Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler

Hücrelerin Parçalanması

• Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot)• Sonikasyon (Ultrason),• Mekanik Parçalama (Blender)• Organik çözücülerle hücre zarının

geçirgenleştirilmesi• Deterjanlarla muamele

Ultrasonla Parçalama

Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?

Mekaniksel Parçalama

Çöktürme ile kısmi saflaştırma

• Amonyum sülfat çöktürmesi• İzoelektrik çöktürme• Organik çözücülerle çöktürme• Asit ile çöktürme• Isı yoluyla çöktürme• Triton X-100 veya CHAPS ile membran

proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.

Santifüj

• Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır.

• Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.

Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine

maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.

Denge yoğunluk gradient santrifüj yöntemi

Diyaliz

• Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.

Diyaliz

• Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.

Diyaliz

• Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.

Diyaliz İşlemi ile tuzların uzaklaştırılması

Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya kadar devam eder

Jel filtrasyon kromatografisi ile de tuzlar uzaklaştırılabilir

Kromatografik Yöntemler

• Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar:– Afinite kromatografisi– İyon değişim kromatografisi– Jel filtrasyon kromatografisi

• Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır.

• Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir

• Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler.

• Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi…

• Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…

Uygulama Şekline Göre

• İnce Tabaka Kromatografisi• Kolon Kromatografisi

Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.

İnce Tabaka Kromatografisi

• Sabit Faz

Başlangıç

Hareketli Faz

More polar!

Less polar!

s olvent frontorigin mixture

s olvent front

component B

component A

origin

s olvent front

component B

component A

origin

• Rf değeri aynı şartlarda bir madde için aynıdır.

• Rf ayırt edici bir özelliktir.

A B unknown

Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz.

Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.

Kolon Kromatografisi

Principles of Separation on a column

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

Principles of Separation

• Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir.

– İyon değişim kolonu– Jel filtrasyon kolonu– Afinite kolonu– Hidrofobik etkileşme kolonu

İyon Değişim KromatografisiKolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.

Jel Filtrasyon KromatografisiŞOK! ŞOK! ŞOK!

Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.

Afinite Kroma..

Specific interactions

Afinite KromatografisiSabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.

Afinite kromatografisinde gerekirse uzatma kolu kullanılabilir

• Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi:

– HPLC– Gaz Kromatografisi

HPLCHewlett-PackardSeries 1100 HPLC

Çözücüler

Pompa

Enjektör

Kolon

Dedektör

HPLC

HPLC ŞEMA

HPLCHPLC Chromatogram of Standard 1

0.500 x 10-4 M caffeine

HPLCHPLC Chromatogram of Standard 2

1.00 x 10-4 M caffeine

HPLC

Gaz Kromatografisi

Gaz Kromatografisi

http://faculty.sdmiramar.edu/fgarces/LabMatters/Instruments/GC/Pic_AAS/PT_AA_Poster.gif

Protenleri derişikleştirmeA. Ultra Filtrasyon

Protenleri derişikleştirmeB. Liyofilizasyon

Elektroforez

1D elektroforez Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar) SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat

Poliakril Amid Jel Elktroforezi)

2D elektroforez

Elektroforezin Temeli

Dikey Elektroforez Proteinleri Ayırmada Kullanılmaktadır

Dikey Elektroforez

SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi

Elektroforezden sonra boyama yapılır

Boyamadan sonra ise yıkama yapılır

SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması

Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır

Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır

Nükleer Materyallerin Elektroforez ile Ayrılması

İzoelektrik Fokuslama

2D Elektroforez

2D Elektroforez

DNA İzolasyonu

Malzemeler1. Lizis solüsyonu

0.5 M Tris-HCl pH 8.0,20 mM EDTA10 mM NaCl1% SDS0.5 mg/mL proteinase K

2. Doygun NaCl (6M)3. Etanol (%96, %70)

DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları

• Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir.

• 1 mL doygun NaCL eklenir.• Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.• 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.• Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant

yeni bir tüpe aktarılır.• Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol

eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.

DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları

• Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır.• Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol

fazı atılır.• %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir.

Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.

• DNA havada kurutulur.• Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10

dakika tutulur.• Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı

ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

• Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA

Sandviç ELISA