%). Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ

200 v/p ở 28oC trong 50 – 60h.

* Thí nghiệm 3: Xác định số lượng bào tử/tinh thể độc của vi khuẩn Bt

Do mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ giải phóng ra một bào

tử và một tinh thể độc. Cho nên bằng cách đếm số lượng bào tử ta có thể ước

tính số lượng bào tử có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ

sinh trưởng của chủng Bt đang sử dụng.

Để đếm số lượng bào tử ta tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi

pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml ở 3 nồng độ pha loãng cuối cấy gạt vào các đĩa

thạch vô trùng chứa môi trường đếm số lượng bào tử (mỗi nồng độ 2 đĩa). Để

vào tủ ấm ở 28oC trong 24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.

Số lượng bào tử trong 1ml dịch lên men sẽ được tính theo công thức:

X = n.10/a (bào tử/ml)

X: số bào tử trong 1ml dịch lên men.

n: số khuẩn lạc trung bình

a: nồng độ pha loãng.

* Thí nghiệm 4: Thử khả năng diệt sâu của các chủng Bt trong phòng thí

nghiệm

Để thử hoạt lực diệt sâu của các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập, tôi tiến

hành thu hồi dịch lên men tương ứng với từng chủng ở thời điểm thu được nhiều

bào tử và tinh thể độc (50 - 60 giờ). Tôi tiến hành pha loãng 3 lần dịch lên men

của từng chủng Bt để thử hoạt tính.

Để có cơ sở so sánh và đánh giá hiệu quả diệt sâu của các chủng Bt đã

phân lập, tôi bố trí thêm 1công thức đối chứng dương là chế phẩm Bt thương mại

được sản xuất bởi một công ty sản xuất thuốc trừ sâu sinh học của Trung Quốc

và 1 công thức công thức đối chứng âm thức ăn được nhúng vào môi trường lên

men vô trùng không có vi khuẩn Bt. Chế phẩm có dạng thuốc bột, chứa chủng B.

thuringiensis var kurstaki, được lưu hành và sử dụng ở Việt Nam.

Bố trí thí nghiệm:

- Với Sâu ăn lá dưa chuột, Dưa hấu (Spodoptera litura Fabricius) được

chia vào các lô thí nghiệm bố trí trong các đĩa petri vô trùng với số lượng sâu như

nhau (10 sâu/đĩa) và tương đối đồng đều về tuổi sâu. Thức ăn của sâu (lá dưa

chuột tươi) sau khi lấy về được rửa sạch dưới vòi nước, để khô tự nhiên. Sử dụng

panh vô trùng gắp lá dưa nhúng vào dịch lên men đã pha loãng tương ứng với

từng chủng Bt. Gắp lá dưa ra, để ráo bớt dịch sau đó cho vào các đĩa petri. Trên

thành đĩa petri ghi rõ chủng Bt, nồng độ pha loãng, ngày thí nghiệm... Thả sâu

vào các lô thí nghiệm với số lượng 10 sâu/đĩa. Đậy các đĩa petri bằng vải màn

thưa để đảm bảo môi trường trong đĩa luôn được thoáng khí. Đặt các đĩa thí

nghiệm trong phòng có nhiệt độ 250C.

Ở lô đối chứng, thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô

trùng đã chuẩn bị sẵn (không có vi khuẩn Bt) và tiếp cho sâu ăn với lượng thức

ăn và lượng sâu như tiến hành với các lô thí nghiệm có dịch Bt.

Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24h, 48h,

72h ở tất cả các lô thí nghiệm.

Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott:

(C - T) . 100 Trong đó:

A = A: % sâu chết

C C: Số sâu sống sót ở lô đối chứng.

T: Số sâu sống sót ở lô thí nghiệm.

- Với Sâu ăn lá Cải bắp và Su hào (Spodoptera exigua) thí nghiệm được bố

trí tương tự như đối với sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu.

2.5.2.4. Bảo quản và lưu giữ các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập

- Bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập sử dụng phương pháp đông

lạnh sử dụng glycerol 20%. Tiến hành nhân giống, thu sinh khối vi khuẩn bằng li

tâm, trộn với glycerol 20% bảo quản bằng ống eppendol ở điều kiện - 850C, -

200C .

- Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường dinh dưỡng

trong ống nghiệm và bảo quản điều kiện 40C.

SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM

Xử lý ở 800C Khử trùng nhẹ

Cấy trải trên đĩa petri

Mẫu đất Mẫu sâu

Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu

Bacillus cereus + Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis

Nhân giống cấp I, II

Lên men

Bố trí thí nghiệm xác định hoạt lực diệt sâu

Nhuộm fuchsin

Quan sát dưới KHV Chọn lọc khuẩn lạc Bacillus thuringiensis

Thuần khiết giống Giữ giống

Tiếp giống 5%

Bình tam giác 250 ml có 100ml môi trường lên men

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

3.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis

Từ 32 mẫu đất và 3 mẫu côn trùng thu thập quanh khu vực Trường Đại học

Lâm nghiệp, chúng tôi đã thu nhận được 148 chủng vi khuẩn thuộc nhóm

Bacillus cereus - Bacillus thuringiensis. Trong số đó có 66 chủng có sự sản sinh

tinh thể độc (crystal) được nhận dạng . Hình ảnh trong quá trình phân lập( xem

Hình 3.1).

Sự phân bố của 51 chủng Bt trong các mẫu đất và sâu:

Sự phân bố của 66 chủng Bt trong các mẫu đất và sâu ( xem Bảng 3.1 và Bảng 3.2.).

Bảng 3.1: Bt phân lập được từ các mẫu sâu

TT Nguồn mẫu Ký chủ thực vật Số lượng Kí hiệu chủng

1 Sâu đỏm Cây Đỏm lông 1 BtĐ

2 Sâu keo Cây Keo 1 BtK

Pha loãng mẫu

3 Tằm Cây tằm 1 BtT

Bảng 3.2: Bt phân lập được từ các mẫu đất

TT Địa điểm lấy mẫu

(Trường ĐHLN)

Thảm thực

vật

Số lượng Kí hiệu chủng

1 Khu vực hồ Long não 5 H1.1; H1.2; H1.3; H1.4 ; H1.5

2 Nhà T5 Đa lá bóng 2 T5.1; T5.2

3 Hội trường G6 Re hương 2 G6.1; G6.2

4 Vườn ươm Cau Bụng 1 MS2

5 Khu tập quân sự núi Nuốt Rừng keo 2 MS8.1; MS8.2

6 Khu giảng đường G1 Long não 3 MS9.1; MS9.2; MS9.3

7 Khu chòi canh núi Nuốt Rừng keo 4 MS10.2; MS10.3; MS10.4; MS10.5

8 Chân núi Nuốt Rẻ cau 2 MS11.1; MS11.2

9 Khu tập quân sự núi Nuốt Re hương 2 MS12.2; MS12.3

10 Đỉnh núi Nuốt Thông 2 MS13.1; MS13.3

11 Khu vườn ươm núi Nuốt Hoa sữa 4 MS14.1; MS14.2; MS14.3; MS14.4

12 Đỉnh núi Nuốt Rừng trẩu 3 MS15.1; MS15.2; MS15.3

13 Khu vườn ươm núi Nuốt Xoan ta 4 MS16.1; MS16.2; MS16.3; MS16.4

14 Khu vườn ươm núi Nuốt Lát hoa 2 MS17.1; MS17.2

15 Chân núi Nuốt Thông 2 MS18.1; MS18.3

16 Khu vườn ươm núi Nuốt Ươm Keo 2 MS19.1; MS19.2

17 Đỉnh núi Nuốt Thông 1 MS20

18 Khu vườn ươm núi Nuốt Cẩm lai vú 2 MS21.1; MS21.2

19 Đỉnh núi Nuốt Re hương 2 MS22.1; MS22.2

20 Chân núi Nuốt Gội gác 1 MS23

21 Khu KTX K13 Nhội 3 MS24.1 ;MS24.2 ; MS24.3

22 Khu Bể nước Trẩu 2 MS25.1 ; MS25.2

23 Khu Nghĩa trang Lim xẹt 2 MS26.1 ; MS26.2

24 Khu KTX K12 Keo Lá Tràm

5 MS27.1 ; MS27.2 ; MS27.3 MS27.4

; MS27.5

25 Khu KTX K11 Trẩu 1 MS28

26 Thư viện cũ Tếch 2 MS29.2 : MS29.1

Kết quả chỉ ra ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 cho thấy: Từ 3 mẫu sâu chết chúng

tôi đã phân lập được 3 chủng Bt và từ 32 mẫu đất đã có 63 chủng vi khuẩn được

nhận dạng. Các mẫu đất thu thập ở một số địa điểm có khả năng phân lập được

nhiều chủng Bt gồm: Khu vực hồ (5 chủng), khu chòi canh núi Luốt (4 chủng),

khu vườn ươm (4 chủng), khu vực KTX K12 (5 chủng). Kết quả nhận được cho

phép khẳng định rằng đất ở khu vực Trường ĐHLN là một địa điểm tốt để thu

thập các chủng Bt. Điều đó có thể được giải thích là do khu vực Trường ĐHLN

có hệ sinh thái đa dạng, tập trung nhiều loại thực vật rừng với số lượng lớn, là

nơi trú ngụ của nhiều loại sâu hại cây lâm nghiệp, cây bụi... nên cũng tiềm ẩn

một quần thể vi sinh vật đối kháng với tần suất xuất hiện cao hơn so với những

khu vực khác (Theo Ngô Đình Bính và cộng sự, 2003, tần suất xuất hiện Bt trong

đất ở Việt Nam là khá cao so với các nước khác trong khu vực, khoảng 60% -

90%).

Đặc điểm khuẩn lạc của 66 chủng Bt đã phân lập

Trên cùng loại môi trường phân lập trong các đĩa petri, các chủng Bt khác

nhau sẽ mọc thành các khuẩn lạc có hình thái và màu sắc khác nhau ( xem Bảng

3.3).

Bảng 3.3: Hình dạng, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các chủng Bt

TT Kí hiệu

chủng

Hình dạng khuẩn lạc

1 BtK Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 1- 2 mm

2 BtT Tròn, trắng sữa, viền nhăn, có tâm dày viền mỏng. Đk 5 - 8 mm

3 BtĐ Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 1 - 2 mm

4 H1.1 Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn. Đk 4 - 5 mm

5H1.2

Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 - 4

mm

6 H1.3 Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 4 - 5 mm

7 H1.4 Tròn, trắng trong, viền nhăn, bề mặt gồ ghề. Đk 2 - 3mm

8 H1.5 Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn. Đk 2 - 3 mm

9 T5.1 Tròn, trắng sữa, có tâm dày viền mỏng. Đk 2 - 3 mm

10 T5.2 Tròn, vàng nhạt, bề mặt gồ ghề. Đk 2 - 3 mm

11 G6.1 Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 3 - 4 mm

12 G6.2 Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn. Đk 4 - 6 mm

13 MS2 Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn. Đk 3 - 5 mm

14 MS8.1 Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng. Đk 4 - 6 mm

15 MS8.2 Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 5 - 6 mm

16 MS9.1 Tròn, trắng sữa, viền nhăn, có tâm dày viền mỏng. Đk 6 - 8 mm

17MS9.2

Tròn, trắng đục, bề mặt gồ ghề, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 - 5

mm

18 MS9.3 Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 - 5 mm

19 MS10.2 Tròn, trắng sữa, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 - 5 mm

20 MS10.3 Hình sao, trắng trong, có tâm dày viền mỏng. Đk 2 - 3 mm

21MS10.4

Tròn, trắng sữa, viền có ghờ nổi lên, ở giữa khuẩn lạc lõm.

Đk 3 - 4 mm

22MS10.5

Hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề, có tâm dày viền mỏng. Đk

8 – 10 mm

23 MS11.1 Tròn, trắng sữa, viền nhăn, tâm dày viền mỏng. Đk 9 – 11 mm

24 MS11.2 Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng. Đk 7 – 9mm

25MS12.1

Hình sao, trắng trong, có tâm dày viền mỏng, bề mặt gồ ghề. Đk

4 – 7 mm

26 MS12.3 Hnh sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề, có viền dày. Đk 3 – 5 mm

27 MS13.1 Tròn, viền nhăn, màu trắng sữa, có tâm, bề mặt gồ ghề. Đk 8 –

10 mm

28 MS13.3 Tròn, trắng trong, có tâm dày viền mỏng. Đk 2 – 4 mm

29 MS14.1 Tròn, trắng sữa, viền nhăn dày. Đk 5 – 7 mm.

30 MS14.2 Tròn, trắng trong. Đk 8 – 10 mm

31MS14.3

Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 – 4

mm.

32 MS14.4 Tròn, trắng đục, có tâm. Đk 3 – 4 mm

33MS15.1

Tròn, trắng trong, viền nhăn, có tâm dày viền mỏng. Đk 3 – 4

mm.

34MS15.2

Tròn, trắng trong, có vết lõm ở tâm bề mặt gồ ghề, viền nhăn. Đk

2 – 4 mm.

35MS15.3

Tròn, màu trắng sữa, có vết lõm ở tâm, bề mặt gồ ghề. Đk 3 – 5

mm

36MS16.1

Hình cầu, trắng sữa, có tâm dày viền mỏng, bề mặt gồ ghề. Đk 3

– 5 mm

37 MS16.2 Tròn, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 2 – 4 mm

38 MS16.3 Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 2 – 3 mm

39 MS16.4 Hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề. Đk 3 – 5 mm

40MS17.1

Tròn, trắng trong, có tâm dày viền mỏng, viền nhăn. Đk 3 – 4

mm.

41 MS17.2 Tròn, trắng vôi, bề mặt gồ ghề, viền nhăn. Đk 4 - 6 mm

42 MS18.1 Tròn, trắng trong, có tâm lõm, viền nhăn. Đk 2 - 3 mm



45 MS19.2 Hình sao, trắng trong, có tâm, bề mặt gồ ghề. Đk 7 - 10 mm

46MS20

Tròn, trắng sữa, có tâm dày, viền mỏng và nhăn, bề mặt nhẵn.

Đk 8 - 9 mm

47MS21.1

Tròn, trắng sữa. bề mặt nhẵn, có tâm dày, viền mỏng. Đk 2 - 5

mm

48 MS21.2 Tròn, trắng vàng, bề mặt nhẵn. Đk 2 - 4 mm

49 MS22.1 Hình sao, trắng trong, có tâm dày, viền mỏng. Đk 2 - 4 mm

50 MS22.2 Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn. Đk 8 - 10 mm

51 MS23 Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 2 - 5 mm

52 MS24.1Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng. Đk 6 – 9mm

53 MS24.2Hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề. Đk 4 – 6 mm

54 MS24.3Hnh sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 3 – 4 mm

55 MS25.1Tròn, viền nhăn, màu trắng sữa, có tâm. Đk 7 – 10 mm

56 MS25.2Tròn, trắng trong, có tâm dày viền mỏng. Đk 4 – 6 mm

57 MS26.1Tròn, trắng sữa, viền nhăn dày. Đk 4 – 7 mm.

58 MS26.2Tròn, trắng trong, viền nhăn dày. Đk 8 – 9 mm

59 MS27.1 Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn. Đk 3 –5 mm.

60 MS27.2Tròn, trắng đục, có tâm, bề mặt nhẵn. Đk 3 – 4 mm

61MS27.3

Tròn, trắng trong, viền nhăn, có tâm dày viền mỏng. Đk 6 – 8

mm.

62MS27.4

Tròn, trắng trong, có vết lõm ở tâm bề mặt gồ ghề, viền nhăn. Đk

4 - 6 mm.

63 MS27.5Tròn, màu trắng sữa, có vết lõm ở tâm. Đk 4 – 7 mm

64 MS28Hình cầu, trắng sữa, có tâm dày viền mỏng. Đk 8 – 10 mm

65 MS29.1Tròn, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 5 - 8 mm

66 MS29.2Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề. Đk 3 - 5 mm

Hình 3.1: Một số hình ảnh trong quá trình phân lập Bt3.1-A, 3.1- B: Vi khuẩn Bt mọc trên môi trường phân lập3.1-C: Các chủng Bt thuần khiết trên môi trường giữ giống

3.2. Kết quả quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc

Bằng phương pháp nhuộm đơn với fuchsin, soi ở vật kính x100, chúng tôi

nhận được các thông tin về mật độ, hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của

66 chủng Bt (các chủng Bt có đặc điểm: tinh thể nội bào bắt màu sẫm; tế bào

sinh dưỡng hình que bắt màu hồng; bào tử dạng gần tròn, có mép, không bắt

màu( xem Bảng 3.4 và xem Hình 3.2). - Phương pháp này chỉ có độ chính xác

tương đối.

Bảng 3.4: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của các chủng Bt

TT Kí hiệu chủng

Hình dạng tế bào

Hình dạng

bào tử

Hình dạng

tinh thể độc

1 BtK Hình que ngắn Hình trứng Quả trám

A B

C

2 BtT Hình que ngắn Hình trứng Tròn

3 BtĐ Hình que ngắn Hình trứng Đa giác

4 H1.1 Hình que ngắn Hình trứng Tròn

5 H1.2 Hình que ngắn Hình trứng Kim

6 H1.3 Hình que ngắn Hình trứng Đa giác

7 H1.4 Hình que ngắn Hình trứng Quả trám

8 H1.5 Hình que dài Hình trứng Quả trám

9 T5.1 Hình que dài Hình trứng Đa giác

10 T5.2 Hình que ngắn Hình trứng Tròn

11 G6.1 Hình que dài Hình trứng Tròn, đa giác

12 G6.2 Hình que ngắn Hình trứng Tròn

13 MS2 Hình que ngắn Hình trứng Đa giác

14 MS8.1 Hình que ngắn Hình trứng Tròn

15 MS8.2 Hình que ngắn Hình trứng Kim

16 MS9.1 Hình que ngắn Hình trứng Tròn, đa giác

17 MS9.2 Hình que ngắn Hình trứng Đa giác

18 MS9.3 Hình que dài Hình trứng Tròn






24 MS11.2 Hình que dài Hình trứng Tròn, đa giác

25 MS12.1 Hình que dài Hình trứng Thoi




29 MS14.1 Hình que dài Hình trứng Tròn, đa giác

















46 MS20 Hình que dài Hình trứng Tròn





51 MS23 Hình que ngắn Hình trứng Quả trám

52 MS24.1 Hình que ngắn Hình trứng Quả trám




56 MS25.2 Hình que dài Hình trứng Kim


58 MS26.2 Hình que ngắn Hình trứng Quả trám

59 MS27.1 Hình que dài Hình trứng Quả trám

60 MS27.2 Hình que dài Hình trứng Đa giác




64 MS28 Hình que dài Hình trứng Đa giác



Kết quả xác định sơ bộ số lượng bào tử/tinh thể độc của 66 chủng Bt đã phân lập dưới kính hiển vi cho thấy: có 20/66 chủng có lượng bào tử/tinh thể độc cao hơn so với những chủng còn lại, gồm các chủng: H1.2; MS8.1; MS15.3; MS16.2; MS16.3; MS17.1; MS21.1; BTK ; H1.5;T5.1;G6.1;MS27.4;MS27.1;MS23; T5.2 ; G6.1; MS26.1; BtT; MS11.1;MS19.2.

Hình 3.2: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc các chủng Bt

3.2-A: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của chủng H1.5

3.2-B: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của chủng MS21.1

3.3. Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu

3.3.1. Kết quả nhân giống cấp I, II và lên men

Sau khi xác định được sơ bộ số lượng bào tử, tinh thể độc của 66 chủng Bt đã phân lập dưới kính hiển vi, chúng tôi chọn ra 20/66 chủng sản sinh nhiều bào tử và tinh thể độc hơn so với những chủng còn lại, gồm các chủng: H1.2; MS8.1; MS15.3; MS16.2; MS16.3; MS17.1; MS21.1; BTK ; H1.5;T5.1;G6.1;MS27.4;MS27.1;MS23; T5.2 ; G6.1; MS26.1; BtT; MS11.1;MS19.2 để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.

Các chủng Bt sản sinh nhiều bào tử, tinh thể độc đã lựa chọn được tiến hành

nhân giống trên môi trường nhân giống cấp I, cấp II. Sau khi cấy giống vào môi trường

sau 3 giờ – 4 giờ thì vi khuẩn đã phát triển và làm vẩn đục môi trường, đến 24 giờ thì

môi trường đục hoàn toàn ở thời điểm này, tôi tiến hành cấy chuyền sang môi trường

nhân giống cấp II.

A

B

Ở môi trường nhân giống cấp II sau 24 giờ khi vi khuẩn đã phát triển mạnh và

làm vẩn đục môi trường, tôi tiến hành lên men với tỉ lệ tiếp giống 5% . Tiến hành lên

men trên máy lắc ở 220 vòng/phút ở 280C. Thu hồi dịch lên men ở thời điểm sau 50 giờ

- 60 giờ thời điểm này vi khuẩn Bt đã phóng thích nhiều bào tử và tinh thể độc ra môi

trường.

3.3.2. Kết quả xác định số lượng bào tử

Do mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ giải phóng ra một bào tử và

một tinh thể độc. Cho nên bằng cách đếm số lượng bào tử ta có thể ước tính số

lượng tinh thể độc có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ sinh

trưởng của chủng Bt đang sử dụng.

Để có cơ sở cho pha loãng dịch lên men của 21 chủng Bt khác nhau sao cho

dịch lên men của các chủng sau pha loãng sẽ có mật độ bào tử và tinh thể độc

tương đối đồng đều nhau, chúng tôi tiến hành đếm số lượng bào tử của các chủng

Bt trong 1 ml dịch lên men ( xem Bảng 3.5).

Bảng 3.5: Số lượng bào tử/ml dịch lên men (thu hồi sau 60h lên men)

TT Kí hiệu chủng Số lượng bào tử (x109)/ml dịch lên men

1 BtK 8,1

2 BtT 6,03

3 H1.2 3,07

4 H1.5 15,07

5 T5.1 8,50

6 T5.2 8,57

7 G6.1 10,04

8 MS8.1 4,25

9 G6.2 6,25

10 MS11.1 7,98

11 MS15.3 6,87

12 MS16.2 9,25

13 MS21.1 14,08

14 MS27.1 11,44

15 MS27.4 14,02

16 MS26.1 6,4

17 MS23 5,4

18 MS17.1 8,2

19 MS16.3 4,0

20 MS19.2 6,0

Kết quả đếm số lượng bào tử/ml dịch lên men trình bày ở bảng 07 cho thấy

số lượng bào tử của 21 chủng Bt nằm trong khoảng từ 3,07 x 109 bào tử/ml đến

khoảng 15,07x 109 bào tử/ml.

3.3.3. Kết quả khả năng diệt sâu

3.3.3.1. Kết quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu

Sâu ăn lá dưa chuột, dưa hấu (Spodoptera litura Fabricius) phát triển

mạnh vào vụ Thu – Đông và vụ Xuân – Hè, bướm có chiều dài thân khoảng 20-

25mm, sải cánh rộng từ 35-45mm. Cánh trước màu nâu vàng, giữa cánh có vân

trắng, cánh sau màu trắng óng ánh, trứng có hình bán cầu, đường kính từ 0,4 -

0,5mm.

Thời gian phát triển của ấu trùng kéo dài từ 20-25 ngày, sâu có 5-6 tuổi tuỳ

thuộc điều kiện môi trường. Nếu điều kiện thuận lợi sâu có thể dài từ 35-53mm,

hình ống tròn. Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục, càng lớn sâu chuyển dần thành màu

nâu đậm. Trên cơ thể có một sọc vàng sáng chạy ở hai bên hông từ đốt thứ nhất

đến đốt thứ tám của bụng, mỗi đốt có một chấm đen rõ nhưng hai chấm đen ở đốt

thứ nhất to nhất. Sâu càng lớn, hai chấm đen ở đốt thứ nhất càng to dần và gần

như giao nhau tạo thành khoang đen trên lưng nên sâu ăn tạp còn được gọi là

“sâu khoang”.

Theo nhiều tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố [3], [6].

Trong số các loài sâu ăn lá thuộc bộ cánh vẩy, thì sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu

là một trong những loài ký chủ rất đặc hiệu của vi khuẩn Bt.

Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu được bố trí trong các đĩa petri, mỗi đĩa 10

sâu (tương đối đồng đều về kích thước). Nồng độ bào tử vi khuẩn của dịch vi

khuẩn cho thí nghiệm diệt sâu khoảng 109 bào tử/ml.

Kết quả đếm số lượng bào tử ở mục 5.3 cho thấy 21 chủng Bt sản sinh số

lượng bào tử trong khoảng 3,07 x 109 bào tử/ml - 15,07x 109 bào tử/ml. Do vậy

cần tiến hành pha loãng dịch lên men để đảm bảo số lượng bào tử, tinh thể độc

của 21 chủng Bt trong thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu là tương đối đồng đều.

Các chủng Bt ký hiệu MS8.1; MS16.3; MS26; MS15.3; BtT; MS23; H1.2; MS19.2; G6.2

có số lượng bào tử/ml dịch lên men ≈ 5 x 109 bào tử/ml nên cần pha loãng 5 lần

với nước cất vô trùng để đạt mật độ bào tử trong khoảng 109 bào tử/ml.

Các chủng T5.1; T5.2; MS16.2; MS11.1; MS17.1; G6.1 ;BtK có số lượng bào tử/ml

dịch lên men ≈ 9 x 109 bào tử/ml. Do vậy chúng tôi dịch lên men của các chủng

này ra độ pha loãng 9 lần.

Các chủng H1.5; MS21.1; MS27.4; MS27.1 có số lượng bào tử/ml dịch lên men ≈

13 x 109 bào tử/ml. Chúng tôi pha loãng 13 lần đối với dịch lên men của các

chủng này.

Công thức đối chứng âm là môi trường lên men vô trùng.

Công thức đối chứng dương là chế phẩm thuốc trừ sâu Bt nhãn hiệu Anhuy

do Trung quốc sản xuất. Chế phẩm này chứa chủng Bt thuộc thứ kurstaki sinh

tinh thể độc hình quả trám 8 mặt, dạng bột và được hoà tan với nước cất vô trùng

tạo thành dạng lỏng, đảm bảo số lượng bào tử cũng khoảng 109 bào tử/ml.

Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24h, 48h và 72h (tính

theo công thức Abbott), ( xem Bảng 3.6 và xem Hình 3.3).

Bảng 3.6: Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu chết bởi

chế phẩm Bt

TT Kí hiệu Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian

chủng 24h 48h 72h1 ĐC 0 0 0

2 BtAn huy 50 100 100

3 BtK 40 50 50

4 BtT 30 40 60

5 H1.2 20 30 506 H1.5 60 80 1007 T5.1 40 60 808 T5.2 30 40 609 G6.1 20 40 8010 G6.2 30 50 5011 MS8.1 10 30 4012 MS11.1 20 30 8013 MS15.3 30 60 7014 MS16.2 40 60 8015 MS16.3 10 30 5016 MS17.1 30 50 7017 MS19.2 20 50 6018 MS21.1 40 90 9019 MS23 20 50 6020 MS26.1 20 30 6021 MS27.1 30 50 9022 MS27.4 40 70 90

Xem kết quả ở bảng trên tôi thấy:

Công thức đối chứng âm (nhúng lá dưa với môi trường lên men vô trùng)

có tỉ lệ sâu chết 0% sau 3 ngày thí nghiệm.

Công thúc đối chứng dương (BtAnhuy) sử dụng chế phẩm Bt thương mại của

Trung quốc hiệu lực diệt sâu dưa chuột và dưa hấu rất cao. Sau 48h tất cả các sâu

trong thí nghiệm đều chết (100%).

Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc đã phân lập, đáng chú

ý nhất là hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và lá dưa hấu của các chủng sau:

- Chủng H1.5 có hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu cao tương

đương hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu của chủng Bt thương mại của

Trung quốc. Sau 24h (60%), sau 48h (80%) sâu ở công thức thí nghiệm này chết,

sau 72h (100%) sâu trong thí nghiệm chết.

- Chủng MS21.1; MS27.4 ; MS27.1 có hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa

hấu cao gần bằng hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu của chủng Bt

thương mại của Trung quốc. Hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu của 3

chủng như sau : Sau 24h - MS21.1 (40%), MS27.4 (40%), MS27.1( 30%); sau 48h -

MS21.1 (90%), MS27.4 (70%), MS27.1(50%); sau 48h - MS21.1 (90%), MS27.4 (90%),

MS27.1( 90%)

- 4 chủng có hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu 80% sau 72h thí

nghiệm là T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1.

Các chủng Bt còn lại có hiệu quả diệt sâu thấp hơn.

Khi xem xét kích cỡ sâu và lượng lá dưa tiêu thụ ở các lô thí nghiệm chúng

tôi nhận thấy:

Do sâu ăn lá dưu hấu và dưa chuột trong một ngày có thể ăn hết một lượng

lá dưa đáng kể, tương ứng với lượng lá dưa sâu đã ăn, có thể dễ dàng quan sát

thấy kích cỡ sâu to lên sau từng ngày. Do vậy, lượng lá dưa chúng tôi tiếp cho

sâu ăn trước thí nghiệm là đầy đĩa petri nhưng cũng chỉ đủ cho sâu ăn trong 24h ,

sau đó nếu lô thí nghiệm nào sâu ăn hết thức ăn thì sẽ phải nhúng thêm lá dưa

tươi với dịch khuẩn tương ứng với mỗi lô thí nghiệm để tiếp thêm cho sâu.

Ở lô đối chứng âm, lượng lá tiêu thụ hết sạch chỉ sau 1 ngày. Do vậy, cứ

sau khoảng 18h - 24h chúng tôi lại thực hiện nhúng lá dưa tươi với môi trường

lên men vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu. Sâu sinh trưởng phát triển bình

thường nên có sự lớn lên về kích cỡ và trọng lượng.

Ở các công thức thí nghiệm bố trí với các chủng Bt có hiệu quả diệt sâu

thấp (như MS23, MS26.1, MS19.3... ), chúng tôi cũng phải tiếp thêm thức ăn nhúng

dịch khuẩn cho sâu, tuy nhiên lượng thức ăn cần tiếp thêm không nhiều như lô

đối chứng âm và kích cỡ, trọng lượng của những sâu còn sống sót cũng tăng lên.

Lô thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu của các chủng BtAnhuy, H1.5 , MS21.1,

MS27.4 , MS27.1 , T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1. Sau 24h thí nghiệm, lượng thức ăn dành

cho sâu cũng giảm đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lượng

nhiều bằng lô đối chứng âm và các lô thí nghiệm khác). Tuy nhiên, từ 24h trở đi,

số lượng sâu còn sống sót không nhiều, những sâu còn sống sót thì rất yếu nên

lượng lá dưa trong các đĩa hầu như không được tiêu thụ thêm nữa. Sâu trong các

lô thí nghiệm này hầu như không tăng lên về kích cỡ và trọng lượng.

Tương tự, các lô thí nghiệm khác có sự tiêu thụ lượng lá dưa nhiều ít khác

nhau tương ứng với hiệu quả diệt sâu của từng chủng Bt tương ứng với từng lô

thí nghiệm. Hiệu quả diệt sâu thấp, lượng lá dưa sâu tiêu thụ nhiều. Hiệu quả diệt

sâu cao hơn thì lượng lá dưa cần tiếp cho sâu ăn ít hơn.

Hình 3.3: Hình ảnh về hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu

3.3-A : Hình ảnh về hiệu quả diệt sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu của

chủng H1.5

3.3-B: Hình ảnh về mẫu đối chứng âm

3.3.3.2. Sâu ăn lá cải bắp và su hào

Sâu ăn lá cải bắp và su hào Plutella xylostella Linnaeus phát triển mạnh

vào vụ Đông – Xuân. Bướm dài từ 6 - 10 mm, sải cánh rộng từ 10 - 15 mm. Cánh

trước màu nâu, giữa lưng có một dải gợn sóng, màu trắng trên bướm đực và màu

vàng trên bướm cái, chạy dài đến cuối cánh. Bướm có thể sống đến 2 tuần và đẻ

độ 200 trứng.

Ấu trùng màu xanh lục, mình nở to chính giữa, 2 đầu nhọn, thân chia đốt

rõ ràng và có 3 cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, lớn đủ sức mình sâu dài từ 8

đến 11mm. Sâu có 4 tuổi với thời gian phát triển lâu độ 7 - 10 ngày. Thời gian

làm nhộng lâu 4 - 7 ngày. Khi mới hình thành nhộng có màu xanh nhạt, khoảng 2

ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ 5 - 7mm, chung quanh nhộng

có kén bằng tơ bao phủ.

A B

Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu được bố trí trong các đĩa Petri giống như

với sâu ăn lá dưa hấu và dưa chuột, mỗi đĩa 10 sâu (tương đối đồng đều về kích

thước). Công thức đối chứng âm là môi trường lên men vô trùng. Công thức đối

chứng dương là chế phẩm thuốc trừ sâu Bt nhãn hiệu Anhuy do Trung quốc sản

xuất.

Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24h, 48h và 72h

(tính theo công thức Abbott), (xem Bảng 3.7 và xem Hình 3.4).

Bảng 3.7: Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá cải bắp và su hào chết bởi chế

phẩm Bt


Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian

24h 48h 72h1 ĐC 0 0 0

2 BtAn huy 60 100 100

3 BtK 10 50 60

4 BtT 40 40 70

5 H1.2 20 20 506 H1.5 50 90 1007 T5.1 30 60 708 T5.2 50 60 809 G6.1 20 40 9010 G6.2 20 30 3011 MS8.1 20 30 5012 MS11.1 40 60 8013 MS15.3 30 60 4014 MS16.2 40 50 9015 MS16.3 20 30 7016 MS17.1 20 50 6017 MS19.2 20 50 5018 MS21.1 40 80 9019 MS23 20 60 6020 MS26.1 20 40 50

21 MS27.1 40 70 9022 MS27.4 50 90 100

Xem kết quả ở bảng trên tôi thấy:

Công thức đối chứng âm (nhúng lá dưa với môi trường lên men vô trùng)

có tỉ lệ sâu chết 0% sau 3 ngày thí nghiệm.

Công thúc đối chứng dương (BtAnhuy) sử dụng chế phẩm Bt thương mại của

Trung quốc hiệu lực diệt sâu ăn lá Cải bắp và Su hào rất cao. Sau 48h (100%) sâu

trong thí nghiệm đều chết.

Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc đã phân lập, đáng chú

ý nhất là hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào của các chủng sau:

- Chủng H1.5, MS27.4 có hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào cao tương

đương hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào của chủng Bt thương mại của

Trung quốc. Hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào của 3 chủng như sau: Sau

24h - H1.5(50%), MS27.4(50%); sau 48h - H1.5(90%), MS27.4(90%); sau 72h –

( 100%) sâu trong thí nghiệm đều chết.

Chủng MS27.1, G6.1 , MS16.2, MS21.1 có hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su

hào cao gần bằng chủng Bt thương mại của Trung quốc và chủng H1.5 ,MS27.4 .

Hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào của 4 chủng như sau: Sau 24h -

MS27.1(40%), G6.1 (20%), MS16.2 (40%), MS21.1(40%) ; sau 48h - MS27.1(70%), G6.1

(40%), MS16.2 (50%), MS21.1(80%); Sau 72h - MS27.1(90%), G6.1 (90%), MS16.2

(90%), MS21.1(90%).

- 2 chủng có hiệu quả diệt sâu 80% sau 72h thí nghiệm là MS11.1, T5.2.

Các chủng Bt còn lại có hiệu quả diệt sâu thấp hơn.

Khi xem xét kích cỡ sâu và lượng lá cải bắp tiêu thụ ở các lô thí nghiệm

chúng tôi nhận thấy:

Sâu ăn lá cải bắp va su hào trong một ngày lượng lá sâu ăn giảm đi một

nửa, tương ứng với lượng lá cải bắp sâu đã ăn, ta thấy kích thước của sâu tăng

chậm . Do vậy, lượng lá tôi tiếp cho sâu ăn trước thí nghiệm là đầy đĩa petri đủ

cho sâu ăn trong 24h – 36h , sau đó nếu lô thí nghiệm nào sâu ăn hết thức ăn thì

sẽ phải nhúng thêm lá cải bắp tươi với dịch khuẩn tương ứng với mỗi lô thí

nghiệm để tiếp thêm cho sâu.

Ở lô đối chứng âm, lượng lá tiêu thụ hết sạch chỉ sau 36h. Do vậy, cứ sau

khoảng 24h chúng tôi lại thực hiện nhúng lá cải bắp tươi với môi trường lên men

vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu. Sâu sinh trưởng phát triển bình thường

nên có sự lớn lên về kích cỡ và trọng lượng.

Ở các công thức thí nghiệm bố trí với các chủng Bt có hiệu quả diệt sâu

thấp (như MS19.2, MS26.1, MS23...),chúng tôi cũng phải tiếp thêm thức ăn nhúng

dịch khuẩn cho sâu, tuy nhiên lượng thức ăn cần tiếp thêm không nhiều như lô

đối chứng âm và kích cỡ, trọng lượng của những sâu còn sống sót cũng tăng lên.

Lô thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu của các chủng BtAnhuy, H1.5 , MS27.4 ,

MS21.1 , MS27.1, G6.1 . Sau 24h thí nghiệm, lượng thức ăn dành cho sâu cũng giảm

đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lượng nhiều bằng lô đối

chứng âm và các lô thí nghiệm khác). Tuy nhiên, từ 24h trở đi, số lượng sâu còn

sống sót không nhiều, những sâu còn sống sót thì rất yếu nên lượng lá trong các

đĩa hầu như không được tiêu thụ thêm nữa. Sâu trong các lô thí nghiệm này hầu

như không tăng lên về kích cỡ và trọng lượng.

Tương tự, các lô thí nghiệm khác có sự tiêu thụ lượng lá nhiều ít khác nhau

tương ứng với hiệu quả diệt sâu của từng chủng Bt tương ứng với từng lô thí

nghiệm. Hiệu quả diệt sâu thấp, lượng lá cải bắp sâu tiêu thụ nhiều. Hiệu quả diệt

sâu cao hơn thì lượng lá cần tiếp cho sâu ăn ít hơn.

Từ những số liệu thống kê phần trăm hoạt lực diệt sâu ăn lá cải bắp và su

hào trên ta thấy sâu ăn lá hại cải bắp và su hào cũng là một trong những loài ký

chủ rất đặc hiệu của vi khuẩn Bt. Kết quả thử hoạt tính với hoạt lực diệt sâu cải

bắp và su hào của các chủng không thay đổi nhiều so với kết quả thử hoạt tính

đối với sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu. Điều này chứng tỏ kết quả thử hoạt tính

là tương đối chính xác, từ đó ta có thể thấy các chủng vi khuẩn Bt phân lập có

hoạt lực cao chọn được là các chủng tốt cần lưu giữ và nghiên cứu sâu hơn về

loài, chi và hoạt lực của chúng đối với các loại côn trùng khác, cũng như tìm

cách nâng cao hoạt lực của các chủng này.

Hình 3.4 : Hình ảnh về hiệu quả diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào

3.4-A: Hình ảnh diệt sâu ăn lá cải bắp và su hào của chủng MS27.4

3.4-B: Hình ảnh mẫu đối chứng âm

3.3. Kết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập

Các chủng vi khuẩn Bt phân lập đã được thuần khiết để trong ống nghiệm

ở tủ lạnh 40C, sau khi tiến hành lên men thử hoạt tính để tìm ra các chủng có hoạt

lực cao. Tôi tiến hành bảo quản các chủng bằng phương pháp cấy chuyển và

đông lạnh, nhằm lưu giữ cho các nghiên cứu lâu dài. Đối với các chủng đã được

thử hoạt tính nhưng có hoạt lực thấp, hoạt lực tương đối và các chủng chưa được

thử hoạt tính( như MS10.3, MS12.1, MS12.3...), tôi tiến hành bảo quản đông lạnh

bằng glycerol ở - 850C. Đối với các chủng đã được thử hoạt tính và được xác

định là có hoạt lực diệt sâu 90% - 100% ( như H1.5 , MS27.4 , MS21.1 , MS27.1,

MS11.1,T5.2,G6.1 ……), để tiện cho việc nghiên cứu tôi tiến hành lưu giữ ở 3 điều

kiện - 850C, - 200C và 40C. Sau khi tiến hành bảo quản 15 ngày, chúng tôi lấy

các chủng được bảo quản ra và đem nuôi trên môi trường nhân giống thấy các

chủng này phát triênt bình thường, chứng tỏ việc bảo quản đã thành công.

Kết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập tại Trung tâm Giống

& CNSH – Trường ĐHLN (xem Bảng 3.8) .

Bảng 3.8 : Kết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập

AB


Số lượng mẫu

Ở - 850C Ở - 200C Ở 40C

1 BtK 2 0 0

2 BtT 2 0 0

3 BtĐ 2 0 0

4 H1.1 2 0 0

5 H1.2 2 0 0

6 H1.3 2 0 0

7 H1.4 2 0 0

8 H1.5 2 0 2

9 T5.1 2 0 2

10 T5.2 2 0 2

11 G6.1 2 0 2

12 G6.2 2 0 0

13 MS2 2 0 0

14 MS8.1 2 0 0

15 MS8.2 2 0 0

16 MS9.1 2 0 0

17 MS9.2 2 0 0

18 MS9.3 2 0 0

19 MS10.2 2 0 0

20 MS10.3 2 0 0

21 MS10.4 2 0 0

22 MS10.5 2 0 0

23 MS11.1 2 0 2

24 MS11.2 2 0 0

25 MS12.1 2 0 0

26 MS12.3 2 0 0

27 MS13.1 2 0 0

28 MS13.3 2 0 0

29 MS14.1 2 0 0

30 MS14.2 2 0 0

31 MS14.3 2 0 0

32 MS14.4 2 0 0

33 MS15.1 2 0 0

34 MS15.2 2 0 0

35 MS15.3 2 0 0

36 MS16.1 2 0 0

37 MS16.2 2 0 2

38 MS16.3 2 0 0

39 MS16.4 2 0 0

40 MS17.1 2 0 0

41 MS17.2 2 0 0

42 MS18.1 2 0 0

43 MS18.3 2 0 0

44 MS19.1 2 0 0

45 MS19.2 2 0 0

46 MS20 2 0 0

47 MS21.1 2 0 2

48 MS21.2 2 0 0

49 MS22.1 2 0 0

50 MS22.2 2 0 0

51 MS23 2 0 0

52 MS24.1 2 0 053 MS24.2 2 0 054 MS24.3 2 0 055 MS25.1 2 0 056 MS25.2 2 0 057 MS26.1 2 0 058 MS26.2 2 0 059 MS27.1 2 0 260 MS27.2 2 0 061 MS27.3 2 0 062 MS27.4 2 0 263 MS27.5 2 0 0

64 MS28 2 0 065 MS29.1 2 0 066 MS29.2 2 0 0

KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm, chúng tôi có thể rút ra một số

kết luận như sau:

- Đã phân lập được 66 chủng vi khuẩn Bt. Trong đó:

+ Từ 3 mẫu côn trùng, phân lập được 3 chủng vi khuẩn Bt.

+ Từ 32 mẫu đất, phân lập được 63 chủng vi khuẩn Bt.

- Đã xác định được đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc của 66 chủng vi

khuẩn Bt.

- Đã xác định được hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của 66 chủng vi

khuẩn Bt.

- Đã xác định được hoạt lực diệt sâu của các chủng vi khuẩn Bt sản sinh nhiều

bào tử và tinh thể độc trong số 66 chủng đã phân lập.

+ Đối với sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu, trong số 20 chủng Bt đã xác định

được:

* Có 1/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, là các chủng H1.5 có hoạt lực

diệt sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h.

* Có 7/20 chủng có hoạt lực diệt sâu đạt 80% - 90% sau 72h; là các

chủng T5.1, MS16.2 , MS27.1, MS11.1, G6.1, MS21.1, MS27.4.

+ Đối với sâu ăn lá cải bắp và su hào, trong số 20 chủng Bt đã xác định được :

* Có 2/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, là các chủng H1.5, MS27.4 có

hoạt lực diệt sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h.

* Có 6/20 chủng có hoạt lực diệt sâu đạt 80% - 90% sau 72h; là các

chủng MS16.2 , MS27.1, MS11.1,T5.2,G6.1, MS21.1, MS11.1.

- Đã bảo quản được 66 chủng vi khuẩn Bt đã phân lập được tại Trung tâm Giống

& CNSH – Trường ĐHLN.

Tồn tại

Do thời gian thực hiện khoá luận, trang thiết bị, số lượng sâu thí nghiệm

có hạn, cũng như trình độ bản thân nên:

- Chưa xác định chính xác được các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập thuộc loài,

chi nào và chúng có bị trùng lặp hay không.

- Chưa xác định được chính xác tiềm năng của các chủng vi khuẩn Bt đã phân

lập vì tôi chỉ sử dụng môi trường nuôi cấy chung cho vi khuẩn Bt.

- Chưa xác định được chính xác hình dạng tinh thể độc của các chủng vi

khuẩn Bt đã phân lập.

- Chưa thử được hoạt lực diệt sâu của cả 66 chủng Bt đã phân lập.

- Chưa thử được hoạt lực diệt sâu với một số loại sâu hại cây nông - lâm

nghiệp khác.

Kiến nghị

- Tiếp tục phân lập thêm vi khuẩn Bt ở các địa điểm khác quanh khu vực

Trường ĐHLN (đây là một địa điểm có tiềm năng xuất hiện Bt với tần suất

cao và có hoạt lực diệt sâu mạnh).

- Thử hoạt lực diệt một số loài sâu khác (ngoài sâu dưa) của tất cả các chủng

Bt đã phân lâp.

- Tiếp tục nghiên cứu xác định các chủng vi khuẩn Bt đã xác định là có hoạt

lực mạnh ( như H1.5, MS21.1,và MS27.4) thuộc loài, chi nào, chúng có bị trùng

lặp hay không và tìm cách nâng cao hoạt lực diệt sâu của chúng. Tìm ra môi

trường nuôi cấy phù hợp nhất đối với từng chủng, để chúng có khả năng phát

triển và sinh tinh thể độc tốt nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải( 1998), “

Gen kháng côn trùng và ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật “ . Kỉ yếu

viên công nghệ sinh học.

2. Lưu Đình Thúy (2005), Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus

thruringiensis và ứng dụng trong phòng trừ sâu hại ( Khóa luận tôt nghiệp ).

3. Ngô Đình Bính ( 2005), “ Thuốc trừ sâu vi sinh” Nhà xuất bản Đại Học Quốc

Gia Hà Nội, tr 10 – 43.

4. Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Đình Quyến(1998), “Nghiên cứu sản xuất thuốc

trừ sâu Bt và ứng dụng trong phòng trừ sâu hại ”, Báo cáo nghiệm thu nhánh đề

tài thuộc dự án hợp tác Việt Nam – CHLB Đức. VNM 9510-017.

5. Nguyễn Lân Dũng,( 1981). Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng,

nhà xuất bản KHKT.

6. Ngô Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn

Ánh Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cường( 2000), “Nghiên cứu sự

phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus thurigiensis phân lập ở một số tỉnh ở

Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học, Nhà

xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 484 – 488.

7. Nguyễn Thị Thanh Vân (1996), Nghiên cứu điều kiện đơn giản nhân giống

Bacillus thurigiensis, lựa chọn phương pháp sản xuất giống để cung cấp cho

các vùng trồng rau sạch.( Luận văn thạc sĩ sinh học).

8. Phạm Thị Thuỳ (2004). Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, NXB Đại

học quốc gia Hà Nội, tr 235 - 243.

Tài liệu tiếng Anh

9. Amos Navon(1993), “Control of Lepidoteran pets with Bacillus thurigiensis ",

Bacillus thurigiensis an environment biopestiside theory and practide, tr 126 –

146.

10. Chilcot C.N and P. J Wigley (1994), “Insecticidal activity of Bacillus

thurigiensis crystal protein", Proceeding of the 2nd Canberra meeting on

Bacillus thurigiensis, tr 43 – 52.

11. Choma C . T . W. K. surewicz, P. R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor and H.

Kaplan (1990), Unusual proteolysis of the protoxin and toxin Bacillus

thurigiensis”, Eur.J. Biochem189: tr 523 – 527.

12. Deluca A.J, Simonson J.G and larson A. D(1981), “Bacillus thurigiensis

distribution on soil of the United States”, Microbiol, 27: tr 865 – 870.

13. Hofte. H and H. R. Whitelog (1989) “Insecticidal crystal protein of Bacillus

thurigiensis", Microbiol. Rev. 53: tr 242 – 255.

14. Iizuka T(1999), “Historical review on Bacillus thurigiensis", Biotechnology

of Bacillus thurigiensis, Eds : Yuzinin, Sun Ming and Liu Ziduo, Vol 3: tr 3-

5.

15. Laurent P. H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M(1996),

“ A micromethod for serotyring Bacillus thurigiensis”, Microbiol.22: tr 259-261.

16. Pries F . G(1992), “ Biological control of Mosquitoes and other bitting flies

by Bacillus thurigiensis and B sphaericus”, Journal of Applied

Bacteriology,72: tr 357- 369

17. Powel, C.A. Charlton and T. Yanamoto(1994), “Recent advences in structure

and fuction reseach on Bacillus thurigiensis crystal protein”, Bacillus

thurigiensis biotechnology and environmental benefits, Vol 1: tr 1-20.

18. Sakhi. V. F. P. Parenti, G.M.Hanazet, B.Giordara, P . Lluthy(1986), “Bacillus

thurigiensis toxin inhibits K+ - gradient dependent amino acid transport across

the brush border membrane of pieris brassicae midgut cell”, Microbiol

Rev.53: tr 213 – 218.

19. Thiery and E. Frachon( 1997), “ Indentification, isolation culture and

preservation enbromo pathogenic Biologocal techniques manual of

technology in Insect pathology”, A academicpress, tr 55 – 56.

Các trang web

20. http\\:www.agbiotech.com.vn

21. http\\:www.ebook.edu.vn

22. http\\:www.thiennhien.net

Documents

Bckhoa Luan(Tien)