Biohemijski principi

O80 UNIVERZITET U NOVOM SADU FAKULTET TEHNIČKIH NAUKA

ODSEK: INŽINJERSTVO ZAŠTITE ŽIVOTNE SREDINE

INTERNA SKRIPTA

BIOHEMIJSKI I MIKROBIOLOŠKI PRINCIPI

I deo

Radmila Kovačević Gordana Grubor-Lajšić Olga Petrović Nebojša Andrić

Novi Sad, 2006

Biohemijski i mikrobiološki principi

1. ĆELIJE PROKARIOTA I EUKARIOTA

Za sve organizme, izuzev virusa, ćelija predstavlja osnovnu jedinicu građe i funkcije, bez obzira da li se radi o organizmu koji sadrži samo jednu (jednoćelijski) ili više ćelija (višećelijski organizam). Drugim rečima, i pored velikog diverziteta (raznovrsnosti) živog sveta na našoj planeti, ceo život počiva na ćelijskoj osnovi, i jedini oblik života koji nema ćelijsku građu (acelularni oblik života) jesu virusi.

I pored velike specijalizacije pojedinih ćelija (u različitim organima višećelijskih organizama) postoje osnovne morfološke i funkcionalne karakteristike i unutrašnje brojne strukture (organele) zajedničke za sve ćelije. Dugo vremena se smatralo da je biologija ćelije jedinstvena sve dok primenom savremenih tehnika, posebno elektronske mikroskopije nije učinjen revolucionarni skok, napredak u razumevanju strukture i funkcije ćelije koji je jasno izdiferencirao dva osnovna tipa ćelije – prokariotski i eukariotski tip (Sl. 1). Razlika je vezana pre svega za organizaciju naslednog, genetičkog materijala u ćeliji. Kod velike grupe organizama, odnosno velikog broja živih bića, taj nasledni materijal (označen kao jedro, odnosno nucleus – latinska, ili karion – grčka reč) je posebno organizovan i membranom odvojen od ostalog sadržaja ćelije. Ovaj tip ćelije označen je kao – EUKARIOTSKI (ćelije sa “pravim” jedrom). Humana, biljna i životinjska ćelija pripadaju ovom tipu, kao i ćelije većine mikroorganizama - protozoe, gljive, alge, lišajevi. Drugi tip ćelije, označen kao – PROKARIOTSKI , odnosi se na ćelije kod kojih genetski materijal nije jasno morfološki izdiferenciran, niti membranom odvojen od ostalog dela ćelije. Ovoj grupi pripada manji broj ćelijskih organizama, uglavnom mikroorganizmi, kao što su bakterije i cijanobakterije (modrozelene alge, kako se ponekad nazivaju).

Sl. 1 Prokariotska i eukariotska ćelija

Ukratko, organizmi ćelijske (celularne) građe dele se na dve velike grupe, na PROKARIOTE i EUKARIOTE. Između ova dva tipa ćelija postoji sličnost, ali i razlike koje se na nivou ćelije kao osnovne gradivne i funkcionalne jedinice, ogledaju pre svega u organizaciji genetičkog materijala (jedra), strukturi i hemijskom sastavu ćelijskog zida i drugih struktura van ćelijskog zida, odsustvu membranom okruženih ćelijskih organela, kao i veličini. Prokariotske ćelije su malih dimenzija

1


(dijametar 1 - 5 µm), dok su eukariotske veće i po dimenzijama vrlo raznolike. Najveći broj ima dijametar od 10 – 30 µm, dok jajna ćelija može da ima prečnik i do 200 µm. Takodje, ćelije u skeletnim mišićima (mišićna vlakna) mogu da imaju dužinu nekoliko cm, a akson neurona može da bude dugačak i do 1 m.

Sličnost između ova dva tipa ćelija bazira se na sličnoj strukturi plazma membrane, na genetskoj informaciji sadržanoj u DNK i genetskom kodu, sličnim mehanizmima transkripcije i translacije genetskih informacija, sličnim ribozomima, sličnim metaboličkim putevima, načinu konzervacije hemijske energije u ATP-u, sličnom mehanizmu fotosinteze (između cijanobakterija i zelenih biljaka) i još nekim svojstvima.

MIKROORGANIZMI kao heterogena grupa imaju predstavnike i eukariotskog (protozoe, gljive, lišajevi, alge) i prokariotskog tipa ćelije (bakterije i modrozelene alge). Praktično, u živom

Sl. 2 Prokariotska ćelija

svetu prokariotski tip ćelije srećemo samo kod mikroorganizama, i to kod bakterija (Archea i Eubacteria ) i modrozelenih algi – (Cyanophyta) ili Cyanobacteria (savremen taksonomski pristup).

Osnovne karakteristike prokariotskog tipa ćelije, koji predstavlja jednostavniji tip organizacije, su sledeće - genetski materijal nije membranom odvojen od ostalog sadržaja ćelije, ne postoje jasno izražene organele obavijene membranom (npr. mitohondrije, hloroplasti, Goldžijev aparat, lizozomi).

Neke karakteristike građe i organizacije prokariotskih organizama

Genetski materijal se kod bakterija na elektronmikroskopskim snimcima uočava kao slabo kontrastna oblast koja nije odvojena od citoplazme nikakvom opnom. U toj oblasti je gusto raspoređen vlaknasti materijal dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u obliku dugog zamršenog konca bez slobodnog kraja. Zbog nižeg stupnja strukturne organizacije ovo “bakterijsko jedro” naziva se – nukleoid (Sl. 1 i 2). To je jedan džinovski molekul dvostruke DNK koji sadrži potpunu genetsku informaciju i obezbeđuje genetski kontinuitet bakterijske ćelije. Kod bakterija, DNK je mnogo puta duža od same ćelije, nije vezana sa baznim proteinima i sintetiše se skoro neprekidno u intervalu od jedne do druge ćelijske deobe. Sinteza DNK se obustavlja samo u toku raspodele DNK pri binarnoj ćelijskoj deobi. Pošto je bakterijski molekul DNK ekvivalent jednom hromozomu, često se tako i naziva, pa možemo reći da bakterije imaju samo jedan “hromozom”. Bakterije kao najprostiji prokariotski organizmi su haploidni organizmi, jer u jednom hromozomu sadrže samo jednu garnituru gena. Prilikom deobe hromozoma ne formira se deobno vreteno i izostaje pojava mitoze.

2


Kod modrozelenih algi ili cijanobakterija takođe ne postoji morfološki oformljeno pravo jedro (nukleus). U protoplastu ovih organizama jasno se razlikuje jedan centralni bezbojni deo označen kao centroplazma ili nukleoplazma koji se može smatrati ekvivalentom jedra kod eukariotskih algi. Nukleoplazma se sastoji iz hijaloplazme i fibrila DNK i nije nikakvom membranom odvojena od perifernog pigmentisanog dela protoplasta – hromatoplazme, odnosno jasna granica između ove dve zone ne postoji.

Ćelijski zid. Najveći broj bakterija ima čvrst ćelijski zid kao spoljašnji omotač koji daje ćeliji oblik i čvrstinu i štiti je od mehaničkih i svih drugih nepovoljnih uticaja spoljašnje sredine (Sl. 3). Bakterije kao prokariotski organizmi imaju specifičnu građu ćelijskog zida. U pitanju je heteropolimer peptidoglukan koji je sastavljen od polisaharidnog i peptidnog dela i naziva se – murein (videti kasnije).

Sl. 3 Ćelijski zid kod gram - bakterija

Mikoplazme su bakterije bez ćelijskog zida, a arhebakterije nemaju peptidoglukana, već mogu sadržavati različite polimere kao što je pseudomurein. Modrozelene alge koje takođe pripadaju prokariotskim organizmima imaju višeslojan ćelijski zid u kome se razlikuju 4 sloja označeni simbolima L1, L2, L3 i L4. Prvi L1 sloj je najbliži citoplazmatičnoj membrani, a na njega se naslanja L2 sloj u kome se nalazi specifična supstanca – murein, zbog čega se ovi organizmi i nazivaju cijanobakterije. U sastavu trećeg i četvrtog sloja pretežno se nalaze ugljeni hidrati.

Ćelijska membrana. Ćelijska membrana (plazmalema, plazma membrana, citoplazmatska membrana) kao opšta zajednička komponenta svih ćelija, nalazi se i kod bakterija. Struktura ove membrane identična je onoj kod eukariotskih ćelija (fluidno-mozaični model), ali postoje i neke specifičnosti. Bitna odlika prokariotskih mikroorganizama je da citoplazmatska membrana gradi jedan složen membranski sistem koji prožima ćeliju. Ovakve intracelularne membranske tvorevine su u suštini manje ili više složena ulegnuća membrane, koja sa njom čine jedinstveni morfološki povezan sistem. Ove invaginacije prodiru pliće ili dublje u citoplazmu i dalje se ispunjavaju naborima koji se raspoređuju tako da stvaraju sisteme različitih tipova (pločast, cevast, mehurast). Na ovaj način veoma se povećava “radna površina” plazma membrane što je od ogromne važnosti za prokariotsku ćeliju, kod koje plazma membrana praktično obavlja mnoštvo funkcija koje u eukariotskoj ćeliji inače obavljaju posebne organele.

Intracelularne membranske tvorevine su bile prvo uočene kod grampozitivnih bakterija, za vreme procesa deobe, kod obrazovanja poprečnih pregrada. Ove tvorevine zapažene su na sredini ćelije pa otuda i naziv mezozomi (grčki –mesos = sredina, soma = telo). Ovaj izraz se zadržao i dalje u užem smislu za određene tvorevine koje učestvuju u deobi ćelije i formiranju poprečnog zida. Kasnija saznanja pokazuju da se mnoge membranske tvorevine sreću i na drugim mestima u ćeliji i da imaju drugačiju funkciju, pa su u odnosu na funkciju kod eukariotskih ćelija označeni kao analogi (npr. analogi mitohondrija, analogi glatkog i hrapavog endoplazmatskog retikuluma).

3


Danas je poznato postojanje i funkcija sledećih značajnih intracelularnih membranskih tvorevina:

• Analogi mitohondrija – primenom citohemijskih i elektronmikroskopskih ispitivanja kod bakterija je potvrđeno postojanje membranskih tvorevina izuvijanih poput klupčeta i neposredno povezanih sa citoplazminom opnom (Sl. 4). Na ovim tvorevinama otkrivene su pečurkaste substrukture kao i mnogobrojni fermentni sistemi koji ukazuju da su ove tvorevine centri oksidoreduktivne aktivnosti, odnosno da su vezani za funkciju disanja, te otuda i naziv – analogi mitohondrija.

• Mezozomi – ove u vidu puža izuvijane membranske tvorevine uočavaju se za vreme rasta i deobe grampozitivnih bakterija, na mestu nastajanja poprečnih pregrada – septi (Sl. 4). Ovim tvorevinama, koje su označene kao mezozomi u užem smislu i uočavaju se uvek u središnjem delu ćelije na početku ćelijske deobe, pripusuje se uloga u sintezi materijala ćelijskog zida i posebno učešće u izgradnji septi. Po završetku deobe bakterije na dve jedinke, mehurići mezozoma koji su ispunili svoju funkciju iščezavaju povlačeći se u periplazmazski prostor. Mezozomi u užem smislu, dakle, nisu postojane tvorevine već se uvek iznova formiraju kod započinjanja procesa ćelijske deobe.

Sl. 4 Intracelularne membranske tvorevine u prokariotskoj ćeliji

• Kruškaste membranske tvorevine – ove tvorevine imaju ulogu u procesu započinjanja ćelijske deobe, odnosno replikacije DNK. Ove tvorevine u vidu kruškastih telašaca takođe nisu postojane membranske tvorevine jer se obrazuju uvek de novo na mestu kontakta DNK sa citoplazminom membranom (Sl. 4). Smatra se da je na tom delu citoplazmine opne za koji se pričvršćuje despiralizovana nit DNK lokalizovan proteinski molekul označen kao inicijator (verovatno DNK polimeraza), koji započinje proces ćelijske deobe.

• Tilakoidi – su intracitoplazmatske membranske tvorevine koje obrazuju jedan sistem spoljoštenih mehurića (grčki, tilakoides - meškolik) različitog izgleda kod pojedinih predstavnika prokariota (Sl. 4). Ove tvorevine su nosioci različitih pigmenata i predstavljaju centre fotohemijske aktivnosti (kod purpurnih i zelenih) fotosintetskih bakterija. Tilakoidne tvorevine uočene su i u ćelijama nitrifikacionih bakterija, ali su vezane sa procesima oksidacije amonijaka i nitrita. Kod modrozelenih algi (cijanobakterija) u perifernom delu ćelije nalaze se pojedinačni ili grupisani tilakoidi u vidu spljoštenih kesica. Hlorofil a i pigmenti iz

4


grupe karotinoida nalaze se u membranama tilakoida, a pigmenti iz grupe fikobilina nalaze se u vidu granula (fikobilizomi) na površini tilakoida. Tilakoidi modrozelenih algi predstavljaju najprostiji fotosintetički aparat i praktično vrše funkciju analogu hloroplastima - organelama eukariotskih algi.

• Analogi endoplazmatskog retikuluma (mrežice) - u bakterijskim ćelijama po ribozomima smeštenim na njima, identifikovani su analogi hrapavog endoplazmatskog retikuluma, koji učestvuje u sintezi strukturnih proteina i drugih komponenata ćelije. Identifikovane su i membranske tvorevine u obliku cisterni koje bi mogle biti analozi glatkog endoplazmatskog retikuluma i imati ulogu u sintezi lipida i ugljenih hidrata. U bakterijskim ćelijama zahvaljujući elektronsko-citohemijskim metodama otkrivene su i membranske tvorevine funkcionalno slične Goldžijevom aparatu i lizozomima.

Na kraju, treba još jednom istaći veliki značaj ovakvih membranskih tvorevina za prokariotsku ćelija (posebno kod bakterija kao jednoćelijskih organizama, gde se u jednoj ćeliji odvijaju tako raznovrsni i kompleksni životni procesi).

Neke karakteristike građe i organizacije eukariotske ćelije

Eukariotske ćelije (Sl. 5) su veće od prokariotskih i sadrže pored plazma membrane i jedra, i veliki broj organela, citoskelet, kao i inkluzije (produkti metabolizma koji se magazioniraju u formi granula, kapljica ili kristala). U veliku grupu eukariota spadaju životinje, biljke, gljive i protisti.

Sl. 5 Eukariotska ćelija

Mitohondrije su organele koje se sastoje od spoljašnje membrane, unutrašnje membrane koja je izuvijana i formira kriste, intermembranskog prostora, i unutrašnjeg prostora označenog kao matriks (Sl. 6). Pošto predstavljaju energetske jedinice ćelije obično ih ima više u onim delovima ćelije u kojima se odvijaju intenzivniji energetski procesi. Matriks mitohondrija sadrži enzime koji katališu različite reakcije odredjenih metaboličkih puteva, a unutrašnja mitohondrijalna membrana sadrži enzimske komplekse odgovorne za prenos elektrona do molekulskog kiseonika i sintezu ATP od ADP i neorganskog fosfata (videti kasnije).

Gotovo je sigurno da su mitohondrije nekad davno bili autonomne bakterijske ćelije koje su vremenom razvile simbiotski odnos sa eukariotskom ćelijom. U skladu sa time je i činjenica da mitohondrije sadrže sopstveni genetski materijal. U mitohondrijama se nalazi mnogo manja količina genoma nego u nukleusu, a i mnogi proteini mitohondrija su kodirani od strane nuklearne DNK. Medjutim, mitohondrijalna DNK je odgovorna za sintezu nekih proteina važnih za funkciju mitohondrija.

5


Sl. 6 Mitohondrija

Spermatozoidi ne predaju svoje mitohondrije zigotu, tako da se mitohondrije koje se nalaze u jajnoj ćeliji prenose na potomstvo. U mitohondrijama ne postoji sistem za popravku oštećenja na DNK, tako da su neke retke bolesti povezane sa oštećenjem mitohondrijalne DNK. To su bolesti povezane sa poremećajem produkcije ATP u tkivima koje imaju visok stepen metabolizma.

Lizozomi predstavljaju strukture okružene membranom (Sl. 7). Unutrašnjost lizozoma je kiselija nego citoplazma, i sadrže hidrolitičke enzime koji bi verovatno razgradili većinu ćelijskih organela da nisu okruženi membranom. Lizozomi funkcionišu kao digestivni sistem ćelije. Supstance koje se unesu u ćeliju, kao i različiti bakterijski organizmi bivaju zarobljeni u tzv. fagocitnu vakuolu. Ta vakuola se kasnije spaja sa lizozomom i započinje proces razgradnje unete materije. Isto tako, sposobni su za razgradnju sopstvenog nekrotičnog tkiva i delova ćelije koju su iz nekog razloga izgubili svoju funkciju, kao i samih ćelija posle njihove smrti.

Oko 25 oboljenja povezano je sa nedostatkom lizozomalne funkcije, prvenstveno nedostatkom nekog specifičnog enzima koji razgrađuje datu materiju. U tom slučaju dolazi do nagomilavanja date materije u lizozomu, što dovodi do raspada ćelije koja sadrži ovakav defektni lizozom. Ovakve bolesti se nazivaju lysosomal storage diseases. Retke su, a najpoznatije je Tay-Sachse oboljenje.

Sl. 7 Lizozomi

Peroksizomi su organele okružene jednom membranom. Matriks peroksizoma sadrži preko 40 enzima koji katalizuju veliki broj reakcija, kao što je katabolizam masnih kiselina sa vrlo dugačkim lancem. Odgovorni su za razgradnju masnih kiselina i toksičnih supstanci. Poremećaji u funkciji peroksizoma su povezani sa nekim teškim oboljenjima. Nedostatak transportnog proteina u

6


mebrani peroksizoma prouzurokuje X-vezanu adrenoleukodistrofiju, koja je smrtonosna još u detinjstvu. Kod ove bolesti razgradnja masnih kiselina sa dugačkim lancem je defektna.

Sl. 8. Endoplazmatski retikulum

Endoplazmatski retikulum je kompleks tubula u citoplazmi ćelije (Sl. 8). Zid ovih tubula je sačinjen od membrana. Postoje dve vrste endoplazmatskog retikuluma hrapavi i glatki. Kod hrapavog endoplazmatskog retikuluma ribozomi su zakačeni na površini endoplazmatskog retikuluma i ovakav tip je prisutan kod ćelija kod kojih se odvija intenzivna sinteza proteina. Glatki ili agranulirani endoplazmatski retikulum je retikulum bez ribozoma na svojoj površini i karakterističan je za ćelije gde se vrši sinteza steroidnih hormona, kao i u procesima detoksifikacije.

Ribozomi su supramolekulske strukture, sastavljene od male i velike subjedinice. Njihova funkcija je u sintezi proteina. Ribozomi koji se zakače na površini endoplazmatskog retikuluma su odgovorni za sintezu proteina, kao što su neki hormoni, zatim proteini koji ulaze u sastav lizozoma ili proteina koji ulaze u sastav ćelijske membrane. Proteini koji se formiraju na taj način dalje odlaze na posttranslacionu modifikaciju u endoplazmatski retikulum. Slobodni ribozomi u citosolu mogu da sintetišu neke proteine kao što je hemoglobin, proteine peroksizoma i mitohondrija, kao i enzime čija se aktivnost odvija u citosolu.

Goldži aparat predstavlja sistem ispresavijanih membrana u obliku tubula ili vrećica (Sl. 9). Obično se jedan ili više Goldži aparata nalazi u eukariotskoj ćeliji. To je polarisana struktura sa svojim cis i trans krajem. Vezikule koje sadrže novo sintetisane proteine se odvajaju od endoplazmatskog retikuluma i kreću se prema Goldži aparatu, gde se fuzionišu sa cis krajem ove organele. Zatim ti proteini prolaze kroz Goldži aparat da bi došli do trans kraja, gde se odvajaju i odlaze u citoplazmu spakovani u vezikule. U Goldžijevom aparatu vrši se konačna obrada proteinske molekule u zavisnosti od krajnje destinacije novo sintetisanog proteina (ćelijska membrana, sekrecija izvan ćelije, lizozomi itd).

Sl. 9. Goldži aparat

7


Jedro (Sl. 10) je prisutno u svim eukariotskim ćelijama. Jedrov omotač čine dve membrane, unutrašnja i spoljašnja, između kojih se nalazi perinuklerna cisterna. Jedrova membrana sadrži tzv. nuklearne pore kroz koje mogu da prođu proteini, kao i molekuli RNK. U unutrašnjosti se nalazi nukleoplazma u kojoj je smešten nasledni materijal predstavljen molekulima dezoksiribonukleinske kiseline (DNK). DNK molekuli su pakovani sa specifičnim proteinima (histoni), a kompleks DNK i histona čini hromatin (Sl. 11). Hromozomi su strukture vidljive tokom ćelijske deobe i svaki hromozom sadrži jedan molekul DNK. Hromozomi su uvek prisutni u paru, jedan od svakog roditelja, izuzev jajnih ćelija i spermatozoida.

Ćelije najčešće imaju jedno jedro, međutim postoje i ćelije koje sadrže više jedara. Jedro u većini ćelija sadrži jedarce (nukleolus). To si sitne granule koje su bogate ribonukleinskom kiselinom (RNK). Neka jedra sadrže i više ovakvih struktura, naročito kod ćelija koje se dele i rastu. Jedarca predstavljaju mesta sinteze ribozoma, struktura koje su značajne u sintezi proteina u citoplazmi.

Sl. 10 Jedro

Sl. 11 Molekul DNK

8


Citoskelet (Sl. 12) predstavlja sistem proteinskih vlakana koji održava strukturu ćelije i omogućuje promenu oblika i kretanje iste. Citoskelet je sačinjen prvenstveno od mikrotubula, intermedijernih filamenata i mikrofilamenata koji zajedno sa mnoštvom drugih proteina predstavljaju skelet ćelije. Mikrotubule su polarizovane cevčice različito rasporedjene u različitim ćelijama. One obezbeđuju transport vezikula, kao što su sekretorne granule, ali i mitohondrija sa

Sl. 12 Citoskelet

jednog na drugi kraj ćelije. Isto tako formiraju i deobno vreteno koje omogućava kretanje hromozoma tokom mitoze. Intermedijerni filamenti prožimaju citosol u vidu mreže ili snopova i pretpostavlja se da im je glavna uloga u zaštiti ćelije od istezanja. Mikrofilamenti su izgradjeni od proteina aktina, formiraju snopove koji pružaju mehaničku potporu ćeliji i ćelijskim izraštajima (na primer, nalaze se u vrhu crevnih resica epitelnih ćelija creva).

Centrozomi predstavljaju strukturu koja se nalazi neposredno uz jedro u eukariotskoj ćeliji. Centromere su izgrađene od dve centriole koje su okružene pericentriolarnim materijalom. Centrozomi tokom ćelijske deobe se dupliraju i par centrozoma odlazi na polove deobnog vretena i učestvuje u formiranju deobnog vretena koje je sačinjeno od mikrotubula.

Hloroplasti (Sl. 13) su karakteristični za biljne ćelije i to je mesto gde se odvija proces fotosinteze (konverzija svetlosne u hemijsku energiju). Strukturno, hloroplasti veoma podsećaju na mitohondrije. Imaju spoljašnju i unutrašnju membranu izmedju kojih se nalazi intermembranski prostor. Za unutrašnju membranu su vezani tilakoidi. Tu su nalaze hlorofil i ostali pigmenti potrebni za proces fotosinteze. Hloroplasti imaju malu količinu DNK i ribozome. Pored hloroplasta, u biljnim organizmima nalazimo i ostale pigmente, kao što su hromoplasti i leukoplasti koji služe sa skladištenje skroba i masti.

9


Sl. 13. Hloroplast

ĆELIJSKI CIKLUS obuhvata promene koje se odigravaju u ćeliji od momenta njenog nastajanja do okončanja deobe na dve nove ćelije. U toku ćelijskog ciklusa ćelija raste, obavlja odgovarajuće funkcije, udvostručava svoj genetski materijal i na kraju se deli na dve ćerke ćelije. U sklopu ćelijskog ciklusa postoje dve osnovne faze: interfaza i mitoza. Interfaza je vremenski period od jedne do druge deobe i deli se na G1, S i G2 fazu (Sl.14).

Sl.14. Ćelijski ciklus

G1 faza je početni period ćelijskog ciklusa. U ovoj fazi, ćelije sintetišu RNK, regulatorne proteine i enzime neophodne za udvajanje DNK. S faza se karakteriše replikacijom DNK , tj. udvostručavanjem genetskog materijala. G2 faza prethodi mitozi. Ova faza se odlikuje ubrzanom pripremom ćelija za deobu. Ćelija akumulira energiju, sintetiše molekule potrebne za deobu. Zatim sledi mitoza ili ćelijska deoba, u kojoj se majka ćelija podeli na dve ćerke ćelije

MITOZA je tip ćelijske deobe karakteristična za somatske (telesne) ćelije, gde od jedne majke ćelije nastaju dve ćerke ćelije i može se podeliti u nekoliko faza: profaza, metafaza, anafaza i telofaza (Sl. 15).

Profaza se karakteriše kondezovanjem hromatinskih niti, te hromozomi postaju jasni i vidljivi. Svaki hromozom sadrži dve sestrinske hromatide spojene u regionu centromere. U toku profaze jedarca isčezavaju.

Metafaza. Hromozomi su maksimalno kondenzovani i pravilno raspoređeni u centru ćelije tako da formiraju ekvatorijalnu ploču.

10


Anafaza. Hromozomi se cepaju na dve hromatide, a niti deobnog vretena se postepeno skraćuju i povlače hromatide ka suprotnim polovima deobnog vretena.

Telofaza. Hromatide se grupišu na polovima deobnog vretena koje polako isčezava. Oko svakog kompleta hromozoma počinje da se formira jedrova opna čime se konstituišu dva jedra. U jedru se pojavljuju jedarca.

Posle kariokineze nastupa citokineza (podela citoplazme majke ćelije). Citokineza započinje formiranjem udubljenja na površini ćelije koje polako prelazi u deobnu brazdu. Nakon toga, deobna brazda se sve više produbljuje sve do trenutka kada se most između sada već dve ćelije ne prekine. Podelom citoplazme nastaju dve ćerke ćelije sa diploidnim brojem hromozoma i diploidnom količinom DNK i genomom identičnim roditeljskoj ćeliji.

Sl.15 Mitoza

MEJOZA je specifičan vid ćelijske deobe koji se odvija isključivo u toku formiranja polnih ćelija. (Sl. 16). Sastoji se iz dve uzastopne deobe nezrelih polnih ćelija koji rezultuju u: redukciji broja hromozoma, redukcijom količine DNK i rekombinacijom gena. Naime, tokom mitoze ćelije koje nastaju imaju diploidni broj hromozoma (46 kod čoveka) i genetski materijal je identičan roditeljskoj ćeliji. Tokom mejoze u polnim ćelija se formira haploidni broj hromozoma (23 kod čoveka) koji je različit od genetskog materijala roditelja zbog procesa rekombinacije gena. Mejoza se odvija u dve deobe; prva mejotska deoba (mejoza I) i druga mejotska deoba (mejoza II).

Prva mejotska deoba obuhvata podelu jedra i citoplazme muških i ženskih polnih (germinativnih) ćelija. Prethodi joj replikacija DNK i prolazi kroz iste faze i događaje kao i mitoza, koje se označavaju sa profaza I, metafaza I, anafaza I i telofaza I. U profazi prve mejotske deobe dolazi do izmene segmenata između homologih roditeljskih hromozoma, što ima za rezultat rekombinaciju gena i stvaranje nove genetske kombinacije.

Druga mejotska deoba je slična prvoj i deli se na profazu II, metafazu II, anafazu II i telofazu II i citokinezu. U ovoj fazi svaki od preostala 23 hromozoma se cepa na dve hromatide koje migriraju ka suprotnim polovima ćelije. Nakon završetka mejoze, ćelije poseduju redukovan broj hromozoma, odnosno dvostruko manji broj hromozoma od somatskih ćelija.

11


Sl. 16 Mejoza

12


2. BIOMOLEKULI

U osnovi biohemije, koja proučava procese u živim sistemima, su hemijske reakcije izmedju bioloških molekula (biomolekula). Ove reakcije podležu zakonima fizike i hemije. Pored vode, najveći deo bioloških molekula su organski molekuli koji pored ugljenika (C), sadrže još vodonik (H), kiseonik (O), azot (N), sumpor (S) i fosfor (P). Osobine ovih atoma, koji su povezani kovalentnim vezama, odredjuju i tipove hemijskih reakcija u kojima učestvuju.

Najvažniji element bioloških molekula je ugljenik, koji ima tetraedarsku strukturu i formira kovalentne veze sa drugim atomima ugljenika, ali i sa atomima vodonika, kiseonika, azota i sumpora. Fosfor je za ugljenik uglavnom vezan preko atoma kiseonika. Različitim kombinacijama povezivanja atoma ovih elemenata, jednostrukim ili dvostrukim vezama (Sl. 17) nastaje ogroman broj bioloških molekula različite složenosti.

Sl. 17. Primeri jednostruke i dvostruke veze

Funkcionalne grupe

Na slici 18. su date najvažnije funkcionalne grupe organskih molekula. Ove grupe su odgovorne za mnoge osobine biomolekula, kao što su rastvorljivost i reaktivnost. Medju važnijim funkcionalnim grupama su hidroksilna (alkoholna), karbonilna (aldehidna i keto), karboksilna, etarska, estarska, anhidridska, amino, amido i sulfhidrilna grupa. Prisustvo funkcionalne grupe u molekulu definiše pripadnost odredjenoj grupi jedinjenja, kao: alkoholi, aldehidi, ketoni, karboksilne kiseline, etri, estri, anhidridi, amini, amidi i sulfhidrilna jedinjenja.

13


Sl. 18. Vrste funkcionalnih grupa najčešće prisutnih u biomolekulima

Grupe sa naelektrisanjem

Kisele grupe sadrže proton koji može da disosuje (H+), ostavljajući ostatak molekula sa negativnim naelektrisanjem. Najvažnije kisele grupe u biomolekulima su: karboksilna, fosfatna i sulfatna grupa. (Sl. 19, a). Jedinjenja koja sadrže azot su uglavnom bazna. Azot ima 5 elektrona u poslednjem, valentnom sloju i kada su 3 elektrona u formi kovelentnih veza sa drugim atomima,

14


atom azota nema naelektrisanje. Medjutim, deleći svoj slobodni elektronski par sa vodonikom ili ugljenikom, azot postaje pozitivno naelektrisan (Sl. 19, b).

(a) (b)

Sl. 19. Primeri negativno i pozitivno naelektrisanih grupa

Polarnost veza i parcijalno naelektrisanje

Kovalentna veza predstavljena parom elektrona dva atoma, koji tako kompletiraju svoje elektronske omotače, može biti nepolarna ili delimično polarizovana. Ako je zajednički elektronski oblak elektronskog para ravnomerno rasporedjen izmedju atoma (u vezi ugljenik-ugljenik i ugljenik-vodonik) kovalentna veza je nepolarna. Polarizovana veza nastaje kada je elektronski oblak pomeren prema jednom od atoma (atom veće elektronegativnosti). U kovalentnoj vezi izmedju kiseonika i ugljenika, kiseonik je elektronegativniji od ugljenika i zato nosi parcijalno negativno naelektrisanje, koje se obeležava sa δ-, ostavljajući ugljenik sa parcijalno pozitivnim naelektrisanjem, δ+. Azot i sumpor su takodje elektronegativniji od ugljenika ili vodonika (Sl. 20). Dobar primer polarnosti veze je molekul vode, koji je vrlo polaran. Zbog elektronegativnosti, atom kiseonika u molekulu vode nosi parcijalno negativno, a atomi vodonika parcijalno pozitivno naelektrisanje (Sl. 21). Ovako naelektrisani molekuli vode, privlačeći se medjusobno, formiraju laticama sličnu strukturu. Elektrostatičko privlačenje izmedju parcijalno pozitivno naelektrisanog vodonika i drugog elektronegativnog atoma (u ovom slučaju kiseonik) naziva se vodonična veza (Sl. 21).

Sl. 20. Parcijalno naelektrisanje u vezi Sl. 21. Vodonična veza izmedju molekula vode C-0, C-N i C-S

15


Rastvorljivost

Da bi bili rastvorljivi u vodi, molekuli moraju imati naelektrisanje ili polarizovane veze kojim privlače parcijalno pozitivno ili negativno naelektrisanje vode. Posledica je da jonska jedinjenja u prisustvu vode disosuju na jone, a da se organska jedinjenja sa hidrofilnim ("vole vodu") grupama rastvaraju u vodi. Molekuli ili delovi molekula koji su nepolarni ne privlače polarizovane molekule vode i zato su nerastvorni. Ovakvi molekuli ili njihovi delovi se označavaju kao hidrofobni ("ne vole vodu") i medjusobno se grupišu (slično se u sličnom rastvara). Amfipatični molekuli imaju i polarne i nepolarne delove.

Reakcije biomolekula

Pet tipova reakcija koji se najčešće javljaju u metabolizmu su: (1) oksido-redukcije, uključuju prenos elektrona sa donora na akceptor, (2) prenos grupa, kada se delovi molekula prenose sa jednog molekula na drugi, (3) raskidanje veza, u prisustvu vode (hidroliza), kada elementi vode postaju sastavni delovi novonastalih produkata, ili nezavisno od vode, (4) reakcije u kojima dolazi do prestruktuiranja unutar molekula, na primer prelazak jednog izomera u drugi i (5) reakcije u kojima se atomi različitih molekula povezuju, koristeći energiju ATP ili ekvivalentan izvor hemijske energije.

Primer reakcije prenosa grupa je fosforilacija, kada se fosfatna grupa sa jednog jedinjenja prenosi na drugo. Najčešći izvor fosfatne grupe je adenozintrifosfat (ATP), koji jednu svoju fosfatnu grupu prenosi na hidroksilnu grupu drugog jedinjenja i formira se fosfoestar (Sl. 22). Na primer, kada glukoza udje u ćeliju ona se fosforiliše.

Sl. 22. Reakcija prenosa grupa: fosforilacija glukoze

Struktura najvažnijih biolmolekula

Organizmi sadrže strukturno vrlo različita jedinjenja, od relativno jednostavnih kao što su šećeri i amino kiseline, do vrlo kompleksnih kao što su proteini i nukleinske kiseline. Struktura svih tih jedinjenja je u osnovi njihove biološke funkcije.

16


2.1. UGLJENI HIDRATI

Ugljeni hidrati, poznati i kao šećeri, imaju nekoliko vrlo važnih bioloških funkcija. Oni su strukturne komponente biljaka, vezivnog tkiva životinja, ćelijskog zida bakterija, spoljašnjeg omotača beskičmenjaka i gradivne komponente mnogih važnih biomolekula. Šećeri su izvor energije za ćeliju i forma njenog deponovanja. Važna uloga šećera je i u procesima kao što je komunikacija medju ćelijama, i odgovor ćelije na delovanje raznih spoljašnjih faktora. Ugljeni hidrati su prema svojoj veličini podeljeni u četiri klase: monosaharidi, disaharidi, oligosaharidi i polisaharidi.

Monosaharidi

Monosaharidi, kao glukoza, galaktoza i fruktoza, su najmanji šećeri i predstavljaju se lancem povezanih ugljenika, od kojih je jedan dvostrukom vezom povezan sa kiseonikom (karbonilna grupa). Ostali atomi ugljenika sadrže hidroksilne grupe. Ako je karbonilna grupa aldehidna, takvi monosaharidi su aldoze, a ako je keto, onda su ketoze. Najčešći monosaharidi su sa 3 (trioze) do 7 (heptoze) ugljenikovih atoma. Monosaharidi sa 4 ugljenikova atoma su tetroze, 5, pentoze a 6, heksoze (Sl. 23).

Sl. 23. Primeri monosaharida

Ugljenikov atom povezan sa četiri različita atoma ili atomske grupe formira asimetrični (ili hiralni) centar. Jedinjenja sa hiralnim centrom postoje u formi stereoizomera i pokazuju optičku aktivnost.

Stereoizomeri imaju istu hemijsku formulu, ali se razlikuju po položaju hidroksilne grupe na jednom od asimetričnih ugljenikovih atoma (Sl. 24).

Sl. 24. Primeri stereoizomera. Sva jedinjenja imaju istu hemijsku formulu (C6H1206) ali se razlikuju po položaju hidroksilne grupe na hiralnim C atomima

17


Mogu biti enantiomeri i epimeri. Enantiomeri su stereoizomeri koji se razlikuju po položaju hidroksilne grupe na asimetričnom ugljenikovom atomu najudaljenijem od karbonilne grupe i odnose se kao predmet i lik u ogledalu (ne mogu se preklopiti). D-gliceraldehid i L-gliceraldehid, kao i D-glukoza i L-glukoza su enantiomeri (Sl. 25).

Sl. 25. Primer D- i L-šećera

Epimeri se razlikuju po položaju hidroksilne grupe, ali na nekom drugom ugljenikovom atomu. D-glukoza i D-galaktoza su epimeri, koji se razlikuju po položaju hidroksilne grupe na četvrtom ugljenikovom atomu (Sl. 26).

Sl. 26. Primeri epimernih šećera

Monosaharidi se najčešće predstavljaju ravnim lancem, mada su u rastvoru u formi prstena, koji je oblika stolice (najstabilnija forma) ili čamca (Sl. 27).

Sl. 27. Forma stolice i čamca - ciklične forme monosaharida

18


Prsten nastaje kada aldehidna ili keto grupa reaguje sa nekom od hidroksilnih grupa istog molekula. Heksoze, kao aldoheksoza glukoza ili ketoheksoza fruktoza, formiraju šestočlani (piranozni) ili petočlani (furanozni) prsten (Sl. 28).

Sl. 28. Piranozni i furanozni prsten glukoze i fruktoze

Ugljenik aldehidne (ili keto) grupe je tako u formi hemiacetala (hemiketala) sa novom hidroksilnom (poluacetalnom) grupom. Ovaj ugljenikov atom, nazvan anomernim, predstavlja novi asimetrični (hiralni) centar u molekulu. Ako zamislimo prsten ciklične forme monosaharida u ravni table ili papira, položaj poluacetalne hidroksilne grupe može biti ispod (α položaj) ili iznad (ß položaj) ove ravni (Sl. 29 ).

Sl. 29. Mogući oblici molekula glukoze u rastvoru

U rastvoru, prsten monosaharida se može otvoriti i ponovo zatvoriti. U otvorenoj formi ravan lanac monosaharida ima aldehidnu ili keto grupu, a pri formiranju prstena poluacetalna grupa zauzima α ili ß položaj, koji prelazeći iz jednog u drugi oblik uspostavljaju ravnotežu. Ako je poluacetalna grupa u vezi sa nekim drugim monosaharidom ili jedinjenjem, onda je reagujuća konformacija “zarobljena” i nisu mogući prelasci u ostale forme.

19


Glikozidi Glikozidi nastaju kada poluacetalna hidroksilna grupa jednog monosaharida reaguje sa hidroksilnom grupom drugog monosaharida ili drugog jedinjenja, uz izdvajanje vode. Nastala veza koja povezuje monosaharide zove se glikozidna veza, a može biti α ili ß u zavisnosti od položaja poluacetalne hidroksilne grupe.

Disaharidi, oligosaharidi i polisaharidi

Disaharidi se sastoje od dva monosaharida povezana glikozidnom vezom. Najpoznatiji disaharidi su maltoza, laktoza i saharoza (Sl. 30). Maltoza se sastoji od dve glukoze povezane α (14) vezom. U laktozi, galaktoza i glukoza su povezani ß (14) vezom. U saharozi, glukoza i fruktoza su povezani α (12) glikozidnom vezom.

Sl. 30. Primeri disaharida. Maltoza nastaje razgradnjom skroba, laktoza je mlečni šećer,a saharoza obični šećer

Oligosaharidi su ugljeni hidrati koji sadrže od 3 do 12 monosaharida, a kod polisaharida hiljade molekula monosaharida je medjusobno povezano glikozidnim vezama. Polisaharidi postoje kao

20


dugački lanci ili formiraju razgranate strukture. Najpoznatiji polisaharidi su skrob, glikogen i celuloza.

Skrob je rezervna forma ugljenih hidrata biljaka i sastoji se od amiloze i amilopektina. U amilozi su molekuli glukoze, α (14) glikozidnom vezom (Sl. 15), povezani u dugačke nerazgranate lance, uvijene u spiralu. U amilopektinu su na isti način formirani lanci, dodatno medjusobno spojeni, formirajući razgranati molekul. Na mestima grananja je α (16) glikozidna veza (Sl. 31). Razgranati molekul amilopektina je sličan glikogenu, koji je još više razgranat.

Sl. 31. α (14) i α (16) glikozidne veze u skrobu i glikogenu

Glikogen, rezervna forma ugljenih hidrata životinja, je veliki, razgranati polisaharidni lanac sastavljen od ostataka glukoze. Molekuli glukoze su povezani α (14) vezom, osim na mestima grananja gde je α (16) glikozidna veza (Sl. 32).

Sl. 32. Struktura glikogena

Derivati monosaharida: glukuronska kiselina, N-acetilglukozamin, N-acetilgalaktozamin, njihovi sulfatni derivati i N-acetilmuraminska i N-acetilneuraminska kiselina izgradjuju manje ili veće molekule ugljenih hidrata u kompleksima ugljenih hidrata i proteina (glikoproteini). Tako su, u formi glukozaminoglikana, hondroitin sulfata, keratan i dermatan sulfata i hijaluronske kiseline, deo proteoglikana. Dugački, nerazgranati lanci glukozaminoglikana, u proteoglikanima su radijalno pričvršćeni za centralni protein, formirajući strukturu sličnu četki za flaše (Sl. 33).

21


Sl. 33. Struktura proteoglikana

Imajući svojstva podmazivača, proteoglikani se nalaze u ekstraćelijskom matriksu, sinovijalnoj tečnosti zglobova i hrskavica. Glikoproteini su i deo ćelijskog zida bakterija (peptidoglikan ili murein), a imaju i druge važne funkcije.

Celuloza je strukturni polisaharid biljaka. U celulozi su molekuli glukoze medjusobno povezani ß(14) glikozidnom vezom. Čovek ne može da koristi celulozu kao hranu jer ne poseduje enzime koji razlažu ovu vezu. Biljojedi u digestivnom traktu imaju simbiotske mikroorganizme koji razlažu celulozu do glukoze.

2.2. PROTEINI

Proteini su biomolekuli koji su, neposredno ili posredno, uključeni u skoro sve aktivnosti ćelije. Oni su i gradivne komponente većine ćelijskih i medjućelijskih struktura (na primer, kolagen). Kao transportni proteini oni nose važne molekule, obezbedjujući njihovo prisustvu na mestima delovanja (na primer, hemoglobin nosi kiseonik). Enzimi, bez kojih se u ćeliji, sa izuzetnom efikasnošću, ne bi moglo odvijati na hiljade hemijskih reakcija, su takodje proteini. Njihovo prisustvo u formi proteinskih hormona i drugih regulatornih molekula obezbedjuje pravilnu funkciju svake ćelije. Proteini su i važne komponente odbrambenog sistema organizma (antitela), a imaju i druge specifične, ali ne manje važne funkcije. Proteini su izgradjeni od aminokiselina, čiji je broj, vrsta i redosled, genetski determinisan i od suštinske vaznosti je za ulogu koju ima odredjeni protein.

Aminokiseline

Aminokiseline su strukturne komponente proteina, a neke i metaboliti iz kojih se dobija energija. Kako aminokiseline sadrže azot, pojedine aminokiseline su prekursori iz kojih nastaju važna jedinjenja sa azotom: neurotransmiteri (adrenalin), pigmenti (hem, melanin), purinske i pirimidinske baze.

Samo ime ovih biomolekula ukazuje na prisustvo i bazne - amino, i kisele - karboksilne grupe u molekulu (Sl. 34). Kod svih aminokiselina, koje izgradjuju proteine, amino i karboksilna grupa se nalaze na α ugljenikovom atomu (ugljenik 2). Pored amino i karboksilne grupe, svaka aminokiselina sadrži i bočni lanac, označen kao R ostatak, takodje vezan za α C atom (Sl. 34).

22


Sl. 34. Struktura aminokiselina

Pri fiziološkom pH, amino grupa nosi proton i naelektrisana je pozitivno, dok karboksilna grupa disocijacijom otpušta proton, i naelektrisana je negativno (Sl. 35).

Sl. 35. Disocijacija karboksilne i amino grupe aminokiselina

Dvadeset aminokiselina koje izgradjuju proteine imaju različite R ostatke. Tako, 19 aminokiselina za α C atom ima vezane različite supstituente, amino i karboksilnu grupu, R ostatak i vodonik. Prisustvo ovog, zbog toga, asimetričnog (hiralnog) centra, uslovljava postojanje aminokiselina u L ili D obliku. Za α C atom aminokiseline glicin su vezana dva atoma vodonika i zato on nije asimetričan. R ostaci ostalih aminokiselina se razlikuju, i njihova hemijska priroda direktno utiče na strukturu proteina.

Uobičajeno je da se aminokiseline prema polarnosti R ostatka dele na nepolarne (hidrofobne), polarne (hidrofilne) i polarne sa pozitivnim ili negativnim naelektrisanjem. Aminokiseline se obeležavaju sa tri ili jednim slovom: glicin Gly (G); alanin Ala (A); glutaminska kiselina Glu (E); fenilalanin Phe (F) i druge.

Peptidna veza

Aminokiseline se povezuju u dugačke polipeptidne lance peptidnim vezama. Peptidna veza nastaje u reakciji karboksilne grupe jedne aminokiseline i amino grupe druge aminokiseline, uz izdvajanje vode (Sl. 36).

23


Sl. 36. Peptidna veza izmedju dve aminokiseline

Na jednom kraju polipeptidnog lanca je aminokiselina sa slobodnom amino grupom, a na drugom kraju lanca aminokiselina sa slobodnom karboksilnom grupom. Peptidna veza je vrlo stabilna i u organizmu je razlažu proteolitički enzimi, proteaze i peptidaze. Delimično dvostruki karakter peptidne veze ne dozvoljava slobodnu rotaciju čineći “kičmu” polipeptidnog lanca. Slobodnom rotacijom oko drugih veza, polipeptidni lanac zauzima najstabilniju prostornu orijentaciju, oblik poznat kao nativna konformacija.

Struktura proteina

Nativnu konformaciju polipeptidnog lanca obezbedjuju peptidne veze, ali i razne vrste medjusobnih interakcija izmedju R ostataka aminokiselina. Peptidna veza je primarna, osnovna veze za postojanje niza, dok su ostale interakcije sekundarne veze. Medju njima su po svojoj zastupljenosti najvažnije vodonične veze i hidrofobne interakcije. Prisustvo primarnih i sekundarnih veza definiše četiri nivoa strukture proteina: primarnu, sekundarnu, tercijarnu i kvarternu (Sl. 37).

Sl. 37. Četiri nivoa strukture proteina

Primarna struktura je linearna sekvenca (redosled) aminokiselina povezanih peptidnom vezom u polipeptidni lanac. Sekundarna struktura nastaje kao rezultat medjusobnog povezivanja vodoničnim vezama raznih delova polipeptidnog lanca i to u delu peptidne veze. Na taj način nastaju dve najvažnije forme sekundarne strukture, α heliks i ß nabrana struktura. Tercijarna struktura je trodimenzionalni izgled (konformacija) polipeptidnog lanca savijenog u globulu (klupče). Kvarterna struktura je trodimenzionalni izgled proteina koga čini više polipeptidnih lanaca (subjedinica). Kvarternu strukturu održavaju iste vrste interakcija izmedju R ostataka aminokiselina, kao kod tercijarne strukture.

Zbog prisustva amino i karboksilne grupe na krajevima lanca, ali i jonizovanih grupa R ostataka aminokiselina, proteini nose odredjeno naelektrisanje. Mogućnost kretanja ovakvih molekula u električnom polju je u osnovi metoda za razdvajanje i identifikaciju proteina.

24


Struktura proteina odredjuje i njihovu funkciju, što uslovljava održavanje nativne (prirodne) strukture proteina. Ipak, pod odredjenim uslovima, kao što su visoka temperatura, ekstremne vrednosti pH i delovanje nekih supstanci, može doći do narušavanja strukture proteina (denaturacija).

Za funkciju mnogih proteina neophodno je prisustvo jona ili kompleksnih molekula. Ovi kompleksni molekuli poznati kao ligandi mogu biti labavo povezani sa proteinom, ili čvrsto, kao hem u hemoglobinu, kada se nazivaju prostetične grupe. Proteinski deo ovakvih kompleksa je apoprotein, a ceo funkcionalni molekul je holoprotein.

2.3. LIPIDI

Lipidi su opšti izraz koji opisuje supstance relativno nerastvorne u vodi, a rastvorljive u nepolarnim, uglavnom organskim rastvaračima. Masne kiseline, u formi glicerofosfolipida i sfingolipida, su važne strukturne i funkcionalne komponente ćelijske membrane, a pripadaju ovoj klasi jedinjenja. Masne kiseline su i važan izvor energije za ćeliju. Nalaze se u sastavu triacilglicerola (triglicerida), depoa masti u organizmu. Lipidima pripadaju i steroidi i eikosanoidi, jedinjenja različite strukture i funkcije.

Masne kiseline

Masne kiseline su dugački alifatični lanci sa metil grupom na jednom kraju (ω ugljenikov atom) i karboksilnom grupom na drugom kraju, kao na primer stearinska kiselina (Sl. 38). Većina masnih kiselina ima paran broj atoma ugljenika (obično izmedju 16 i 20).

Sl. 38. Primer zasićene masne kiseline

Mogu biti zasićene (stearinska) i nezasićene, sa jednom ili više dvostrukih veza. Položaj dvostruke veze se obeležava brojem prvog atoma ugljenika u dvostrukoj vezi (Sl. 39). Na primer, oleinska kiselina, koja ima 18 C atoma i dvostruku vezu izmedju pozicije 9 i 10, može se označiti kao 18:1,Δ9. Broj 18 ukazuje na ukupan broj atoma ugljenika, broj 1 broj dvostrukih veza, a Δ i broj iznad, položaj te veze. Masne kiseline mogu biti klasifikovane i prema rastojanju prve dvostruke veze od ω C atoma. Oleinska kiselina je tako ω9 masna kiselina, a arahidonska sa 4 dvostruke veze i 20 C atoma, kao ω6,20:4,Δ5,8,11,14 (Sl. 39).

25


Sl. 39. Primeri nekih nezasićenih masnih kiselina

Prirodne nezasićene masne kiseline su uglavnom u cis konfiguraciji, označavajući položaj atoma vodonika ugljenikovih atoma dvostruke veze, sa iste strane, za razliku od trans konfiguracije, kada su sa suprotnih strana ove veze (Sl. 40). Tačka topljenja masnih kiselina se povećava sa dužinom lanca, a smanjuje sa stepenom nezasićenosti (brojem dvostrukih veza).

Sl. 40. Cis i trans dvostruka veza u lancu masnih kiselina

Acilgliceroli

Masne kiseline reaguju sa alkoholima (hidroksilnom grupom) i nastaju estri. Glicerol je alkohol sa tri hidroksilne grupe, a u zavisnosti da li je jedna, dve ili sve tri hidroksilne grupe esterifikovano masnim kiselinama, nastaju monoacilgliceroli, diacilgliceroli ili triacilgliceroli (trigliceridi). Masne kiseline u triacilglicerolima su najčešće različite, a od stepena njihove nezasićenosti zavisi i tačka topljenja triacilglicerola. Triacilgliceroli sa zasićenim masnim kiselinama (masti) su čvsti, a sa nezasićenim masnim kiselinama (ulja) su tečni na sobnoj temperaturi.

Fosfoacilgliceroli (glicerofosfolipidi)

Fosfoacilgliceroli sadrže masne kiseline esterifikovane u položaju 1 i 2 glicerola i fosfornom kiselinom u položaju 3. Ovo jedinjenje poznato je kao fosfatidna kiselina (Sl. 41).

26


Sl. 41. Fosfatidna kiselina

Vezivanjem odredjenih supstituenata na fosfatnu grupu fosfatidne kiseline nastaju najvažniji fosfoacilgliceroli: fosfatidilholin (lecitin), fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin i fosfatidilinozitol (Sl. 42). Ova jedinjenja su važne komponente ćelijske membrane.

Sl. 42. Najvažniji fosfoacilgliceroli

Sfingolipidi

Sfingolipidi su jedinjenja koja ne sadrže glicerol, već nezasićeni dvohidroksilni amino alkohol sfingozin. Vezivanjem masne kiseline za amino grupu sfingozina nastaje ceramid (Sl. 43). Esterifikacijom fosforilholina na ceramid nastaje sfingomijelin, a vezivanjem šećerne komponente za ceramid nastaju cerebrozidi i gangliozidi (Sl. 43). Sfingolipidi su glavne komponente ćelijskih membrana nervnog tkiva.

27


Sl. 43. Sfingolipidi, derivati ceramida. Obeležene su grupe koje se nalaze na ceramidu u formi sfingomijelina, galaktocerebrozida i gangliozida (NANA-N acetilneuraminska kiselina,

Glc-glukoza. Gal-galaktoza. GalNAc-N-acetilgalaktozamin)

Steroidi

Steroidi su grupa jedinjenja koja sadrže strukturu sa tri šestočlana i jednim petočlanim prstenom, poznatom kao steroidno jezgro. Holesterol, koji se sintetiše u animalnim ćelijama je steroidni alkohol od koga nastaju sva druga steroidna jedinjenja (Sl. 44). To su žučne kiseline, hormoni kore nadbubrega, polni hormoni. Holesterol sa svojom hidroksilnom grupom može da reaguje sa masnim kiselinama, formirajući holesterol estre. Holesterol estri su još manje rastvorljivi od slobodnog holesterola.

Sl. 44. Holesterol

28


Soli žučnih kiselina su dobar primer amfipatične prirode mnogih lipida. Amfipatična jedinjenja sadrže i hidrofobne i hidrofilne delove molekula, nalazeći se zato, često, u prostoru izmedju lipida i vode. Interagujući svojim hidrofobnim delovima sa lipidima, a hidrofilnim sa vodom, soli žučnih kiselina imaju ulogu deterdženata, pomažući emulzifikaciju lipida u digestivnom traktu.

Eikosanoidi

Eikosanoidi su jedinjenja koje produkuju mnoge ćelije u organizmu, a deluju slično hormonima, ali u neposrednoj sredini gde nastaju (lokalni medijatori). Sintetišu se od polinezasićenih masnih kiselina sa 20 C atoma i sa 3, 4 ili 5 dvostrukih veza. Prostaglandini, tromboksani i leukotrieni pripadaju ovoj grupi jedinjenja.

2.4. NUKLEINSKE KISELINE

Dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) je makromolekul koji, uglavnom kroz sintezu proteina, kontroliše svaku aktivnost ćelije. To je moguće, jer je DNK molekul koji prenosi biološke informacije od jedne generacije ćelija do druge (prenos genetske informacije). Protok biološke informacije sadržan u molekulu DNK ide, sa malim izuzecima, od molekula DNK, preko ribonukleinskih kiselina (RNK) do proteina (ekspresija gena).

Nukleinske kiseline su izgradjene od nukleotida, koji imaju i druge važne funkcije.

Nukleotidi

Nukleotidi su izgradjeni od azotne baze, šećera i fosfata (Sl. 45). Azotna baza može biti purinska (adenin i gvanin) ili pirimidinska (uracil, citozin ili timin). Šećer, riboza ili deoksiriboza, je povezan sa azotnom bazom preko atoma azota i nastaje nukleozid. Vezivanjem fosforne kiseline za šećer nukleozida nastaje nukleotid.

Sl. 45. Komponente nukleotida

Za fosfornu kiselinu nukleotida može da se veže još jedan ili još dva molekula fosforne kiseline, pri čemu nastaje nukleozid di ili tri fosfat (Sl. 46).

29


Sl. 46. Struktura nukleozida i nukleotida

Dve važne uloge nukleotida su: prenosioci energije i gradivne komponente nukleinskih kiselina. Najvažniji nukleotid uključen u prenos energije u organizmu je adenozintrifosfat (ATP), ali tu ulogu u odredjenim reakcijama imaju i drugi nukleotidi. Nukleotidi su i komponente važnih biomolekula kao što su koenzimi, koji učestvuju u metaboličkim reakcijama.

Sl. 47. Polinukleotidni lanac DNK

30


Sl. 48. Mogući način skraćenog prikaza polinukleotidnog lanca

Nukleotidi su monomerne jedinice nukleinskih kiselina, dezoksiribonukleinskih (DNK) i ribonukleinskih (RNK). DNK sadrži purinske baze adenin (A) i gvanin (G), i pirimidinske baze citozin (C) i timin (T). RNK sadrži uracil (U) umesto timina. U DNK šećer je dezoksiriboza, a u RNK riboza. Nukleotidi su povezani 3’ 5’- fosfodiestarskom vezom, formirajući polinukleotidni lanac DNK (Sl. 47, 48) ili RNK. Baze nisu direktno uključene u ovu vezu izmedju šećera i fosforne kiseline (“kičma” lanca), omogućavajuči im slobodu da stupaju u interakcije sa drugim bazama ili proteinima.

DNK čine dva antiparalelna lanca povezana medjusobno preko parova baza vodoničnim vezama, po principu komplementarnosti: adenin sa timinom, gvanin sa citozinom (Sl. 49).

Sl. 49. Parovi baza u DNK povezani vodoničnim vezama (·····)

Dva lanca DNK su antiparalelna jer se pružaju u suprotnim smerovima, 5’ kraj jednog lanca je naspram 3’ kraja drugog i obratno. Ova dva lanca se medjusobno uvijaju, formirajući dupli heliks, tj. zavojnicu (Sl. 50).

31


Sl. 50. Dva lanca DNK formiraju duplu zavojnicu (heliks)

Za razliku od DNK, RNK je jednostruki lanac fosfodiestarskim vezama medjusobno povezanih ribonukleotida. Medjutim, lanac RNK može formirati petlje, a baze koje “idu” u suprotnim smerovima se povezuju po istom principu, gvanin sa citozinom i adenin sa uracilom. Tri osnovna tipa RNK su: informaciona (mesendžer) RNK (iRNK), ribozomalna (rRNK) i transportna RNK (tRNK).

32


3. ENZIMI

Enzimi su katalizatori hemijskih reakcija u ćeliji i van nje (ekstracelularni enzimi). Oni omogućavaju odvijanje hemijskih reakcija odgovarajućom brzinom, njihova aktivnost može da bude regulisana, a to su uslovi koji omogućavaju ćeliji da transformacijom supstrata (hemijsko jedinjenje čiju transformaciju enzim katališe) obezbedi energiju i potrebne gradivne elemente neophodne za ćelijske funkcije. Enzimi ubrzavaju hemijske reakcije, deluju u vrlo malim koncentracijama, i mada kao učesnici reakcije mogu da podležu odredjenim promenama tokom same reakcije, vraćaju se u prvobitno stanje nakon reakcije.

Energetski uslovi za odvijanje hemijske reakcije

U reakcionoj smeši, molekule se nalaze u stalnom kretanju i pri tome dolazi do sudara molekula. To izaziva promenu brzine čestica i njihovog energetskog sadržaja. Učestalost sudara proporcionalna je broju molekula, medjutim, broj sudara daleko je veći od broja molekula koje medjusobno reaguju. To ukazuje da molekule u trenutku sudara moraju da sadrže znatan iznos energije, tj. energiju aktivacije, da bi posle sudara reagovale. Drugim rečima, transformacija reaktanta (-ata) u produkt (-e) tokom hemijske reakcije ograničena je energetskom barijerom (tzv. energija aktivacije). Količina energije koja je potrebna da se svi molekuli u jednom molu supstance na datoj temperaturi aktiviraju do prelaznog stanja (koje se nalazi na vrhu energetske barijere) naziva se slobodna energija aktivacije (Sl. 51). Takodje, treba da postoje odredjeni geometrijski uslovi pri kojima sudar mora da se odigra da bi molekuli medjusobno reagovali.

Energija aktivacije sadržana je u tzv. Arhenius-ovoj jednačini za izračunavanje brzinske konstante:

k = P z e-∆Gakt/RT, gde je

k-brzinska konstanta; P-faktor verovatnoće odredjenih geometrijskih uslova medjusobnog položaja reaktanata pri sudaru; z-učestalost sudara; R-univerzalna gasna konstanta; T-apsolutna temperatura (oK); proizvod Pz može da se zameni jednom konstantom A.

Brzina reakcije zavisi od broja molekula u prelaznom stanju. Ukoliko je slobodna energija aktivacije date reakcije niža, i brzina reakcije je veća. Naime, veći broj molekula u datom momentu dostići će potreban nivo energije.

Sl. 51. Energija aktivacije nekatalisane reakcije Sl. 52. Eenergija aktivacije katalisane reakcije

Postoje dva osnovna načina za povećanje brzine hemijske reakcije. Povećanje temperature reakcione smeše dovodi do ubrzanja hemijske reakcije. Povećanjem temperature za 10oC,brzina

33


mnogih reakcija se udvostručava. Katalizatori ubrzavaju hemijske reakcije “pronalazeći” drugi reakcioni put izmedju reaktanta i produkta, sa nižom energetskom barijerom. Drugim rečima, katalizatori smanjuju slobodnu energiju aktivacije (Sl. 52). Biološki katalizatori - enzimi su mnogo efikasniji u odnosu na neorganske katalizatore (Tab. 1).

Tabela 1. Razgradnja vodonik peroksida (H2O2) na 20oC_____________________________________________________________________________

Uslovi slobodna energija aktivacije (KJ/mol)

nekatalizovana reakcija 75.6katalizovana reakcija - koloidna platina kao katalizator 54.6katalizovana reakcija - enzim katalaza kao katalizator 29.4

Hemijska priroda enzima. Enzimi su proteini. Mogu biti prosti proteini, metaloproteini i složeni proteini, odnosno enzimi koji pored proteinskog dela - apoenzima, sadrže i neproteinsku komponentu - koenzim. Koenzim može da bude vezan za apoenzim kao prostetična grupa, ili da se tokom reakcije vezuje za apoenzim kao kosupstrat, odnosno jedan koenzim može učestvovati u aktivnosti više enzima.

Veliki broj enzima postoji u više različitih formi - izoenzimi, izozimi. To su različiti oblici iste katalitičke aktivnosti, a razlikuju se u odredjenim hemijskim, fizičkim i kinetičkim parametrima. U slučaju monomernih enzima, izoenzimi su kodirani različitim alelnim formama jednog gena. U slučaju oligomernih enzima sastavljenih od različitih subjedinica, izoenzimske forme su rezultat različitog kombinovanja subjedinica. PRIMER - enzim sa 4 subjedinice tipa H i M: HHHH, HHHM, HHMM, HMMM, MMMM - postoji 5 izoenzimskih formi.

Osobine enzima. Enzimi ubrzavaju hemijske reakcije za 106 - 1014 puta. Vrlo su specifični u odnosu na supstrat (supstrat je jedinjenje čiju transformaciju enzim katališe). Ne utiču na ravnotežu hemijske reakcije. Aktivnost enzima je regulisana: kontrolom brzine sinteze i razgradnje enzima; promenom koncentracije supstrata; sintezom u neaktivnoj formi - zimogeni; regulacijom katalitičke efikasnosti - kovalentnom reverzibilnom regulacijom i alosternom regulacijom.

Katalitički centar enzima. Katalitička aktivnost nije vezana za celu površinu enzimske molekule, nego za deo označen kao aktivni ili katalitički centar. On predstavlja relativno mali deo molekule, ima odredjenu konformaciju, i sadrži specifične aminokiselinske ostatke koji obezbedjuju vezivanje supstrata (nekovalentnim vezama) i sam mehanizam katalize. Stvaranje kompleksa enzim-supstrat (ES, C) obezbedjuje dostizanje prelaznog stanja pri nižim energetskim nivoima i reakcija se značajno ubrzava (Sl. 53). Postoje dva modela katalitičkog centra: model ključ i brava (Fisher) i model indukovanog prilagodjavanja (Koschland i sar.), prema kome pri formiranju kompleksa enzim-supstrat dolazi do promene konformacije enzima, a verovatno i supstrata (Sl. 54).

Sl. 53.Smanjenje energije aktivacije dejstvom enzima Sl. 54. Modeli enzim-supstrat kompleksa

34


Nomenklatura enzima

Nastavak –aze označava da su u pitanju enzimi. Trivijalna (uobičajena) imena enzimi su dobijali pri njihovom otkrivanju, npr. tripsin, amilaza, lipaza, peptidaza, proteaza i sl.

Prema preporukama Medjunarodne unije za čistu i primenjenu hemiju (IUPAC) i Medjunarodne unije za biohemiju (IUB) enzimi su podeljeni u šest klasa, a u okviru svake klase postoje odgovarajuće podklase i pod-podklase. Svaki enzim ima svoju oznaku koja se sastoji od četiri broja, gde prvi označava pripadnost klasi, drugi podklasi, treći pod-podklasi, a četvrti označava sam enzim.

Klase su formirane na osnovu tipa rekacije koju enzimi u okviru date klase katališu. Prva klasa su oksidoreduktaze koje katališu reakcije oksidooredukcije, odnosno prenosa elektrona (u formi e-, vodonikovog atoma, ili hidrid jona) od donora do akceptora. Ovi enzimi zahtevaju prisustvo koenzima na koje prenose elektrone sa supstrata. Koenzimi mogu biti nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) i flavinadenindinukleotid (FAD). Druga klasa su transferaze koje prenose funkcionalne grupe sa jednog supstrata na drugi. Funkcionalne grupe su acil (ostatak masne kiseline), amino, metil ili fosfatna (ostatak fosforne kiseline) grupa. Treća klasa su hidrolaze koje katališu raskidanje C-O, C-N ili C-S veze u prisustvu vode (hidroliza). Četvrta klasa su liaze koje cepaju C-C, C-O, ili C-N veze bez prisustva vode, raskidaju dvostruke veze, ili dodaju funkcionalne grupe na dvostruku vezu. Peta klasa su izomeraze koje katališu strukturne promene unutar molekula, odnosno prevode jedan izomer u drugi. Šesta klasa su ligaze (sintetaze) koje katališu formiranje C-C, C-O- C-N veza pri čemu se koristi energija iz ATP.

Primer enzima: EC 2.7.1.2 je enzim glukokinaza koji katališe prenos ostatka fosforne kiseline sa ATP na D-glukozu pri čemu nastaje D-glukozo-6-fosfat i ADP. Prvi broj (2) označava klasu transferaza, drugi broj (7) označava prenos fosfatne grupe, treći broj (1) bliže definiše koji supstrat je akceptor fosfatne grupe, a četvrti broj (2) označava da je u pitanju glukokinaza.

Kinetika reakcija katalizovanih enzimima

Brzina hemijske reakcije opada u funkciji vremena. Dolazi do promene koncentracije supstrata, pH, stvaraju se novi produkti, a sve to može da utiče na intenzitet enzimske aktivnosti. Zato se za odredjivanje normalne katalitičke aktivnosti enzima (enzimske aktivnosti) koriste one eksperimentalne metode gde je moguće merenje inicijalne (početne) brzine reakcije (v0) kada su promene u reakcionoj smeši zanemarljive.

Uticaj koncentracije supstrata na brzinu reakcije katalizovane enzimom. Ako se u nizu reakcionih smeša koncentracija enzima drži konstantnom, a menja se koncentracija supstrata, može se na osnovu eksperimentalnih podataka konstruisati kriva koja predstavlja promenu v0 u funkciji koncentracije supstrata (S). Funkcija je hiperbola koja se asimptotski približava graničnoj vrednosti za brzinu (Vmax) (Sl. 55). Kada se dostigne maksimalna brzina, enzim je zasićen supstratom, tj. dolazi do saturacije enzima. Svi enzimi pokazuju efekat saturacije.

Sl. 55. Uticaj koncentracije supstrata na početnu brzinu

35


Enzimski katalisana reakcija može da se predstavi na sledeći način:

k+1 k+2

[E] + [S] [C] [P] + [E] , gde su k -1 k -2

[E] - koncentracija enzima; [S] - koncentracija supstrata; [C] - koncentracija kompleksa [ES]; [P] - koncentracija produkta.

Reakcije su reverzibilne; konstante brzine označene su sa + i - u odnosu na smer reakcije. Brzinska konstanta k -2 se zanemaruje, jer se posmatra brzina na samom početku reakcije kada je stvoreno vrlo malo produkta, tako da je brzina reverzibilne reakcije zanemarljiva. Jednačina za izračunavanje v0 glasi

Vmax [S]v0 = gde je

[S]+ Km

v0 brzina formiranja produkta pri datim koncentracijama supstrata Km je jednako (k-1+k+2)/k+1 i označeno je kao Mihaelis-Mentenova konstanta, prema autorima koji su prvi formirali model enzimski katalisane reakcije. Jednačina se označava kao Michaelis-Mentenova jednačina za reakciju u kojoj se transformiše jedan supstrat pod delovanjem jednog enzima. Ova jednačina povezuje v0, Vmax i početnu koncentraciju supstrata. Koncentracija enzima sadržana je u Vmax, jer je Vmax = k+2[C], a u saturacionim uslovima, koncentracija kompleksa je jednaka koncentraciji enzima u reakcionoj smeši.

Važan numerički izraz javlja se kada je v0 50% od Vmax. Sledi da je vrednost Km jednaka koncentraciji supstrata u tim uslovima. Stoga se Michaelis-Mentenova konstanta definiše kao ona koncentracija supstrata pri kojoj je inicijalna brzina jednaka polovini maksimalne brzine. Dimenzije za Km su mol/L.. Km je nezavisno od koncentracije enzima. Km je bitna karakteristika enzima u odnosu na dati supstrat.

Saturaciona funkcija (Y) dobija se ako se obe strane jednačine podele sa Vmax. Sledi da je

[S] Y = Vrednosti Y kreću se od 0 – 1, tj., od 0 – 100%.

[S] + Km

Transformacija Mihaelis-Mentenove jednačine. Lineweaver-Burck-ov prikaz, tzv. obostrano recipročan odnos, (1/v0 : 1/s0) je transformacija M.M. jednačine pri kojom se odnos izmedju V0 i s linearizuje (Sl. 56).

1/v0 = 1/Vmax – (Km/Vmax) (1/s0)

Odsečak na y-osi predstavlja recipročnu vrednost od Vmax, a odsečak na x-osi predstavlja recipročnu vrednost od - Km (Sl. 56).

36


Sl. 56. Obostrano recipročan odnos

Inhibicija enzimske aktivnosti

Postoji reverzibilan i ireverzibilan tip inhibicije enzimske aktivnosti. Reverzibilna inhibicija može biti: kompetitivna i nekompetitivna.

Kompetitivna inhibicija. Ako je inhibitor jedinjenje po strukturi srodno supstratu, karakter inhibicije je kompetitivan. To znači da se i supstrat i inhibitor vežu za ista mesta na enzimu stvarajući kompleks enzim-supstrat, enzim-inhibitor (Sl. 57). Prisustvo takvog inhibitora smanjuje vezivanje supstrata, pa je potrebna veća koncentracija supstrata da bi v0 bilo 1/2 od Vmax, tj. vrednost Km se povećava. Zato kompetitivni inhibitor menja Km enzima za dati supstrat. Ukoliko se u reakciju stavi vrlo velika količina supstrata u odnosu na inhibitor, onda se delovanje inhibitora može sprečiti. Reakcije u sistemu: supstrat, enzim i inhibitor mogu se prikazati kao na Sl. 57.

Sl. 57. Kompetitivna inhibicija Sl. 58. Grafički prikaz kompetitivne inhibicije

Rezultat je Lineweaver-Burck-ov prikaz. Odsečak na y-osi se ne menja, a povećava se nagib prave i smanjuje odsečak na x-osi, jer se Km u prisustvu inhibitora povećava (Sl. 58).

Nekompetitivna inhibicija. Kod ovog tipa inhibicije, inhibitor se reverzibilno vezuje za enzim na mestu koje nije specifično za supstrat (Sl. 59). Pretpostavlja se da to dovodi do promene konformacije enzima, pa se smanjuje katalitička efikasnost enzima.

37


Nekompetitivna inhibicija može najbolje da se prepozna iz grafičkog prikaza (Sl. 60). Nagib se menja, a menja se i odsečak na y-osi. On je veći u prisustvu inhibitora, što ukazuje da se Vmax

smanjuje dodatkom inhibitora i da ne može da se poveća bez obzira na koncentraciju supstrata. Km se ne menja, jer zasićenje aktivnog centra enzima ne ometa vezivanje inhibitora na drugom delu molekule enzima. Ovaj tip inhibicije zavisi od koncentracije inhibitora u odnosu na koncentraciju enzima, a ne od medjusobnog odnosa koncentracije supstrata i inhibitora, kao što je slučaj kod kompetitivne inhibicije.

Sl.59. Nekompetitivna inhibicija Sl. 60. Grafički prikaz nekompetitivne inhibicije

Ireverzibilna inhibicija. Ligand koji se ireverzibilno vezuje za enzim ponaša se kao nekompetitivni reverzibilni inhibitor, jer se Vmax smanjuje, a Km ostaje nepromenjeno u prisustvu ireverzibilnog inhibitora. Ovi inhibitori vezuju se za aminokiselinske ostatke u katalitičkom centru i trajno inaktivišu enzim. Primer ireverzibilnog inhibitora je nervni bojni otrov diizopropilfluorofosfat (DPFP) koji inhibiše enzim acetilholin-esterazu koja katališe razgradnju acetil holina, važnog neurotransmitera u centralnom i perifernom nervnom sistemu.

Dejstvo aktivatora

Mnogi enzimi su metalo-proteini, ili metalo-aktivirajući enzimi, znači metalni joni deluju kao aktivatori. Joni metala koji su prisutni u enzimima su Fe2 , Zn2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+ . Zato je važno unošenje oligoelemenata kroz ishranu.

Postoje enzimi koji se sintetišu u neaktivnoj formi (zimogena forma) i koji se aktiviraju odvajanjem dela polipeptidnog lanca (dejstvom nekog enzima). To je ujedno i način regulacije aktivnosti ovih enzima. Primer su enzimi koje sintetiše pankreas (tripsinogen, himotripsinogen, i drugi) , a koji se u zimogenoj formi izlučuju u crevo, gde se tripsinogen pod dejstvom enteropeptidaze (enzim koji sekretuju ćelije creva) prevodi u aktivni tripsin. Tripsin aktivira ostale enzime, a takodje može autokatalitički da prevodi neaktivne molekule tripsinogena u tripsin. Kod blokade pankreasnog kanala, može da dodje do aktivaciuje zimogena u pankreasu i tada aktivni enzimi počinju da vare pankreasno tkivo (tzv. akutni pankreatitis).

Uticaj pH na brzinu reakcije katalizovane enzimom

Mnogi enzimi imaju karakterističan pH pri kome je njihova aktivnost maksimalna. Najčešće kriva aktivnosti ima oblik zvona (Sl. 61). Odnos izmedju pH i aktivnosti enzima zavisi od acido-baznih osobina enzima i supstrata, a posebno od vrste aminokiselinskih ostataka u katalitičkom centru. Jonizovani aminokiselinski ostaci zahtevaju odredjen pH da bi bili u odgovarajućoj formi. Na primer, kisela sredina ne pogoduje disocijaciji karboksilne grupe. Optimalni pH enzima ne mora se poklapati sa pH u ćeliji. To ukazuje na pretpostavku da odnos pH-aktivnost enzima može da bude jedan od faktora koji reguliše intracelularnu aktivnost enzima.

38


Sl. 61. Dejstvo pH na aktivnost enzima

Uticaj temperature na brzinu reakcije katalizovane enzimom

Kao i kod nekatalizovanih reakcija, i uslučaju reakcija katalizovanih enzimima, brzina reakcije povećava se povećanjem temperature, unutar onih granica u kojima je dati enzim stabilan i ispunjava punu aktivnost. Brzina se povećava dva puta, ukoliko se temperatura poveća za 10oC, tj. temperaturni koeficijent je 2. Vrednost temperaturnog koeficijenta varira od enzima do enzima, a zavisi od energije aktivacije katalizovane reakcije, odnosno od visine energetske barijere prelaznog stanja. Ako se prikaže odnos izmedju promene temperature i brzine hemijske reakcije katalizovane enzimom, dobija se zvonasta kriva (Sl. 62). Kriva ukazuje na postojanje “optimuma”- vrh krive. To je rezultat dva procesa: povećanja brzine izazvanog povećanjem temperature (deo krive do vrha) i povećanja brzine termalne denaturacije enzima iznad kritične temperature. Najveći broj enzima inaktivira se na temperaturi preko 55oC. Postoje enzimi koji su stabilni i na mnogo višim temperaturama (PRIMER - enzimi kod termofilnih bakterija koje žive u toplim izvorima aktivni su na temperaturama većim od 85oC).

Sl. 62. Zavisnost enzimske aktivnosti od temperature

Uticaj koncentracije enzima na brzinu reakcije katalizovane enzimom

Brzina enzimske reakcije, ako su ostali uslovi (pH, temperatura, koncentracija supstrata) konstantni, jeste direktno proporcionalna koncentraciji enzima.

v0 = ke0

39


Ovaj odnos važi za veliki broj enzima i na njemu se zasnivaju skoro sve metode za odredjivanje koncentracije enzima. Direktna linearna zavisnost izmedju brzine reakcije i koncentracije enzima postoji na početku reakcije. U kasnijem vremenskom periodu linearnost izmedju koncentracije enzima i brzine nije linearan. Za to postoji više objašnjenja u koja nećemo ulaziti.

Regulacija enzimske aktivnosti

Regulacija brzine odvijanja odredjenih rekacija u metaboličkim putevima je osnov kontrole metaboličkih procesa u ćeliji. Načini regulacije su: promena ukupne količine prisutnog enzima (preko kontrole sinteze i razgradnje); promena količine dostupnog suptrata; sinteza enzima u formi zimogena; kontrola katalitičke aktivnosti enzima - alosterna regulacija i kovalentna reverzibilna regulacija.

Alosterni enzimi. Katalitička aktivnost alosternih enzima menja se nekovalentnim vezivanjem specifičnih metabolita. Alosterni znači da takva molekula sem katalitičkog mesta ima i neko drugo mesto gde se vezuje specifični metabolit (modulator) koji može da ima pozitivno ili negativno dejstvo.

Svi do sada poznati alosterni enzimi predstavljaju oligomerne proteine sa odgovarajućom kvarternom strukturom. Interakcija medju katalitičkim centrima subjedinice rezultira tzv. homotropnim efektom (za enzim se kaže da je homotropan) ako sam supstrat deluje kao modulator. Homotropan efekat je po pravilu kooperativan, odnosno vezivanje jedne molekule supstrata izaziva povećanje afiniteta enzima za supstrat, pa se ubrzava vezivanje ostalih molekula supstrata. Ako se modulator razlikuje od supstrata, i vezuje za neko drugo vezno mesto (ne katalitički centar), onda interakcija izmedju alosternih veznih mesta i katalitičkih centara rezultira tzv. heterotropnim efektom. Po pravilu, svi enzimi sa homotropnim ponašanjem ispoljavaju i tzv. heterotropni efekat, odnosno postoje odredjeni modulatori koji mogu da povećaju (aktivatori) ili smanje (inhibitori) aktivnost enzima (Sl. 63). Alosterno mesto može da se nalazi na drugoj subjedinici u odnosu na katalitički centar. Važna osobina alosternih enzima je odstupanje od Michaelis-Mentenove kinetike. Odnos izmedju v0 i s0 dat je sigmoidnom krivom, a ne hiperbolom (Sl. 64).

Sl. 63. Model alosternog enzima Sl. 64. Uporedni prikaz M.M. kinetike i kinetike alosternih enzima (sigmoidna kriva)

40


Kovalentna reverzibilna regulacija enzima. Enzim se iz neaktivne u aktivnu formu (ili obrnuto) prevodi vezivanjem ostataka fosforne kiseline za aminokiselinske ostatke sa hidroksilnm grupom u molekuli enzima. Proces vezivanja ostatka fosforne kiseline označen je kao fosforilacija, reakciju katalizuju enzimi kinaze, a ostatak fosforne kiseline obezbedjuje se od molekule ATP. Fosforilacija je opšti način kontrole aktivnosti proteinskih molekula u ćeliji, ne samo enzima.

Primer je aktivacija enzima glikogen fosforilaze koja vrši odvajanje molekula glukoze iz molekule glikogena, odnosno katališe razgradnju glikogena (glikogenoliza).

(gukoza)n + HPO4- (gukoza)n-1 + glukozo-1-fosfat

Fosforilacija enzima glikogen fosforilaza prevodi ga iz neaktivne u aktivnu formu. Iz aktivne u neaktivnu formu, enzim se prevodi hidrolizom ostataka fosforne kiseline, što katališe enzim označen kao fosfataza (Sl. 65).

Sl. 65. Reverzibilna kovalentna regulacija aktivnosti glikogen fosforilaze

Mesto delovanja enzima

Glavno mesto delovanja enzima jeste intracelularni prostor. Kod eukariotske ćelije enzimi mogu biti locirani u citosolu, ili u odgovarajućim organelama, gde mogu biti unutar matriksa odgovarajuće organele, ili pak vezani za membranu. Kod prokariota, enzimi deluju unutar citosola, ili vezani za unutrašnju stranu plazma membrane. Medjutim, enzimi mogu da deluju i ekstracelularno. Primer za to su enzimi za varenje u digestivnom traktu životinja i čoveka, ili ektracelularni enzimi baketrija i gljiva koji obezbedjuju razlaganje složenih organskih polimernih molekula na gradivne sastojke koji zatim mogu da se transportuju kroz plazma membranu i koriste u metabolizmu ćelije kao energetski supstrat ili kao izvor ugljenika. Ekstracelularni enzimi pripadaju klasi hidrolaza, i katališu razgradnju odgovarajućih kovalentnih veza kao što su peptidna, glukozidna, estarska i slično.

41


Enzimi koji učestvuju u metabolizmu ksenobiotika

Ksenobiotici (xeno – strani; bios – živi) su supstance koje nisu normalne komponente organizma koji je izložen njihovom dejstvu. Mogu da potiču iz prirodne hrane (alkaloidi, flavoni), ili pak da predstavljaju supstance koje su namerno (lekovi – prirodni i sintetski, aditivi u hrani) ili nenamerno unete u organizam. U ovu poslednju kategoriju ulaze supstance koje je sintetisao čovek za odredjene potrebe, a koje su u životnu sredinu dospele nekontrolisano, i u organizam čoveka i životinja mogu da dodju preko hrane, udisanjem ili dermalnim putem (preko kože). U ove ksenobiotike se ubrajaju pesticidi (herbicidi, insekticidi, fungicidi), poliaromatični ugljovodonici (PAHs), polihlorovani bifenili (PCBs), polihlorovani dibenzo-p-dioksini (PCDD) i polihlorovani dibenzofurani (PCDFs), plastika i razni drugi sintetski polimeri. Sve ove supstance su hidrofobna jedinjenja, što znači da lako prolaze kroz plazma membranu, imaju dug poluživot i predstavljaju perzistentne polutante u svim matricama životne sredine, zemlji, vodi, vazduhu. Termin polutanti koristi se da označi sve ono što je aktivnošću čoveka dospelo u spoljašnju sredinu i izazvalo zagađenje vazduha, vode ili zemljišta.

Životinje, biljke i mikroorganizmi koriste različite mehanizme da se odbrane od nepovoljnog i štetnog dejstva ksenobiotika. Tako naprimer, postoje mnoge grupe bakterija koje su u stanju da odgovarajući ksenobiotik koriste kao izvor ugljenika i na taj način ga ”pretvaraju u korisne materije” za rast i razmnozavanje. Životinjski organizmi poseduju sisteme za eliminaciju (ili deponovanje) toksičnih supstanci.

Metabolizam ksenobiotika, u kome učestvuje veliki broj enzima, može da se podeli u dve faze. Faza I predstavlja hemijske transformacije koje obuhvataju reakcije oksidacije, redukcije, hidroksilacije, hidrolize. Uvodjenje reaktivnih polarnih grupa u molekule ksenobiotika povecava njihovu rastvorljivost, ali i pristupačnost za drugu fazu metabolizma. Faza II obuhvata nastajanje oblika pogodnih za ekskreciju ili transport. Najčesće se aktivnosću transferaza metaboliti ksenobiotika konjuguju sa endogenim jedinjenjima, kao što su glukuronska kiselina ili sulfati.

Najvazniji enzimski sistemi detoksifikacije u fazi I su enzimi monooksigenaze, tzv. citohrom P450 zavisni enzimi koji se u novije vreme označavaju kao CYP enzimi. Postoji ogroman broj izoformi CYP enzima, prisutni su u različitim tkivima, a najviše u jetri životinja i čoveka. Jetra predstavlja organ u kome se odvija metabolizam lekova, i drugih supstanci unetih u organizam, odnosno organ u kome se vrši detoksifikacija. CYP enzimi su locirani u endoplazmatskom retikulumu.

Enzimi II faze su glutation-S-transferaze (GST), koji prenose ostatak organskog molekula na glutation (tripeptid), gradeći manje toksičan derivat. Ostali enzimi konjugacije su enzimi sulfatacije, metilacije, acetilacije i konjugacije sa glicinom.

Antioksidativni enzimi

Reakcije oksidacije su veoma važne u normalnom metabolizmu ćelije, ali su zato i izvor slobodnih kiseoničnih radikala i drugih reaktivnih čestica koje su jaka oksidaciona sredstva. Reaktivne čestice kiseonika tj. čestice koje imaju veću oksidativnu sposobnost od kiseonika obuhvataju:

A. slobodne kiseonične radikale: - superoksid anjon radikal - O2.-

- hidroksil radikal - HO.

- lipidne i druge perokside - LOO. i XOO.

- azot oksid - NO.

B. druge molekule velike reaktivnosti:- vodonik peroksid - H2O2

- lipidni peroksidi i drugi ogranski peroksidi- singlet kiseonik - 1O2

42


Formiranje superoksid anjona može da injicira nastajanje i drugih reaktivnih kiseoničnih radikala, te tako reakcijom dismutacije ili redukcijom, spontano ili enzimski katalizovano, nastaje H2O2, a mogu da nastanu i hidroksil radikal i/ili singlet kiseonik. Prema tome, rezultat permanentnih redoks ciklusa je stalna izloženost ćelije delovanju slobodnih kiseoničnih radikala. Poremećaj ravnoteže izmedju produkcije slobodnih radikala i antioksidativne zaštite ćelije predstavlja oksidativni stres. Slobodni kiseonični radikali mogu da se vežu kovalentno za ćelijske makromolekule i da pri tome ili “oduzimaju” atom vodonika, ili funkcionišu kao donor svog nesparenog elektrona molekulskom kiseoniku. Pri tome se remeti struktura membranskih lipida, nastaju lipidni peroksidi tj. injicira se proces lipidne peroksidacije, što za posledicu ima promenu fluidnosti, integriteta, permeabiliteta i funkcionalnosti ćelijske membrane, te može da dodje i do smrti ćelije.

S obzirom da je produkcija slobodnih radikala u aerobnoj ćeliji stalna, tokom evolucije je došlo do pojave različitih sistema koji svojim specifičnim mehanizmima uklanjaju ili ublažuju negativne efekte slobodno-radikalskih čestica. Ovi zaštitini mehanizmi, označeni kao sistem antioksidativne zaštite obuhvataju: enzimske mehanizme (antioksidativni enzimi), zaštitu malim molekulima (akorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi) i antioksidativne proteine (zaštita vezivanjem metalnih jona)

Antioksidativni enzimi su superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation peroksidaza (GSH-Px), glutation transferaza (GST) i glutation reduktaza (GR).

Superoksid dismutaza pripada grupi metalo-enzima i katališe reakciju dismutacije superoksidnog radikala do vodonik peroksida i molekulskog kiseonika:

O2.- + O2

.- + 2H+ H2O2 + O2

Reakcija dismutacije superoksidnog anjona

Katalaza je enzim koji katališe reakciju razlaganja reaktivne molekule H2O2 na vodu i kiseonik:

2H2O2 H2O + O2

Razlaganje reaktivnog vodonik-peroksida

Glutation peroksidaza je enzim koji katalizuje reakciju redukcije hidroperoksida redukovanim glutationom (GSH) do odgovarajućih alkohola:

2GSH + R-OOH GSSG + ROH + H2O

Redukcija hidroperoksida u prisustvu GSH

Glutation-S-transferaze katališu hidrolizu oganskih i lipidnih peroksida, ali ne deluju na vodonik peroksid. Katalitičku aktivnost ostvaruju redukcijom GSH i konjugacijom redukovanog oblika glutationa (GSH) sa elektrofilnim supstratom, a ova reakcija se smatra univerzalnim mehanizmom detoksifikacije:

2GSH + LOOH GSSG + LOH + H2O

Konjugacija GSH sa elektrofilnim supstratom

43


44


4. BIOENERGETIKA ĆELIJE

Osnovu životnih aktivnosti ćelije čine neprekidna transformacija materije i energije, kao i njihova razmena sa okolinom. Transformacija materije odvija se kroz niz hemijskih reakcija katalisanih enzimima koje su obuhvaćene terminom metabolizam ćelije, a svaka od ovih reakcija praćena je prenosom energije. Stoga je za razumevanje metabolizma ćelije, kao i raznih vidova aktivnosti ćelije (transporti kroz membranu, mehanički rad, prenos informacija i drugo) neophodno poznavanje bioenergetike ćelije.

Živi sistemi funkcionišu pri relativno uniformnoj temperaturi i pritisku, te stoga za vršenje rada mogu da koriste samo deo energije sistema koja je označena kao slobodna energija.

Slobodna energija ∆F = ∆U - T∆S (1) Helmholtzova funkcija

gde je ∆U promena unutrašnje energije sistema, ∆S promena entropije sistema, a T∆S tzv. “vezana energija“, tj. onaj deo energije koji ne može da se iskoristi za vršenje rada.

Slobodna entalpija ∆G = ∆H - T∆S = (∆U + pV) - T∆S (2) Gibsova funkcija

gde je ∆H promena entalpije. Pri konstantnim uslovima temperature (t), pritiska (p) i zapremine (V), sledi da je ∆G = ∆F, pa se i ∆G i ∆F koriste kao oznake za promenu slobodne energije sistema.

∆G je validan parametar za ocenu spontanosti procesa i kvantifikaciju energetskih trasnformacija tokom nekog procesa. Ako je ∆G > 0 proces je označen kao endergoničan, a ako je ∆G < 0, proces je označen kao egzergoničan (Sl. 66). Na Sl. 67 prikazana je endergonična hemijska reakcija (1) i egzergonična hemijska reakcija (2), kao i povezivanje te dve reakcije u reakciju (3), pri čemu je ∆G3 < 0.

Sl. 66. Mehanički model egzergonične i Sl. 67. Primeri egzergonične i endergonične endergonične reakcije hemijske reakcije

∆G hemijske reakcije predstavlja razliku izmedju ∑∆G produkta i ∑∆G reaktanta, tj.

∆G = ∑∆G prod. - ∑∆G reakt. (3)

∆G hemijske reakcije može da se izrazi na sledeći način. Pretpostavimo reakciju:

a[A] + b[B] c[C] + d[D] (4)Promene slobodne energije reakcije (∆G) data je jednačinom:

45


[C]c[D]d

∆G = ∆G’0 +RT ln (5) [A]a[B]b

gde je ∆G’0 - standardna promena slobodne energije, R - gasna konstanta (R=8.314 J/mol0K)T - apsolutna temperatura (0K), [A] - molarne koncentracije (preciznije molarne aktivnosti) reaktanata.

∆G’0 predstavlja promenu slobodne energije pri standardnim uslovima: početna koncentracija svih reaktanata 1 mol/l, T=2980K, pritisak 98.8 kPa. Obzirom da se biohemijske reakcije odvijaju pri pH∼7.0, pH 7.0 dogovorno je odredjen kao standardni pH u biohemijskoj energetici. Standardne promene slobodne energije pri pH 7.0 označavaju se sa ∆G’0.

U uslovima ravnoteže ∆G = 0 i jednačina (5) postaje:

[C]c[D]d

0 = ∆G’0 + RT ln [A]a[B]b

odnosno: [C]c[D]d

∆G’0 = - RT ln (6)[A]a[B]b

U jednačini (6) date su ravnotežne koncentracije produkata i reaktanata, pa sledi da je:

∆G’0 = -RT ln Kr (7)

∆G’0 = -2.303 RT log Kr (8)

Razlike izmedju ∆G i ∆G’0. Standardna promena slobodne energije ima karakterističnu vrednost za datu hemijsku reakciju, jer zavisi od prirode jedinjenja koja stupaju u reakciju. Obzirom na jednačinu (7):

Za Kr > 1, ∆G'0 < 0, reakcija spontano teče u desno do uspostavljanja ravnoteže;

Za Kr < 1, ∆G'0 > 0, reakcija je endergonična i spontano teče u levo do uspostavljanja ravnoteže, da bi se odvijala udesno, potrebno je uložiti energiju;

Za Kr ═ 1, ∆G'0 ═ 0, reakcija je u ravnoteži.

Medjutim, promena slobodne energije hemijske reakcije ne zavisi samo od prirode jedinjenja, što je sadržano u ∆G'0, nego i od koncentracije reaktanata i produkata (videti jedn. 5). Ukoliko je količnik proizvoda koncentracije produkata i proizvoda koncentracije reaktanata jednak jedinici, sledi da je

∆G ═ ∆G'0.

Takodje, ako je reakcija endergonična u standardnim uslovima, a vrednost ∆G0 nije velika, takva reakcija može u nestandardnim uslovima da postane egzergonična ukoliko se podese odgovarajuće koncentracije reaktanata i produkata, tako da drugi izraz u jedančini (5) postane negativan i po apsolutnoj vrednosti veći od ∆G'0. To se u metaboličkim putevima dešava.

46


∆G’0 hemijskih reakcija su aditivne. Ukupna standardna promena slobodne energije za seriju reakcija jednaka je Σ∆G’0 pojedinačnih reakcija.

PR.: A → B ∆G’01

B → C ∆G’02 ∆G’0

s = ∆G’01 + ∆G’0

2

------------------A → C ∆G’0

s

Vezane reakcije. Dve sukcesivne reakcije u kojima je produkt prve reakcije reaktant u drugoj reakciji nazivaju se vezane reakcije kroz zajednički metabolit. Jedini način na koji se hemijska energija prenosi od jedne do druge reakcije pri konstantnoj temperaturi i pritisku jeste da te dve reakcije imaju zajednički metabolit.

A → B + C ∆G’0 = 7 kJ/molB → D ∆G’0 = -12 kJ/mol

________sumarno: A + B → B + C + D ∆G’0 = - 5 kJ/mol

To znači da endergonična reakcija može da se dogodi ako je povezana sa jednom egzergoničnom reakcijom, pri čemu je ∆G’0 < 0.

Adenozin trifosfat (ATP)

Ćelije heterotrofnih (hemoorganotrofnih) organizama obezbedjuju slobodnu energiju neophodnu za odvijanje endergoničnih procesa (različite forme ćelijskog “rada” ) iz egzergoničnih reakcija (reakcije u katabolizmu hranljivih materija) sintezom jedinjenja sa visokim energetskim potencijalom. U živoj ćeliji ovo jedinjenje predstavljeno je adenozin trifosfatom (Sl. 68). ATP je medjuprodukt ili “prenosilac” energije i obezbedjuje “prevodjenje” slobodne energije iz egzergoničnih u endergonične reakcije. Kod fototrofnih organizama ATP se sintetiše i na račun sunčeve energije, a kod hemolitotrofnih na račun energije oslobodjene oksidacijom neorganskih jedinjenja .

Sl. 68. Strukturna formula ATP Sl. 69. Obnavljanje energetskih rezerviATP i produkti njegove hidrolize ADP i AMP su nukleotidi. U njegov sastav ulaze: purinska baza (adenin), pentoza (D-riboza) i ostaci fosforne kiseline (Sl. 68). Pri pH 7.0 fosfatne grupe ATP-a i

47


ADP-a su potpuno jonizovane i oni u stvari predstavljaju anjone ATP4- i ADP3-. U intracelularnoj tečnosti koja sadrži visoku koncentraciju Mg++, ATP i ADP su kompleksirani sa Mg-jonima.

Koncentracija ATP-a u ćeliji je relativno konstantna i predstavlja stacionarno stanje, što znači da se krajnja P-grupa neprekidno hidrolizuje i ponovo zamenjuje iz anorganskog pula fosfata tokom metaboličkih procesa (Sl. 69). ATP ima karakterističnu standardnu promenu slobodne enrgije od -30.5 kJ/mol (Tab. 2).

ATP ima ∆G’0 čija je vrednost u sredini termodinamičke skale fosfatnih jedinjenja te stoga može da služi kao prenosilac fosfatne grupe od jedinjenja čija je ∆G’0 hidrolize veća od njegove, do akceptorskih jedinjenja koja oslobadjaju manje slobodne energije pri hidrolizi pod standardnim uslovima u odnosu na ATP.

Korišćenje ATP u ćeliji

ATP može da preda deo svoje energije prenosom fosfatne grupe na akceptorni molekul. Enzimi kinaze katališu prenos fosfatne grupe sa ATP na akceptorni molekul, pri čemu se formira fosforilisani supstrat i ADP.

TABELA 2. ∆G0’ hidrolize nekih fosfatnih jedinjenja

Naziv jedinjenja ∆G’0

Fosfoenolpiruvat -61.95 kJ/mol1,3-difosfoglicerat -49.39 kJ/molFosfokreatin -43.11 kJ/molADP (AMP + Pi) -30.55 kJ/molATP (ADP +Pi) -30.55 kJ/molGlukozo-1-P -20.93 kJ/molFruktozo-6-P -15.91 kJ/molGlukozo-6-P -13.81 kJ/molGlicerol-1-P -9.20 kJ/mol

ADP + D-glukoza ADP + D-glukozo-6-fosfat ΔG’0 = -16.7 kJ/mol

U ovoj reakciji hidroksilna grupa akceptornog molekula je fosforilisana. Obzirom da je ΔG0’

hidrolize glukozo-6-fosfata (ΔG’0= -13.8 kJ/mol) manje od ΔG’0 hidrolize ATP, gornja reakcija pomerena je u desno pod standardnim uslovima. S druge strane, glukozo-6-fosfat ima veći energetski sadržaj od defosforilisane glukoze, pa može podleći daljoj enzimatskoj transformaciji i ući ili u proces glukolize, ili se transformisati u glukozo-1fosfat i ući u metabolički put sinteze glikogena.

Drugi način korišćenja ATP je hidroliza do AMP i pirofosfata, koji je nestabilan, pa se odmah hidrolizuje do 2 ortofosfata, tako da se praktično utroše 2 visoko energetske fosfatne veze. Pri ovoj reakciji stvara se medjuproizvod od jedinjenja koje treba da bude “aktivirano” i AMP. Primer je aktivacija amino kiselina (AK) pri ugradnji u polipeptidni lanac tokom procesa prevodjenja u ribosomima. U prvoj etapi tog procesa stvara se kompleks AK-AMP-enzim, a zatim se AK prenosi na tRNK koja će je odneti u ribozom.

Putevi resinteze ATP u ćeliji

48


ATP se sintetiše na račun energije oslobodjene u reakcijama oksido-redukcije. U tim reakcijama učestvuju enzimi oksidoreduktaze (dehidrogenaze) koji elektrone (redukcione ekvivalente u formi atoma vodonika, ili hidrid jona) prenose sa supstrata koji se oksiduje na koenzime koji se pri tome redukuju. Primeri koenzima koji “rade” sa dehidrogenazama su nikotinamidadenin dinukleotid (NAD+), nikotinamidadenin dinukleotid fosfat (NADP) i flavinadenin dinukleotid (FAD). NAD+ je koenzimska forma vitamina nikotinamida (Sl. 70). FAD je koenzimska forma vitamina riboflavina (B2) (Sl. 71).

E1

SH2 + NAD+ S + NADH+H+ (Reakcija 1) red. oksid. oksid. red.

E2

SH2 + FAD S + FADH2 (Reakcija 2) red. oksid. oksid. red.

Reakcije 1 i 2 prikazuju oksidaciju supstrata (SH2), uz istovremenu redukciju odgovarajućih koenzima.

NAD+ prima sa supstrata SH2 elektrone i proton dok drugi proton ostaje u rastvoru. Jedan elektron odlazi u prsten, dok atom vodonika formira sa C1 atomom iz prstena kovalentnu vezu (Sl. 70 ). S druge strane, FAD prima kompletne atome vodonika (Sl. 71).

Sl. 70. Strukturna formula NAD+

49


Sl. 71. Strukturna formula FAD

Standardni oksido-redukcioni potencijal (E'0). E'0 predstavlja kvantitativni izraz težnje datog redoks para da prima/odaje elektrone. U reakcijama (1) i (2), S/SH2 predstavljaju jedan redoks par, a NAD+/NADH+H+ u reakciji (1), a FAD/FADH2 u reakciji (2) drugi redoks par. Drugim rečima, redoks par predstavlja oksidovanu i redukovanu formu datog molekula. Redoks par koji lako odaje elektrone ima negativniji oksidoredukcioni (redoks) potencijal, od onog koji lako prima. Analiza reakcije (1) ili (2) ukazuje da redoks par S/SH2 ima manji redoks potencijal od redoks parova oba koenzima, jer oni primaju elektrone i protone sa supstrata koji se pri tome oksiduje dok se oni redukuju. Medjutim, u sledećoj reakciji

NADH+H+ + ½ O2 NAD+ + H2O (Reakcija 3)

Koenzim se oksiduje i predaje elektrone molekulskom kiseoniku. ∆E'0 redoks para ½ O2/H2O iznosi +0.82 V, dok E'0 redoks para NAD+/NADH+H+ iznosi –0.32 V.

Promena slobodne energije u reakcijama oksidoredukcije srazmerna je razlici u redoks potencijalu redoks parova koji u reakciji učestvuju. Promena slobodne energije izračunava se prema sledećoj formuli:

∆G'0 ═ -n F ∆E'0 (9)

gde je n broj elektrona koji se prenose, F je Faradejeva konstanta (96500 Culon/V.mol), a ∆E'0

razlika standardnog redoks potencijala učesnika u reakciji. U reakciji (3):

∆G'0 ═ 2x96500x[0.82 – (-0.32)] ═ -210.18 kJ/mol

Katabolički putevi u ćeliji organizovani su tako da redoks par sa negativnijim redoks potencijalom predaje elektrone paru sa pozitivnijim redoks potencijalom.

50


Sinteza ATP u ćeliji. Postoji više načina resinteze ATP u ćeliji. Jedan način je tzv. fosforilacija na nivou susptrata u kojoj visoko energetsko fosfatno jedinjenje nastalo kao metabolit u datom kataboličkom putu predaje fosfatni ostatak na ADP. Takva jedinjenja su npr. fosfoenolpiruvat i 1,3-difosfoglicerat (Tab. 2), medjuproizvodi u glikolizi, procesu razgradnje glukoze do piruvata (videti kasnije). Drugi način je fotosintetska fosforilacija kod autotrofnih organizama, gde se sunčeva energija koristi za sintezu ATP. U procesima respiracije u ćeliji, prilikom prenosa elektrona duž respiratornog lanca, specifičnog sistema enzima i koenzima koji su poredjani po rastućem redoks potencijalu, oslobadja se velika količina energija koja se koristi za sintezu ATP (tzv. oksidativna fosforilacija). Ukoliko je krajnji akceptor elektrona molekulski kiseonik, pa nastaje voda, respiracija je označena kao aerobna. Kod nekih grupa mikroorganizama, krajnji akceptor elektrona u respiratornom nizu nije kiseonik, nego neki drugi neorganski akceptor (NO3

-, SO4

2-), pa se respiracija označava kao anaerobna.

ATP sistem u ćeliji - dinamičan stacionarni sistem

Koncentracija ATP u ćeliji je stalna, ali se vrši neprekidna hidroliza i sinteza ATP. Poluvreme za razmenu (zamenu) krajnje fosfatne grupe u ATP u ćeliji jetre je 1-2 minuta, dok kod aerobnih bakterija iznosi svega nekoliko sekundi. Čovek od 70 kg sadrži negde oko 50 mg ATP u organizmu. Ako se pretpostavi da troši dnevno oko 11700 kJ/dan to bi značilo da mu dnevno treba 384 mola ATP (uzimajući u obzir ΔG’0 od 30.5 kJ/mol), što predstavlja masu od 190 kg. To znači da se pul ATP od 50 mg u organizmu neprekidno stvara i troši.

Koncentracija ATP, ADP, AMP u ćeliji odredjuje energetski status ćelije, koji se izražava preko energetskog naboja:

[ATP]+1/2 [ADP]Energetski naboj = (10)

[ATP]+[ADP]+[AMP]

Vrednost ide od 0 (sve AMP) do 1 (sve ATP). Pokazano je da su metabolički putevi u kojima se vrši sinteza ATP inhibisani visokim energetskim nabojem ćelije, dok su metabolički putevi u kojima se koristi ATP stimulisani visokim energetskim nabojem ćelije. Energetski naboj najvećeg broja ćelija je u granicama 0.80 - 0.95.

51


52


5. BIOLOŠKE MEMBRANE I TRANSPORTI KROZ MEMBRANU

Struktura membrane, funkcije membrane

Ćelijska membrana (plazmalema) je zajednička komponenta svih ćelija. To je selektivna barijera koja formira granicu izmedju odeljaka različite kompozicije. Sastoji se od lipida, proteina i šećera vezanih za lipide i proteine. Membranski lipidi su složeni lipidi - fosfolipidi, sfingolipidi, glikolipidi (imaju hidrofilni – polarni ili naelektrisani deo molekule, i hidrofobni deo molekule – ostaci masnih kiselina). Ovi lipidi spontano formiraju bimolekulski sloj koji ima ulogu rastvarača za proteine i odredjuje propustljivost membrane za pojedine materije. Prisustvo nezasićenih masnih kiselina u hidrofobnom delu lipidnih molekula obezbedjuje fluidnost membrane. Pored navedenih lipida u membranama sisara značajan udeo ima i holesterol. Holesterol čini membranu manje fluidnom, ali sprečava veće promene u fluidnosti membrane pri promenama temperature. Membranski proteini su mozaično rasporedjeni u membrani (integralni proteini koji se protežu kroz membranu od jedne do druge strane, proteini uronjeni u unutrašnji ili spoljni deo dvosloja) i odredjuju funkcije membrane. Imaju ulogu receptornih proteina, jonskih kanala, nosača, jonskih pumpi, enzima, energetskih transduktora itd. Membrana je nekovalentna struktura, asimetrična – različit je sastav spoljašnjeg i unutrašnjeg dela bimolekulskog dvosloja, a šećerna komponenta vezana je samo sa E-strane membrane, koja je u kontaktu sa ekstracelularnom tečnošću. Tečno-mozaični model Singera i Nikolsona (Singer i Nicolson, 1972) predstavlja najprihvatljiviji model molekularnog poretka membrane (Sl. 72).

Sl. 72. Tečno-mozaični model membrane

Bimolekulski sloj lipida propustljiv je za gasove i vodu (koeficijent propustljivosti 10-2 cm/sek), dok propustljivost za ostale supstance zavisi od veličine, rastvorljivosti u lipidima i naelektrisanja. Molekule kao O2 i N2 koje su nepolarne prolaze vrlo lako, jer se rastvaraju u lipidima. Mali nenaelektrisani polarni molekuli kao CO2 takodje brzo difunduju kroz membranu, dok je difuzija polarnih nenaelektrisanih molekula kao što je glukoza, ili naelektrisanih kao što su joni vrlo spora. Medjutim, joni, glukoza i drugi molekuli koriste jonske kanale i druge transportne proteine za prolaz kroz membranu.

Transporti kroz membranu

Transport materija kroz membranu može da se grupiše u dve osnovne kategorije: transporti u kojima se ne troši energija, i aktivni transport koji podrazumeva utrošak energije. U prvu grupu ulaze: difuzija kroz lipidni sloj (gasovi, male polarne molekule – urea, etanol), transporti kroz jonske kanale koji mogu biti pasivni jonski kanali – pore u plazma membrani, i jonski kanali sa vratima koji se otvaraju odredjenim mehanizmom (videti kasnije). Takodje, u ovu grupu ulazi i olakšana difuzija, koja podrazumeva transport pomoću nosača. Trasporti kroz jonske kanale i olakšana difuzija pokazuju efekat saturacije (zasićenja), ponašaju se po Mihaelis-Mentenovoj kinetici, mogu se blokirati kompetitivnim supstancama.

53


U zavisnosti od toga koliko vrsta molekula i u kom smeru se prenosi, transporti sa nosačem mogu da budu: (a) uniport - prenosi se jedna supstanca; (b) simport – prenose se dve supstance u istom smeru; (c) antiport – prenose se dve supstance u suprotnom smeru (Sl. 73).

Sl. 73. Stehiometrija transporta

Difuzija. Difuzija je medjusobno mešanje molekula dvaju ili više tela kroz dodirnu površinu tih tela. Kod gasova i tečnosti uzrok difuzije je termičko kretanje molekula, jona i koloidnih čestica, a kod čvrstih tela medjusobno izmenjivanje mesta molekula u prostornoj rešetki. Difuzija je spor proces. Ona postaje značajna u prostoru gde je površina kroz koju se difuzija vrši mnogo veća u odnosu na rastojanje na kome se neto kretanje dešava. U odnosu na dimenzije jedne ćelije, ili manje biološke sisteme, difuzija je brz i bitan način transporta. Difuzija se ne dešava samo kroz ćelijsku membranu, nego i kroz membranske strukture unutar ćelije, kroz kapilarni zid itd. Difuzija zavisi od veličine čestica, rastojanja na kome se vrši, površine kroz koju se vrši, temperature, koncentracijskog gradijenta. Difuzija kroz membranu zavisi i od propustljivosti membrane i naelektrisanja čestica koje difunduju.

Donanov efekat. Difuzija difuzibilnih jona kroz membranu zavisi od prisustva nedifuzibilnih anjona sa jedne strane membrane. U odsustvu drugih sila, u takvom sistemu uspostavlja se ravnoteža, pri kojoj je neravnomeran raspored difuzibilnih jona uravnotežen odgovarajućim električnim gradijentom za svaki jon, odnosno pojavom potencijalne razlike na membrani. Naime, ukoliko pre uspostavljanja ravnoteže u odeljku 1 ima 100 mM natrijum-proteinata, a u odeljku 2 100 mM NaCl razdvojenih polupropustljivom membranom koja je nepropustljiva za anjone proteina, dok Na+ i Cl- mogu da difunduju kroz membranu, onda će zbog razlike u koncentraciji Cl-

doći do povećanog kretanja jona Cl- u odeljak 1 (Sl. 74). Radi održanja električne neutralnosti u

Sl. 74. Donanova ravnoteža

svakom odeljku, kretanje jona Cl- biće praćeno odgovarajućim kretanjem Na+ jona. U jednom momentu doći će do uspostavljanja ravnoteže (neto difuzija jona = 0) i pojave električne potencijalne razlike na membrani za svaki jon koja će biti uravnotežena koncentracijskim gradijentom za dati jon. Ova ravnoteža rezultat je dvaju suprotnih tendencija: težnje za izjednačavanjem koncentracije difuzibilnih jona sa obe strane membrane, što bi vodilo gubitku elektroneutralnosti svake sredine, i težnje za održanjem elektroneutralnosti svake sredine.

54


Potencijalna razlika na membrani (označena kao ravnotežni potencijal za dati jon) predstavlja lokalnu akumulaciju pozitivnog i negativnog naelektrisanja razdvojenog membranom; ova lokalna akumulacija rezultat je tendencije difuzibilnih katjona da se kreću u odeljak 2 zbog svoje veće koncentracije u odeljku 1; suprotno važi za difuzibilne anjone, pa su zbog toga ravnotežni potencijali za anjone i katjone paralelni. U datom primeru membrana je sa strane 1 negativno naelektrisana, a sa strane 2 pozitivno naelektrisana. Vrednost ravnotežnog potencijala za dati jon može da se izračuna pomoću Nernstove jednačine date na Sl. 74.

Zašto je Donanov efekat, tj. Donanova ravnoteža važna za ćeliju? U ćeliji postoji velika koncentracija proteina koji su pri datom pH ćelije uglavnom prisutni kao anjoni, i za koje je plazma membrana nepropustljiva. U ektracelularnoj tečnosti (ECT), odnosno medjućelijskoj tečnosti (intersticijelna tečnost, IST) praktično nema proteina, te stoga prisustvo nedifuzibilnih anjona proteina u ćeliji utiče na distribuciju difuzibilnih jona.

Ukoliko su joni na membrani rasporedjeni po Donanovoj ravnoteži, to znači da ćelija ne troši energiju za njihovu distribuciju, i da se ravnotežni potencijal za dati jon poklapa sa membranskim potencijalom date membrane, što može da se proveri korišćenjem Nernstove jednačine. Ukoliko se ravnotežni potencijal za dati jon ne poklapa sa membranskim potencijalom mirovanja to znači da ćelija ulaže rad (troši energiju) da bi održala dati raspored jona s jedne i druge strane membrane, tj. date koncentracijske gradijente za svaki jon.

Olakšana difuzija. U membrani postoji specifičan nosač koji prenosi datu supstancu sa mesta veće na mesto manje koncentracije, što znači da teorijski transport može da se odvija u oba smera kroz plazma membranu, u zavisnosti od koncentracije date materije s jedne i druge strane membrane. U konkretnim primerima, transport se obično vrši samo u jednom smeru sa mesta veće na mesto manje koncentracije date supstance. Primer, transport glukoze u ćelije pomoću nosača. Pimer, kotransport ADP i ATP kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu, antiport sistem, jer se ADP unosi u mitohondrije, a ATP se iz mitohondrije prenosi u citosol. (Sl. 75).

Sl. 75. Transport glukoze olakšanom difuzijom

Aktivan transport. Primer aktivnog transporta je Na+-K+-pumpa (Sl. 76 i 77). Prosečno oko 40% od ukupne energije ćelije troše za rad ove pumpe. Pumpa se sastoji od dve subjedinice, a α-subjedinica ima vezno mesto za Na+, K+, katalitički centar ATP-aze i mesto za autofosforilaciju. Protein može da postoji u dve konformacije, fosforilisan i defosforilisan. U defosforilisanom stanju vezno mesto za Na+ sa unutrašnje strane je aktivno i vezuju se 3 jona Na+. To indukuje vezivanje ATP, njegovu hidrolizu i autofosforilaciju α-subjedinice, što ima za posledicu gubitak afiniteta za Na+ koji se izbacuje iz ćelije i povećanje afiniteta za K+, koji se vezuje za vezna mesta sa spoljne strane membrane. Vezivanje K+ ima za posledicu defosforilaciju subjedinice i njen prelazak u defosforilisano stanje, što smanjuje afinitet za K+ koji se ubacuje u ćeliju, čime se ciklus završava. Po jednoj molekuli ATP prenesu se 3 jona Na+ van ćelije, a u ćeliju ubace 2 jona K+.

55


Na membrani endoplazmatskog retikuluma postoji pumpa za Ca2+ koja trošeći ATP ubacuje Ca2+

iz citosola u endoplazmatski retikulum.

Sl. 77. Natrijum-kalijumova pumpa

Sekundarni trasnporti. Jonski gradijenti se koriste za transport jona kroz membranu nasuprot koncentracijskom gradijentu, tzv. sekundarni transporti. Na račun jonskog gradijenta za Na+

(rezultat rada Na+-K+-pumpe), u srčanim mišićnim ćelijama, antiport sistem ubacuje Na+ u ćeliju (niz koncentracijski gradijent), a transportuje Ca2+ van ćelije (nasuprot koncentracijskom gradijentu). Koncentracija Ca2+ u IST je oko 2x10-3 M, dok je u citosolu <10 –7 M. Tokom odredjene aktivnosti koncentracija intracelularnog Ca može da se poveća na 10-5 M, što znači da je gradijent na plazma membrani vrlo veliki. Ukoliko se blokira rad Na+-K+-pumpe, blokira se i rad ovog antiport sistema, jer se na membrani smanji jonski gradijent za Na+.

Drugi primer sekundarnog transporta je kotransport Na+ i glukoze u epitelijalne ćelije creva. Glukoza se transportuje iz lumena creva u epitelijalne ćelije u kotransportu sa Na+ čiji se koncentracijski gradijent održava radom Na-K-pumpe (Sl. 78).

Sl. 78. Sekundarni transport (simport) glukoze

Endocitoza i egzocitoza

Endocitoza je proces preuzimanja supstanci i različitih čestica u unutrašnjost ćelije (Sl. 79). Jedna vrsta endocitoze je fagocitoza - proces preuzimanja bakterija, dela mrtvog tkiva ili drugih čestica koje preuzimaju fagociti. Pri kontaktu sa plazma membranom dolazi do formiranja ulegnuća koje obuhvata materiju koja se fagocitira, i formiranja fagocitne vezikule unutar ćelije koja može da se spoji sa primarnim lizozomom, što omogućava razgradnju fagocitiranog materijala.

56


Egzocitoza je proces sekrecije velikih proteinskih molekula, kao i neurotransmitera male molekulske mase u intersticijelni prostor (Sl. 79). Materija koja se sekretuje pakuje se u vezikule, koje se nakon spajanja sa plazma membranom otvaraju, i sadržaj se izbacuje u ECT. Egzocitoza je endergoničan proces (troši se ATP) koji zahteva povećanje koncentracije intracelularnog Ca+

(iz ECT, ili intracelularnih rezervoara).

Sl. 79. Endocitoza i endocitoza

Jonski gradijenti kao izvor ćelijske energije. Ćelija formira jonske gradijente na plazma membrani ili na intramembranskim strukturama koristeći za to energiju sadržanu u molekulu ATP, ili kao što je slučaj kod prenosa elektrona duž respiratornog niza smeštenog na unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani kod eukariota, energiju oslobodjenu u procesima oksido-redukcije. Tako formirani jonski gradijenti predstavljaju za ćeliju izvor energije koja se koristi za transport čestica kroz memebranu nasuprot koncentracijskom gradijentu (primeri sekundarnih transporta); za sintezu ATP od ADP i neorganskog fosfata, tzv. oksidativna fosforilacija u mitohondrijama (na račun hemiosmotskog protonskog gradijenta na unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani), ili pak kao izvor energije za formiranje električnih signala za prenos informacija duž membrane nervne i mišićne ćelije.

ELEKTRIČNE OSOBINE MEMBRANE

Membranski potencijal

Kod ćelija prokariota membranski potencijal iznosi oko –100mV, a rezultat je protonskog gradijenta. Kod biljnih ćelija protonski gradijent obezbedjuje membranski potencijal od –120mV do –180mV. Potencijalna razlika na membrani životinjskih ćelija iznosi od –10mV do –100 mV. Predznak minus označava da je unutrašnja strana membrane elektronegativna u odnosu na spoljašnju stranu (Sl. 80). Ova razlika potencijala odnosi se samo na uzan sloj uz membranu, dok je ostali intracelularni i ekstracelularni prostor električki neutralan. Deo jona koji je odgovoran za postojanje potencijalne razlike na membrani predstavlja 1/200000 deo od ukupno prisutnih jona u ECT i ICT. Da bi se potencijalna razlika povećala za 10 mV potrebno je da se poveća pozitivno, odnosno negativno naelektrisanje za po 600 naelektrisanih čestica/µm2 membrane. Membranski potencijal na plazma membrani životinjskih ćelija rezultat je različite distribucije jona Na+, K+ i Cl- sa jedne i druge strane membrane. Jona Na+ ima u ECT oko 10 puta više u odnosu na intracelularnu koncentraciju, jona Cl- takodje ima oko 10 puta više ekstracelularno u odnosu na intracelularnu koncentraciju, dok jona K+ ima oko 20 puta više u ICT u odnosu na ECT. Šta održava ove jonske gradijente? Koncentracijski gradijent za Na+ i K+ održava Na+-K+-pumpa, što znači da ćelija troši energiju za održavanje navedenih jonskih gradijenata. Jonski gradijent za Cl-

u mnogim ćelijama je rezultat Donanove ravnoteže, drugim rečima, membranski potencijal mirovanja poklapa se sa ravnotežnim potencijalom za jone Cl-, i za njegov raspored ćelija ne troši energiju. Pored rada pumpe, različita propustljivost membrane za jone K+, Na+ i Cl- takodje doprinosi stabilnosti jonskih gradijenata. Naime, postoji različita distribucija pasivnih jonskih kanala za navedene jone. Tako npr. u plazma membrani neurona relativan odnos propustljivosti za jone K+ : Na+ : Cl- = 1 : 0.04 : 0.45. Membranski potencijal je vrlo značajan za održavanje osmotskog balansa ćelije, odnosno sprečava povećan ulazak vode u ćeliju radi izjednačavanja osmotskog pritiska ICT i ECT. Pored toga, u nadražljivim ćelijama, membranski potencijal je

57


osnov za genezu električnih signala kojima se prenose informacije od jedne do druge nadražljive ćelije.

Sl. 80. Merenje membranskog potencijala

Pasivna električna svojstva membrane nadražljivih ćelija

Električne osobine plazma membrane su : jonske baterije, otpor i kapacitet. Odgovarajući model membrane je tzv. RC kolo (Sl. 81).

Jonske baterije su rezultat nejednake distribucije jona sa spoljne i unutrašnje strane membrane. Npr. koncentracija K+ je veća u unutrašnjosti ćelije, tako da K+ teži da difunduje iz ćelije kroz pasivne jonske kanale za K+. Ovakva difuzija dovodi do razdvajanja naelektrisanja na membrani, i nakupljanja “+” naelektrisanja sa spoljne strane membrane ostavljajući “-” naelektrisanje sa unutrašnje strane. Nastala razlika potencijala funkcioniše kao stalni izvor elektromotorne sile i može da se nazove jonskom baterijom. Napon baterije za svaki jon (K+, Na+, Cl-) jednak je ravnotežnom potencijalu za odredjeni jon. Jonske baterije za Na+ i K+ se pune Na+-K+-pumpom. Difuzija K+ iz ćelije i Na+ u ćeliju kroz pasivne kanale, uravnotežena je aktivnim transportom ovih jona od strane Na+-K+-pumpe. Naime, pumpa se suprotstavlja “pasivnim” strujama za K+ i Na+ i ona pumpa Na+ iz ćelije u zamenu za K+ koji vraća u ćeliju.

Sl. 81. Fizički model membrane - RC kolo

Provodljivost membrane za jone je vrlo mala, odnosno oni prolaze samo kroz pasivne jonske kanale. Svaki pasivan jonski kanal dozvoljava difuziju jona prema koncentracijskom gradijentu i tako omogućava generisanje elektromotorne sile. Provodljivost membrane (g) srazmerna je broju pasivnih jonskih kanala po jedinici površine, a obrnuto je srazmerna otporu membrane (R) za prolaz jona. Fizički ekvivalent provodljivosti je otpornik.

Kapacitet membrane je sposobnost da razdvaja naelektrisanje, odnosno da funkcioniše kao kondenzator. ECT i ICT predstavljaju provodnike, a lipidni dvosloj membrane je izolator. Zbog postojanja pasivnih jonskih kanala, membrana se opisuje kao kondenzator “koji curi.”

58


Električni signali nadražljivih ćelija

Nadražljive ćelije u životinjskom svetu su čulne, nervne i mišićne ćelije. Karakterišu se formiranjem odredjenih električnih signala koji omogućavaju medjusobnu komunikaciju. Ti signali mogu da budu lokalne promene membranskog potencijala (na membrani čulnih ćelija, na nivou sinapse) ili prostirući fenomeni, tzv. akcioni potencijal (AP) na membrani nervne i mišićne ćelije.

Ovi signali nastaju aktivnošću odredjenih jonskih kanala u membrani: (a) voltažno-zavisni jonski kanali koje aktivira smanjenje membranskoh potencijala, tj. depolarizacija membrane odgovorni su za nastajanje i prostiranje AP, dok su (b) ligand-zavisni jonski kanali odgovorni za lokalnu promenu membranskog potencijala na nivou sinapse, tzv. postsinaptički potencijali (PSP).

PLAZMA MEMBRANA I ĆELIJSKI ZID PROKARIOTA

Sve bakterijske ćelije imaju plazma membranu i ćelijski zid (sem nekih izuzetaka) (Sl. 82). Pored toga, gram-negativne bakterije imaju kompleksan ćelijski zid koji pored mureina sadrži i tzv. spoljnu membranu.

Sl. 82. Ćelijski zid kod bakterija: A. gram-; B. gram+

Plazma membrana bakterijske ćelije ima istu strukturu kao i eukariotske ćelije, tj. važi fluidno-mozaični model, s tim što je sadržaj proteina oko 70%, jer je to jedina membranska struktura ćelije.

Ćelijski zid poseduju, uz odredjene izuzetke, sve bakterije. Sastavljen je od polimera koji se naziva peptidoglikan ili murein (Sl. 83-85). Murein se sastoji od šećerne komponente koja ima ponavljajuću sekvencu od dva aminošećera (N-acetilglukozamin i N-acetilmuraminska kiselina). Ovi šećerni polimeri su medjusobno povezani tetrapeptidnim mostovima, što zajedno čini jedan čvrst vrećast makromolekul koji čini mehaničku zaštitu za plazma membranu. Gram-pozitivne bakterije u mureinu imaju još i pentapeptidni most od 5 glicina koji povezuju susedne tetrapeptide, dok se kod gram-negativnih bakterija povezivanje ostvaruje direktno bez posredovanja pentapeptidnih glicinskim mostova (Sl. 83 i 85). Pored toga, gram-pozitivne

59


bakterije u ćelijskom zidu sadrže više slojeva mureina sa dopunskim sastojcima anjonskih polimera (teihojne kiseline, polisaharide, polipeptide), pa je stoga mureinski sloj debeo od 40 – 80 nm (Sl. 83). Kod gram-negativnih bakterija, debljina mureina je oko 2-3 nm, jer zid sadrži samo jedan sloj mureina. Funkcija ćelijskog zida je očuvanje oblika ćelije, mehanički otpor velikom osmotskom pritisku u ćeliji koji može da iznosi i do 20 atm. Takodje ima ulogu i u deobi ćelije.

Sl. 83. Detalji ćelijskog zida kroz gram-pozitivnih bakterija. Struktura peptidoglikana mureina

Gram-negativne bakterije imaju kompleksan ćelijski zid. Pored mureina u ćelijskom zidu sadrže i spoljnu membranu koja se sastoji od fosfolipida, lipopolisaharida i proteinskih molekula koji formiraju pore u spoljnoj membrani (tzv. porini) za prolaz materija. Deo prostora izmedju plazma membrane i spoljne membrane označen je kao periplazmatski prostor. Periplazmatski prostor gram-negativnih bakterija sadrži mnoge proteine koji učestvuju u ishrani bakterija – na primer, hidrolitičke enzime i tzv. proteine-nosače koji su uključeni u transport materija u ćeliju. Bakterije-denitrifikatori i hemolitoautotrofne bakterije mogu imati u periplazmatskom prostoru elektron-transportujuće proteine. Gram-pozitivne bakterije nemaju periplazmatski prostor i one sekretuju enzime u spoljašnju sredinu (ekstracelularni enzimi), a neki od njih mogu da budu vezani za spoljnu stranu plazma membrane.

Lipopolisaharidi u spoljnoj membrani gram-negativnih bakterija predstavljaju endotoksine koji izazivaju nespecifičnu zapaljensku rekaciju (inflamaciju) u organizmu životinja i čoveka. Spoljna membrana deluje kao zaštitna barijera. Ona sprečava ili usporava prolazak žučnih soli, antibiotika i drugih toksičnih materija koje mogu da usmrte bakteriju. I pored toga spoljna membrana je propustljivija od plazma membrane jer sadrži specijalne proteinske molekule porine koji formiraju uzane kanale (Sl. 84 i 85).

60


Sl. 84. Plazma membrana, i ćelijski zid kod gram-negativnih bakterija

Sl. 85. Ćelijski zid kod gram-pozitivnih bakterija

Transporti kroz plazma membranu bakterija. Plazma membrana kod prokariota poseduje efikasne transportne sisteme za prenos hranljivih materija i jona. Jedan od transporta je olakšana difuzija, transport koji nije često zastupljen, mada je jednostavan i ne zahteva utrošak energije. Npr. kod E. coli , preuzimanje glicerola vrši se na ovaj način. U plazma membrani nalaze se specifični kanali za glicerol i E. coli može da raste isključivo na glicerolu, ukoliko je on u medijumu prisutan u velikoj koncentraciji. Medjutim, pri niskim spoljnim koncentracijama, transport je neefikasan i postaje ograničavajući faktor za rast. Grupni transport je modifikacija olakšane difuzije, s tim da prilikom transporta dolazi do hemijske modifikacije materije koja se transportuje. U membrani se nalazi nosač koji vrši hemijsku modifikaciju (u pitanju je fosforilacija jedinjenja prilikom prolaska kroz membranu) supstance. Najčešće je ta modifikacija neophodan korak u metabolizmu date supstance u ćeliji. S druge strane, modifikacija supstance održava koncentracijski gradijent i pri manjim koncentracijama date supstance u spoljnoj sredini, jer se u ćeliji ona ne nakuplja u polaznom obliku. Primer, transport šećera i njegova fosforilacija. Aktivan transport može da bude uz direktan utrošak ATP, jer nosač predstavlja ATP-azu, a supstanca se prenosi sa mesta manje na mesto veće koncentracije, ili sekundarni transport, tj aktivan transport zavisan od protonskog gradijenta (Tab. 3).

61


Tabela 3. TRANSPORT RASTVORENIH SUPSTANCI KOD BAKTERIJA

Osnovni tipovi Mehanizmi transportaA. Olakšana difuzija

B. Olakšana difuzija uz hemijsku modifikaciju rastvorene supstance (Group transfer)

C. Aktivan transportC.1. ATP-zavisanC.2. Zavisan od protonskog gradijenta

Selektivni kanaliNema nagomilavanja transportovane supstance u ćeliji

Hemijska modifikacija rastvorene supstanceTransportovana supstanca specifično reaguje sa nosačem na membrani

Transport se odvija nasuprot koncen. gradijentuZahteva hidrolizu ATP-aVezan za jonski gradijent (“sekundarni transport”)

62


6. METABOLIZAM

Život ćelije zavisi od izvora energije neophodne za vršenje rada, kao i izvora ugljenika neophodnog za sintezu biomolekula. Prema izvoru energije, svi živi organizmi mogu da se podele na fototrofe koji energiju obezbedjuju vezivanjem sunčeve energije, i hemotrofe koji energiju obezbedjuju oksidacijom hemijskih jedinjenja. Prema izvoru ugljenika, svi živi organizmi mogu da se podele na autotrofe koji ugljenik obezbedjuju iz ugljendioksida, te stoga predstavljaju proizvodjače primarne organske materije, i heterotrofe koji kao izvor ugljenika koriste organska jedinjenja. Klasifikacija organizama na osnovu ova dva kriterijuma rezultira sledećim grupama organizama:

svi organizmi

fototrofi hemotrofi

fotoautotrofi fotoorganotrofi hemolitotrofi hemoorganotrofi (heterotrofi) - hemolitoautotrofi (heterotrofi)

- cijanobakterije - neke grupe - grupe ekološki - mnoge bakterija važnih bakterija - bakterije

- biljke - gljive - alge - hemolitoorganotrofi - protozoe - lišajevi neke bakterije - životinje - purpurne i zelene b.

Ako se pogleda gornja šema jasno se uočava da su bakterije prisutne u svim kategorijama, što ukazuje na njihovu ogromnu metaboličku raznovrsnost.

Metabolizam ćelije predstavlja sveukupnost hemijskih reakcija u kojima se vrši transformacija i materije i energije. Iako metabolizam obuhvata hiljade enzimski katalisanih reakcija povezanih u kompleksne mreže, ipak se tom složenom sistemu mogu odrediti neke opšte karakteristike. Naime, broj reakcija u metabolizmu je ogroman, ali je zato broj vrsta reakcija relativno mali.

Sl. 86. Trasformacija materije i energije u ćeliji

Karakteristične su reakcije hidrolize, oksido-redukcije, prenosa funkcionalnih grupa, kao i formiranja kovalentnih veza (C-C-, C-N, C-O). Glavni metabolički putevi zajednički su svim formama života, a definisani su aktivnošću odredjenih enzima koji katališu reakcije datog metaboličkog puta. Broj enzima koji učestvuje u nekom metaboličkom putu je različit, pri čemu

63


produkt reakcije koju katališe prvi enzim postaje supstrat za drugi enzim, odnosno, transformacija nekog jedinjenja ide preko niza medjuproizvoda (metabolita). Najveći broj metaboličkih puteva je linearan, ali može da bude i cikličan, pri čemu postoje grane koje ulaze i izlaze iz datog puta.

Metabolizam se sastoji od kataboličkih (degradacionih) i anaboličkih (sintetskih) puteva(Sl. 86). U katabolizmu, veliki i kompleksni molekuli se razgradjuju u jednostavnije produkte uz oslobadjanje energije. Deo te energije vezuje se u formi ATP i taj deo može da se iskoristi za vršenje rada, dok se ostali deo oslobadja kao toplota. Anabolizam, tj. sintetske reakcije znače povećanje veličine i kompleksnosti strukture, što zahteva unos energije koja se dobija iz ATP. Anabolizam je proces koji divergira i počinje od jednostavnih prekursora dajući u krajnjoj fazi različite makromolekule neophodne za održavanje strukture i funkcije ćelije. Mogu se postaviti sledeća pitanja. Zašto razgradnja hranljivih materija ide postupno preko niza hemijskih reakcija koje slede jedna za drugom? Zašto se krajnji produkt ne dobija nakon nekoliko etapa, ili samo jedne? Osnovni razlog leži u promeni slobodne energije koja prati svaku hemijsku reakciju. U procesima katabolizma dolazi do oslobadjanja energije tokom odredjenih hemijskih reakcija, i ta energija magacionira se u formi ATP. Da bi se formirao molekul ATP iz ADP i P potrebna je odredjena količina energije. Takodje, odredjena količina slobodne energije oslobadja se pri razgradnji ATP. Stoga su metabolički putevi predstavljeni nizom enzimski katalisanih reakcija postupne razgradnje (katabolizam), odnosno sinteze (anabolizam) jedinjenja, a te etape koje “odaju” i one koje “zahtevaju” energiju prilagodjene su “paketima” energije sadržane u molekulu ATP.

U reakcijama katabolizma vrši se postupna oksidacija supstrata, odnosno elektrone “sakupljaju” koenzimi NAD+ i FAD koji se pri tome redukuju (Sl. 86). Nesmetano odvijanje kataboličkih procesa podrazumeva reoksidaciju ovih koenzima, odnosno postojanje krajnjih akceptora elektrona. Organizmi se razlikuju prema tome ko je akceptor elektrona. Aerobni organizmi kao krajnjeg akceptora elektrona oslobodjenih u kataboličkim putevima koriste molekulski kiseonik. Elektroni se sa redukovanih koenzima prenose na članove respiratornog niza poredjane po rastućem oksido-redukcionom potencijalu, i na kraju na molekulski kiseonik, pri čemu se stvara voda. Procesi razgradnje organskih molekula u prisustvu kiseonika označeni su kao aerobna respiracija. Postoje organizmi kod kojih se elektroni sa redukovanih koenzima takodje prenose na članove respiratornog niza, ali kranji akceptor elektrona nije molekulski kiseonik, nego neko neorgansko jedinjenje kao što su NO-

3, SO4-, Fe3+, H2S, a u nekim slučajevima i fumarat (Tab. 4).

U ovom slučaju procesi razgradnje su označeni kao anaerobna respiracija. Postoje, medjutim, mikroorganizmi kao što su mnoge gljive i neke grupe bakterija, algi i protozoa koji nemaju respiratorni niz, ili ga u odredjenim uslovima ne koriste, i kod njih organski molekuli predstavljaju i donore i akceptore elektrona. Takvi katabolički putevi označeni su kao fermentacija.

Ćelijska respiracija

Ćelijska respiracija obuhvata fazu (I) produkcije acetil-CoA, fazu (II) oksidacije acetil-CoA, i fazu (III) prenosa elektrona duž respiratornog niza i oksidativnu fosforilaciju. Prva faza (Sl. 87) obuhvata kataboličke puteve razgradnje amino kiselina, masnih kiselina i monosaharida do zajedničkog metabolita acetil-CoA. U drugoj fazi (Sl. 88), u ciklusu trikarbonskih kiselina (TCA ciklus) vrši se oksidacija acetil-CoA, pri čemu se oslobadja CO2 i istovremeno vrši prenos elektrona na koenzime NAD+ i FAD, koji u trećoj fazi (Sl. 89) elektrone predaju članovima respiratornog niza, a zatim na krajnjeg akceptora elektrona (molekulski kiseonik, ili u slučaju anaerobne respiracije nekog drugog egzogenog akceptora elektrona). Kao što je ranije napomenuto, članovi respiratornog niza poredjani su po rastućem oksido-redukcionom potencijalu i stoga je prenos elektrona od jednog do drugog člana praćen oslobadjanjem energije koja su koristi da se u procesu oksidativne fosforilacije izvrši sinteza ATP od ADP i neorganskog fosfata.

64


Sl. 87. Prva faza respiracije i stvaranje zajedničkog metabolita

Sl. 88. Druga faza respiracije, Krebsov ciklus

Sl. 89. Treća faza respiracije, elektron transportni lanac i oksidativna fosforilacija

65


Anaerobna respiracija

Anaerobna respiracija prisutna je kod različitih grupa bakterija. Glavni akceptori elektrona su nitrati, sulfati i CO2, mada metalni joni i neki organski molekuli takodje mogu da budu redukovani (Tab. 4). U slučaju nitrata kao krajnjeg akceptora elektrona redukcija ide preko nitrita do molekulskog azota. Taj proces je označen kao denitrifikacija. Bakterije koje vrše ovaj proces su fakultativni anaerobi, i u prisustvu kiseonika koriste njega kao krajnjeg akceptora elektrona. Bakterije koje koriste sulfate i ugljendioksid su obligatorni anaerobi. Anaerobna respiracija dozvoljava korišćenje manje energije za sintezu ATP, jer je razlika izmedju redoks potencijala NADH i nitrata (ili drugog akceptora koji nije kiseonik) manja no u slučaju NADH i molekulskog kiseonika. To znači da anaerobna respiracija rezultira sintezom manje količine ATP u odnosu na sintezu kada je akceptor molekulski kiseonik a produkt voda. No, i pored toga, u anaerobnoj respiraciji koristi se više energije no u slučaju fermentacije. S druge strane, anaerobna respiracija je važna u sredinama siromašnim kiseonikom kao što su neaerisano zemljište i sediment.

Ukoliko je u jednoj sredini prisutno više akceptora elektrona, dolazi do promena u gustini pojedinih grupa mikroorganizama na datom prostoru. Ako su prisutni kiseonik, nitrati, sulfati, CO2

i supstrat koji može da se oksidiše (koristi kao “hrana”), onda će se molekulski O2 koristiti kao akceptor prvi, jer će korišćenje nitrata od strane iste grupe bakterije koja alternativno koristi oba akceptora biti sprečeno. Naime, aktiviraće se onaj katabolički put koji daje više energije za sintezu ATP. Dok je O2 prisutan, bakterije koje koriste sulfate i metanogene bakterije biće inhibisane u rastu, jer su one obligatorni anaerobi i ne mogu da egzistiraju u sredini gde ima kiseonika. Ali ako se O2 i nitrati potroše, onda na scenu stupaju druge grupe bakterija koje koriste druge akceptore elektrona.

Tabela 4. Akceptori elektrona_____________________________________________________________________________

Akceptor Redukovani produkt Organizmi

Aerobna O2 H2O Biljke, životinje, čovek, sve aerobne bakterije, gljive, alge i protozoe

Anaerobna NO3- NO2

- Enterične bakterije NO3

- NO2-, N2 Pseudomonas, Bacillus

SO42- H2S Desulfovibrio

CO2 CH4 Metanogene bakterije Fe3+ Fe2+ Pseudomonas, Bacillus

_____________________________________________________________________________

Razgradnja glukoze do piruvata – glukoliza

Mikroorganizmi koriste nekoliko metaboličkih puteva da razgrade glukozu i druge šećere. Medjutim, i kod njih je najčešće korišćen put glukoliza, odnosno razgradnja glukoze do piruvata (Sl. 90 i 91). Ovaj put prisutan je kod životinja i drugih heterotrofnih eukariota, kao i kod autotrofnih organizama u procesima respiracije. Glukoliza se odvija u citosolu i može da se podeli u dve faze: pripremnu, i fazu odavanja energije, tj. sinteze ATP.

U prvoj fazi, glukoza se fosforiliše na atomu C6, što podiže energetski nivo molekula i omogućava izomerizaciju u fruktozo-6fosfat. Fosforilacija fruktoze na C1 atomu (treća reakcija) omogućava u sledećem koraku cepanje fruktozo-1,6-bisfosfat na dva trougljenična fosforilisana jedinjenja: gliceraldehid-3-fosfat i dioksiaceton-1-fosfat, koji izomerizuje u gliceraldehid-3-fosfat, a ovo

66


Sl. 90. Prva faza glukolize

Sl. 91. Druga faza glukolize

jedinjenje ulazi u drugu fazu glukolize. Gliceraldehid-3-fosfat oksiduje se u kiselinu, a energija oslobodjena oksidacijom supstrata omogućava sintezu visokoenergetskog fosfatnog jedinjenja 1,3-bisfosfoglicerata uključenjem neorganskog fosfata. Istovremeno, u ovoj reakciji nastaju 2 redukovana NADH. U sledećem koraku fosfatna grupa sa atoma C1 prenosi se na ADP i

67


sintetiše se ATP. To je prvi primer fosforilacije na nivou supstrata u procesu glukolize. Takodje, pri prelazu fosfoenolpiruvata u piruvat (deseta reakcija) nastaje ATP od ADP i fosfatne grupe koja se prenosi sa visokoenergetskog supstrata.

Sumarni pregled glukolize pokazuje da se sintetišu 4 mola ATP i redukuju 2 mola NAD+ prilikom razgradnje 1 mola glukoze. Druge heksoze ulaze u proces razgradnje na nivou prve faze glukolize. Da bi se glukoliza nesmetano odvijala neophodno je da se NADH reoksiduje. Ukoliko su uslovi u ćeliji aerobni, molekuli redukovanog koenzima odlaze u mitohondrije i predaju elektrone respiratornom nizu smeštenom na unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani. U anaerobnim uslovima i u odsustvu egzogenog akceptora elektrona, akceptor elektrona i vodonikovih atoma je piruvat (Sl. 92).

Pored glukolize, vrlo značajan put razgradnje glukoze je pentozofosfatni put ili heksozomonofosfatni put. On je značajan jer povezuje metabolizam heksoza i pentoza, i u njemu se sintetišu fosforilisane pentoze: ribulozo-1,5-fosfat neophodan u procesu fotosinteze kao akceptor CO2 (kod autotrofa), i ribozo-5-fosfat neophodan za sintezu nukleinskih kiselina. Takodje je izvor gliceraldehid-3-fosfata koji može da udje u proces glukolize. U ovom putu nastaje i redukovani NADPH neophodan za mnoge biosintetske reakcije kao donor elektrona i vodonikovih atoma. Iz ovog kratkog opisa vidi se da je ovaj put važan za procese anabolizma, a to važi kako za mikroorganizme, tako i za više organizme.

Sl. 92. Aerobna i anaerobna razgradnja glukoze

Fermentacija

U odsustvu aerobne i anaerobne respiracije, NADH se oksiduje tako što predaje hidridni jon piruvatu ili nekom metabolitu nastalom od piruvata (Sl. 93). Na taj način glukoliza može da se odvija nesmetano i sinteza ATP fosforilacijom na nivou supstrata je obezbedjena. Proces može da bude tako efikasan da neki hemoorganoheterotrofi ne vrše respiraciju iako je kiseonik ili neki drugi egzogeni akceptor dostupan ćeliji, a ona poseduje respiratorni niz. Postoje različite vrste fermentacije (vrenja) i one su karakteristika date grupe mikroorganizama. Važno je naglasiti da se u procesu fermentacije supstrat samo delimično oksiduje, pa se iz supstrata izdvaja manje energije no pri aerobnoj respiraciji kada se supstrat oksiduje do CO2.

68


Sl. 93. Fermentacija glukoze kod različitih mikroorganizama

Oksidativna dekarboksilacija piruvata

Ukoliko u ćeliji ima dovoljno kiseonika, piruvat se transformiše u acetil-CoA u metaboličkom putu označenom kao oksidativna dekarboksilacija piruvata, koji se odvija u matriksu mitohondrija. Pri tome se oslobadja CO2 (otuda naziv dekarboksilacija) i nastaje redukovani NADH+H+ (otuda naziv oksidativna).

piruvat + NAD+ + CoA acetil-CoA + NADH+H+ + CO2

Acetil ostatak predstavlja ostatak cirćetne kiseline koja nastaje dekarboksilacijom piruvata. Acetil-CoA je zajednički metabolit razgradnje i masnih kiselina i nekih amino kiselina tokom razgradnje hranljivih molekula u ćeliji. U tom jedinjenju karboksilna grupa sirćetne kiseline povezana je sa SH grupom iz koenzima A, odnosno, to je tzv. tioestraska veza koja takodje predstavlja visokoenergetsku vezu. Stoga je moguće acetil ostatak sa koenzima A preneti na neki supstrat u cilju formiranja C-C veze, što se i dešava u prvoj reakciji Krebsovog ciklusa, kada se od oksalacetata (dikarbonska kiselina sa četiri C atoma) i acetil ostatka formira limunska kiselina (trikarbonska kiselina sa šest C atoma).

69


Ciklus trikarbonskih kiselina

Krebsov ciklus ili ciklus trikarbonskih kiselina (TCA) predstavlja kružni metabolički put za oksidaciju ostatka sirćetne kiseline do CO2, u kome nastaju još i 3 redukovana NADH, 1 redukovan FADH2 i 1 GTP (ekvivalent ATP) kao i prekursori za sintezu mnogih biomolekula(Sl. 94). Acetil-CoA koji ulazi u ciklus kondenzuje se sa oksalacetatom (četiri C atoma, dikarbonska kiselina) i nastaje citrat (6 C atoma, trikarbonska kiselina). Nivo oksalacetata mora da prati nivo acetil-CoA koji nastaje razgradnjom monosaharida, masnih kiselina i nekih aminokiselina, kako bi sav acetil-CoA mogao da udje u Krebsov ciklus. Oksalacetat može da nastane od piruvata, i ta reakcija obezbedjuje dodatne količine oksalacetata u ćeliji.

Krebsov ciklus prisutan je kod svih aerobnih organizama, životinja, biljaka, aerobnih bakterija, slobodno-živećih protozoa, i najvećeg dela algi i gljiva. E. coli, koja je fakultativni anaerob, ne koristi TCA ciklus u anaerobnim uslovima, ili pri visokim koncentracijama glukoze u podlozi, ali u aerobnim uslovima ga koristi.

Sl. 94. Ciklus trikarbonskih kiselina

Transport elektrona i oksidativna fosforilacija

Elektron-transportni lanac (respiratorni lanac, respiratorni niz), smešten je na unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani i sastoji se iz četiri kompleksa enzima i koenzima (I, II, III, i IV komples). Svi članovi respiratornog niza su proteinski molekuli, neki sadrže metalni jon, neki hem kao prostetičnu grupu (citohromi), a u okviru respiratornog niza poredjani su po rastućem oksido-redukcionom potencijalu (Sl. 95). Neki od koenzima prenose elektrone i protone, a neki kao citohromi samo elektrone. Ovi kompleksi su međusobno povezani na sledeći način. Koenzim Q (neproteinski molekul koji moće da primi 2 elektrona i 2 protona) povezuje komplekse I i III, i II i III. Citohrom c povezuje kompleks III i IV.

NADH predaje elektrone i protone kompleksu I, zatim se vrši prenos na koenzim Q, pa na citohrome u kompleksu III, sledi citohrom c i na kraju prenosioci u kompleksu IV. Sa kompleksa IV elektrone prihvata molekulski O2.

Za potpunu redukciju O2 potrebno je 4 elektrona, pri čemu se vezuju H+ iz matriksa i nastaje voda. U kompleksu I, III, i IV postoje članovi respiratornog niza izmedju kojih postoji veća razlika u redoks potencijalu, pa je prenos elektrona praćen oslobadjanjem veće količine energije.

70


Istovremeno, u tim kompleksima postoje proteini koji predstavljaju protonske pumpe, i koristeći energiju oksidoredukcije pumpaju protone iz matriksa u medjuprostor izmedju dve membrane.

Sl. 95. Respiratorni niz

Ovde treba naglasiti da je unutrašnja membrana mitohondrija nepropustljiva za protone, i da se na ovaj način na membrani formira protonski gradijent. To izaziva pojavu električnog i pH gradijenta na membrani, odnosno spoljna P strana unutrašnje membrane postaje elektropozitivna u odnosu na unutrašnju M stranu. Na kraju svakog respiratornog niza smešten je transmembranski protein – ATP sintaza koji se sastoji iz dve komponente F1 i F0 (svaka sadrži više subjedinica), a komponenta F0 sadrži poru koja predstavlja jedini put za vraćanje protona nazad u matriks. Pri vraćanju protona kroz ATP-sintazu, dolazi do sinteze ATP od ADP i neorganskog fosfata – proces oksidativne fosforilacije. Poznata je struktura i funkcija ATP-sintaze i mehanizam korišćenja energije protonskog gradijenta za sintezu ATP.

Napred opisan sled dogadjaja: prenos elektrona, korišćenje energije oslobodjene pri reakcijama oksidoredukcije za pumpanje protona i formiranje protonskog gradijenta, vraćanje protona nazad u matriks da bi se poništio protonski gradijent i korišćenje tako akumulirane energije za sintezu ATP poznat je kao hemiosmotska teorija (P. Mičel, 1961).

Kod bakterija, respiratorni niz smešten je u plazma membrani, a protoni se pumpaju van ćelije. Vraćanje protona nazad u ćeliju kroz ATP-sintazu koristi se za sintezu ATP. Protonski gradijent može da se koristi i za tzv. sekundarne transporte jona kroz membranu (opisano ranije), ili za rotiranje bakterijskih flagela. Stoga je protonski gradijent na plazma membrani bakterijske ćelije značajan za različite fiziološke funkcije prokariotske ćelije.

Količina energije koja može da se dobije pri prenosu elektrona srazmerna je razlici redoks potencijala izmedju donora i krajnjeg akceptora elektrona.

∆G’0 = - n F ∆E’0, gde se ∆E’0 izračunava kao razlika izmedju ∆E’0 akceptora i donora

71


NADH predaje elektrone na početku lanca, te stoga omogućava pumpanje protona kroz sve tri protonske pumpe (kompleks I, III, IV). FADH2 predaje elektron preko kompleksa II na koenzim Q, tako da se prva pumpa zaobilazi.

Pri prenosu 2 elektrona od NADH do molekulskog kiseonika sintetišu se tri molekula ATP, a količina energije koja se oslobadja iznosi

∆G'0 ═ 2x96500x[0.82 – (-0.32)] ═ -220 kJ/mol

To znači da je efikasnost sinteze ATP u standardnim uslovima oko 40%, jer za sintezu 3 ATP treba 3x30.5kJ.

Pri prenosu 2 elektrona od FADH2 sintetišu se 2 molekula ATP, a količina energije koja se pri tome oslobadja iznosi 201 kJ/mol, što znači da je efikasnost u standardnim uslovima oko 30%.

∆G'0 ═ 2x96500x[0.82 – (-0.22)] ═ -201 kJ/mol

Energetski bilans glukolize i oksidacije glukoze do CO2 i H2O

Glukoliza. Četiri mola ATP se sintetišu fosforilacijom na nivou supstrata, a 2 se utroše pri razgradnji 1 mola glukoze do piruvata. Nastanu 2 redukovana NADH koji odlaze na respiratorni niz i omogućavaju sintezu 6 mola ATP. Neto-rezultat je 8 mola ATP.

Oksidativna dekarboksilacija piruvata. Nastaju 2 mola NADH koji predaju elektrone respiratornom nizu, što znači da nastaje 6 mola ATP.

Krebsov ciklus. U Krebsovom ciklusu nastaju 3 mola NADH, 1 mol FADH2 i 1 mol GTP. Ukoliko se računa sinteza ATP po 1 molu glukoze, napred navedene brojeve treba pomnožiti sa 2, jer u ciklus ulaze 2 mola acetil-CoA, a zatim broj redukovanih NADH pomnožiti sa 3, a broj redukovanih FADH2 pomnožiti sa 2, jer pri prenosu elektrona duž respiratornog niza u slučaju da je donor NADH nastaje 3, a u slučaju da je donor FADH2 nastaju 2 mola ATP. Neto-rezultat je 24 mola ATP.

Sumarno sledi da oksidacijom 1 mola glukoze do CO2 i H2O nastaje 38 mola ATP.

Razgradnja lipida

Iz neutralnih masti, glicerol odlazi u proces glukolize nakon transformacije u gliceraldehid-3-P, a masne kiseline se u matriksu mitohondrija razgradjuju u metaboličkom putu označenom kao β-oksidacija masnih kiselina (Sl. 96). To je proces u kome se postupno lanac masne kiseline skraćuje za po jedan dvougljenični ostatak u formi acetil-SCoA. Ovaj aktivirani ostatak nastaje kroz četiri sukcesivne reakcije, od kojih su dve reakcije oksidoredukcije, što znači da se elektroni sa supstrata prenose na koenzime. Pri tome nastaju jedan NADH i jedan FADH2. Ako pretpostavimo da se razgradjuje molekul masne kiseline sa 16 C atoma (zasićena masna kiselina, palmitat), potrebno je 7 ciklusa od po 4 uzastopne reakcije. Znači da nastaje 8 molekula acetil-SCoA, i sedam NADH i sedam FADH2. Acetil-SCoA odlazi u Krebsov ciklus, a redukovani koenzimi predaju elektrone respiratornom nizu.

Energetski bilans oksidacije masnih kiselina do CO2 i H2O

Pri oksidaciji jednog mola palmitata do CO2 i H2O, nastaje ukupno 131 mol ATP, a neto prinos je 129 mola ATP, jer se 2 mola ATP utroše za aktivaciju masnih kiselina, tj. za formiranje acil-SCoA koji može da se transportuje u mitohondrije.

72


Oksidacija 7 mola NADH i 7 mola FADH2 koji nastaju tokom β-oksidacije omogućavaju sintezu 21, odnosno 14 mola ATP u procesu oksidativne fosforilacije. Osam mola acetil-ScoA ulazi u Krebsov ciklus, pa nastaje (8x3) mola NADH, (8x1) mol FADH2 i (8x1) mol GTP. Redukovani koenzimi predaju elektrone respiratornom nizu, što omogućava sintezu 24x3 mola ATP, odnosno 8x2 mola ATP.

Sumarno: 21 + 14 + 72 +16 + 8 = 131 mol ATP.

Sl. 96. Beta oksidacija masnih kiselina

Razgradnja aminokiselina

Prvi korak u razgradnji aminokiselina je deaminacija, odnosno uklanjanje amino grupe, pa nastaje α-keto kiselina koja može da se transformiše u piruvat, acetil-SCoA, ili pak predstavlja medjuproizvod u Krebsovom ciklusu. Odvajanje amino grupe rezultira stvaranjem toksičnog amonijum jona (NH4

+) koji se uklanja iz organizma na različite načine, zavisno od vrste. Kod čoveka se uklanja u jetri u procesu označenom kao ciklus ureje. Ovaj ciklus zahteva unos energije, tako da se za sintezu 1 mola ureje utroše 2 mola ATP (Sl. 97).

73


Sl. 97. Katabolizam aminokiselina

Oksidacija neorganskih molekula – mikroorganizmi

Prilikom aerobne i anaerobne respiracije, ATP se sintetiše na račun prenosa elektrona duž respiratornog niza, a supstrati koji se oksiduju i pri tome odaju elektrone predstavljaju organske molekule. Medjutim, elektroni mogu da se dobiju i oksidacijom neorganskih jedinjenja, i tu sposobnost imaju hemolitotrofne bakterije. To su najčešće autotrofi, odnosno bakterije koje koriste ugljenik iz CO2 za sintezu organskih molekula (primarna produkcija organske materije). Medjutim, postoje i grupe bakterija koje kao izvor ugljenika koriste organsku materiju. Ove grupe bakterija imaju veliki ekološki značaj, jer neorgansku materiju dovode do stupnja koji mogu da koriste zelene biljke, i tako doprinose kruženju hemijskih elemenata u prirodi (biogeohemijski ciklusi).

Postoje grupe bakterija koje oksiduju H2, pri čemu se elektroni prenose direktno na respiratorni niz ili na NAD+. Ukoliko nastaje NADH, on predaje elektrone na respiratorni niz gde je kranji akceptor molekulski O2, i u procesu oksidativne fosforilacije sintetiše se ATP od ADP i neorganskog fosfata. Ove bakterije vrlo često koriste organske materije kao izvor energije ukoliko su takvi nutrijenti dostupni.

Veoma su značajne nitrifikacione bakterije (Nitrosomonas) prisutne u zemljištu i vodi koje vrše oksidaciju amonijaka do nitrita:

2 NH4 + 3 O2 2 NO2 + 2 H2O + 4 H+

Nitrite dalje oksiduju nitratne bakterije (Nitrobacter):

2 NO2 + O2 2 NO3

Kada su ove dve grupe bakterija prisutne zajedno u zemljištu, amonijak se oksidiše do nitrata koji je dostupan biljkama, a proces je označen kao nitrifikacija.

74


Energija oslobodjena oksidacijom neorganskih molekula koristi se za sintezu ATP koji se koristi kao izvor energije pri sintezi organskih molekula od ugljenika iz CO2. Medjutim, ćeliji je potreban i izvor elektrona za redukciju CO2 pri formiranju organskih molekula. Kako je redoks potencijal amonijaka i nitrita viši od redoks potencijala NAD+, elektroni dobijenin oksidacijom amonijaka ili nitrita ne mogu direktno da se koriste za redukciju NAD+. Ovaj problem bakterije rešavaju tako što protonski gradijent nastao prenosom elektrona duž elektron-transportnog lanca koriste da obrnu tok elektrona od redoks para sa većim, ka redoks paru sa manjim redoks potencijalom, i na taj način elektroni stižu do NAD+ i redukuju ga. Kako se energija oslobodjena prenosom elektrona duž respiratornog niza koristi i za sintezu ATP i za redukciju NAD+, nivo sinteze ATP je nizak u odnosu na nivo oksidativne fosforilacije kod aerobnih heterotrofa. Stoga, hemolitoautotrofi moraju da oksidišu velike količine neorganske materije da bi obezbedili sebi dovoljno energije. To se ne iskazuje kao problem, jer nema kompetitujućih vrsta koje koriste istii izvor supstrata za oksidaciju.

Postoje hemolitotrofne bakterije koje u pisustvu kiseonika oksidišu sumpor (S0), vodonik sulfid (H2S), ili tiosulfate (S2O3

2-) do sulfata i stoga imaju veliki ekološki značaj. Medjutim, ove bakterije mogu da žive i u anaerobnim uslovima, pa tako jedna grupa koja koristi sumpor kao izvor elektrona u aerobnim uslovima, u anaerobnim uslovima koristi sumpor kao akceptora elektrona.

Postoje i gvoždjevite bakterije koje oksidišu Fe2+ → Fe3+. Mogu da koriste CO2 kao izvor ugljenika (autotrofi), ili pak da kao heterotrofi koriste organske materije (glukoza, amino kiseline) kao izvor ugljenika.

Fotosinteza

Proces fotosinteze prisutan je kod fotototrofnih organizama koji kao izvor energije koriste Sunčevu energiju. Ukoliko kao donora elektrona koriste vodu pa nastaje molekulski O2, onda je to oksigena fotosinteza. Ona je prisutna kod biljaka i cijanobakterija, fotoautotrofnih organizama koji kao fotosintetski pigment imaju hlorofil. Ukoliko organizmi kao donora elektrona koriste neorganske materije (npr. H2S, H2) ili organske materije (npr. organske kiseline, alkohole), onda je to tzv. anoksigena fotosinteza, jer ne dolazi do izdvajanja molekulskog kiseonika. Ova vrsta fotosinteze prisutna je kod neke vrste purpurnih i zelenih fotosintetskih bakterija koje sadrže pigment bakteriohlorofil.

Fotosinteza se odigrava u hloroplastima i obuhvata dve faze - svetlu i tamnu. Svetla faza uključuje apsorpciju svetlosti, transport elektrona preko fotosintetičkog niza (u kome su akceptori elektrona poredjani po rastućem redoks potencijalu) do akceptora (NADP ili NAD+), sintezu ATP od ADP i neorganskog fosfata, a tamna faza obuhvata fiksaciju CO2 i sintezu prostih šećera. Reakcije u kojima se sintetiše ATP i redukuje NADP zavise direktno od svetlosne energije i stoga se označavaju kao svetla faza fotosinteze. Reakcije u četvrtoj etapi indirektno zavise od svetlosne energije, mogu da se odigravaju i u mraku, pa se stoga često označavaju kao tamna faza fotosinteze. Medjutim, to ne znači da se sinteza šećera i fiksacija CO2 dešavaju samo u odsustvu svetlosti.

Apsorbovana svetlost koristi se za oksidaciju donora elektrona pri čemu se oslobadjaju elektroni, a ako je donor voda nastaje molekulski O2 (Sl. 98).

2 H2O + Sunč. E → O2 + 4 H + 4e- (1)

Oslobodjeni elektroni prelaze na elektron-transportni lanac, gde se prenose od jednog do drugog člana kroz reakcije oksido-redukcije. Kao i u mitohondrijama, prilikom prenosa elektrona duž respiratornog niza, oslobodjena energija oksido-redukcije koristi se za pumpanje protona kroz tilakoidne membrane iz strome u intratilakoidni prostor (lumen), ili u slučaju bakterija, iz citosola u periplazmatski prostor (Sl. 98). To rezultira stvaranjem protonskog gradijenta. Krajnji akceptor elektrona je kod biljaka i cijanobakterija NADP+ (reakcija 2), a kod nekih vrsta bakterija NAD+.

75


2 H2O + NADP + Sunč. E → 2 H+ + 2 NADPH + O2 (2)

Sl. 98. Primeri protonskih pumpi: mitohondrije, hloroplast kod biljaka, bakterijska ćelija

Protonski gradijent omogućava sintezu ATP, i pri vraćanju protona u matriks hloroplasta dolazi do sinteze ATP od ADP i neorganskog fosfata:

H+ + ADP + Pi → ATP + H2O (3)

Redukovani NADPH i ATP sintetisan u procesu fotosinteze koriste se za redukciju CO2, pri čemu ribulozo-1,5-fosfat služi kao akceptor CO2.

76


7. GENETIČKA INFORMACIJA

Sl. 99. Prenos genetičke informacije

Funkcije DNK, čuvanje i prenošenje genetičke informacije, kao i kontrola životnih aktivnosti na nivou ćelije i organizma, ostvaruju se preko nekoliko procesa koji obuhvataju: samoudvajanje ili replikaciju, prepisivanje ili transkripciju, i prevodjenje ili translaciju (Sl. 99, 100). U procesu samoudvajanja, nasledna informacija prenosi se sa generacije na generaciju prilikom deobe somatskih ćelija, ili prilikom mejotičke deobe i formiranja polnih ćelija. Uticaj na ćelijske funkcije ostvaruje se prepisivanjem informacije sa DNK na RNK, a zatim prevodjenjem te informacije u primarnu strukturu polipeptidnog lanca. Punu aktivnost proteinski molekul stiče nakon dodatne obrade, koja podrazumeva formiranje daljih nivoa strukture i složenosti molekule.

Sl. 100. Šema prenosa genetičke informacije

77


Proces samoudvajanja (replikacije)

Proces samoudvajanja odvija se po tzv. semikonzervativnom modelu (Sl. 101), odnosno roditeljski lanci služe kao matrice (kalupi) za sintezu komplementarnih lanaca, pa novonastali molekuli DNK sadrže jedan roditeljski i jedan novosintetisani lanac.

Proces samoudvajanja vrši se po tzv. bidirekcionom modelu kod E. coli (Sl. 102 A). Dve replikacione viljuške polaze od mesta započinjanja i kreću se u suprotnom smeru dok se ne sretnu. Kod eukariota se javlja fenomen "očiju" koje se stvaraju pri višestrukom započinjanju bidirekcione replikacije (Sl. 102 B).

Sl. 101. Proces samoudvajanja – semikonzervativni model

Sl. 102 Bidirekcioni model samoudvajanja DNK: A. prokarioti; B. eukarioti

78


Za replikaciju su potrebni :

A. Specifični enzimi

A.1. Helikaza – enzim koji raspliće komplementarne lance DNK;

A.2. RNK-zavisna-DNK polimeraza je enzim koji katališe formiranje 3' – 5' fosfodiestarske veze izmedju dva nukleotida u polinukleotidnom lancu koji se sintetiše na roditeljskom lancu kao kalupu; DNK polimeraza ima polimeraznu funkciju u smeru 5' – 3', a čita kalup u smeru 3’ - 5’; može da “radi” ukoliko je prethodno sintetisan RNK prajmer;

A.3. Enzim primaza koji sintetiše kratak RNK lanac od oko deset nukleotida, tzv. RNK primer, RNK inicijator, u našoj upotrebi – prajmer;

A.4. Enzim ligaza koji spaja Okazaki fragmente;

B. Komplementarni nukleotidi u formi nukleozidtrifosfata (dNTP)

Sl. 103. Proteini odgovorni za razdvajanje lanaca vezuju se na delu koji rasplete enzim helikaza

Kada helikaza rasplete lance i za njih se vežu SSB proteini koji sprečavaju ponovno spajanje komplementarnih baza, započinje sinteza RNK prajmera na oba lanca (ovi kratki oligonukleotidni lanci se takodje sintetišu u smeru 5’-3’, a enzim čita kalup u smeru 3’-5’. Nakon sinteze prajmera na scenu stupa RNK-zavisna-DNK-polimeraza koja započinje povezivanje komplementarnih dezoksiribonukleotida (Sl. 103). Kako su roditeljski lanci antiparalelni, to znači da je jedan od lanaca postavljen u odnosu na polimerazu u smeru 3’-5’, tj. u smeru u kome ona može da radi, dok je drugi obrnutog smera. To znači da se jedan od novosintetisanih lanaca može da sintetiše u kontinuitetu, tzv. vodeći lanac (leading strand), dok drugi mora da se sintetiše od kratkih fragmenata, tzv. Okazaki fragmenti koji se zatim spajaju (to je tzv. zaostajući lanac, lagging strand) (Sl. 104).

79


Sl. 104. Sinteza vodećeg (leading) i zaostajućeg (laggind) lanca. Ostali detalji u tekstu.

Samoudvajanje može da se podeli u nekoliko koraka: (1) Odvijanje dela DNK i vezivanje SSB;(2) Sinteza prajmera; (3) Sinteza komplementarnog DNK lanca u kontinuitetu (vodeći lanac), odnosno u vidu kraćih DNK lanaca - Okazaki fragmenti (zaostajući lanac); (4) Isecanje prajmera; (5) Spajanje Okazaki fragmenata na zaostajućem lancu (Sl. 104).

Proces prepisivanja

Proces prepisivanja (Sl. 105) obuhvata sintezu iRNK, kao i sintezu mRNK i tRNK. Ribozomalna i transportna RNK prepisuju se sa odredjenih sekvenci DNK u formi većih prekursorskih lanaca koji se nakon prepisivanja obradjuju i formiraju se odgovarajući molekuli mRNK i tRNK. Informaciona RNK prepisuje se sa tzv. strukturnih gena koji nose informaciju o sintezi datog polipeptidnog lanca. Kod prokariota, RNK polimeraza je oligomerni protein, i sadrži tzv. σ-faktor, subjedinicu koja prepoznaje promotorski region, tj. sekvencu nukleotida ispred dela DNK koji treba da se prepiše. Ovaj enzim takodje čita kalup u smeru 3’–5’, a spaja odgovarajuće komplementarne nukleotide u smeru 5’-3’. Kada pročita datu sekvencu, sama polimeraza ili tzv. ρ-faktor prepoznaju sekvencu nukleotida na DNK kalupu koja znači "stop" i završetak sinteze RNK. Prokariotska iRNK može da nosi informaciju sa više gena (policistronska), a prepisivanje teče uporedo sa prevodjenjem. Poluživot za RNK iznosi oko 2 minute.

Kod eukariota informacija u genima je isprekidana (egzoni su kodirajući delovi, a introni su nekodirajući delovi, pa se prilikom prepisivanja prepisuju i egzoni i introni. Kod eukariota, RNK polimeraza II koja katališe sintezu iRNK, nema sposobnost da sama prepozna i veže se za promotorski region. U tome joj je potrebna pomoć specifičnih proteinskih transkripcionih faktora (TF), koji se prvi vežu za promotorski region, a zatim omogućavaju vezivanje RNK polimeraze (videti kasnije). Nakon prepisivanja RNK lanac se označava kao heteronuklearna RNK (hRNK), jer sadrži i introne i egzone i potrebna je obrada lanca da bi se formirala iRNK koja informaciju sadrži u kontinuitetu. Ta obrada nosi naziv posttranskripciona modifikacija RNK - dodavanje nukleotidnih sekvenci na 3' i 5' kraju; isecanje introna pomoću male nuklearne RNK (snRNK), i spajanje egzona, odnosno formiranje iRNK koja iz nukleusa ide u citoplazmu (Sl. 106).

80


Sl. 105. Proces prepisivanja

Sl. 106. Obrada hRNK uz pomoć snRNK

81


Genetički kod

Genetički kod je veza izmedju sekvence baza u molekuli DNK i sekvence AK u datom polipeptidnom lancu i predstavljen je sa tri uzastopna nukleotida u molekuli DNK. Komplementaran triplet baza u molekuli iRNK označava se kao kodon (Sl. 107), a čita se u smeru 5' – 3'. Kako postoji 4 različite baze, broj kodona je 64, tj. 43. Tri kodona, UAA, UAG i UGA ne odredjuju mesto AK u polipeptidnom lancu, nego predstavljaju tzv. stop kodone koji označavaju kraj sinteze polipeptidnog lanca. Postoji najmanje jedan kodon za svaku od 20 AK koje ulaze u sastav proteina, a za neke i više kodona (61 kodon nosi informaciju o mestu AK u polipeptidnom lancu). U slučaju kada za jednu AK postoji više kodona, oni se razlikuju po trećoj

Sl. 107. Kodoni za 20 AK. UAA, UAG i UGA su tzv. stop kodoni

bazi, tj. trećem slovu. Tripleti baza komplementarni kodonima, tzv. antikodoni postoje na molekuli tRNK (Sl. 108). Postoji 20 tRNK, za svaku AK po jedna, a i antikodon odgovarajuće tRNK može da prepozna sve kodone koji šifriraju mesto date AK u polipeptidnom lancu. To je moguće zato što je pri prepoznavanju važna komplementarnost prve i druge baze u kodonu sa prvom i drugom bazom u antikodonu. Karakteristike genetičkog koda su univerzalnost, što znači da je zajednički svim živim bićima, specifičnost što znači da dati kodon odredjuje mesto odredjene AK u polipeptidnom lancu, pri čitanju koda “nema zapete i preklapanja”, što znači da se npr. sekvenca ABCDEFGHI čita uvek kao ABC/DEF/GHI, tj. tri po tri slova, odnosno nukleotidne baze.

Proces prevodjenja

Proces prevodjenja, odnosno sinteze polipeptidnih lanaca prema informaciji sadržanoj u molekuli DNK, odvija se u nekoliko faza: (A) faza aktivacije AK; (B) faza formiranja inicijalnog kompleksa; (C) faza elongacije; (D) faza završetka sinteze; (E) faza obrade polipeptidnog lanca i formiranje trodimenzionalne organizacije proteinske molekule.

82


Sl. 108. Šema transportne RNK

Sl. 109. Formiranje inicijalnog kompleksa

Aktivacija AK obuhvata vezivanje AK za odgovarajuću t-RNK, što se odvija u dva koraka i zahteva aktivnost odgovarajućeg enzima i utrošak energije. Prvo se stvara kompleks AMP-enzim-AK (AMP potiče iz ATP koji hidrolizuje na AMP i pirofosfat, tj. PPi što znači da se za aktivaciju AK troše praktično dva molekula ATP) i zatim povezivanje tako aktiviranog ostatka AK na t-RNK).

AK + Enzim + ATP → Enzim-AMP-AK + PPi (PPi → 2Pi)Enzim-AMP-AK + tRNK → AK-tRNK + Enzim + AMP

83


Formiranje inicijalnog kompleksa predstavlja povezivanje male i velike subjedinice ribozoma, iRNK koja treba da se prevede, i tRNK koja prepoznaje prvi kodon u iRNK (Sl. 109). Za formiranje kompleksa neophodni su odredjeni proteinski faktori, i energija koja se dobija hidrolizom GTP.

Sl. 110. Faza elongacije u tri koraka, objašnjenje u tekstu

Elongacija obuhvata prepoznavanje kodona, formiranje peptidne veze i translokaciju (Sl. 110). Na početku elongacije, prva tRNK sa prvom AK nalazi se na tzv. peptidil (P) mestu u ribozomu. Pored tog mesta, postoji i tzv. aminoacil (A) mesto na koje se vezuje tRNK koja prepoznaje sledeći kodon koji treba da se pročita. Nakon toga formira se peptidna veza izmedju karboksilne grupe prve AK i amino grupe druge AK i novostvoreni dipeptid ostaje privremeno vezan za drugu tRNK. Da bi se oslobodilo A mesto u ribozomu, dolazi do translokacije, odnosno premeštanja tRNK na P mesto. Tako se završava prvi ciklus, i može da se pročita treći kodon od strane odgovarajuće tRNK. Elongacija se odvija sve dok na A mesto ne dodju tzv. stop kodoni koje ne prepoznaje ni jedna tRNK. To je znak za završetak sinteze polipeptidnog lanca i on se oslobadja iz ribozoma. Za formiranje jedne peptidne veze potrebna je energija 4 ATP (2 za aktivaciju AK i 2 GTP za elongaciju). Kod bakterija je moguće da se proces prevodjenja dešava istovremeno sa procesom prepisivanja iRNK (Sl. 111), jer je ona odmah spremna za sledeću fazu. Takodje, ova dva procesa u bakterijskoj ćeliji nisu prostorno razdvojeni, kao što je to slučaj u eukariotksoj ćeliji gde se prepisivanje vrši u jedru, a prevodjenje u ribozomima koji se nalaze slobodni u citosolu, ili se pak vezuju za endoplazmatski retikulum, tzv. hrapavi endplazmatski retikulum.

84


Nakon sinteze polipeptidnog lanca, koji na taj način dobija svoju primarnu strukturu, vrši se dalja obrada istog. Dolazi do formiranja viših nivoa strukture proteinskog molekula (sekundarne, tercijerne, kvarterne – zavisno od proteina) ili pak vezivanja za polipeptidni lanac oligosaharidne komponente, ostatka fosforne kiseline itd., odnosno formiranje složenih proteina sa datom prostetičnom grupom.

Sl. 111. Sinteza polipeptidnog lanca u ribozomima vezanim za ER

Sl. 112. Prepisivanje i prevodjenje u bakterijskoj ćeliji mogu da se dešavaju istovremeno

Regulacija transkripcije kod prokariota

Primer: Lac operon kod E. coli – kontrola sinteze enzima koji učestvuju u razgradnji laktoze (Sl. 113). (A) Sa regulatornog gena se prepisuje informacija za sintezu proteina represora koji se vezuje u nivou promotorskog regiona za deo označen kao operator, što onemogućava vezivanje RNK polimeraze i prepisivanje strukturnih gena. (B) Gajenje E. coli na hranljivoj podlozi sa laktozom izaziva blokadu represornog molekula koji ima vezno mesto za laktozu, i represor gubi sposobnost vezivanja za operator. RNK polimeraza može da se veže za promotor i geni se prepisuju, odnosno dolazi do sinteze enzima.

85


Sl. 113. Lac operon, objašnjenje u tekstu

Sl. 114. Kontrola Lac operona u prisustvu glukoze

Postoji i dodatna kontrola, koja se ogleda u postojanju molekula cAMP, čija koncentracija u ćeliji zavisi od prisustva glukoze, odnosno prisustvo glukoze u hranljivoj podlozi smanjuje nivo cAMP u bakterijskoj ćeliji. Efikasnost RNK polimeraze zavisi od vezivanja kompleksa cAMP-CAP protein

86


u nivou promotorskog regiona (Sl. 114, b i c). Enzimi čija se sinteza kontroliše označeni su kao inducibilni, jer se njihova sinteza indukuje prisustvom specifičnog supstrata. Za razliku od ovih inducibilnih enzima, u bakterijskoj ćeliji postoje enzimi čija sinteza nije kontrolisana i ne zavisi od prisustva supstrata (konstitutivni enzimi).

Regulacija transkripcije kod eukariota

Kod eukariota regulacija ekspresije gena je na nivou transkripcije. Postoje osnovni transkripcioni faktori (TF, formiraju sa polimerazom, tzv. pre-inicijacioni kompleks – PIC) i inducibilni TF(uključuju se na tkivno specifičan i vremenski uslovljen način u regulaciju ekspresije odredjenih gena u ćelijama eukariota). Inducibilni TF su regulatorni proteini koji se vezuju za tzv. regulatorne sekvence DNK (pojačivači – enhancers). Primer inducibilnih faktora su npr. steroidni hormoni. U ciljnim ćelijama receptori za steroidne hormone su locirani unutar ćelije, tzv. intracelularni receptori koji su u odsustvu hormona u inaktivnom stanju. Vezivanjem hormona za receptor, dolazi do njegove aktivacije i kompleks hormon receptor vezuje se za specifična mesta na DNK i dovodi do prepisivanja odredjenih gena. Prema tome, intracelularni receptori predstavljaju ligand-zavisne TF.

Sl. 115. Kontrola prepisivanja kod eukariota

87


88


8. HOMEOSTAZA I ĆELIJSKA KOMUNIKACIJA

HOMEOSTAZA

Kada se konfrontiraju sa promenama u okolini, životinjski organizmi mogu da pokažu tri tipa odgovora: izbegavanje, uskladjivanje, regulaciju.

Izbegavanje – u prostoru (prelazak u prostor gde se promena ne oseća, migratorna kretanja) ili vremenu (prelazak u stanje u kome je moguće preživljavanje “teškog vremena”, pr. dijapauza kod insekata).

Uskladjivanje (konformisti) – ovi organizmi podešavaju svoju unutrašnju sredinu saglasno promenama u spoljnoj sredini, pr. promene u koncentraciji soli u vodi rezultiraju promenom u koncentraciji tih soli u unutrašnjoj sredini organizma, ili okso-konformisti su gliste čija se potrošnja kiseonika menja u zavisnosti od dostupnosti kiseonika u zemljištu.

Regulacija – ovakvi organizmi mogu da održe stalnost unutrašnje sredine u okviru odredjenog dijapazona variranja date promenljive u spoljnoj sredini. Tendencija organizma da održi stalnost unutrašnje sredine organizma označava se kao HOMEOSTAZA (B.N.Cannon, 1890). Na primer, organizam čoveka predstavlja skup od ogromnog broja ćelija organizovanih u odgovarajuće funkcionalne celine (tkiva-->organi). Ćelije su okružene ekstracelularnom tečnošću (ECT), a unutrašnjost ćelija ispunjena je intracelularnom tečnošću (ICT). Obezbedjenje optimalnih uslova za funkcionisanje ćelija zahteva održavanje konstantnih uslova u ECT. To znači da se vitalni fiziološkii parametri (pritisak, temperatura, pH, koncentracija glukoze itd.) moraju držati u odredjenim granicama. Svaka funkcionalna celina daje svoj doprinos održavanju homeostatskih uslova u ECT. Održavanje homeostatskih uslova u ECT obezbedjuje normalno funkcionisanje ćelija i obrnuto. Puferska svojstva telesnih tečnosti, uloga bubrega i respiratornog sistema u održavanju pH krvi, primeri su homeostatskih mehanizama. Čak i mišićno-skeletni sistem, omogućavajući organizmu da se skloni od opasnosti, odnosno da dodje do potrebnih izvora hrane, učestvuje u obezbedjenju homeostaze organizma.

Homeostaza se obezbedjuje koordinacijom kompleksnih regulatornih sistema koji se mogu prikazati kao sistemi povratne sprege. Pojam povratne sprege vezan je sa sistemima upravljanja (odnosno kontrole). Sistem upravljanja sastoji se od upravljanog (kontrolisanog) elementa i njemu pridruženog upravljačkog elementa (onog koji vrši kontrolu), kao i izvršnog organa koji menja upravljačka dejstva u skladu sa signalima upravljanja. U sistemima upravljanja mogu postojati direktne i povratne veze medju elementima koji taj sistem formiraju.

Ako se za formiranje upravljačkih dejstava ne koriste informacije o vrednostima kontrolisanih veličina, ostvarenih u procesu upravljanja, u takvom sistemu postoje samo direktne veze i sistem je otvoren. Ukoliko se za formiranje upravljačkih dejstava koriste informacije o vrednostima kontrolisanih veličina, u sistemu postoje i direktne i povratne veze i sistem je zatvoren.

Postoji negativna i pozitivna povratna sprega. Negativna povratna sprega se javlja u slučaju kada povećanje izlaza redukuje odgovor na ulaz.

A +→ B +→ C -

Pozitivna povratna sprega se javlja u slučaju kada povećanje izlaza produkuje povećan odgovor na ulaz.

A +→ B +→ C +

89


Biološki kontrolni sistemi počivaju na specifičnoj prostornoj i vremenskoj organizaciji pojedinih komponenti živog sistema, povezanih u zatvoren funkcionalni krug koji obezbedjuje povratno dejstvo na samog sebe - to su sistemi povratne sprege. Mnogi homeostatski mehanizmi u organizmu deluju kao negativna povratna sprega. Pozitivna povratna sprega javlja se da obezbedi uzlaznu fazu nekog cikličnog fenomena (primer – hormonska kontrola menstrualnog i estrusnog ciklusa, ili depolarizaciona faza akcionog potencijala).

ĆELIJSKA KOMUNIKACIJA

Ćelije medjusobno komuniciraju preko hemijskih glasnika (signalnih molekula) koji na nivou tzv. ćiljne ćelije imaju specifičan receptor (proteinski molekul) za koji se vezuju, i iniciranjem odredjenih kaskadnih reakcija omogućavaju odgovor ciljne ćelije. Taj odgovor može da bude stimulacija ili inhibicija odredjene aktivnosti u ćeliji. Hemijska komunikacija medju ćelijama neophodna je za kontrolu razvića, diferencijaciju ćelija, organizaciju ćelija u tkiva, kao i koordinaciju metaboličkih i drugih procesa u organizmu.

Rastvorljivost signalnih molekula

Signalni molekuli mogu da budu hidrofilni i lipofilni. Ovi drugi mogu da prodju difuzijom kroz plazma membranu, odnosno kroz bimolekulski sloj lipida, te se zbog toga specifični receptori za ove molekule nalaze unutar ćelije. S druge strane, hidrofilni molekuli ne mogu da prodju kroz plazma membranu, te se za njih specifični receptori nalaze kao receptorni proteini u plazma membrani (Sl. 116).

Sl. 116. Membranski i intracelularni receptori. Hidrofilni (a) signalni molekuli imaju receptore u

plazma membrani, a lipofilni (hidrofobni) signalni molekuli (b) imaju receptore unutar ćelije

Mehanizam dejstva hidrofobnih signalnih molekula

Lipofilni signalni molekuli su steroidni hormoni (hormoni gonada i hormoni kore nadbubrega), kao i hormoni štitne žlezde. Na slici 116 (b) prikazan je mehanizam dejstva lipofilnih signalnih molekula. Kada udju u ćeliju ovi hormoni se vezuju za specifične receptorne proteine (levi deo

90


šeme), pri čemu vezivanje liganda aktivira receptor, tj. omogućava promenu konformacije. Kompleks ligand-receptor se vezuje za specifično hormon-senzitivno mesto na molekulu DNK (desni deo šeme) što dovodi do prepisivanja odredjenih gena (ekspresije gena). Nakon prepisivanje gena i formiranja iRNK, dolazi do sinteze odredjenih proteina, što predstavlja odgovor ćelije na dejstvo odredjenog lipofilnog hormona. Obzirom da se kompleks hormon-receptor vezuje za DNK i indukuje ekspresiju gena, to znači da intracelularni receptori predstavljaju transkripcione faktore koji se aktiviraju vezivanjem liganda. Kao što je u poglavlju o genetičkoj informaciji već rečeno, lipofilni hormoni preko svojih intracelularnih receptora kontrolišu ekspresiju gena na prostorno i vremenski specifičan način.

Mehanizam dejstva hidrofilnih signalnih molekula

Hidrofilni signalni molekuli su neurotransmiteri, proteinski hormoni, peptidni faktori rasta. Postoji nekoliko tipova membranskih receptora, kao što su receptori sa aktivnošću tirozin kinaze,G-protein zavisni receptori, ligand-zavisni jonski kanali. U slučaju prenosa informacije preko membranskih receptora, postoji mehanizam trandukcije (pretvaranja) signala, tj. mehanizam koji kroz seriju kaskadnih reakcija omogućava formiranje intracelularnog signala koji inicira odgovor ćelije.

Tako naprimer, receptori sa aktivnošću tirozin-kinaze (RTK) imaju ekstracelularni domen za koji se vezuje ligand, pri čemu to vezivanje dovodi do aktivacije intracelularnog domena (kroz promenu konformacije) koji ima funkciju tirozin kinaze (enzima koji vrši fosforilaciju aminokiseline tirozin u odredjenom proteinskom susptratu (Sl. 117). Kada se aktivira RTK u membrani ciljne ćelije, to izaziva aktivaciju serije enzima kinaza, što u kranjem rezultatu dovodi do fosforilacije odredjenih transkripcionih faktora i ekspresije gena.

Sl. 117. Receptor sa aktivnošću tirozin kinaze. Kada se veže ligand dolazi do promene konformacije i aktivira se intracelularni domen koji predstavlja tirozin kinazu, koja fosforiliše sam

receptor, i druge proteinske supstrate u ćeliji.

G-protein zavisni receptori imaju ekstracelularni domen za koji se vezuje ligand i intracelularni domen koji nakon vezivanja liganda, zbog promene konformacije može da aktivira jedan drugi protein, tzv. G-protein (Sl. 118). G-protein zatim aktivira specifičan enzim u membrani, a on katališe unutar ćelije sintezi tzv. intracelularnog (ili sekundarnog) glasnika. Ako je enzim adenil ciklaza (AC), onda je intracelularni glasnik ciklični-AMP (cAMP). cAMP aktivira enzim, protein

91


kinazu A koja vrši fosforilaciju odredjenih proteina koji mogu da budu enzimi, ili jonski kanali, ili mogu da budu transkripcioni faktori. Fosforilacija izaziva aktivaciju/inhibiciju datog proteina, a aktivnost/inhibicija datog proteina predstavlja odgovor ćelije na informaciju koju nosi signalni molekul. Drugim rečima, fosforilacija može da aktivira ili inhibiše odredjeni enzim, odnosno da otvori ili zatvori jonski kanal (prikaz na šemi 1)

Sl. 118. Aktivacija G-protein zavisnog receptora za epinefrin (ili norepinefrin i neke lekove sa agonističkim dejstvom). Objašnjenje u tekstu

Šema 1. Kaskada reakcija pri aktiviranju G-protein zavisnog receptora vezivanjem specifičnog liganda (hormona)

Vezivanje SM za R⇓

Aktivacija G-proteina cAMP zavisni put prenosa informacije u ćeliji

⇓Aktivacija enzima u membrani (adenilil ciklaza, AC)

⇓Sinteza cAMP od ATP (cAMP je intracelularni sekundarni glasnik)

⇓cAMP aktivira protein kinazu A (PKA)

⇓PKA fosforiliše odredjene proteine koji mogu biti enzimi, jonski kanali,transkripcioni faktori, i drugi proteini u ćeliji

Ligand-zavisni jonski kanali se javljaju na membrani tzv. postsinaptičke nervne ćelije u okviru sinapse (Sl. 119). Sinapse u centralnom nervnom sistemu omogućavaju obradu informacija koje se prenose nervnim sistemom. Na postsinaptičkoj membrani se javlja lokalni električni signal, tzv. postsinaptički potencijal koji predstavlja lokalnu promenu membranskog potencijala (MPM). Promena može da bude u smeru depolarizacije membrane, tzv. ekscitirajući postsinaptički potencijal (EPSP), kada pod odredjenim uslovima može da dodje do prenosa informacije sa

92


presinaptičkog na postsinaptički neuron. Nasuprot tome, promena u smeru hiperpolarizacije membrane, tzv. inhibirajući postsinaptički potencijal (IPSP) ima funkciju gašenja signala u nivou sinapse. Ove lokalne promene MPM rezultat su otvaranja ligand-zavisnih jonskih kanala. Kanali se otvaraju kada se za njih veže odgovarajući neurotransmiter. Ako je to kanal za Na+, javiće se ulazna Na+-struja, pa će doći do lokalne depolarizacije membrane (EPSP). Ako je u pitanju kanal za Ca2+, ulazna Ca2+-struja takodje će dovesti do lokalne depolarizacije (EPSP). Ukoliko je to kanal za K+, izlazna K+-struja dovešće do lokalne hiperpolarizacije membrane (IPSP).

Sl. 119. Ligand-zavisan jonski kanal. Neurotransmiter acetil-holin (Ach), kanal za Na+ i K+

Regulacija metaboličkih procesa hormonima

Hormoni utiču na brzinu odvijanja odredjenih metaboličkih procesa kovalentnom reverzibilnom regulacijom enzimske aktivnosti (fosforilacijom). Fosforilacija anzimskog molekula može da dovede do njegove inhibicije, odnosno aktivacije. Fosforilacija enzima koji učestvuju u kataboličkim putevima dovodi do njihove aktivacije, dok fosforilacija enzima koji učestvuju u anaboličkim putevima dovodi do njihove inhibicije. Na taj način, dejstvom hormona na ciljnu ćeliju obezbedjuje se preusmeravanje metabolizma ćelije u potrebnom smeru. Ilustrativan primer jeste regulacija metabolizma glikogena (šema 2) pod dejstvom glukagona (hormon pankreasa) i adrenalina (hormon srži nadbubrežnih žlezda). Oba hormona deluju preko specifičnih G-protein zavisnih receptora za glukagon, odnosno adrenalin. Aktivacija ovih receptora u membrani ciljne ćelije (mišićne ćelije, ćelije jetre), dovodi do formiranja cAMP i aktivacije protein kinaze A koja vrši fosforilaciju enzima koji učestvuje u sintezi glikogena (glikogen sintaza) i pri tome ga inhibiše, dok istovremeno fosforilacijom glikogen fosforilaze (enzim koji katališe odvajanje molekula glukoze iz glikogena u formi glukozo-1-P) indukuje aktivnost ovog enzima i na taj način omogućava razgradnju glikogena. Povećana sekrecija ova dva hormona javlja se u uslovima povećanih potreba ćelija za energijom. To znači da u mišićnim ćelijama glukoza iz glikogena treba da udje u proces glukolize, a u jetri da dodje do razgradnje glikogena, pri čemu se molekuli glukoze oslobadjaju u krvi i na taj način se održava nivo glukoze u krvi.

93


Šema 2. Regulacija metabolizma glikogena

Hormoni glukagon i adrenalin stimulišu razgradnju glikogena

E1

(glukoza)n (glukoza)n-1 + glukozo-1P E1 – glikogen fosforilaza

E2 E2 – glikogen sintaza

Glikogen fosforilaza može da bude u dve forme: nefosforilisa (neaktivna) i fosforilisana (aktivna).

Glikogen sintaza može da bude u dve forme: nefosforilisana (aktivna) i fosforilisana (neaktivna).

Molekulska osnova kancera

Embriogeneza (embrionalni razvoj jedinke) podrazumeva odvijanje sledećih procesa:

diferencijacije(stvaranje odredjenih vrsta ćelija), proliferacije (deoba, umnožavanje ćelija) i

kontrolisane smrti ćelije – apoptoze. Korektna prostorna i vremenska organizacija ovih

procesa omogućava razvoj normalnog funkcionalnog organizma.

Kod odraslog organizma postoje ćelije koje se neprekidno dele (proliferišu) i diferenciraju, kao što su ćelije krvnog tkiva (leukociti, eritrociti), ćelije epitela creva, ćelije kože i druge. Mnoge druge vrste ćelija se ne dele, odnosno nakon rodjenja one miruju u tzv. G0 fazi ćelijskog ciklusa (Sl. 120). To su na primer nervne ćelije i mišićne ćelije. Kontrolu faze ciklusa u kojoj se nalazi data ćelija vrše tzv. faktori (hormoni) rasta i to: faktori kompetencije, koji omogućavaju prelaz iz faze mirovanja u G1 fazu, i faktori progresije, koji omogućavaju da ćelija iz G1 faze dodje u sintetsku, G2 fazu, a zatim da se izvrši deoba ćelije (mitoza).

Sl. 120. Ćelijski ciklus. Prelaz iz Go u G1 fazu obezbedjuju signalni molekuli označeni kao faktori kompetencije, dok prelaz iz G1 u S omogućavaju signalni molekuli označeni kao faktori progresije

Gubitak kontrole u okviru ćelijskog ciklusa može da dovede do prekomerne proliferacije ćelija i do formiranja benignih tumora koji su inkapsulirani u vezivno tkivo, ili do razvoja malignih tumora – kancera koji raste i čije ćelije mogu da migriraju u druge delove organizma gde nastavljaju proliferaciju, tzv. metastaze (Sl. 121). Kancerozne ćelije su besmrtne i dele se bez kontrole rasta i deobe, i ne podležu apoptozi. Transformacija normalne u kanceroznu ćeliju praćena je kompleksnom serijom strukturnih, biohemijskih i genetičkih promena. Uzročnici pojave kancera

94


mogu da dovedu do oštećenja u molekuli DNK, i do pojave mutacija. Kancerogene materije su različiti ksenobiotici prisutni u našem okruženju, kao na primer dioksini i furani, neki pripadnici poliaromatičnih ugljovodonika (PAH) - dibenz[a,h]antracen, benz[k]fluoranten, benz[a]piren. Polihlorovani bifenili (PCBs) su potencijalno kancerogena jedinjenja, ali izazivaju različite toksične efekte na nivou jetre, nervnog sistema, reproduktivnog sistema.

Sl. 121. Nastanak tumora. Modifikovana ćelija (a) može da rezultira nastankombenignog tumora (b) ili kancera (c) koji migrira u druge delove organizma (d)

95


9. IMUNI MEHANIZMI

Život svakog organizma je pod neprekidnim uticajima od strane drugih organizama, pri čemu mnogi od tih uticaja predstavljaju pretnju za život datog organizma. Stoga je svaka vrsta opremljena odgovarajućim odbrambenim mehanizmima (Tabela 1), koji mogu biti npr. mimikrija, otrovi, dobro razvijeni mišići za trčanje. Kontinuirana borba kičmenjaka sa mikroorganizmima rezultirala je razvojem tzv. imunog sistema koji radi na principu prepoznavanja i učenja. Prvi susret sa bakterijskim, gljivičnim, virusnim agensom obično rezultira infekcijom praćenom ravojem bolesti. Imuni sistem pomaže da se organizam oporavi od infekcije, a nakon toga organizam razvija odgovarajuće mehanizme koji ga čine otpornim na sledeću infekciju istim agensom. Osnovni princip je prepoznavanje. Imuni sistem mora da prepozna napadača, a takodje mora da razlikuje stranog napadača od sastavnih konstituenata svog organizma. Ako se to ne desi, dolazi do pojave tzv. autoimunih bolesti, kada imuni mehanizmi deluju protiv sopstvenih molekula (prvenstveno proteinskih).

Tabela 1. Prisustvo odgovarajućih odbrambenih mehanizama kod različitih organizama

Taksonomska grupa

Prirodni imunitet

Stečeni imunitet

Fagocitoza T i B limfociti

Antitela Antimikrobni peptidi

Više biljke + - - - - +Sundjeri + - + - - ?Gliste + - + - - ?Insekti, rakovi + - + - - +Ribe + + + + + +Žabe + + + + + +Reptili + + + + + +Ptice + + + + + +Sisari + + + + + +

Imuni sistem prepoznaje stranog agensa, a takodje dovodi i do njegove destrukcije. Prepoznavanje stranog agensa vrše limfociti, a destrukciju limfociti, ali i makrofagi i neutrofili. Pored ove dve osnovne funkcije, imuni sistem može da uništi kancerozne ćelije, a kod eksperimentalnih životinja može da spreči razvoj odredjenih tumora. Takodje, imuni sistem je uključen u odbacivanje transplantata, sa izuzetkom transplantata od jednojajčanog blizanca.

Imunitet predstavlja sposobnost odbrane organizma od dejstva njemu stranih agenasa (mikroorganizmi, virusi, toksini,…). Urodjeni imunitet (otpornost) - reakcije nespecifične, odgovor na ponovljeno dejstvo stranih agenasa isti. Stečeni imunitet – sposobnost organizma da prepozna i uništi strani agens povećava se pri ponovnom kontaktu (pamćenje), a odgovor je specifičan.

Ćelije odgovorne za urodjeni i stečeni imunitet smeštene su izmedju ostalog i u limfatičnom tkivu koje pripada limfnom sistemu. To je sistem koji pomaže održavanje balansa tečnosti u tkivima, preuzima masti i druge supstance iz digestivnog trakta, i deo je odbrambenog sistema organizma. Sačinjavaju ga: limfa, limfatični sudovi, difuzno limfatično tkivo koje sadrži dispergovane limfocite, makrofage i druge ćelije, limfni čvorovi, krajnici, slezina, timus.

URODJENI IMUNITET (MEHANIZMI)

Svi višećelijski organizmi, uključujući biljke, beskičmenjake i kičmenjake poseduju urodjene mehanizme koji ih štite od mikroorganizama. Obzirom da su ti mehanizmi prisutni u organizmu, i spremni da prepoznaju stranog agensa, označavaju se kao prirodni, urodjeni imunitet. Prirodni imunitet je značajan odbrambeni mehanizam koji deluje pre no što se aktiviraju mehanizmi

97


stečenog imuniteta. S druge strane, stečeni imunitet koristi mehanizme i prirodnog imuniteta u cilju odbrane organizma. Na primer, inflamacija (videti kasnije) je proces koji se javlja i u okviru prirodnog i u okviru stečenog imuniteta. Drugim rečima, postoji bidirekciona komunikacija medju mehanizmima urodjenog i stečenog imuniteta.

Komponente urodjenog imuniteta kod kičmenjaka su: (a) epitel koji predstavlja barijeru za mikroorganizme; (b) ćelije u cirkulaciji i u tkivima, i (c) veći broj plazma proteina, i citokini (interleukini).

Epitel koji predstavlja barijeru za mikroorganizme

Uobičajeni ulazi mikroorganizama u organizam životinja jesu koža, gastrointestinalni trakt i pluća, kroz koje mogu da udju putem fizičkog kontakta, ingestije i udisanja. Ove dodirne površine su zaštićeni epitelom koji pruža fizičku i hemijsku barijeru protiv infekcije. Pored toga, epitelijalne ćelije luče aktivne peptide koji ubijaju mikroorganizme.

Ćelije u cirkulaciji i u tkivima

Sl. 122. Ćelije koje učestvuju u odbrani organizma u okviru prirodnog i stečenog imuniteta

Leukociti ili ″bela krvna zrnca″ obuhvataju grupu ćelija koje su uključene u mehanizme urodjenog imuniteta (Sl. 122). Takodje su prisutne i u procesima koji se aktiviraju stečenim imunitetom (primer inflamatorni odgovor, aktivacija limfocita). Tu pre svega treba spomenuti fagocite i to neutrofile i monocite/makrofage. Naime, postoje dva tipa fagocita koji cirkulišu u krvi, neutrofili i monociti, koji prepoznaju strani agens i fagocitiraju ga. Neutrofili (polimorfonuklearni leukociti) su najbrojniji leukociti u krvi, imaju polu-život 6 h. Organizam čoveka produkuje 1011 neutrofila na

98


dan, i to su ćelije koje prve reaguju na infekciju. Uništavaju mikroorganizme u cirkulaciji, ali mogu da odu iz krvnog suda u tkivo ili digestivni trakt, gde takodje uništavaju mikroorganizme. Monociti su manje brojni od neutrofila, a uništavaju mikroorganizme i u cirkulaciji i u tkivima. Naime, monociti koji napuste cirkulaciju ulaze u tkivo, zapremina im se povećava 5x, i predstavljaju glavne fagocite (Sl. 122 i 123) u potkožnom tkivu, mukoznim membranama, oko krvnih i limfnih sudova) – tzv. sistem tkivnih makrofaga.

Pored neutrofila i monocita, i druge ćelije uključene su u odgovor na infekciju. To su bazofili koji mogu da napuste krv i udju u inficirano tkivo, zatim mastociti koji su nepokretni, i nalaze se ispod epitelijalnih površina na mestima mogućeg ulaza mikroorganizama u tkiva. Mastociti i bazofili oslobadjaju različite supstance, npr. histamin, heparin, koji dovode do inflamacije ili aktiviraju druge mehanizme kao npr. kontrakciju glatke muskulature u plućima. Pored neutrofila i bazofila, postoje i eozinofili čiji broj raste prilikom infekcije parazitima. Takodje se registruje njihov porast pri alergijskim rekacijama. U krvi postoje i tzv. NK ćelije (natural killer cells) koje pripadaju limfocitima, a prepoznaju tumorozne i virusima-zaražene ćelije.

Sl. 123. Fagocitoza bakterijske ćelije od strane makrofaga

Plazama proteini i interleukini

U krvi postoje grupa od oko 20 proteina koji su označeni kao sistem komplemenata i u odsustvu infekcije cirkulišu u krvi u inaktivnom stanju. Komplementi se mogu aktivirati u sklopu prirodnog, kao i stečenog imuniteta. Neki se vezuju za membranu bakterijske ćelije izazivajući lizu ćelije. Takodje, stimulišu makrofage da fagocitiraju bakterijsku ćeliju. Privlače ćelije imunog sistema na mesto infekcije i podstiču inflamaciju.

Interferoni. Proteini koje produkuje većina ćelija. Pri virusnoj infekciji, interferoni se vezuju za susedne nenapadnute ćelije i stimulišu sintezu antivirusnog proteina koji blokira umnožavanje virusa u tim ćelijama. Deluju i protiv nekih tumora.

Interleukini i drugi citokini. Limfociti, makrofagi i druge ćelije sekretuju ogroman broj hemijskih medijatora (signalnih molekula) proteinske prirode (peptidi, polipeptidi), koji su neophodni za formiranje imunog odgovora i u slučaju prirodnog, a takodje i stečenog imuniteta. Interleukini su citokini čija je primarna struktura poznata. Funkcije: aktivacija odredjenih ćelija imunog sistema u smislu proliferacije, sekrecije sopstvenih interleukina, diferencijacije, sinteze antitela (B limfociti), blokada nekih funkcija ciljne ćelije itd.

99


Inflamatorni odgovor

Inflamatorni odgovor predstavlja kompleksnu sekvencu dogadjaja koja uključuje gore navedene ćelije i njihove produkte (Šema 1, Sl. 124). Bakterije, ili oštećeno tkivo, izazivaju oslobadjanje ili aktivaciju hemijskih medijatora (histamin, prostaglandini, leukotrieni, sistem komplemenata, kinini itd.), što dovodi do vazodilatacije, kretanja fagocita, povećane vaskularne propustljivosti. Komplementi pojačavaju inflamatorni odgovor i privlače dodatne fagocite. Proces oslobadjanja hemijskih medijatora i privlačenja fagocita traje dok se ne unište bakterije. Inflamacija može da bude lokalna ili sistemska. Simptomi lokalne inflamacije su crvenilo, oticanje, toplota, bol, gubitak funkcije tkiva gde se inflamacija dogadja. U sistemskoj inflamaciji, pored lokalnih simptoma postoje i dodatni: povećana produkcija neutrofila, pirogeni faktori oslobodjeni od strane mikroorganizama, makrofaga i neutrofila izazivaju groznicu, može doći do povećane permeabilnosti u većem delu cirkulatornog sistema, što vodi velikom gubitku tečnosti iz krvi u tkivo, a smanjenje zapremine krvi može da dovede do šoka i smrti.

Šema 1. Dijagram inflamatornog odgovora

Ulaz bakterija u tkivo⇓

Oštećenje tkiva⇓

Oslobadjanje hemijskih medijatora⇓

HemotaksijaPovećan tok krvi

⇓Povećan broj leukocita i hemijskih medijatora na mestu ozlede

⇓Fagocitoza i unistavanje bakterija

Bakterije uništene Bakterije nisu uništene⇓ ⇓

Oporavak tkiva Dodatno oslobadjanje hemijskih medijatora

100


Sl. 124. Oštećenje tkiva i aktivacija mehanizama prirodnog i stečenog imuniteta. Uočiti aktivnost mastocita, monocita-makrofaga, neutrofila, aktivaciju sistema komplemenata, kao i sekreciju

velikog broja hemijskih medijatora koji posreduju u inflamatornom odgovoru na invaziju bakterija

STEČENI IMUNITET

Stečeni imunitet predstavlja sposobnost da se prepozna, odgovori na dejstvo i zapamti odredjena organizmu strana supstanca koja se označava kao ANTIGEN.

Antigen sadrži specifične delove označene kao determinante, ili epitope, a limfociti odredjenog klona (videti kasnije) sadrže identične membranske proteine – antigene receptore koji odgovaraju datom antigenu. Antigeni su po pravilu molekuli strani organizmu. Medjutim, nekad molekuli organizma mogu da stimulišu imuni odgovor (autoimune bolesti). Tumorski antigeni nekad dovode do stimulacije imunog odgovora (to rezultira smanjenjem tumora).

Hapteni su male molekule koje imaju antigena svojstva, ali ne izazivaju imuni odgovor, sem ukoliko se ne vežu za neki veći molekul, npr. protein plazme.

Stečeni imunitet može da bude tzv. humoralni (posredovan antitelima), za koji su odgovorni B limfociti, i tkivni imunitetet, za koji su odgovorni T limfociti (Sl. 125).

Postoje dve vrste B limfocita: plazma ćelije i memorijske ćelije koje se formiraju nakon kontakta organizma sa antigenom.

101


Sl. 125. B limfociti (a), TH ćelije pomoćnice i citotoksične T ćelije

Postoji četiri vrste T limfocita: T ćelije pomoćnice (TH ćelije), efektorne T ćelije (tzv. citotoksični T limfociti), memorijske T ćelije i supresorske T ćelije koje učestvuju u regulaciji aktivnosti B i T limfocita.

Poreklo i razvoj limfocita: Klonovi B i T limfocita nastaju od matičnih ćelija u kostnoj srži tokom fetalnog razvoja i neonatalnog života (postoji i spora kontinuirana produkcija novih limfocita od matičnih ćelija i kod odraslih). Neke matične ćelije daju tzv. pre-T ćelije koje preko krvi odlaze u timus i tu se dele i transformišu u T limfocite, i pre-B ćelije koje se u fetalnoj jetri i koštanoj srži dele i transformišu u B limfocite. Nakon obrade koja se uglavnom dešava u fetalnom i neonatalnom periodu, B i T limfociti odlaze u limfne čvorove i druga tkiva. Broj različitih antigena koje mogu da prepoznaju limfociti je ekstremno velik. Ova sposobnost prepoznavanja je urodjena i razvija se bez izlaganja antigenu. Matične ćelije diferenciraju u milione različitih T i B limfocita sposobnih da prepoznaju odredjeni antigen. B i T ćelije koje odgovaraju na dati antigen sastoje se iz malih grupa identičnih limfocita koji se nazivaju klonovi. Mada svaki klon odgovara samo na odredjeni antigen, postoji tako veliki broj klonova da imuni sistem jednog organizma može da reaguje na većinu antigena.

102


Antitela

Sl. 126. Struktura antitela i formiranje kompleksa antigen-antitelo

Antitela (Sl. 126) su produkt aktivnosti plazma ćelija koje nastaju aktivacijom B limfocita. Postoji 5 klasa antitela, a sva pripadaju gama globulinskoj frakciji plazme. Pet klasa antitela su: IgM, IgA, IgG, IgD i IgE. IgG čine 80-85% od ukupnih serumskih antitela, aktiviraju komplement, olakšavaju fagocitozu mikroorganizama (opsonizaciju, zakače se za bakterijsku ćeliju i olakšavaju njenu fagocitozu od strane makrofaga), mogu da prodju placentu i tako štite fetus od infekcije, odgovorni za Rh reakciju, kao što je hemoliza kod novorodjenčeta. IgM čine 5-10%, aktiviraju komplement, i deluju kao antigen vezujući proteini na membrani B limfocita, odgovorni za transfuzijske reakcije ABO sistema krvnih grupa, često prva antitela produkovana u odgovor na infekciju. IgA se sekretuju u pljuvačci, suzama, na mukoznim membrana, tj. deluju lokalno, a javljaju se i u kolostrumu, pa štite novorodjenče. IgE su prisutni u niskoj koncentraciji 0.002% u serumu, vezuju se za mastocite i stimulišu inflamatorni odgovor. Povećava im se koncentracija prilikom infekcije nekim parazitima i kod alergije. IgD funkcionišu kao antigen vezujući receptori na membrani B limfocita.

Sl. 127. Stvaranje kompleksa antigen-antitelo

Dejstvo antitela – inaktivacija antigena, olakšava fagocitozu antigena (opsonizacija), aktivira specifične proteine – enzime u plazmi (komplemente) koji u kaskadnom procesu dovode do inflamacije, hemotaksije i lize (raspadanja) ćelija, kao i oslobadjanja inflamatornih medijatora iz mastocita (Sl. 127 i 128).

103


Sl. 128. Neutralizacija bakterijskih toksina, aktivacija komplementa i opsonizacija i fagocitoza bakterijske ćelije od strane makrofaga

Glavni histokompatibilni kompleks (MHC)

Glavni histokompatibilni kompleks predstavljaju molekuli glikoproteina koji su locirani na površinama svih ćelija i funkcionišu da razlikuju “sopstveno” od “stranog”. Npr. identični blizanci imaju identične MHC proteine. Funkcija MHC molekula je da prikažu peptide poreklom od proteinskog antigena antigen-specifičnim T limfocitima. Postoje dve klase MHC proteina: MHC I i MHC II (Sl. 129). MHC II klasa proteina prisutna je u makrofagima i drugim ćelijama koje vrše tzv. prezentaciju antigena. Naime, ove ćelije specijalizovane su da obrade antigen i da ga u kompleksu sa MHC II ugrade u svoju plazma membranu tj. omoguće njegovu “prezentaciju” TH

ćelijama. Na taj način dolazi do aktivacije TH ćelija, što je neophodan uslov za aktivaciju B limfocita. Kompleks MHC II je prisutan i u B limfocitima koji takodje obradjuju antigen, a ova obrada prethodi aktivaciji B limfocita od strane TH ćelija. MHC I klasa proteina (sadrže ih sve ćelije sa jedrom) funkcionišu “pri prezentaciji” intracelularnih antigena, npr. virusa, ili drugih agenasa koji se mogu naći u citoplazmi. Virus se razmnožava u ćeliji, a virusni proteini su strani organizmu. MHC I klasa proteina kombinuje se za virusnim proteinom-antigenom i ugradjuje se u plazma membranu date ćelije. Takav kompleks prepoznaju citotoksične T ćelije.

104


Sl. 129. Formiranje antigen-MHC II kompleksa (levo) i antigen-MHC I kompleksa (desno)

Aktivacija B limfocita

Pre izlaganja antigenu, broj limfocita u klonu je mali, nakon kontakta sa antigenom i aktivacije od strane TH ćelija, dolazi do proliferacije (deobom se povećava broj ćelija) i diferencijacije B limfocita u plazma ćelije i memorijske ćelije (Sl. 130). Plazma ćelije produkuju antitela, a memorijske pamte antigen.

Sl. 130. Obrada i formiranje klonova B limfocita u kostnoj srži (levo) i aktivacija B limfocita i formiranje plazma i memorijskih ćelija (desno) – ova faza dešava se nakon ulaska antigena u

organizam

Primarni i sekundarni odgovor. U prvom susretu sa antigenom aktivacija B limfocita zahteva period od nekoliko dana do porasta nivoa antitela u plazmi. Pri ponovnom susretu sa antigenom, sekundarni odgovor B limfocita je mnogo brži i intenzivniji, jer u njemu učestvuju memorijske ćelije (Sl. 131).

105


Sl. 131. Primarni i sekundarni odgovor. Uočiti znatno brže i povećano stvaranje antitela pri ponovnom kontaktu sa antigenom A

Aktivacija T limfocita

T limfociti učestvuju u ćelijama-posredovanom imunom odgovoru koji treba da ukloni infekciju izazvanu intracelularnim agensima. U odredjenim slučajevima mikroorganizmi fagocitirani od strane fagocita ne bivaju uništeni, nego dospevaju u citoplazmu ćelije. S druge strane, virusi koji napadnu ćeliju domaćina, razmnožavaju se koristeći genetičku mašineriju ćelije domaćina i na taj način se u citoplazmi ćelije domaćina nalaze virusne čestice. MHC I klasa proteina kombinuje se za virusnim proteinom-antigenom i ugradjuje se u plazma membranu date ćelije. Takav kompleks prepoznaju T ćelije. Pri aktivaciji T limfocita stvaraju se citotoksične T ćelije (ubijaju inficiranu ciljnu ćeliju) i memorijske ćelije (koje pamte susret sa stranim agensom).

Tolerancija prema vlastitim antigenima

Kao što je napred navedeno, odgovarajuće matične ćelije iz kosne srži tokom fetalnog razvoja daju tzv. pre-T ćelije koje preko krvi odlaze u timus i tu se dele i transformišu u T limfocite, i pre-B ćelije koje se u fetalnoj jetri i koštanoj srži dele i transformišu u B limfocite. Tokom obrade pre-T-limfocita u timusu i pre-B-limfocita u fetalnoj jetri i koštanoj srži, ove ćelije su izložene sopstvenim antigenima, tj proteinima organizma. Tada se uništavaju svi oni klonovi limfocita koji su specifični za vlastita tkiva, zbog stalne izloženosti tim antigenima. To je razlog što sopstvene proteine organizam ne prepoznaje kao strane.

U nekim slučajevima proces eliminacije klonova prema sopstvenim tkivima nije potpun i javljaju se autoimune bolesti. Pr. miastenia gravis – antitela na receptor za acetilholin u neuromuskularnoj vezi, multipla skleroza – antitela na proteine koji se nalaze u mijelinskom omotaču oko nervnih vlakana.

106


Sl. 132 Bolesti kod ljudi izazvane antitelima

Tipovi stečenog imuniteta

Postoji četiri osnovna načina formiranja stečenog imuniteta u odnosu na način kontakta sa stranim agensom i u odnosu na to da li organizam aktivno učestvuje u formiranju antitela: (a) AKTIVAN PRIRODNI IMUNITET - kontakt (slučajan) sa antigenom izaziva primarni odgovor. Pri prvom kontaktu mogu da se razviju simptomi bolesti, ali ne moraju, a razvija se otpornost na dati antigen; (b) AKTIVAN VEŠTAČKI IMUNITET – VAKCINACIJA - vakcina sadrži na neki način promenjen antigen tako da ne izaziva simptome bolesti. Prva injekcija izaziva primarni odgovor, a sledeća odgovor memorijskih ćelija, visok titar antitela i dugotrajnu protekciju; (c) PASIVAN PRIRODNI IMUNITET - majka – fetus, majčino mleko – odojče; (d) PASIVAN VEŠTAČKI IMUNITET - davanje antitela – momentalna zaštita, ali kratkotrajna.

Rana preosetljivost (hipersenzitivnost) i reakcije rane preosetljivosti (alergija, atopija)

Poremećaji koji su izazvani imunskim odgovorom nazivaju se bolesti uzrokovane preosetljivošću. Imunski odgovor na strane antigene može da bude poremećen i nekontrolisan, što dovodi do oštećenja tkiva. Postoji četiri tipa preosetljivosti. I tip preosetljivosti, ili rana preosetljivost je tip patološke reakcije koji je posledica oslobađanja signalnih molekula iz mastocita; dolazi do brze reakcije krvnih sudova i glatke muskulature zbog delovanja IgE antitela na mastocite koji oslobađaju različite citokine i druge signalne molekule, reakcija je često praćena zapaljenjem, a javlja se kod nekih osoba nakon susreta sa određenim stranim antigenima, kojima su te osobe

107


bile prethodno iizložene. Reakcije rane preosetljivosti nazivaju se i alergija ili atopija. Takve reakcije mogu da zahvate različita tkiva. Uobičajene reakcije su: polenska groznica, alergije na hranu, bronhijalna astma, anafilaksija.

Sl. 133 redosled događaja u ranoj preosetljivosti

Alergeni su supstance proteinske prirode koje predstavljaju deo naše spoljašnje sredine (prirode, stana, radnog mesta). Po svojoj prirodi su neškodljivi za čoveka, ali kod alergiji sklonih osoba (predisponiranih osoba) predstavljaju snažne aktivatore imunskog sistema i pokretači su alergijskih bolesti. Najčešći alergeni su poleni trava, korova i drveća, kućne grinje, budji i gljivice, te produkti kućnih ljubimaca (perut psa, mačke...).

U nastanku reakcije rane preosetljivosti, u odgovor na antigen (alergen) dolazi do stvaranja IgE antitela koja se vezuju za amstocite. Pri ponovnom kontaktu sa istim antigenom (alergenom) oni se vezuju za IgE antitela na mastocitima, što izaziva aktivaciju mastocita i oslobađanje različitih signalnih molekula: histamina koji izaziva širenje i povećava propustljivost malih krvnih sudova, enzima-proteaza koji mogu da oštete okolno tkivo, prostaglandina koji izazivaju širenje krvnih sudova i leukotriena koji izazivaju produženu kontrakciju glatke muskulature. Ove rekacije krvnih sudova i glatkih mišićnih ćelija mogu da nastanu u roku od nekoliko minuta od ponovnog kontakta sa alergenom. Drugi signalni molekuli mastocita su citokini koji tokom narednih nekolikon sati privlače neutrofile i eozinofile na mesto reakcije, i dolazi do zapaljenske reakcije koja se naziva reakcija kasne faze.

108


Sl. 134 Tipovi reakcije rane preosetljivosti

Reakcije na udahnute alergene kao što su proteini polena korova su npr. rinitis, gde mastociti u nazalnoj sluznici oslobađaju histamin koji izaziva povećanu sekreciju mukusa u nosu. reakcija kasne faze može da dovede do produženog zapaljenja. Kod alergije na hranu, progutani alergeni pokreću aktivaciju mastocita u zidu creva, a oslobođeni histamin povećava pokrete creva. U bronhijalnoj astmi mastociti iz bronhija izazivaju bronhokonstrikciju i opstrukciju disajnih puteva. Najteži oblik rane preosetljivosti je anafilaksija, sistemska reakcija koju karakterišu edemi u raznim tkivima i pad krvnog pritiska.

109


110

Documents

Biohemijski principi