biochemj00616-0152

7/21/2019 biochemj00616-0152

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B i o c h e m . J .

1 9 7 2 )

1 3 0 ,

1 0 4 5 - 1 0 5 4

P r i n t e d

i n G r e a t

B r i t a i n

B i o s y n t h e s i s o f G e r a n i o l a n d N e r o l a n d

t h e i r

P - D - G l u c o s i d e s

i n

P e l a r g o n i u m

g r a v e o l e n s a n d

R o s a

d i l e c t a

B y

DEREK

V . BANTHORPE

a n d GEOFFREY

N .

J . LE

PATOUREL

C h r i s t o p h e r

I n g o l d L a b o r a t o r i e s ,

U n i v e r s i t y

C o l l e g e

L o n d o n ,

2 0

G o r d o n

S t r e e t ,

L o n d o n

WCIH

O A J , U . K .

a n d

MARTIN J . 0 .

FRANCIS

U n i l e v e r

R e s e a r c h

L a b o r a t o r y ,

C o l w o r t h

H o u s e ,

S h a r n b r o o k , B e d f o r d ,

U . K .

( R e c e i v e d

2 5

J u l y

1 9 7 2 )

1 .

3 R - [ 2 - 1 4 C ] M e v a l o n a t e

w a s

i n c o r p o r a t e d

i n t o

g e r a n y l

a n d

n e r y l

, B - D - g l u c o s i d e s

i n

p e t a l s

o f

R o s a

d i l e c t a

i n

u p

t o

1 0 . 6 y i e l d ,

a n d t h e

t e r p e n o i d p a r t

was

s p e c i f i c a l l y

a n d

e q u i v a l e n t l y

l a b e l l e d i n t h e

m o i e t i e s

d e r i v e d f r o m

i s o p e n t e n y l

p y r o p h o s p h a t e

a n d

3 , 3 -

d i m e t h y l a l l y l

p y r o p h o s p h a t e .

A

s i m i l a r

l a b e l l i n g p a t t e r n ,

w i t h

i n c o r p o r a t i o n s

o f

0 . 0 6 - 0 . 1

w a s

f o u n d

f o r

g e r a n i o l

o r

n e r o l

f o r m e d

i n

l e a v e s

o f


g r a v e o l e n s

T h e

f o r m e r

r e s u l t s

p r o v i d e

t h e

b e s t

a v a i l a b l e

e v i d e n c e

f o r

t h e

m e v a l o n o i d

r o u t e t o

r e g u l a r

m o n o t e r p e n e s

i n

h i g h e r

p l a n t s .

2 .

I n c o r p o r a t i o n

s t u d i e s

w i t h

3 R S - [ 2 - 4 C , 4 R ) - 4 - 3 H 1 ] -

m e v a l o n a t e

a n d i t s

4 S ) - i s o m e r s h o w e d

t h a t

t h e

p r o - 4 R

h y d r o g e n

atom

o f

t h e

p r e c u r s o r

w a s

r e t a i n e d a n d

t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n

a t o m w a s

e l i m i n a t e d

i n

b o t h

a l c o h o l s a n d

b o t h

g l u c o s i d e s . T h e s e

r e s u l t s s u g g e s t

t h a t

t h e

c o r r e l a t i o n

o f

r e t e n t i o n

o f t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n

a t o m o f m e v a l o n a t e

w i t h f o r m a t i o n

o f a

c i s - s u b s t i t u t e d

d o u b l e

b o n d ,

s u c h

a s

h a s b e e n

f o u n d

i n

c e r t a i n

h i g h e r

t e r p e n o i d s ,

d o e s

n o t

a p p l y

t o

t h e

b i o s y n t h e s i s

o f

m o n o t e r p e n e s .

I t i s

p r o p o s e d

t h a t

e i t h e r n e r o l i s

d e r i v e d

f r o m

i s o m e r i z a t i o n

o f

g e r a n i o l

o r t h e

t w o

a l c o h o l s

a r e

d i r e c t l y

f o r m e d

b y

d i f f e r e n t

p r e n y l t r a n s f e r a s e s .

P o s s i b l e

m e c h a n i s m s

f o r

t h e s e

p r o c e s s e s

a r e

d i s c u s s e d .

3 .

T h e

e x p e r i m e n t s

w i t h

[ 1 4 C , 3 H ] m e v a l o n a t e a l s o s h o w

t h a t

i n t h e s e

h i g h e r

p l a n t s ,

a s

h a s b e e n

p r e v i o u s l y

f o u n d

i n

a n i m a l

t i s s u e

a n d

y e a s t ,

t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n a t o m o f

m e v a l o n a t e w a s

l o s t

i n

t h e

c o n v e r s i o n

o f

i s o p e n t e n y l p y r o -

p h o s p h a t e

i n t o

3 , 3 - d i m e t h y l a l l y l

p y r o p h o s p h a t e .

M o n o t e r p e n e


i s

b e l i e v e d

t o

i n v o l v e

t h e

c o n v e r s i o n

o f

m e v a l o n a t e

i n t o

i s o p e n t e n y l p y r o p h o s -

p h a t e

a n d

3 , 3 - d i m e t h y l a l l y l

p y r o p h o s p h a t e ,

w h i c h

i n

t u r n c o n d e n s e

t o f o r m

g e r a n y l


F r a n c i s ,

1 9 7 1 ) .

H o w e v e r ,

i n c o r p o r a t i o n s o f

m e v a l o n -

a t e

i n t o

t h e


o f

h i g h e r

p l a n t s a re

u s u a l l y

e x t r e m e l y l o w ,

o f t e n

b e l o w 0 . 0 1

( B a n t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 2 a ) , a n d

t h e s e

v a l u e s

w o u l d

n o t

q u a l i f y

t h e

compound

t o

b e

a n

o b l i g a t e

precursor w i t h o u t :

a )

i t s

w e l l - a u t h e n t i c a t e d

r o l e i n

t h e


o f

h i g h e r

t e r p e n e s

C l a y t o n ,

1 9 6 5 a , b ) ;

b )

t h e

s p e c i f i c

l a b e l l i n g

p a t t e r n s o b s e r v e d i n

s e v e r a l


a f t e r

i n c o r p o r a t i o n o f

a p p r o p r i a t e l y

l a b e l l e d

m a t e r i a l

( B a n t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 0 ;

B a n t h o r p e

B a x e n d a l e ,

1 9 7 0 ;

B a n t h o r p e

C h a r l w o o d ,

1 9 7 1 ;

B a n t h o r p e

e t

a l . , 1 9 7 2 b ) ;

c )

t h e l a c k

o f

a

r e a s o n a b l e

a l t e r n a t i v e

p a t h w a y

t o

t h e s e

c o m p o u n d s .

3 R - [ 2 - 1 4 C ] M e v a l o n a t e

w a s

r e c e n t l y

f o u n d

t o b e


very

e f f i c i e n t l y

a p p r o x . 2 2

)

i n t o

t h e


f o r m e d i n

t h e

p e t a l s o f

R o s a

d i l e c t a

c v .

L a d y

S e a t o n

F r a n c i s

O ' C o n n e l l , 1 9 6 9 ; F r a n c i s

A l l c o c k ,

1 9 6 9 ) .

We

now

r e p o r t

t h e

l a b e l l i n g

p a t t e r n

o b t a i n e d i n

g e r a n i o l

I ;

3 , 7 - d i m e t h y l o c t a - t r a n s - 2 , 6 -

d i e n - 1 - o l ) ,

n e r o l

I I ;

3 , 7 - d i m e t h y l o c t a - c i s - 2 , 6 - d i e n - 1 -

V o l . 1 3 0

o l )

a n d

t h e i r

f l - D - g l u c o s i d e s

f o r m e d

i n

s i m i l a r

e x p e r i -

m e n t s . We

h a v e a l s o

d e t e r m i n e d

t h e

s t e r e o c h e m i s t r y

o f

p r o t o n

l o s s

i n t h e

f o r m a t i o n

o f t h e

t r a n s -

a n d

c i s -

s u b s t i t u t e d

d o u b l e

b o n d s i n t h e s e

c o m p o u n d s .

P a r t

o f

t h i s

w o r k h a s

b e e n

p r e s e n t e d

as

a

p r e l i m i n a r y

c o m m u n i c a t i o n

F r a n c i s

e t

a l . ,

1 9 7 0 ) .

R e s u l t s

S t u d i e s

w i t h

1 4 C

G e r a n i o l

a n d n e r o l

o c c u r r i n g

f r e e

i n t h e

l e a v e s

o f


g r a v e o l e n s

A i t .

( F a m i l y

G e r a n i a c e a e )

a n d

o b t a i n e d

b y

e n z y m i c

h y d r o l y s i s

o f

t h e

co r-

r e s p o n d i n g

f l - D - g l u c o s i d e s t h a t

w e r e

e x t r a c t e d

f r o m

t h e

p e t a l s

o f

R o s a

d i l e c t a cv.

Lady S e a t o n

( F a m i l y

R o s a c e a e )

w e r e

i s o l a t e d

a f t e r

a d m i n i s t r a t i o n

o f

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e t o t h e

two p l a n t

s p e c i e s . The

i s o l a t e d

m o n o t e r p e n e

a l c o h o l s

w e r e

r i g o r o u s l y p u r i -

f i e d

t o

c o n s t a n t

s p e c i f i c

r a d i o a c t i v i t y

a n d

w e r e t h e n

d e g r a d e d

a s

s h o w n

i n

S c h e m e

1 .

T h e

f r e e

a l c o h o l s

f r o m

t h e

p e t a l s

o f R .

d i l e c t a

w e r e

l a b e l l e d

t o

a

r e l a t i v e l y

s m a l l

e x t e n t

a p p r o x . 0 . 9

o f

a d m i n i s t e r e d

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

i n

t h e s e


c o m p a r e d

1 0 4 5

7/21/2019 biochemj00616-0152


D . V . BANTHORPE, G .

N .

J . LE PATOUREL

AND

M .

J . 0 .

FRANCIS

o r

I )

I I )

2 C O 2 H

+

C H I 3

C O 2 H

I X )

X )

L C O N 3

CON3

X I )

NCO

l N C O

X I I )

I I I )

I V )

0

CO2H

+

+ ( C H 3 ) 2 C O

C 0 2 1 {

C O 2 H

V )

V I ) V I I )

) H C 0 2 E t

- N H C O , 2 E t

X I I I )

C H 1 3

+

CH3CO2H

V I I I )

[

NH2

+

CO

NH2

( X I V ) ( X V )

S c h e m e

1 . D e g r a d a t i o n s c h e m e s f o r g e r a n i o l

a n d

n e r o l

I ) G e r a n i o l ;

1 I )

n e r o l ; V ) l a e v u l i n i c

a c i d ; V I )

o x a l i c

a c i d ; V I I )

a c e t o n e ; V I I I )

i o d o f o r m ;

I X )

s u c c i n i c

a c i d ;

( X ) i o d o f o r m ; ( X I V )

e t h y l e n e d i a m i n e ; ( X V )

c a r b o n

d i o x i d e .

w i t h t h e

u p t a k e s

i n t o

t h e c o r r e s p o n d i n g g l u c o s i d e s

s e e

T a b l e

1 ) ,

a n d

w e r e n o t f u r t h e r i n v e s t i g a t e d .

D i l u t i o n

f a c t o r s

a r e

n o t

r e c o r d e d , a s

t h e s e

h a v e

l i t t l e

m e a n i n g u n l e s s t h e y

r e f e r t o t r u e m e t a b o l i c

p o o l s , a n d

t h e r e i s

r e a s o n t o b e l i e v e

( B a n t h o r p e e t

a l . ,

1 9 7 2 a )

t h a t

c o m p a r t m e n t a t i o n e f f e c t s a n d

t h e

i s o l a t e d s i t u -

a t i o n

o f

b i o s y n t h e t i c

s i t e s c a n l e a d t o l a r g e ,

v a r i a b l e

a n d

i s o l a t e d

p o o l s o f m n a n y t e r p e n o i d s .

I n

n o c a s e

d i d

t h e

s u g a r

m o i e t y

o f t h e g l u c o s i d e s

c o n t a i n

t r a c e r .

T h e

s p e c i f i c

r a d l o a c t i v i t i e s

o f

m o n o -

t e r p e n o l s a f t e r

a d d i t i o n o f

c a r r i e r

a n d

d e g r a d a t i o n

o f

p r o d u c t s

a r e

r e c o r d e d

i n

T a b l e 1 . T h e s e

a c t i v i t i e s

h a d

s t a n d a r d d e v i a t i o n s

i n

d i f f e r e n t

e x p e r i m e n t s o f

+ 2

t o ±5

o f

t h e

q u o t e d

v a l u e s .

D o u b l e - l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s

T h e

3 H / ' 4 C

r a t i o s i n f r e e

t e r p e n o l s

a n d

t h e i r

/ B -

g l u c o s i d e s i s o l a t e d

a f t e r t h e

p l a n t

t i s s u e h a d

b e e n

g i v e n

s p e c i f i c a l l y

l a b e l l e d

[ 1 4 C ,

3 H ] m e v a l o n a t e

a r e

1 9 7 2

1 0 4 6

7/21/2019 biochemj00616-0152


BIOSYNTHESIS

OF

GERANIOL

AND NEROL AND

THEIR

GLUCOSIDES

T a b l e

1 . R a d i o a c t i v e

t r a c e r

p a t t e r n i n

m o n o t e r p e n e s a f t e r u p t a k e

o f 3 R S - [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

F o r

e x p e r i m e n t a l

d e t a i l s s e e t h e

t e x t .

T h e

t i m e

o f

h a r v e s t i n g

a f t e r i n i t i a l a d m i n i s t r a t i o n

o f t r a c e r s i s

s h o w n .

A

r e f e r s

t o

s p e c i f i c

r a d i o a c t i v i t i e s

o f

i n i t i a l d e g r a d a t i o n

p r o d u c t s ,

a n d

B

t o

s p e c i f i c


a f t e r

a d d i t i o n

o f

c o m p o u n d

( V )

a s

c a r r i e r

a n d f u r t h e r

d e g r a d a t i o n .

F o r

i d e n t i t y

o f

I ) - { X V )

s e e S c h e m e

1 .

Compound

G e r a n i o l

( f r o m

g l u c o s i d e )

N e r o l ( f r o m

g l u c o s i d e )

G e r a n i o l

N e r o l

S o u r c e

R .

d i l e c t a

p e t a l s

R . d i l e c t a

p e t a l s

P . g r a v e o l e n s

l e a v e s

P .

g r a v e o l e n s

l e a v e s

T i m e

3 R - 2 - 1 4 C ] M e v a l o n a t e

h )


( )

1

1

1 0 . 6

0 . 2 5 - 0 . 5

2 4

2 4

0 . 1

0 . 0 6

S p e c i f i c


d . p . m . / m m o l )

A :

I ) 8 6 6 2 0 ;

V )

4 4 6 8 0 ;

V I I )

4 3 9 4 0 ; V I )

0 ;

V I I I )

2 1 5 0 0

B : ( X )

0 ;

I X ) 5 2 4 4 ;

( X I V )

5 1 9 0 ;

( X V )

0

A :

I I )

1 7 5 8 0 ;

V ) 8 0 9 8 ;

V I I )

9 7 4 3 ;

V I )

0 ; ( X )

0

B :

I X ) 2 8 0 9 ; ( X I V )

2 5 6 2 ;

( X V )

0

V )

3 7 7 9 ; V I I )

3 3 7 2

I I )

5 6 8 4 ;

V ) 2 6 0 6 ;

V I I )

2 5 8 0

T a b l e

2 .

R a d i o a c t i v e

t r a c e r i n

p r o d u c t s a f t e r

f e e d i n g

[ I 4 C , 3 H ] m e v a l o n a t e

t o

p l a n t s

F o r

e x p e r i m e n t a l d e t a i l s

s e e t h e t e x t .

E r r o r s i n

a l l

i n i t i a l r a t i o s a r e

± 0 . 0 4 , a n d

f o r

p r o d u c t s

( m o n o t e r p e n e )

a r e

± 0 . 0 4 f o r

e x p e r i m e n t s o n

R . d i l e c t a a n d

± 0 . 0 3 f o r

o t h e r s . C o u n t s i n e a c h

i s o t o p e

c h a n n e l w e r e

m e a s u r e d

i n

d . p . m . :

t y p i c a l l y

t h e 4 C


w a s

5 0 0 - 5 0 0 0 d . p . m .

L a b e l l e d

3 R S - m e v a l o n a t e

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) 4 3 H , ]

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) _ 4 _ 3 H 1 ]

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) - _ 4 3 H , ]

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) _ 4 _ 3 H ,

[ 2 - 4 C , 4 R ) _ 4 _ 3 H , ]

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) - _ 4 3 H 1 ]

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) 4 3 H , ]

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) _ 4 _ 3 H j ]

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) - 4 - 3 H I ]

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) _ 4 _ 3 H I ]

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) - 4 - 3 H I )

P r o d u c t

G e r a n i o l

G e r a n i o l

N e r o l

G e r a n y l g l u c o s i d e

G e r a n y l g l u c o s i d e

N e r y l g l u c o s i d e

N e r y l

g l u c o s i d e

G e r a n i o l

G e r a n i o l

N e r o l

N e r o l

S o u r c e

R .

d i l e c t a

p e t a l s

R .

d i l e c t a

p e t a l s

R . d i l e c t a

p e t a l s

R .

d i l e c t a p e t a l s

R .


R .


R .


P .

g r a v e o l e n s

l e a v e s


l e a v e s

P .

g r a v e o l e n s l e a v e s

P .

g r a v e o l e n s

l e a v e s

I n i t i a l

3 H / 1 4 C

r a t i o

i n

m e v a l o n a t e

1 . 2 5

1 . 9 9

1 . 9 9

1 . 2 5

1 . 9 9

1 . 2 5

1 . 9 9

0 . 5 7

0 . 8 0

0 . 5 7

0 . 8 0

3 H / 1 4 C

r a t i o

i n

p r o d u c t

0 . 0 8

1 . 9 1

2 . 2 0

0 . 0 6

1 . 9 6

0 . 0 9

2 . 3 1

0 . 1 3

0 . 7 5

0 . 0 8

0 . 7 9

r e c o r d e d i n

T a b l e

2 . I n t h e

e x p e r i m e n t s w i t h R .

d i l e c t a ,

3 R - [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e w a s


i n t o

g l u c o s i d e s a n d

f r e e

a l c o h o l s t o t h e

e x t e n t o f 8 . 2 a n d

3 . 0

r e s p e c t i v e l y .

I n c o r p o r a t i o n s i n t o t h e

f r e e

a l c o h o l s

i n

t h i s

s e t

o f

e x p e r i m e n t s w e r e

c o n s i d e r a b l y

h i g h e r

t h a n

t h o s e l i s t e d

i n t h e

p r e v i o u s s e c t i o n .

T h e

r e a s o n s

f o r t h e s e

d i f f e r e n c e s

a r e

n o t

known

b u t m a y

b e

r e l a t e d

t o

t h e

f a c t

t h a t

t h e

f l o w e r s

u s e d i n

t h e


w i t h

[ 4 C ] m e v a l o n a t e

w e r e p r o d u c e d

i n

g r e e n h o u s e

c o n d i t i o n s , w h e r e a s

t h e


w i t h

V 1 4 C ,

3 H ] m e v a l o n a t e u s e d

f l o w e r s g r o w n u n d e r

n a t u r a l c o n d i t i o n s .

I n c o r p o r a t i o n s

o f 3 R - m e v a l o n a t e

V o l . 1 3 0

i n t o f r e e

a l c o h o l s

i n


w e r e

a l m o s t

i d e n t i c a l

w i t h t h o s e

f o u n d

i n

t h e

p r e v i o u s

s e t .

B o t h

s e t s

o f

e x p e r i m e n t s o n t h i s

s p e c i e s u s e d

f l o w e r s

g r o w n

u n d e r n a t u r a l

c o n d i t i o n s .

P h o s p h o r y l a t e d d e r i v a t i v e s

o f m e v a l o n a t e

C h r o m a t o g r a p h y

o f

e x t r a c t s o f

l e a v e s o f

P .

g r a v e o l e n s

a t

5 . 5 h

a f t e r

u p t a k e

o f

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

s h o w e d t h a t

m e v a l o n i c

a c i d

5 - p h o s p h a t e , m e v a l o n i c

a c i d

5 - p y r o p h o s p h a t e

a n d


p y r o p h o s -

p h a t e

w e r e

p r e s e n t ,

w i t h


o f

0 . 8 ,

0 . 6

1 0 4 7

7/21/2019 biochemj00616-0152


D .

V .

BANTHORPE,

G .

N . J .

LE

PATOUREL

AND

M.

J . 0 .

FRANCIS

a n d 0 . 2

t r a c e r r e s p e c t i v e l y f r o m t h e 3 R - m e v a l o n a t e

p r e c u r s o r .

D i s c u s s i o n

P a t t e r n

o f 1 4 C

l a b e l l i n g

D e g r a d a t i o n

o f

g e r a n i o l

a n d

n e r o l i s o l a t e d

f r o m

t h e , B - D - g l u c o s i d e s

b i o s y n t h e s i z e d

i n

p e t a l s o f

R o s a

d i l e c t a c v .

L a d y

S e a t o n

r e v e a l e d

t h a t

t h e t r a c e r

i n c o r p o r a t e d f r o m [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

w a s d i s t r i b u t e d

e q u a l l y w i t h i n t h e

e x p e r i m e n t a l

e r r o r )

b e t w e e n

( C - 4 + C - 5 ) a n d

( C - 8 + C - 1 0 ) s e e

f o r m u l a

X V I ) .

On

b i o g e n e t i c

g r o u n d s

t h e l o c a t i o n s c a n

b e

a l m o s t

c e r -

t a i n l y

a s s i g n e d

t o

( C - 4 + C - 1 0 ) .

T h e


o b s e r v e d

f o r

t h e

t e r p e n e

g l u c o s i d e s

T a b l e 1 ) r e p r e s e n t

a n i n c r e a s e

b y

a

f a c t o r

o f

1 0 2 _ 1 0 3 o v e r

t h o s e

t y p i c a l l y

o b t a i n e d f o r t h e


f o r m e d

i n t h e

f o l i a g e

o f

h i g h e r

p l a n t s

( B a n t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 2 a ) ,

a n d

t o -

g e t h e r

w i t h t h e

p o s i t i o n s p e c i f i c i t y

o f

l a b e l l i n g p r o v i d e

t h e b e s t

e v i d e n c e t o

d a t e

f o r

t h e

m e v a l o n o i d r o u t e

t o


o f t h e

c o n v e n t i o n a l

t y p e , a l t h o u g h

h i g h

a n d

p o s i t i o n - s p e c i f i c


h a v e b e e n

r e c o r d e d

f o r c e r t a i n

i r r e g u l a r m o n o t e r p e n e s

a n d t h o s e

o f

t h e

c y c l o p e n t a n o i d g r o u p

( B a n t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 2 a ) .

T h e


o f

t r a c e r

i n t o t h e f r e e

m o n o -

t e r p e n e s i n p e t a l s

w a s a l s o

s o m e

1 0 - 1 0 2 - f o l d

g r e a t e r

t h a n t h o s e

g e n e r a l l y

f o u n d i n l e a f t i s s u e .

S e v e r a l r a t i o n a l i z a t i o n s

h a v e

b e e n

p r o p o s e d

( B a n t h o r p e e t

a l . , 1 9 7 0 )

f o r

t h e

g e n e r a l l y

f o u n d l o w


o f

m e v a l o n a t e

i n t o t h e l e a f

mono-

t e r p e n e s ,

a n d

t w o o f

t h e s e

i n

p a r t i c u l a r t h e

o c c u r -

r e n c e

o f

c o m p a r t m e n t a t i o n

e f f e c t s a n d t h e

s h u n t i n g

o f

p r e c u r s o r

i n t o c a r o t e n o i d s a n d

s t e r o i d s )

m ay

b e

much

l e s s

i m p o r t a n t

i n

p e t a l s

t h a n

i n

l e a f

t i s s u e .

A

c o m p a r i s o n

w i t h

t h e


o f

u n c o n -

j u g a t e d g e r a n i o l

a n d

n e r o l

i n l e a v e s

i s

p r o v i d e d

b y

t h e w o r k

w i t h P e l a r g o n i u m g r a v e o l e n s .

H e r e ,

u p t a k e

o f

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

a g a i n

r e s u l t e d

i n

e q u i v a l e n t

l a b e l l i n g

a t

C - 4

a n d

C - 1 0 ,

b u t

t h e


i n t o

g e r a n i o l a l t h o u g h h i g h

f o r

l e a f

m o n o t e r p e n e s )

w e r e s o m e 1 0 0 - f o l d

l e s s t h a n i n t h e

r o s e

p e t a l s .

T h e

t i m e

o f

maximum

i n c o r p o r a t i o n

o f

t r a c e r f r o m

a d m i n i s t e r e d

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

w a s

a b o u t

1 h

f o r

t h e

t e r p e n e

g l u c o s i d e s

o f

R .

d i l e c t a

F r a n c i s

O C o n n e l l ,

1 9 6 9 ) .

We

f o u n d

t h e

c o r r e s p o n d i n g

t i m e

f o r

g e r a n i o l

a n d

n e r o l i n

P .

g r a v e o l e n s

t o

b e

a p p r o x .

2 4 h ;

t h i s

i s


l e s s

t h a n

t h a t

a p p r o x .

4 - 5

d a y s )

f o r

mono-

a n d

b i - c y c l i c m o n o t e r p e n e s

f u r t h e r

a l o n g

t h e

p r e s u m e d b i o s y n t h e t i c

p a t h w a y

( B a n t h o r p e

e t a l . , 1 9 7 0 ; B a n t h o r p e

B a x e n d a l e , 1 9 7 0 ;

B a n t h o r p e

C h a r l w o o d , 1 9 7 1 ;

B a n t h o r p e

e t

a l . , 1 9 7 2 b ) .

An

i m p o r t a n t

d i f f e r e n c e

b e t w e e n b o t h

t h e s e s e t s

o f

l a b e l l i n g p a t t e r n s

a n d

t h o s e

o b t a i n e d f o r

t h u j a n e

d e r i v a t i v e s

( B a n t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 0 ) , c a m p h o r

( B a n t h o r p e

B a x e n d a l e ,

1 9 7 0 ) ,

a r t e m i s i a k e t o n e

( B a n t h o r p e

C h a r l w o o d , 1 9 7 1 ) , p u l e g o n e B a n -

t h o r p e

e t

a l . ,

1 9 7 2 b ) ,

p o s s i b l y )

c i t r a l

N e e t h l i n g

e t

'10

-1_

( X V I )

X V I I )

a l . ,

1 9 6 3 )

a n d

f o r

c e r t a i n

s e s q u i t e r p e n e s

B i o l l a z

A r i g o n i , 1 9 6 9 ; C r o t e a u

L o o m i s ,

1 9 7 2 )

i s t h a t i n

t h e

p r e s e n t w o r k

e q u a l

l a b e l l i n g

o f

t h e m o i e t i e s

d e r i v e d

f r o m

i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e

a n d

3 , 3 - d i m e t h y l -

a l l y l

p y r o p h o s p h a t e w a s

o b s e r v e d , w h e r e a s p r e f -

e r e n t i a l

l a b e l l i n g u s u a l l y g r e a t e r t h a n

9 5 )

i n t o

t h a t

p a r t d e r i v e d f r o m i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e

( f o r m u l a

X V I I ,

A )

w a s

f o u n d

p r e v i o u s l y .

A

p r i o r i ,

t h e r e i s

n o r e a s o n

t o

s u p p o s e t h a t t h e

s p e c i f i c

r a d i o -

a c t i v i t i e s o f

t h e m o i e t i e s

A

a n d

B

i n t h e

s k e l e t o n

( X V I I )

s h o u l d

b e t h e

s a m e ,

a s


p y r o -

p h o s p h a t e

a n d 3 , 3 - d i m e t h y l a l l y l p y r o p h o s p h a t e

c o u l d b e d i l u t e d t o

d i f f e r i n g e x t e n t s b y

i n a c t i v e

p r e c u r s o r s

i n

m e t a b o l i c

p o o l s o f v a r i o u s

s i z e s ,

b u t

t h e a s y m m e t r i c a l

l a b e l l i n g p a t t e r n w a s

c o n t r a r y

t o

e x p e c t a t i o n

C l a y t o n ,

1 9 6 5 a ;

W a l l e r ,

1 9 6 9 ) .

O u r

p r e s e n t l y r e p o r t e d e x a m p l e s o f s y m m e t r i c a l

l a b e l l i n g

a n d a

s i m i l a r r e c e n t

r e p o r t f o r l i n a l o o l

f o r m e d

i n

C i n n a m o n u m

c a m p h o r a

( S u g a

e t

a l . ,

1 9 7 1 )

s u g g e s t

t h a t

s u c h p a t t e r n s

may o c c u r b o t h i n

p e t a l s

( w h e r e

h i g h


o f p r e c u r s o r

o c c u r )

a n d

i n

l e a v e s

w i t h

l o w

i n c o r p o r a t i o n s ) a n d b o t h

i n

f r e e t e r p e n o l s

a n d

i n

t h o s e

c o n j u g a t e d

a s

g l u c o s i d e s .

I t

may b e

s i g n i f i c a n t t h a t s y m m e t r i c a l l a b e l l i n g

o c c u r r e d

f o r

t h e

f i r s t - f o r m e d

m o n o t e r p e n e s g e r a n i o l ,

n e r o l a n d l i n a l o o l ) w h e r e a s t h e


p a t t e r n

w a s

f o u n d f o r d e r i v e d

m o n o t e r p e n e s . T h i s

may

i n d i c a t e t h a t

t h e s e

t h r e e m o n o t e r p e n e s

( w h i c h

ma y

b e

r e a d i l y

i n t e r c o n v e r t i b l e i n

v i v o ;

s e e

b e l o w )

ma y

e x i s t

i n

m o r e t h a n

o n e

m e t a b o l i c p o o l .

M e v a l o n a t e

m ay b e

r a p i d l y

i n c o r p o r a t e d i n t o t h e c o n s t i t u e n t s

o f

o n e s u c h

p o o l

t o

g i v e

p r o d u c t s

w i t h

s y m m e t r i c a l

l a b e l l i n g p a t t e r n s

t h a t

a c c u m u l a t e o r a r e

u s e d

a s

p r e c u r s o r s f o r

h i g h e r

t e r p e n o i d s ,

w h e r e a s

t h e

s a m e

p r e c u r s o r m ay

b e


i n t o

t h e

c o m p o n e n t s

o f a n o t h e r

p o o l

t o a

much l e s s e r e x t e n t

t o

g i v e

a s y m m e t r i c a l l y

l a b e l l e d

p r o d u c t s

t h a t c a n

a c t a s

p r e c u r s o r s

o f

o t h e r

m o n o t e r p e n e s .

T h e

a s y m m e t r y

o f

l a b e l l i n g

c o u l d

r e s u l t

f r o m

t h e

p r e s e n c e o f e n d o -

g e n o u s

3 , 3 - d i m e t h y l a l l y l p yr o p h o sp h a t e ( B a n t h o r p e

e t

a l . , 1 9 7 0 ) .

T h e

i d e a

o f

d i f f e r e n t

m e t a b o l i c

p o o l s

i s

c o n s i s t e n t w i t h t h e

o c c u r r e n c e

o f

s y n t h e s i s o f mono-

t e r p e n e s a n d

h i g h e r t e r p e n e s

a t d i f f e r e n t

s i t e s i n t h e

p l a n t W a l l e r ,

1 9 6 9 ;

C r o t e a u

L o o m i s ,

1 9 7 2 )

a n d

w i t h

l i m i t e d

r e s u l t s

C l a y t o n , 1 9 6 5 a , b ; W a l l e r , 1 9 6 9 )

s u g g e s t i n g t h a t ,

i n

c o n t r a s t

t o t h e

p a t t e r n

o f

a s y m -

m e t r i c

l a b e l l i n g

f o u n d

i n

m o n o t e r p e n e s ,

p h y t o s t e r o l s

1 9 7 2

1 0 4 8

7/21/2019 biochemj00616-0152


BIOSYNTHESIS

OF

GERANIOL AND NEROL

AND THEIR GLUCOSIDES

a n d

c a r o t e n o i d s

f o r m e d

i n

p l a n t s

f r o m

[ 2 - 1 4 C ] -

m e v a l o n a t e s h o w

a s ym m e t r i c a l

l a b e l l i n g p a t t e r n .


o f

0 . 8 ,

0 . 6 a n d 0 . 2

o f

3 R - [ 2 - 1 4 C ] -

m e v a l o n a t e

i n t o

m e v a l o n i c

a c i d

5 - p h o s p h a t e ,

m e v a -

I o n i c

a c i d 5 - p y r o p h o s p h a t e

a n d

i s o p e n t e n y l p y r o -

p h o s p h a t e

i n

l e a v e s

o f P .

g r a v e o l e n s

o c c u r r e d

w i t h i n

5 h

o f f e e d i n g ,

a t i m e

s h o w n

b y

c o n t r o l


t o a l l o w

maximum


i n t o t h e s e

i n t e r -

m e d i a t e s .

T h e s e


w e r e


g r e a t e r

t h a n

t h o s e i n t o

t h e


f o r m e d

i n

t h e

s a m e

t i s s u e .

D o u b l e - l a b e l l i n g s t u d i e s

A

f u n d a m e n t a l

q u e s t i o n

i n

m o n o t e r p e n e

b i o -

s y n t h e s i s i s

t h e

n a t u r e

o f t h e r o u t e s

t o

g e r a n y l


a n d

n e r y l p y r o p h o s p h a t e ,

t h e

p r e -

s u m e d p r e c u r s o r s

o f

a c y c l i c

a n d

h i g h e r

t e r p e n o i d s

o r

c y c l i c


r e s p e c t i v e l y .

I t i s

p o s s i b l e

t h a t

a

p a t h w a y

t o t h e l a s t

c l a s s o f c o m p o u n d s

e x i s t s

i n

p l a n t s

t h a t

i s

a b s e n t

f r o m

a n i m a l s ,

w h e r e s u c h

c o m -

p o u n d s

a r e

r a r e l y f o u n d .

T h e r e s u l t s o b t a i n e d

f r o m

f e e d i n g

w i t h

[ 1 4 C ,

3 H ] -

m e v a l o n a t e ( T a b l e 2 ) i n d i c a t e

t h a t t h e

p r o - 4 R

h y d r o -

g e n

a t o m o f t h e p r e c u r s o r

w a s

a l m o s t e n t i r e l y

r e -

t a i n e d w h e r e a s t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n

a t o m

w a s

v e r y

l a r g e l y

e l i m i n a t e d i n t h e

f o r m a t i o n

o f

g e r a n i o l

a n d

n e r o l ,

b o t h f r e e a n d

b o n d e d

a s

g l u c o s i d e s .

T h e


o f t r a c e r

f r o m

[ 2 - 1 4 C , 4 S ) - 4 3 H I ] -

m e v a l o n a t e w a s u s u a l l y s i g n i f i c a n t l y

g r e a t e r

t h a n

z e r o , a n d

t h i s r e s i d u a l v a l u e ,

w h i c h

i s

b e l i e v e d n o t

t o r e p r e s e n t

c o n t a m i n a t i o n

b y

r a d i o a c t i v e

i m p u r i t i e s ,

m ay r e s u l t f r o m s o m e

p r o c e s s

t h a t r a n d o m i z e s

t h e

l o c a t i o n s

o f

3H

l a b e l l i n g s e e

t h e p e n u l t i m a t e p a r a -

g r a p h

o f

t h i s

D i s c u s s i o n ) .

T h e e x p e r i m e n t s w i t h

P .

g r a v e o l e n s

i n v o l v e d

a

3 H / 1 4 C

r a t i o

i n

p r e c u r s o r

t h a t

w a s

l o w e r t h a n

t h a t

u s e d

i n t h e


w i t h

R . d i l e c t a , b u t

t h e

v a l u e w a s

a d e q u a t e f o r

t h e

p u r p o s e .


o f m e v a l o n a t e i n t o t h e

m o n o t e r p e n e s o f


w e r e

l o w

r e l a t i v e

t o

t h o s e

i n

R . d i l e c t a , a n d t o

o b t a i n b o t h a n

a d e q u a t e

1 4 C


c o u n t

a n d a

h i g h 3 H / ' 4 C

r a t i o

i n

p r o d u c t s ,

l a r g e r

s a m p l e s

o f m e v a l o n a t e h a d t o

b e

u s e d

w i t h P .

g r a v e o l e n s .

H o w e v e r ,

p r e l i m i n a r y

s t u d i e s

u s i n g

1 0 - f o l d l a r g e r

d o s e s t h a n

t h o s e r e c o r d e d

i n

t h e

E x p e r i m e n t a l

s e c t i o n

g a v e

e r r a t i c r e s u l t s ,

o w i n g

p e r h a p s t o

t h e

o p e r a t i o n

o f p r o c e s s e s t h a t

r a n d o m i z e

t h e

p o s i t i o n

o f t r a c e r .

O u r r e s u l t s

w e r e

u n e x p e c t e d ,

f o r a l t h o u g h t h e


o f

h y d r o g e n

l o s s h a d

n o t

b e e n

d e m o n s t r a t e d

f o r m o n o t e r p e n e s ,

t h e

b i o s y n t h e s i s o f

t r a n s - o l e f i n i c

l i n k a g e s

i n

s e v e r a l

s e s q u i t e r p e n o i d s a n d

h i g h e r t e r p e n o i d s

h a d b e e n f o u n d

t o

i n v o l v e

e l i m i n a -

t i o n

o f t h e

p r o - 4 S h y d r o g e n

a t o m o f

m e v a l o n a t e

s e e ,

e . g . ,

S t o n e

H e m m i n g , 1 9 6 5 ;

Goodwin

W i l l i a m s ,

1 9 6 5 , 1 9 6 6 ;

A r c h e r

e t a l . , 1 9 6 6 ;

Dada e t

a l . ,

1 9 6 8 ) ,

w h e r e a s c o n s t r u c t i o n o f

c i s - o l e f i n i c

l i n k a g e s

i n r u b b e r

( A r c h e r e t a l . ,

1 9 6 6 )

a n d

i n

c e r t a i n p o l y -

V o l .

1 3 0

i s o p r e n o l s S t o n e

H e m m i n g , 1 9 6 7 ;

G o u g h

H e m m i n g ,

1 9 6 7 , 1 9 7 0 )

l e d t o

t h e l o s s o f

t h e

p r o - 4 R

h y d r o g e n

a t o m .

T h e c o r r e l a t i o n

b e t w e e n

g e o m e t r y

o f o l e f i n i c

l i n k a g e

a n d

s t e r e o s p e c i f i c i t y

o f

h y d r o g e n

l o s s h a d

s e e m e d w e l l

e s t a b l i s h e d

( S t o n e

H e m m i n g ,

1 9 6 7 ) .

On e

e x p l a n a t i o n

o f o u r

r e s u l t s

i s

t h a t

n e r y l

p y r o -

p h o s p h a t e

o r n e r o l )

i s

d e r i v e d

b y

i s o m e r i z a t i o n

o f

g e r a n y l


o r

g e r a n i o l )

r o u t e

c o r

d ,

S c h e m e 2 ) . S u c h

a d i r e c t i s o m e r i z a t i o n

o f

a

d o u b l e

b o n d h a s

f e w b i o c h e m i c a l a n a l o g i e s c f .

P a r k e

W i l l i a m s , 1 9 5 1 ;

H u b b a r d , 1 9 5 5 ;

L a c k ,

1 9 6 1 ) , b u t

a

p o s s i b l e

i n d i r e c t

r o u t e

i n

t h i s

c a s e

c o u l d

b e t h e

e n z y m e - c a t a l y s e d

c i s - a d d i t i o n

o f

t h e

e l e m e n t s

o f

X-H t o

t h e

d o u b l e

b o n d ,

f o l l o w e d b y

a t r a n s - e l i m i n a -

t i o n .

An a t t r a c t i v e

s p e c i a l

c a s e

o f

t h i s

m e c h a n i s m

i n v o l v e s

M i c h a e l a d d i t i o n

o f w a t e r

t o

g e r a n i a l

I I I ) :

t h e l a t t e r c o u l d

b e

f o r m e d

f r o m

g e r a n i o l

b y e n z y m e

s y s t e m s

s i m i l a r

t o

t h o s e

c h a r a c t e r i z e d

f r o m

s e v e r a l

s o u r c e s

( V a r m a

C h i c h e s t e r ,

1 9 6 2 ; D o n n i n g e r

R y b a c k ,

1 9 6 4 ;

P o t t y

B r u e m m e r ,

1 9 7 0 ) .

P r e l i m i n -

a r y

d o u b l e - l a b e l l i n g


o n t h e f o r m a t i o n

o f

g e r a n i a l

a n d n e r a l

I V )

i n

C y m b o p o g o n

m a r t i n i i

( l e m o n g r a s s )

s u g g e s t

t h a t t h e s e c o m p o u n d s

a r e

r a p i d -

l y i n t e r c o n v e r t e d i n

v i v o ( M .

M o r t

G .

N .

J .

L e

P a t o u r e l ,

u n p u b l i s h e d

w o r k ) ,

a n d

f u r t h e r ,

t h e

e n t i r e

r e d o x - i s o m e r i z a t i o n

r o u t e

f r o m

g e r a n i o l

t o n e r o l

I - * 1 I I - I I V - ÷ I I )

h a s

r e c e n t l y

b e e n

c h a r a c t e r i z e d b y

u s i n g

a c e t o n e - d r i e d

p o w d e r s

f r o m r o s e p e t a l s P .

D u n p h y ,

U n i l e v e r R e s e a r c h , p e r s o n a l

c o m m u n i c a -

t i o n ) .

A

g e r a n i o l - n e r o l

r e d u c t a s e

t h a t c o n v e r t s e i t h e r

s u b s t r a t e i n t o

c i t r o n e l l o l

( X V I I I )

h a s

b e e n

i s o l a t e d

f r o m r o s e

p e t a l s ( D u n p h y

A l l c o c k ,

1 9 7 2 ) ; c o u p l i n g

o f

t h i s

w i t h

a n

a p p r o p r i a t e

d e h y d r o g e n a s e

c o u l d

c o n s t i t u t e

a s ys t e m c a p a b l e

o f i n t e r c o n v e r t i n g

g e r a n i o l

a n d

n e r o l ,

a l t h o u g h

t h e

d e t a i l s

o f t h e

s u g g e s t e d

d e h y d r o g e n a s e s t e p

a r e

o b s c u r e .

T h e

o n l y

r e a s o n a b l e



o f

o u r

r e s u l t s r e q u i r e s

e i t h e r

d i f f e r e n t

p r e n y l t r a n s f e r a s e s

o r

a

s i n g l e p r e n y l t r a n s f e r a s e

w i t h t w o

d i f f e r e n t a c t i v e

s i t e s

t h a t c a t a l y s e

t h e

d i r e c t c o u p l i n g s

o f



w i t h

3 , 3 - d i m e t h y l a l l y l p y r o p h o s p h a t e

t o f o r m e i t h e r n e r y l


o r g e r a n y l p y r o -

p h o s p h a t e s t e p s

a a n d

b ,

S c h e m e 2 ) .

I f

t h e r e l a t i v e

o r i e n t a t i o n s

o f

t h e

r e a c t a n t s

a t

t h e

a c t i v e

s i t e s

w e r e

t h o s e

s h o w n

i n

f o r m u l a e

( X I X ) a n d ( X X ) ,

c o u p l e d

S N 2 + E 2 )

p r o c e s s e s

i n v o l v i n g

t r a n s - e l i m i n a t i o n

w o u l d

l e a d

t o l o s s o f

t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n a t o m

o f

m e v a l o n a t e

i r r e s p e c t i v e

o f

w h e t h e r

g e r a n y l p y r o -

p h o s p h a t e

o r

n e r y l


w a s

f o r m e d .

A

s i m i l a r

r o u t e

h a s

b e e n

s u g g e s t e d

P r o f e s s o r

0 . C o r i ,

U n i v e r s i t y

o f

C h i l e , p e r s o n a l

c o m m u n i c a t i o n )

t o

a c c o u n t f o r

t h e

f a i l u r e

t o d e t e c t

i n t e r c o n v e r s i o n s

o f

g e r a n y l


a n d n e r y l p y r o p h o s p h a t e

i n

c e l l - f r e e

s y s t e m s

f r o m

o r a n g e

o r

f r o m

P i n u s r a d i a t a

( G e o r g e - N a s c i m e n t o

C o r i ,

1 9 7 1 ; J a c o b

e t a l . ,

1 9 7 2 ) .

O u r r e s u l t s

d o n o t

a l l o w

a

c h o i c e

t o

b e

m a d e

a t

0 4 9

7/21/2019 biochemj00616-0152


D . V .

BANTHORPE,

G . N . J .

LE

PATOUREL

AND

M. J . 0 .

FRANCIS

M e v a l o n a t e

e

I s o p e n t e n y l


3 , 3 - D i m e t h y l a l l y l p y r o p h o s p h a t e

b )

( C )

d )

OH

v(II)

OH

~ ~ ~

CHO

(IV)

( X V I I I

(e)

S c h e m e

2 .

P r o p o s e d

s c h e m e s

f o r

t h e

i n t e r c o n v e r s i o n

o f

g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e

a n d

n ery l


O P P , P y r o p h o s p h a t e .

p r e s e n t

b e t w e e n

t h e s e a l t e r n a t i v e s ,

a n d

f u r t h e r w o r k

i s

r e q u i r e d

t o

e l u c i d a t e t h i s f u n d a m e n t a l p o i n t

i n

m o n o t e r p e n e b i o s y n t h e s i s .

Th e

p r e v i o u s l y

o b s e r v e d

c o r r e l a t i o n

o f t h e

l o s s

o f

t h e

p r o - 4 R h y d r o g e n

a t o m

w i t h

f o r m a t i o n

o f a

c i s - o l e f i n i c

l i n k a g e

r e s t s

a l m o s t

e n t i r e l y

on t h e r e s u l t s

i n v o l v i n g

r u b b e r


i n

l a t e x ,

a n d

t h i s

s t e r e o c h e m i c a l

r e s u l t

may

n o t

a p p l y

t o

t e r p e n e s y n t h e s i s

i n

g e n e r a l .

No

d e t a i l e d

s t u d i e s

h a v e

b e e n m a d e

o n


from

h i g h e r p l a n t s ,

b u t

t h e

e n z y m e

f r o m

p i g

l i v e r

(EC

2 . 5 . 1 . 1 )

h a s

b e e n shown

t o

c a t a l y s e t h e f o r m a t i o n

o f

b o t h

g e r a n y l


a n d

f a r n e s y l p y r o -

p h o s p h a t e , a l t h o u g h

t h e


o f

p r o t o n

l o s s i n t h e

c o u p l i n g

i s

unknown

( H o l l o w a y P o p j a k ,

1 9 6 7 ; P o p j d k

e t

a l . , 1 9 6 9 a , b ) .

Ou r

r e s u l t s

d o , h o w e v e r ,

e x c l u d e a m e c h a n i s m

w h e r e i n t h e

r e a c t a n t s

a re

h e l d i n

a s p e c i f i c

o r i e n t a t i o n

o n

t h e e nzy m e

s u r f a c e , s u c h as i n

f o r m u l a ( X I X ) ,

a n d

1 9 7 2

(a)/

OPOPP

i

I )

CHO

I I I )

l

0 5 0

7/21/2019 biochemj00616-0152


BIOSYNTHESIS OF GERANIOL

AND NEROL

AND

THEIR GLUCOSIDES

i n w h i c h

t r a n i s - e l i m i n a t i o n f r o m

t h e

s i n g l e b i n d i n g

s i t e w o u l d

l e a d

t o

t h e

l o s s o f

t h e

p r o - 4 S o r

p r o - 4 R .

h y d r o g e n

a t o m

o f

i n e v a l o n a t e

w h e n g e r a n y l p y r o -

p h o s p h a t e

o r n e r y l p y r o p h o s p h a t e i s f o r m e d r e -

s p e c t i v e l y .

T h i s

s i t u a t i o n

( X I X ,

R

C 5 H 9

e t c . )

c o u l d

a c c o u n t f o r t h e r e s u l t s

w i t h

r u b b e r a n d t h e

c o n -

c o m i t a n t l y

f o r m e d

t r a n s - t r a n s - f a r n e s o l .

A

v a r i a n t

o f

t h i s p r o c e s s

i s

a n

' X - g r o u p '

m e c h a n i s m

s u c h a s h a s

b e e n

p r o p o s e d t o

b e

g e n e r a l

f o r

c h a i n

e x t e n s i o n

o f

t e r p e n o i d s ( C o m f o r t h , 1 9 6 8 , 1 9 6 9 ) : h e r e a n

i n t e r -

m e d i a t e

( f o r m u l a

X X I I ; S c h e m e 4 )

( e n z y m e - b o n d e d

? )

c a n e i t h e r

b r e a k

down w i t h t r a n s - e l i m i n a t i o n

o f

H-X t o

g i v e g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e o r

n e r y l

p y r o -

p h o s p h a t e

w i t h l o s s o f t h e

a p p r o p r a t e

e p i m e r i c

h yd r o g e n a t o m ) o r

b e m o d i f i e d t o f o r m l i n a l o o l

X X I I I ) .

A g a i n

t h i s

p a r t i c u l a r m e c h a n i s m

i s e x -

c l u d e d

b y o u r r e s u l t s ,

a l t h o u g h i t i s

c o m p a t i b l e

w i t h

e i t h e r o f t w o d i f f e r e n t


o r

o n e

e n z y m e

w i t h t w o d i f f e r e n t

a c t i v e

s i t e s . Tw o a d d i t i o n a l

p o i n t s

a r i s e

f r o m

t h e

r e s u l t s i n

T a b l e

2 .

F i r s t ,

n e r o l

a n d i t s

g l u c o s i d e f o r m e d i n p e t a l s

o f

R . d i l e c t a

f r o m

[ 2 - 1 4 C , 4 R ) 4 3 H i

] m e v a l o n a t e b o t h h a d 3 H / 1 4 C r a t i o s

s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n

t h e

v a l u e s

i n

t h e p r e c u r s o r o r

i n

g e r a n i o l

a n d i t s

g l u c o s i d e

t h a t w a s c o n c o m i t a n t l y

f o r m e d . C o n t a m i n a t i o n w i l l

h a v e b e e n

e l i m i n a t e d

b y

t h e

r i g o r o u s p u r i f i c a t i o n

t o

c o n s t a n t

s p e c i f i c

r a d i o -

a c t i v i t y

a n d

i t

i s

d i f f i c u l t t o

s e e

ho w i s o t o p e

f r a c t i o n a -

t i o n c o u l d h a v e o c c u r r e d . T h e r e s u l t s

s u g g e s t

t h e


o f e x t r a n e o u s 3 H ,

a n d

a

v e r y

t e n t a t i v e


i s

t h a t

t r a c e r d e r i v e d f r o m s t e r e o s p e c i f i c

o x i d a t i v e d e g r a d a t i o n

o f e x c e s s o f t h e

p r e c u r s o r

o r

o f

p h y s i o l o g i c a l l y

i n a c t i v e

3 S - m e v a l o n a t e ) a t t h e

b i o s y n t h e t i c s i t e w a s t r a n s f e r r e d t o C - 1

o f

n e r a l i n

t h e r e d o x p r o c e s s ( S c h e m e 2 : I - * I I I - d I V - I I ) . W h a t -

e v e r t h e

d e t a i l s

o f

t h e

m e c h a n i s m ,

t h e

o c c u r r e n c e o f

a p p a r e n t l y e x t r a n e o u s

t r a c e r

i n

n e r o l b u t n o t

i n

g e r a n i o l i s c o n s i s t e n t w i t h

t h e

f o r m a t i o n o f

t h e f o r m e r

f r o m t h e l a t t e r .

S e c o n d l y ,

t h e

s i t u a t i o n

i n t h e

t w o

h i g h e r p l a n t s

s t u d i e d

w a s c o n f i r m e d t o

b e

s i m i l a r t o t h a t

i n

a n i m a l

t i s s u e

a n d

i n

y e a s t C o r n f o r t h , 1 9 6 8 ,

1 9 6 9 ) i n t h a t

t h e

p r o - 4 S

h y d r o g e n

a t o m

o f m e v a l o n a t e

w a s

l o s t

i n t h e

c o n v e r s i o n

o f



i n t o

3 , 3 -

d i m e t h y l a l l y l p y r o p h o s p h a t e .

E x p e r i m e n t a l

M a t e r i a l s

R . d i l e c t a a n d

P .

g r a v e o l e n s

w e r e

o b t a i n e d

f r o m

t h e

U n i l e v e r

R e s e a r c h

L a b o r a t o r y , S h a r n b r o o k ,

B e d f o r d ,

U . K .

T h e f o r m e r s p e c i m e n s

w e r e

g r o w n

e i t h e r o u t -

d o o r s o r i n g r e e n h o u s e s ;

t h e

l a t t e r

w e r e

a l l

g r o w n

o u t d o o r s

s e e

t h e

R e s u l t s

s e c t i o n ) .

S c h e m e

3 .

S t e r e o c h e m i s t r y

o f

l o s s

o f p r o - 4 S h y d r o g e n

a t o m o f m e v a l o n a t e

i n

f o r m a t i o n o f g e r a n y l p y r o p h o s -

p h a t e

o r n e r y l p y r o p h o s p h a t e

O P P ,

P y r o p h o s p h a t e .

F e e d i n g

w i t h


m a t e r i a l

F l o w e r h e a d s

o f

R .

d i l e c t a

i n t h e

p r e - p e r f e c t

s t a g e

F r a n c i s

A l l c o c k ,

1 9 6 9 ) ,

8

d a y s

a f t e r

i n i t i a l

s p l i t t i n g

o f

t h e

c a l y x ,

w e r e

f e d

F r a n c i s

A l l c o c k ,

1 9 6 9 ;

F r a n c i s

O C o n n e l l , 1 9 6 9 )

u n d e r

s t e r i l e

c o n d i t i o n s

w i t h

e i t h e r

t h e

d i b e n z y l e t h y l e n e d i a m i n e

s a l t o f

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e 5 , u C i ;

0 . 2 3 m g p e r

f l o w e r .

h e a d

o r w i t h t h e

p o t a s s i u m

s a l t o f

t h e

[ 4 _ 3 H 1 ] -

m e v a l o n a t e

i s o m e r s

1 . 0 , u C i )

m i x e d w i t h

[ 2 - 1 4 C ] .

m e v a l o n a t e

0 . 5 , u C i )

a s m a r k e r .

3 R S - [ 2 - 4 C ] -

a n d

3 R S - [ 4 R S ) - 4 - 3 H 1 ] - m e v a l o n a t e

( f r o m

T h e

R a d i o -

c h e m i c a l

C e n t r e , A m e r s h a m ,

B u c k s . ,

U . K . )

w e r e

u s e d

a t

s p e c i f i c


o f

6 . 4

a n d

1 1 6 m C i /

m m ol r e s p e c t i v e l y .

A f t e r

h a r v e s t i n g

t h e

p l a n t

m a t e r i a l ,

n e r o l

a n d

g e r a n i o l ,

b o t h f r e e

a n d a s

t h e

'OPP

( X X I )

N v N

O P P

A

OPP

X X I I )

O 0 H

X X I I I )

S c h e m e 4 .

X - g r o u p

m e c h a n i s m

f o r

t h e

f o r m a t i o n

o f

g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e

a n d

n e r y l p y r o p h o s p h a t e

O P P ,

P y r o p h o s p h a t e ,

V o l .

1 3 0

1 0 5 1

7/21/2019 biochemj00616-0152


D . V .

BANTHORPE, G .

N . J .

LE PATOUREL

AND

M . J . 0 . FRANCIS

, B - D - g l u c o s i d e s , w e r e

e x t r a c t e d a n d

p u r i f i e d F r a n c i s

A l l c o c k ,

1 9 6 9 ;

F r a n c i s

O C o n n e l l , 1 9 6 9 )

a n d

t h e

g l u c o s i d e s

w e r e

c l e a v e d w i t h

f l - g l u c o s i d a s e

[ e m u l s i n ;

f r o m

S i g m a

( L o n d o n )

C h e m i c a l

C o . ,

L o n d o n

S . W . 6 , U . K . ] a n d t h e m o n o t e r p e n o l s w e r e

r e c o v e r e d

f o r d e g r a d a t i o n

e x p e r i m e n t s .

Young

l e a v e s

( 1 - 2

w e e k s

a f t e r

b u d d i n g ;

a v e r a g e

w e i g h t

0 . 0 7

g )

o f


w e r e f e d

u n d e r

s t e r i l e

c o n d i t i o n s

a n d w i t h f o r c e d

t r a n s p i r a t i o n

( B a n t h o r p e

e t

a l . , 1 9 7 0 )

w i t h

t r a c e r

a t s i x

t o

t e n

t i m e s t h e

a m o u n t

o f


u s e d f o r

R .

d i l e c t a . T h e

i s o t o p e r a t i o s

w e r e a s

s h o w n

i n T a b l e 2 .

M o n i t o r i n g

o f t h e

l e a v e s

r e v e a l e d

t h a t


i n

t h e

l a m i n a e

b e c a m e

c o n s t a n t

w i t h i n

2 0 m i n

o f

c o m p l e t i o n

o f

u p t a k e

o f

t r a c e r

a n d

r e m a i n e d

s o f o r

2 4 h . A t

t h e e n d

o f t h e

m e t a b o l i s m

p e r i o d ,

t h e

l e a v e s w e r e

g r o u n d

i n

l i q u i d

N 2

a n d t h e

r e s u l t i n g

p o w d e r

w a s

m i x e d

1 : 1 , w / w )

w i t h

a n h y d r o u s

N a 2 S O 4

a n d e x t r a c t e d w i t h

e t h e r

2 0 m l ) .

T h e

e x t r a c t

w a s

c o n c e n t r a t e d

u n d e r

r e d u c e d

p r e s s u r e t o 2 m l )

a n d

w a s

c h r o m a t o g r a p h e d

o n

a

c o l u m n

o f

M g O ( 1 5 c m

x

1

c m

e x t e r n a l

d i a m . ) ,

w i t h

h e x a n e a s

e l u e n t ,

t o

g i v e

a

m i x t u r e o f n e r o l a n d

g e r a n i o l . C a r r i e r

( 5 0 m g

o f

g e r a n i o l

o r

n e r o l )

w a s

a d d e d

a n d t h e a l c o h o l s

w e r e

p u r i f i e d

b y p r e p a r a t i v e -

s c a l e

g . l . c .

o n C a r b o w a x 2 0

M

( 6 m

x 1

c m

e x t e r n a l

d i a m . ; 2 0 , w / w )

a t

1 5 0 ° C

w i t h

a

f l o w r a t e

o f

5

l i t r e s

o f

N 2 / h . A

d e t a c h a b l e

s e c t i o n

( 3 0 c m )

a t

t h e

i n l e t e n d

o f

t h e

g . l . c .

c o l u m n t r a p p e d n o n - v o l a t i l e

i m p u r i t i e s

a n d w i t h

c o n t i n u o u s

h i g h - t e m p e r a t u r e

p u r g i n g

e n a b l e d t h e

b a c k g r o u n d

r a d i o a c t i v i t y t o b e

d e c r e a s e d

t o

a b o u t

6 d . p . m .

a b o v e

b a c k g r o u n d .

S a m p l e s

w e r e

c o l l e c t e d

i n

a

U - t u b e ( 2 0 m l

c a p a c i t y )

t h a t

w a s h a l f - f i l l e d w i t h

g l a s s

b e a d s

(1mm d i a m . ) ,

w h i c h

i n

t u r n w e r e c o v e r e d

w i t h

h e x a n e

c o n t a i n i n g

c a r r i e r

n e r o l o r

g e r a n i o l

( 5 0 m g ) ;

t h e

w h o l e w a s

c o o l e d a t

- 7 0 ° C .

W i t h

t h i s

d e v i c e ,

g e r a n i o l c o u l d

b e

c o l l e c t e d w i t h

90

r e c o v e r y

a t

f l o w

r a t e s u p t o

1 8

l i t r e s / h .

R a d i o c h e m i c a l

m e t h o d s

S o l i d s o r

s o l i d

d e r i v a t i v e s o f

l i q u i d s

w e r e

r e -

c r y s t a l l i z e d

o r

r e s u b l i m e d , n o r m a l l y

a t

l e a s t

t h r e e

t i m e s ,

t o

c o n s t a n t

s p e c i f i c

r a d i o a c t i v i t y .

R a d i o c h e m i c a l

a s s a y s

w e r e m a d e

b y

u s i n g

a B e c k -

m a n

t h r e e - c h a n n e l

s c i n t i l l a t i o n

s y s t e m ,

g e n e r a l l y w i t h

5

-

4 -

b i p h e n y l y l )

-

2

-

4

-

t

-

b u t y l p h e n y l )

-

1

-

o x a

-

3 , 4

-

d i a z o l e

( b u t y l - P B D ) ( C I B A

L t d . )

i n

s o d i u m - d r i e d

t o l u e n e 8 g / l i t r e ) a s

s c i n t i l l a n t . C o u n t i n g e f f i c i e n c i e s

w e r e

t y p i c a l l y a p p r o x .

9 6 a n d

5 5

f o r

I 4 C

a n d

3 H

r e s p e c t i v e l y

a n d w e r e

u n c h a n g e d

b y

r e d i s t i l l a t i o n

o f

t h e

t o l u e n e o r

r e m o v a l o f

0 2 f r o m t h e


s o l u t i o n

i n

a

s t r e a m o f

N 2 .

B u t y l - P B D 5 g )

i n

t o l u e n e

( 5 0 0 m l )

a n d

m e t h a n o l

5 0 0 m I ) ,

o r

B r a y ' s

1 9 6 0 )

s o l u t i o n ,

w e r e u s e d

f o r

s a m p l e s

t h a t

w e r e i n s o l u b l e

i n

t o l u e n e . U s u a l l y a b o u t

20mg

s a m p l e s

o f l a b e l l e d

m a t e r i a l s

w e r e

u s e d ;

t h e s e

s a m p l e s

s o m e t i m e s

c o n -

s i s t e d o f

c o m b i n e d f r a c t i o n s

f r o m

s e v e r a l

f e e d i n g s

c a r r i e d

o u t

a t t h e s a m e

t i m e .

T h e m e t h o d o l o g y o f

c o u n t i n g

s a m p l e s f o l l o w e d

t h a t

i n

a

d e f i n i t i v e

t e x t

T u r n e r ,

1 9 6 7 ) .

' 4 C a n d

3H


w e r e u s u a l l y d e t e r m i n e d

f r o m

c o u n t s o f


i n t h e


c h a n n e l s

a f t e r

c o r r e c t i o n s

h a d

b e e n m a de

f o r

q u e n c h i n g

a n d

c o u n t i n g e f f i c i e n c y .

T h e s e

c o r r e c t i o n s w e r e

o b t a i n e d

f r o m c a l i b r a t i o n c u r v e s

c o n n e c t i n g

t h e

q u e n c h i n g

p r o p e r t i e s

o f

v a r i o u s

a m o u n t s

o f c h l o r o f o r m

o n

s t a n d a r d

s o l u t i o n s o f

[ 1 4 C ] -

a n d

[ 3 H ] - h e x a d e c a n e

w i t h

c o u n t i n g

e f f i c i e n c i e s t h a t w e r e

a u t o m a t i c a l l y

c o m p u t e d b y

t h e

c o u n t e r ,

w i t h

1 3 7 C s

a s

a n

e x t e r n a l

s t a n d a r d

i n t h e

c h a n n e l s - r a t i o

mode

o f

o p e r a t i o n .

F o r

a f e w

h i g h l y q u e n c h e d

o r

f e e b l y


s a m p l e s

t h e

i n t e r n a l - s t a n d a r d m e t h o d

w a s

u s e d t o

d e t e r m i n e

c o u n t i n g

e f f i c i e n c y b y

u s i n g

t h e

a p p r o -

p r i a t e l y

l a b e l l e d

h e x a d e c a n e .

E a c h

s e t

o f

f e e d i n g ,

i s o l a t i o n

a n d

d e g r a d a t i o n


w a s

d o n e

i n

d u p l i c a t e ,

a n d

i n d i v i d u a l


a s s a y s

w e r e

r e p e a t e d

t w o o r

t h r e e t i m e s

t o

a c c u m u l a t e i n

e a c h

c o u n t i n g

p e r i o d ) a p p r o x .

4 x 1 0 4 s c i n t i l l a t i o n s ; t h i s e n s u r e d

t h a t 2 a w a s

± 1

.

No c o r r e c t i o n s

w e r e m a de

f o r

3H

d e c a y ,

a s t h e

[ I 4 C , 3 H l ] m e v a l o n a t e

w a s

a s s a y e d d i r e c t l y

a f t e r

t h e

d e r i v e d

p r o d u c t s .

C o m b i n e d

e r r o r s

i n

w e i g h i n g ,

c o u n t i n g

p r o c e d u r e s

e t c .

w e r e e s t i m a t e d a t

a p p r o x .

± 2

a n d

r e p r o d u c i b i l i t y

b e t w e e n

d i f f e r e n t

e x p e r i -

m e n t s

w a s

a p p r o x .

± 3 .


s c h e m e s

G e n e r a l .

A l l

c o m p o u n d s

h a d

m e l t i n g

p o i n t s u n -

c o r r e c t e d )

i n

a g r e e m e n t

( ± 1 l C )

w i t h

l i t e r a t u r e

v a l u e s

a n d

i . r . ,

p r o t o n - m a g n e t i c - r e s o n a n c e a n d

m a s s

s p e c t r a

w e r e c o n s i s t e n t w i t h t h e

a c c e p t e d

s t r u c t u r e s . T h e

f o l l o w i n g d e g r a d a t i o n

s c h e m e s w e r e

v a r i o u s l y p e r -

f o r m e d o n

1 0 0 - 5 0 0 m g

o f

s t a r t i n g m a t e r i a l .

Q u a n t i t i e s

a r e

g i v e n

f o r o n e

s e t

o f

d e g r a d a t i o n s .

P u r i f i c a t i o n

a n d o x i d a t i o n

o f g e r a n i o l

a n d

n e r o l .

G e r a n i o l

9 8

p u r e ,

b y

g . l . c . )

f o r

u s e

a s

c a r r i e r w a s

p u r i f i e d

f r o m

c o m m e r c i a l

m a t e r i a l

b y

m e a n s

o f

i t s

C a C l 2 c o m p l e x S i m o n s e n ,

1 9 4 7 ) ; n e r o l f o r

s i m i l a r

u s e

w a s

p u r c h a s e d

F l u k a

A . G . ,

B u c h s ,

S w i t z e r l a n d ;

9 8

p u r e ) .

T h e

s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t i e s o f

g e r a n i o l

a n d

n e r o l , p u r i f i e d a s

t h e

3 , 5 - d i n i t r o b e n z o a t e s , c o u l d

n o t

b e

a c c u r a t e l y m e a s u r e d b e c a u s e o f

e x t e n s i v e

q u e n c h i n g ;

c o n s e q u e n t l y

t h e a l c o h o l s

w e r e

o x i d i z e d

t o

g e r a n i a l

a n d

n e r a l

I I I , I V )

a n d


o f

t h e s e

w e r e

p r e p a r e d .

I n

a

f e w

e x p e r i m e n t s g e r a n i o l

w a s

p u r i f i e d t h r o u g h

i t s

C a C l 2 c o m p l e x .

The

a l c o h o l

( 4 5 0 m g )

i n

l i g h t

p e t r o l e u m

b . p . 4 0 - 6 0 ' C ; 3 0 m l )

w a s t r e a t e d w i t h

MnO2

3 g ) u n d e r N2

a t

2 0 ° C

f o r

1 5 h . T h e

o x i d a n t

w a s

f r e s h l y p r e p a r e d a n d

w a s

s t o r e d i n a

s e a l e d

t i n :

s t o r a g e

i n

a d e s i c c a t o r

g a v e

m a t e r i a l

o f

l o w e r

a c t i v i t y . G e r a n i a l

a n d

n e r a l

w e r e

s e p a r a t e d

o n

a

c o l u m n

o f

M g O

w i t h

h e x a n e a s

1 9 7 2

1 0 5 2

7/21/2019 biochemj00616-0152


BIOSYNTHESIS OF

GERANIOL

AND NEROL AND

THEIR

GLUCOSIDES

e l u e n t

a n d

w e r e c o n v e r t e d

i n t o s e m i c a r b a z o n e s

6 9

y i e l d ) ,

m e l t i n g p o i n t s

1 6 2 ° C

a n d

1 8 3 ° C a f t e r

r e -

c r y s t a l l i z a t i o n

f r o m a q .

a l c o h o l ) .

O x i d a t i o n

o f

g e r a n i a l a n d

n e r a l . T h e


a l d e h y d e

( 1 0 0 m g ) i n

p u r i f i e d m e t h a n o l

( 1 0 m l ) o r

c a r b o n

t e t r a c h l o r i d e

( 1 2 m l ) w a s

o z o n i z e d

( O z o n i z e r

m o d e l 1 5 - 6 9 K ;

N u - a i r e

L t d . ,

K i n g s

L a n g l e y ,

H e r t s . ,

U . K . )

a t

- 7 0 ° C o r

- 1 5 ° C r e s p e c t i v e l y

a n d

t h e

c r u d e

o z o n i d e s w e r e

r e c o v e r e d

a s

v i s c o u s

o i l s a n d

w e r e

d e c o m p o s e d b y t r e a t m e n t

f o r

3

d a y s

a t

2 0 ° C

w i t h a

m i x t u r e o f

f o r m i c

a c i d

9 8 ,

w / w ; 1 . 5 m l )

a n d h y d r o -

g e n p e r o x i d e

3 0 v o l . ;

1 . 1 m l ) , a f t e r

w h i c h t h e

p e r -

o x i d e s

w e r e

d e s t r o y e d b y

t r e a t m e n t w i t h

MnO2

( 2 m g )

f o r 3 h

a t

0 ° C .

T h i s e x p e r i m e n t

w a s c a r r i e d

o u t

s e v e r a l t i m e s w i t h

r a d i o a c t i v e g e r a n i a l

a n d

n e r a l a n d

t h e o v e r a l l

y i e l d s w e r e :

l a e v u l i n i c

a c i d V )

5 5 ;

a c e t o n e

7 2 ;

o x a l i c a c i d

5

.

No

f o r m a l d e h y d e

c f .

K n i g h t s

W a i g h t , 1 9 5 5 ) w a s f o u n d .

A c e t o n e

w a s

d i s t i l l e d

o u t o f

t h e

r e a c t i o n

m i x t u r e

a n d

w a s

p u r i f i e d

a s t h e

2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e ,

m . p .

1 2 8 ° C . T h e k e t o n e

w a s r e g e n e r a t e d

f r o m

t h i s

b y

r e f l u x i n g 5 h )

w i t h

a

t e n f o l d e x c e s s o f

a q . s o d i u m

p y r u v a t e , a n d

w a s

s u b j e c t e d

t o

t h e

i o d o f o r m r e a c t i o n

( H i c k i n b o t t o m ,

1 9 5 7 )

t o g i v e

a p o o r ( 1 0 )

y i e l d . I n

l a t e r

e x p e r i m e n t s ,

a c e t o n e

w a s

p u r i f i e d

a s t h e

4 -

p h e n y l c a r b a z o n e

m . p .

1 6 0 ° C ) , t h i o s e m i c a r b a z o n e

m . p .

1 7 9 ° C )

o r

t o s y l h y d r a z o n e

m . p . 1 4 6 ° C )

a l l

a f t e r

r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m

a q . a l c o h o l ) ;

t h e s e


w e r e

s u p e r i o r t o t h e

2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l -

h y d r a z o n e

f o r


c o u n t i n g .

T h e

r e s i d u e

o f

l a e v u l i n i c

a c i d

a n d

o x a l i c a c i d

t o t a l

a p p r o x .

1 8 0 m g )

w a s

a c i d i f i e d

w i t h

10

H C l )

a n d

c o n t i n u o u s l y e x t r a c t e d 5 h ) w i t h

e t h e r

( 5 0 m l )

t o

r e m o v e

t h e

l a e v u l i n i c

a c i d . T h e

e t h e r e x t r a c t

w a s

e v a p o r a t e d t o

d r y n e s s , a n d r e - e x t r a c t e d

w i t h

c h l o r o -

f o r m a n d t h e

l a t t e r

e x t r a c t

a p p r o x .

0 . 5

m l )

w a s

a d d e d

t o

s i l i c i c

a c i d

2 g ;

t y p e C C 7 ,

1 0 0 - 2 0 0

m e s h ;

M a l l i n c k r o d t

I n c . ,

S t .

L o u i s ,

M o . ,

U . S . A . )

a n d

s h a k e n

t o

f o r m a

p o w d e r .

T h i s w a s

a d d e d

t o t h e

t o p

o f

a

c o l u m n

( 2 0 c m

x

1

c m

e x t .

d i a m . )

t h a t

h a d

b e e n

m a d e

u p

i n

b e n z e n e

w i t h

s i l i c i c

a c i d

l O g ) ,

w h i c h i n

t u r n

h a d

b e e n

s h a k e n

w i t h

0 . 0 2 5 M - H 2 S O 4

6 m l ) ,

a n d

t h e

c o l u m n

w a s

e l u t e d

w i t h

b e n z e n e - e t h e r

1 : 1 , v / v ) ,

w h i c h h a d

b e e n

s i m i l a r l y e q u i l i b r a t e d

w i t h

H 2 S O 4 ,

t o g i v e l a e v u l i n i c a c i d

( 1 5 5 m g ) ,

p u r i f i e d a s

t h e

4 -

p h e n y l s e m i c a r b a z o n e

y i e l d

7 0 ;

m . p .

1 8 5 ° C ,

a f t e r


a q .

a l c o h o l )

o r

t h e

t o s y l -

h y d r a z o n e

y i e l d

8 0 ; m . p .

1

5 9 ° C ,

a f t e r

r e c r y s t a l -

l i z a t i o n f r o m

c h l o r o f o r m ) . T h e

r e s i d u e f r o m t h e

e t h e r

e x t r a c t i o n w a s

s i m i l a r l y

c h r o m a t o g r a p h e d a n d

e l u t e d

w i t h

e t h e r

t o

g i v e o x a l i c a c i d

y i e l d

1 4 m g ;

m . p .

1 8 9 ° C , a f t e r


e t h a n o l -

b e n z e n e ) .


o f l a e v u l i n i c

a c i d .

T h e

l a e v u l i n i c a c i d

o b t a i n e d

a s

d e s c r i b e d a b o v e w a s

t y p i c a l l y d i l u t e d

f o u r f o l d w i t h

c a r r i e r a n d w a s

f u r t h e r

d e g r a d e d .

An

i o d o f o r m r e a c t i o n

o n t h e a c i d

( 6 0 0 m g ) g a v e

s u c c i n i c

a c i d

I X )

y i e l d

8 5 ; m . p .

1 8 5 ° C ) ,

w h i c h

w a s

p u r i f i e d

V o l .

1 3 0

b y c h r o m a t o g r a p h y

o n

s i l i c i c

a c i d w i t h


2 : 1 ,

v / v ;

6 0 m l ) ,


1 : 2 , v / v ;

3 0 m l )

a n d

f i n a l l y

e t h e r

( 3 0 m l ) a s

e l u e n t s .

T h i s

a c i d ( 5 0 0 m g )

w a s

c o n v e r t e d i n t o i t s

d i m e t h y l

e s t e r w i t h

d i a z o m e t h a n e

( 1 9 5 m g )

i n

e t h e r : t h e

p r o d u c t

w a s n o t

p u r i f i e d

b u t

w a s s h a k e n

w i t h

h y d r a z i n e

h y d r a t e ( 3 0 0 m g )

f o r a f e w

m i n u t e s ,

w h e n

t h e

d i h y d r a z i d e

y i e l d

9 5 ;

m . p .

1 7 3 ° C ,

f r o m

a l c o h o l )

p r e c i p i t a t e d . T r e a t m e n t

o f t h e

d i h y d r a z i d e

( 4 0 0 m g )

i n w a t e r

( 4 m l )

w i t h

t h e

s t o i c h e i o m e t r i c

q u a n t i t y

o f n i t r o u s

a c i d

g a v e

t h e

d i a z i d e

X I ) ,

w h i c h

w a s

e x t r a c t e d

i n t o e t h e r

( l S m l )

b u t

w a s

n o t f u r t h e r

p u r i f i e d b e c a u se o f i t s

i n s t a b i l i t y .

T h e

d i a z i d e

u n d e r w e n t

C u r t i u s

r e a r r a n g e m e n t t o

f o r m

t h e u r e t h a n e

X I I I ) ,

m . p . 1 1

1 ° C

( f r o m

c a r b o n

t e t r a c h l o r i d e ) ,

i n

o v e r a l l

y i e l d

( f r o m

t h e d i -

h y d r a z i d e ) o f

a p p r o x . 4 0

,

when t h e

e t h e r e a l

s o l u t i o n

o b t a i n e d

a b o v e a n d

e t h a n o l ( S m l ) w e r e

r e f l u x e d f o r 1 h . T h i s

p r o d u c t

( 1 6 0 m g )

w a s

i n

t u r n

d e c a r b o x y l a t e d w i t h

HBr

c o n s t a n t - b o i l i n g

m i x t u r e ;

3 m l ) ,

o n h e a t i n g t o 1 3 0 ° C t o f o r m

e t h y l e n e d i a m i n e

( X I V ) ,

w h i c h w a s

p u r i f i e d b y s u b l i m a t i o n

o f

i t s

d i -

h y d r o b r o m i d e

( d e c o m p o s e s

a b o v e

1 8 0 ° C ) ; t h e

l a t t e r

w a s f o r m e d

i n 8 3

y i e l d ,

b a s e d o n t h e

u r e t h a n e .

T h e

CO2 w a s

c o n c o m i t a n t l y c o l l e c t e d

8 8

y i e l d

b a s e d

o n

t h e

u r e t h a n e ) a s B a C O 3 . An


p r o c e d u r e f o r

e f f e c t i n g

t h e

r e a r r a n g e m e n t w a s t o

r e f l u x t h e

d i a z i d e

( 1 0 0 m g ) i n b e n z e n e 5

m l ) f o r 1 h : t h e

i s o c y a n a t e

X I I ) t h a t w a s f o r m e d

w a s n o t

i s o l a t e d b u t

w a s

d e c o m p o s e d

b y

HCl

1 2 M ,

0 . 5 m l )

a t

r oom

t e m p e r -

a t u r e

t o

g i v e

t h e

d i h y d r o c h l o r i d e

o f

e t h y l e n e d i a m i n e

( 4 3

y i e l d b a s e d o n

t h e

d i a z i d e ) a n d

CO2 ( 8 7

y i e l d ) .

T h e

CO2

w a s

r e g e n e r a t e d

f r o m BaCO3

a n d

w a s

p a s s e d

i n t o

e t h a n o l a m i n e - 2 - m e t h o x y e t h a n o l

2 : 1 , v / v ;

l O m l ) ; a p o r t i o n

( S m l ) o f

t h i s

w a s

a d d e d

t o

t h e


f l u i d

( l O m I )

f o r


c o u n t i n g .

P h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e s

f r o m m e v a l o n a t e .

S m a l l

l e a v e s

a p p r o x .

0 . 5

g )

o f

P .

g r a v e o l e n s

4 - w e e k -

o l d

p l a n t s )

w e r e

p l a c e d

i n v i a l s

c o n t a i n i n g [ 2 - 1 4 C ] -

m e v a l o n a t e

2 , u C i ;

0 . 1

m l )

a n d

w e r e

i l l u m i n a t e d

w i t h

n a t u r a l

s u n l i g h t

a u g m e n t e d

w i t h

a 1OOW

t u n g s t e n

l a m p

a t a

d i s t a n c e

o f

1

m .

A f t e r

5 4 h t h e

f o l i a g e

w a s

g r o u n d

w i t h

s o d i u m

p h o s p h a t e

b u f f e r

0 . 1 M ,

p H 7 . 0 ;

2 . O m l )

a n d t h e

f i l t r a t e

w a s

h e a t e d a t

1 0 0 ° C

f o r

1

m i n ,

c o o l e d

a n d

c h r o m a t o g r a p h e d

o n

a

c o l u m n

( 1 5 c m

x

1 . 5 c m e x t e r n a l

d i a m . )

o f Dowex 1

( X 8 ;

f o r m a t e

f o r m ;

2 0 0 - 3 0 0

m e s h )

a n d

s u b j e c t e d

t o

g r a d i e n t

e l u t i o n

w i t h

a q .

f o r m i c

a c i d - a m m o n i u m

f o r m a t e

B l o c h

e t

a l . ,

1 9 5 9 ) .

F r a c t i o n s

( l O m l )

w e r e

c o l l e c t e d a n d t h e

r a d i o -

a c t i v i t y

o f

s a m p l e s

( l m l )

o f

e a c h w a s

m e a s u r e d

i n

p o r t i o n s

( 2 0 m l )

o f

a

s c i n t i l l a t i o n medium made

u p

f r o m

n a p h t h a l e n e

1 6 g )

a n d

b u t y l - P B D

1 . 4 g )

i n

t o l u e n e

( 1 2 0 m l )

a n d

2 - m e t h o x y e t h a n o l

8 0 m l ) .

P e a k s

o f


o c c u r r e d

i n

f r a c t i o n s

1 8 - 2 6 ,

3745

a n d

6 8 - 7 3 ,

a n d

w e r e

a s s i g n e d

t o m e v a l o n i c

a c i d 5 -

p h o s p h a t e ,

m e v a l o n i c

a c i d

5 - p y r o p h o s p h a t e

a n d



b y c o m p a r i s o n

w i t h

s t a n d a r d s

b y

u s i n g

p a p e r

c h r o m a t o g r a p h y

w i t h

f o u r

1 0 5 3

7/21/2019 biochemj00616-0152


1 0 5 4

D .

V . BANTHORPE,

G . N .

J . LE PATOUREL

AND M. J . 0 .

FRANCIS

s o l v e n t

s y s t e m s

( T c h e n ,

1 9 5 8 ;

B e n e d i c t

e t

a l . ,

1 9 6 5 ;

C h e s t e r t o n

K e k w i c k ,

1 9 6 8 ) a n d

b y

t . l . c . w i t h a

r a n g e

o f

b e n z e n e - e t h e r - e t h y l

a c e t a t e

m i x t u r e s .

We a c k n o w l e d g e

m u c h

h e l p

f r o m

D r .

G . A y r e y

I s o t o p e

U n i t ,

Q u e e n

E l i z a b e t h

C o l l e g e ,

L o n d o n ) w i t h

c o u n t i n g

t e c h n i q u e s

a n d

we

t h a n k

U n i l e v e r

L t d .

( L o n d o n )

f o r

a

s t u d e n t s h i p

t o G . N .

J . L e P .

a n d

f o r

p e r m i s s i o n

f o r

M.

J . 0 .

F .

t o

u n d e r t a k e

a n d

p u b l i s h

t h i s

w o r k .

We a r e

a l s o

v e r y g r a t e f u l

t o D r . P .

D u n p h y

U n i l e v e r R e s e a r c h ,

S h a r n b r o o k )

a n d P r o f e s s o r

0 . C o r i S a n t i a g o )

f o r

m a k i n g

a v a i l a b l e

t o u s r e s u l t s b e f o r e p u b l i c a t i o n .

R e f e r e n c e s

A r c h e r ,

B .

L . , B a r n a r d , D . ,

C o c k b a i n ,

E .

G . , C o m f o r t h ,

J .

W . , C o r n f o r t h ,

R .

H .

P o p j A k ,

G . 1 9 6 6 ) P r o c . R o y .

S o c . S e r .

B

1 6 3 ,

5 1 9 - 5 2 3

B a n t h o r p e ,

D .

V .

B a x e n d a l e ,

D .

1 9 7 0 )

J . C h e m .

S o c .

C

2 6 9 4 - 2 6 9 6

B a n t h o r p e ,

D . V .

C h a r l w o o d ,

B .

V .

1 9 7 1 )

N a t u r e

( L o n d o n ) Ne w B i o l . 2 3 1 , 2 8 5 - 2 8 6

B a n t h o r p e ,

D .

V . , M a n n ,

J .

T u r n b u l l ,

K .

W. 1 9 7 0 )

J .

C h e m .

S o c .

C 2 6 8 9 - 2 6 9 3

B a n t h o r p e ,

D . V . , C h a r l w o o d ,

B . V .

F r a n c i s ,

M. J . 0 .

1 9 7 2 a ) C h e m .

R e v .

7 2 , 1 1 5 - 1 5 5

B a n t h o r p e ,

D .

V . , C h a r l w o o d ,

B . V .

Y o u n g , M. R .

1 9 7 2 b )

J .

C h e m .

S o c .

P e r k i n T r a n s .

1 ,

1 5 3 2 - 1 5 3 4

B e n e d i c t ,

C . , K e t t ,

J .

P o r t e r ,

J . W. 1 9 6 5 )

A r c h .

B i o c h e m .

B i o p h y s . 1 1 0 ,

6 1 1 - 6 2 1

B i o l l a z ,

M .

A r i g o n i ,

D .

1 9 6 9 )

C h e m .

C o m m u n . 6 3 3 - 6 3 4

B l o c h , K . ,

C h a y k i n ,

S . ,

P h i l l i p s ,

A .

H . d e

W a a r d ,

A .

1 9 5 9 )

J .

B i o l .

C h e m . 2 3 4 , 2 5 9 5 - 2 6 0 4

B r a y ,

G .

A .

1 9 6 0 )

A n a l .

B i o c h e m .

1 ,

2 7 9 - 2 8 6

C h e s t e r t o n ,

C .

J .

K e k w i c k ,

R .

G . 0 .

1 9 6 8 )

A r c h .

B i o c h e m . B i o p h y s . 1 2 5 , 7 6 - 8 5

C l a y t o n ,

R .

B .

1 9 6 5 a )

Q u a r t .

R e v . C h e m .

S o c .

1 9 , 1 6 8 - 2 0 0

C l a y t o n ,

R . B .

1 9 6 5 b ) Q u a r t .

R e v .

C h e m .

S o c .

1 9 , 2 0 1 - 2 3 0

C o r n f o r t h , J .

W.

1 9 6 8 ) A n g e w .

C h e m .

I n t .

E d .

E n g l .

7 ,

9 0 3 - 9 1 1

C o r n f o r t h ,

J . W.

1 9 6 9 )

Q u a r t .

R e v . C h e m .

S o c . 2 3 , 1 2 5 -

1 4 0

C r o t e a u ,

R .

L o o m i s ,

W. D .

1 9 7 2 )

P h y t o c h e m i s t r y

1 1 ,

1 0 5 5 - 1 0 6 6

D a d a ,

0 .

A . ,

T h r e l f a l l , D . R .

W h i s t a n c e ,

G . R .

1 9 6 8 )

E u r .

J .

B i o c h e m . 4 , 3 2 9 - 3 3 3

D o n n i n g e r ,

C .

R y b a c k ,

R .

1 9 6 4 )

B i o c h e m .

J . 9 1 ,

1 1 p

D u n p h y ,

P .

J .

A l l c o c k ,

C .

1 9 7 2 )


1 1 ,

1 8 8 7 - 1 8 9 2

F r a n c i s ,

M.

J . 0 . 1 9 7 1 )

i n

A s p e c t s o f T e r pe n o i d C h e m i s t r y

a n d B i o c h e m i s t r y ( G o o d w i n , T . W . ,

e d . ) , p p . 2 9 - 5 1 ,

A c a d e m i c P r e s s ,

L o n d o n

F r a n c i s ,

M.

J .

0 .

A l l c o c k ,

C . 1 9 6 9 ) P h y t o c h e m i s t r y 8 ,

1 3 3 9 - 1 3 4 7

F r a n c i s , M. J . 0 .

O ' C o n n e l l , M.

1 9 6 9 )


8 , 1 7 0 5 - 1 7 0 8

F r a n c i s ,

M.

J .

O . ,

B a n t h o r p e ,

D . V . L e

P a t o u r e l ,

G .

N .

J .

1 9 7 0 )

N a t u r e

L o n d o n ) 2 2 8 ,

1 0 0 5 - 1 0 0 6

G e o r g e - N a s c i m e n t o , C .

C o r i ,

0 .

1 9 7 1 ) P h y t o c h e n i i s t r y1 0 ,

1 8 0 3 - 1 8 1 0

G o o d w i n ,

T .

W.

W i l l i a m s ,

R . J . H .

1 9 6 5 )

B i o c h e m .

J .

9 4 ,

5 c - 7 c

G o o d w i n , T . W. W i l l i a m s ,

R .

J .

H .

1 9 6 6 )

P r o c .

R o y .

S o c .

S e r .

B

1 6 3 ,

5 1 5 - 5 1 8

G o u g h ,

D .

P .

H e m m i n g ,

F .

W.

1 9 6 7 )

B i o c h e m .

J .

1 0 5 ,

l O c - 1 2 c

G o u g h ,

D .

P .

H e m m i n g ,

F . W.

1 9 7 0 ) B i o c h e m ,

J .

1 1 7 ,

3 0 9 - 3 1 7

H i c k i n b o t t o m ,

W. J .

1 9 5 7 )

R e a c t i o n s

o f O r g a n i c C o m -

p o u n d s , 3 r d .

e d n . , p . 2 5 7 , L o n g m a n s ,

L o n d o n

H o l l o w a y , P . W.

P o p j i k , G .

1 9 6 7 )

B i o c h e m . J .

1 0 4 ,

5 7 - 7 0

H u b b a r d ,

R .

1 9 5 5 )

F e d .

P r o c . A m e r .

S o c . E x p .

B i o l .

1 4 , 2 2 9

J a c o b , G . ,

C a r d e m i l , E . , C h a y e t , L . , T e l l e z ,

R . ,

P o n t -

L e z i c a ,

R .

C o r i ,

0 .

1 9 7 2 )

P h y t o c h e m i s t r y 1 1 ,

1 6 8 3 - 1 6 8 8

K n i g h t s ,

J .

W a i g h t ,

E .

S .

1 9 5 5 ) J .

C h e m . S o c .

L o n d o n

2 8 3 0 - 2 8 3 4

L a c k ,

L .

1 9 6 1 )

J . B i o l . C h e m .

2 3 6 , 2 8 3 5 - 2 8 4 0

N e e t h l i n g ,

L .

P . , R e i b e r ,

H .

G .


C . 0 . 1 9 6 3 )

N a t .

C o n f .

N u c l .

E n e r g y

A p p l .

I s o t o p . R a d i a t . ,

P r o c .

4 5 1 - 4 6 0

P a r k e , D .

V .

W i l l i a m s ,

R .

T .

1 9 5 1 ) B i o c h e m .

J . 4 9 ,

l i i

P o p j i k , G . ,

H o l l o w a y ,

P .

W . ,

B o n d ,

R .

P .

M.

R o b e r t s ,

M .

1 9 6 9 a )

B i o c h e m . J . 1 1 1 , 3 3 3 - 3 4 3

P o p j A k ,

G . ,

R a b i n o w i t z ,

J . L .

B a r o n ,

J . M. ( 1 9 6 9 b )

B i o c h e m .

J .

1 1 3 ,

8 6 1 - 8 6 8

P o t t y ,

V . H .

B r u e m m e r , J . H .

1 9 7 0 )


9 , 1 0 0 3 - 1 0 0 7

S i m o n s e n ,

J .

L .

1 9 4 7 )

T h e

T e r p e n e s ,

2 n d . e d n . , v o l .

1

p .

4 1 , C a m b r i d g e

U n i v e r s i t y P r e s s , L o n d o n

S t o n e ,

K . J .

H e m m i n g , F .

W.

1 9 6 5 ) B i o c h e m . J .

9 6 ,

1 4 c - 1 7 c

S t o n e ,

K .

J .

H e m m i n g ,

F .

W.

1 9 6 7 )

B i o c h e m .

J .

1 0 4 ,

4 3 - 5 6

S u g a ,

T . ,

S h i s h i b o r i ,

T .

B u k e o ,

M.

1 9 7 1 )

P h y t o -

c h e m i s t r y

1 0 , 2 7 2 5 - 2 7 2 6

T c h e n ,

T . T . 1 9 5 8 ) J .

B i o l .

C h e m .

2 3 3 ,

1 1 0 0 - 1 1 0 3

T u r n e r ,

J .

C .

1 9 6 7 )

S a m p l e P r e p a r a t i o n

f o r

L i q u i d

S c i n t i l l a t i o n

C o u n t i n g ,

T h e

R a d i o c h e m i c a l C e n t r e ,

A m e r s h a m

V a r m a ,

T . N .

R .


C .

0 .

1 9 6 2 )

A r c h .

B i o c h e m .

B i o p h y s .

9 6 ,

4 1 9 - 4 2 2

W a l l e r , G . R . 1 9 6 9 ) P r o g r . C h e m . F a t s

O t h e r L i p i d s 1 0 ,

1 5 1 - 2 3 8

1 9 7 2

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