Bioinformatika 2 10. előadás...2018.11.12. Bioinformatika 2 Proteomika -összetettebb, mint a genomika A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció

2018.11.12. Bioinformatika 2

Bioinformatika 2 − 10. előadás

Prof. Poppe László

BME Szerves Kémia és Technológia Tsz.

Bioinformatika – proteomika

Előadás és gyakorlat

Bioinformatika 22018.11.12.

Genomika vs. proteomika

A genomika módszereivel nem a tényleges fehérjéket vizsgáljuk, hanem azokat az expresszálódott

géneket, amelyek transzlációja az adott fehérjét eredményezi. A proteomika módszereivel a ténylegesen

képződött fehérjéket vizsgáljuk.

Az előző ábrán látható DNS chip az expresszálódott génekről szolgáltat információkat, így tehát csak

közvetett adatokhoz juthatunk a tényleges fehérje termékekről. A genomikai megközelítés előnye, hogy a

gének kisérletileg jobban hozzáférhetőek és egyszerűbben kezelhetőek, mint a fehérjék. Ennek

köszönhetően napjainkban a genomikai módszerek elterjedtebbek, mint a proteomikai eljárások. A

kísérleti technikák fejlődésével párhuzamosan előre jelezhető a proteomika egyre nagyobb térnyerése.

Tisztában kell lennünk azonban a genomikai megközelítés hátrányaival is. Első az, hogy egy gén

expressziós szintje nem feltétlenül felel meg a megfelelő protein magas sejtbéli koncentrációjának, holott

ez fontosabb ha a tényleges protein expresszió mértékére és az ezzel összefüggő betegségre vagyunk

kíváncsiak.

Talán még fontosabb az, hogy a fehérjék jelentős része a transzlációt követően módosul (post-

translational modifications). Ilyen módosulások a glikozilálások (összetett cukor egységek fehérje

felszínhez kötődése) és foszforilálások (foszfát egységek kötödése a fehérjéhez). Ezek a transzlációt

követő módosulások az azonos primer aminosav szekvenciával rendelkező proteinek számos eltérő

változatához vezethetnek. A genomika nem képes ezen módosulások követésére, amelyek számos

esetben alapvető fontosságűak lehetnek.


Proteomika jelentősége

A fehérjék tejes szekvenciája csak részben következtethető ki a nekik megfelelő

genetikai szekvenciából.

Sokszor fordulnak elő a transzlációt követően módosulások: pl. alternatív lánc

összekapcsolódás, N-terminális rövidülés, poszt-transzlációs módosulások (PTM). A

proteomika tehát e módosulásokat előidéző körülmények leírását is jelenti.

Mindezeken túl a fehérjék funkciója és aktivitása függ a koncentrációjuktól, még

általánosabban a környezetüktől. Előfordulhat, hogy fehérjék aktiválnak másik

fehérjéket, vagy az aktivitáshoz nem-fehérje kofaktorok vagy egyéb anyagok /

szubsztrátok kellhetnek. Fehérjék pH-függő folyamatokban a sejt egyik részéból a

másikba transzportálódhatnak, vagy a PTM folyamata a sejt állapotától függően

dinamikusan változhat, stb.


Proteomika - összetettebb, mint a genomika

A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció 1012

tartományt fog át a transzkripciós faktoroktól az albuminig.

Egy adott gén egy adott szövetben akár 20 feletti protein formában expresszálódhat: pl. a

humán plazmában az -1-antitripszinnek legalább különbözó 22 protein formája ismert.

A fehérjék fiziko-kémiai sajátságai extrém módon különbözhetnek: molekula tömegük a

néhány ezertől akár egymillió Dalton-ig terjedhet. Az oldhatóságuk, izoelektromos

pontjuk (pI) és PTM hajlamuk is igen eltérő lehet.

Az emberi szervezetben (a becsült mintegy 40 000 gén expressziós termékeként)

vélhetően előforduló fél-egy millió protein elemzése igazi kihívás mint technológiai,

mind bioinformatikai szempontból.

A vizsgálatok nagyfelbontású fehérjeelválasztási módszereket, a mintaelőkészítés / a

kísérleti módszerek és az adatbázis kezelés nagyfokú automatizálását / parallelizációját

igénylik. Igen fontosak a feljett vizualizációs technikák.


Proteomika – kölcsönhatások / módszerek

Az azonosított és jellemzett fehérjék funkcióját is meg kell határozni, ami sokszor nem

egyszerű.

A fehérjék igen gyakran protein komplexeket képezve kölcsönhatásban állnak egymással,

vagy más fontos biomolekulákkal, mint a DNS. Aktivitásuk kapcsolódhat kisebb,

molekulákkal pl. kofaktorokkal, hormonokkal történő kölcsönhatásokhoz, így tehát érthető,

hogy igen változatos kísérleti technikák lehetnek szükségesek az új diagnosztikus tesztek

kifejlesztéséhez.

A proteom amely a genom egy adott szervezet adott szövétben egy adott időben

exprimálódó proteinjeinek összességeként írható le analízise számos módszer

kombinációját igényli. A módszerek lehetnek kísérleti (wet-lab experiments) és

bioinformatikai (dry-lab experiments) eljárások. Figyelembe véve a proteomban előforduló

proteinek kémiai és fizikai komplexitását, változatos módszerek felhasználását kell

megfontolni. A következő ábra lineáris ”útvonala” a proteom elemzéséhez szükséges

”nedves” és ”száraz” lépéseket tartalmazza.


A proteomika “útvonala”

MintaElválasztás

Folt kiválasztása

Elválasztás

analízis utáni

AzonosításAdatbázisok


Profilkészítés

Azonosítás

Validálás

Gél elektroforézis

1- és 2-dimenziós elválasztások, nagy érzékenység, nagy áteresztőképesség

Proteomika területei és eszközei

Gél-mentes elválsztás jelölésekkel

Protein / peptid szinten – Többdimenziós LC – Izobár / izotóp jelölés

Tömegspektrometria (MS)

“Peptide mass fingerprint” – azonosítás

LC-MS és LC-MS/MS – azonosítás és kvantifikálás

MALDI-TOF/TOF – azonosítás és kvantifikálás

Bioinformatika

Differenciális proteinexpresszió azonosítása

Szekvencia-analízis

Biológiai funkció / relevancia elemzése

Tesztek fejlesztése

Immunoanalízis – ELISA, western blot, immunohisztokémia

MS módszerek – TMT referenciaanyagok, MRM


Proteomika - mintaelőkészítés

Elsőként a megfelelő mintát és mintaelkészítési módszert kell kiválasztani. A minta lehet a

nyers biológiai folyadék, egy sejt extraktum, előkezelt minta, stb. A minta megválasztása

alapvető fontosságú, mivel ez erősen függ az elválasztásra használni kívánt módszertől. A

minta komplexitásának mind a komponensek számát, mind az átfogott tartományok

szélességének tekintve megfelelőnek kell lennia a kiválasztott elválasztási módszerhez.


Proteomika

A minta fehérjéit el kell választani egymástól. A proteomika az 1D de még inkább a 2D

elektroforézis technikákat preferálja (1-DE) / (2-DE).


Proteomika – foltok kiválasztása

A következő lépés az elválasztás eredményének analízise gél-vizualizációs /

alakfelismerő szoftverek segítségével történik (megjelenítés, gélek összehasonlítása,

statisztikai elemzések). Ezek segítenek a szignifikáns foltok kiválasztásában.


Proteomika – vizualizációs szoftver

Melanie https://world-2dpage.expasy.org/melanie/


Proteomika – vizualizációs szoftver

Melanie https://world-2dpage.expasy.org/melanie/


Proteomika – elválasztás utáni analízis

A további elemzésekhez a kiválasztott proteineket elválasztás

utáni elemzésnek vetik alá. Ez a specifikus fehérje-sajátságok

mint az aminosav-összetétel, szekvencia információ

kísérleti meghatározásához endoproteázokkal végzett hasítási

lépést igényel.

Ezen endoproteázokkal végzett hasítások során a proteineket

tipikusan olyan enzimekkel inkubálják, melyek egy adott

aminosavat felismerve a polipeptid-láncot specifikusan

hasítják.


Proteomika – MS analízis

Ez egy rövidebb peptidekből álló ún. emésztett proteineket tartalmazó elgyet eredményez.

A standard eljárás tripszint alkalmaz és a képződőtt fragmenseket gyakran LC

elválasztást követően Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) vagy

Electrospray Ionization (ESI) MS (TOF) módszerekkel vizsgálja.


Proteomika – (Szekvencia)adatok elemzése

A tömegspektrumból meghatározott (szekvencia)adatokat a megfelelő adatbázisokkal

összevetve megtalálható a kísérletileg meghatározott és a „in-silico” emésztett protein

szekvencia-adatbázis közötti legjobb egyezés, ami felhasználható a fehérje azonosítására és

karakterizálására. (Ld. korábban: „mass fingerprinting”)

ExPASy – poszt-transzlációs módosulások

Expasy Tools: https://www.expasy.org/proteomics/post-translational_modification

2018.11.12. Bioinformatics16

17

ExPASy – MS és 2D-E adatok

Expasy Tools: http://www.expasy. org/proteomics/mass_spectrometry_and_2-DE_data

2018.11.12. Bioinformatics


Proteomika – 2DPage adatbázis

Swiss 2D Page https://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/







Documents

Bioinformatika 2 10. előadás...2018.11.12. Bioinformatika 2 Proteomika -összetettebb, mint a genomika A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció