cay khang con trung

PHẦN V

CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

Phần V: CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT 345

CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn UyểnPhòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã vàđang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có lợi vào thựcvật để tạo ra những cây trồng có tính trạng mà chúng ta mong muốn.

Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại. Cácnhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào câytrồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại. Cây trồng mang gen khángsâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến câytrồng. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộLepidoptera, Coleoptera và Diptera. Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển genBt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiệncó hiệu quả trong thực vật. Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụngsúng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bịnày thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương phápđược lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens còn cócác ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có đư ợc.

Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúcvector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen BtcryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute ofTropical Biology).

Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày k ết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sửdụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọtchuyển gen.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Cấu trúc plasmid mới Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 được sử dụng để chuyển gen. Chuẩn E. coli DH5: được dùng làm vi khuẩn có khả năng biến nạp.

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007346

Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi. cryIA(c).

2. Chuyển gen vào cây

Vật liệu và dòng vi khuẩn: Cây trong ống nghiệm được dùng làm vật liệu chuyển gen.Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITBmang gen cryIA(c), gen bar và gen gusA.

Phương pháp chuyển gen vào cây hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn Atđược lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môitrường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 10mg/l BA) có bổ sungchất acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằngdung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lásang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT và 500mg/l cefotaxime. Cấytruyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ượccấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4mg/l PPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ratrồng ở vườn ươm.

Phương pháp chuyển gen vào cây cải ngọt (Brassica integrifolia L.): Lá mầm vớicuống lá dài 1-2mm của cây con từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi được sử dụng làm mẫuchuyển gen. Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầmđược nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/lBA và 3,3mg/l AgNO3) trong hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM).Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime trong thờigian 30 phút, chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa chất chọn lọcPPT và 500mg/l cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 4-5tuần, mẫu có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường ra rễ (môi trường MS có0,1mg/l NAA và 6mg/l PPT).

Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen:

Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh láchồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37C, mẫu chuyển gen sẽ có màuxanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.

PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuyên biệt, quytrình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983).

Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năngkháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa pétri.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Cấu trúc plasmid mới

Việc gắn gen cryIA(b) và cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid mới nhưsau:


Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar. Có 14enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghépcác đoạn gen mong muốn. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạnHind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.

Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở haiđầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạnHind III. Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.

Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện dicho kết quả: với plasmid pCAMBIA đã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và đượcxử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau. C òn plasmidpUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lạicủa plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA.

Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v à đoạn gen cryIA 4kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 oC trong thời gian 16 giờ. Kết quả đã tạo được2 plasmid mới dài khoảng 16 kb.

Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạpE.coli, nhân bản E. coli và tách chiết ADN. Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắtcho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb v à 1 đoạn 4 kb(xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tênlà plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa 3 gen và được chuyển vàodòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105.

Chuyển gen vào cây hông:Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng

độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy tr ìmàu xanh nhưng không h ình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% h ình thành mô sẹovà một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy. S au giai đoạn chọn lọc này cácchồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT. Và chỉ có vài dòngcây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen. Kết quả quátrình chuyển gen được thể hiện như sau:

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/lPPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng

Thínghiệm

Số mẫulá

Số mẫu látạo mô

sẹo

Số mẫu látái sinh

chồi

Số lượngdòng cây

chuyển gen

Tần số chuyển gen(%)

Chuyểngen

580 52 21 5 0,8

Đối chứng 30 0 0 0 0

Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi cấy cây hông giả địnhchuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l đểthử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết hoàn toàn, trong khi các câychuyển gen vẫn tiếp phát triển và ra rễ, giúp chúng tôi khẳng định đây là những cây hông đãđược chuyển gen.


Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển genđã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanhchàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.

Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏđã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhiên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tạiổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiênngoài vườn ươm. Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên các cây đối chứng vàcây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm. Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gentiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dướinhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần nữa đây là những câyhông đã nhận được gen chuyển.

Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCRvới cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khichạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tínhplasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàntoàn không có băng. Qua đó chúng tôi khẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễmsắc thể của cây chuyển gen. Sau đó các cây hông chuyển gen được chuyển ra trồng trong vườnươm. Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ được đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothisarmigera. Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt,trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6.

Chuyển gen vào cây cải ngọt:

Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lámầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm vào dịch vi khuẩnđể lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trường có bổ sung 100 µMAcetosyringone và sau khi rửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh h ình thành và chúng được cấytruyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây.Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ 80-120 mẫu/lần. Kết quả được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Tỷ lệ tái sinh chồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm đượcnhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng

Thí nghiệm Số lá mầmthí nghiệm

Số lá mầmtạo mô sẹo

Số lá mầmtái sinh chồi

Số lượng dòng câygiả định chuyển gen

Tần sốchuyển gen (%)

Chuyển gen 1380 52(3,7%)

21( 1,5%)

2 0,14

Đối chứng 30 0 0 0 0

Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc4mg/l PPT để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ởmức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau,theo chúng tôi đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong quá trình chuyển


gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%). Chúng tôi cho rằng khichuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá cókhả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cóthể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh này, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉcó thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duynhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen. Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phântích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giảđịnh chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giốngnhư mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c)trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng.

KẾT LUẬNVới việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB

để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển genmang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tửvà sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cảingọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt.

Plasmid ITB (lane 2 và 3 manggen cryIA(b) và cryIA(c)

Phân tích PCR gen cryIA(c) ởcây hông chuyển gen (băng

DNA 0,65 kb)

Phân tích PCR gen cryIA(c) ởcây cải ngọt chuyển gen (băng

DNA 0,65 kb)

Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triểntrên môi trường chọn lọc PPT

Cây hông giả định chuyển gen phát triểntrên môi trường chọn lọc PPT


LỜI CÁM ƠNCác tác giả xin chân thành cám ơn Chương tr ình KC-04-13, Chương trình nghiên

cứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Tạo cây hông (Paulownia

fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1088-1090.

2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnhhưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiêncứu tạo cây cải ngọt chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc“Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, HàNội, 3/11/2005, tr. 1194-1197.

3. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Khảo sátkhả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụmầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa họctoàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học YHà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr. 498-500.

4. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, 2003. Nghiên cứu hệ thống táisinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo câychuyển gen. Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc,Hà Nội, 16-17/12/2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 866-869.

5. Murashige, T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497.

6. Pua, E. C., Barfield D. G., 1991. Gene transfer in plants of Brassica juncea usingAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Reports 10: 308-314.

SUMMARYConstruction of plasmid vector and utilization for production

of transgenic plants resistant to insect via Agrobacteriumtumefaciens

Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van UyenInstitute of Tropical Biology

New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar,cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacteriumtumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation. Manytransgenic lines of both plant cultivars were obtained. PCR analyses and indigogenicGUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c)and gusA genes. Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistanceagainst Heliothis armigera.


TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎVÀ CÔN TRÙNG

Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu HổPhòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một trong những yếu tố làm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay lànhững tác hại do sâu bệnh gây ra và việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễmmôi trường ngày càng nghiêm trọng. Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông quasự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường. Một trongnhững ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những câytrồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh. Trong các loại côntrùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làmcây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng nhưvirus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá...

Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó kết quảchuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản,phù hợp với ý muốn của các nhà công nghệ gen.

Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar(gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyểnplasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khuẩnbiến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v à côn trùng.


1. Vật liệu

Vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBluescript SK +-GNA mang cassette gen nguyênvẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna)+ Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb.

Chủng vi khuẩn E. coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừcỏ) và gusA (gen chỉ thị). Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E. coli(Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu). Enzymenày xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không m àu) để tạo thành


sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết. Glucuronide th ường dùnggọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide.Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S.hygroscopicus . Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase(PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết câytrồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây. Vì vậy, ngoài tácdụng chọn lọc trong quá tr ình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai tròkháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp.

Chủng vi khuẩn E. coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số lượngbản sao các plasmid.

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới. Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử

dụng trong nuôi cấy và biến nạp. Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4.

2. Phương phápa. Cấu trúc các plasmid mới

Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook và ctv.(1989). Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 14 0C trong thời gian 3-4g. Biếnnạp E. coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 420C trong 2phút. Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biếnnạp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) vàstreptomycin (25mg/l). Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside)50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổsung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, chophép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng. Ph ương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạcđể kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega.

b. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng

Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng Kutsaga 326. Lá cây thuốc lá trong ống nghiệmđược cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen.

Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ượcnuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 1mg/lBA) trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/ltrong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi trường tái sinh tạo chồi có 10mg/lPPT và 500mg/l Cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần / lần trên cùng loại môi trường. Sau 6tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường ra rễ có chứa 20 mg/lPPT. Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm.

Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen

Khảo sát khả năng phát triển và ra rễ của cây chuyển gen và cây đối chứng in vitrotrên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT.


Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá v àchồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 370C, mẫu chuyển gen sẽ có màuxanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu.

Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồichuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCTC-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’. Kíchthước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR đ ược mong đợi là0,47 kb.

Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tích PCR với các cặp mồi nhưsau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTCGGT GAC GG 3’. Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNAđược khuếch đại là 0,5 kb.

Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l)có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ.


1. Cấu trúc plasmid mới

Trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồmPromoter Ubiquitin (Ubi) + Trình t ự mã hoá protein GNA (gen gna) + TerminatorNopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb nằm trên plasmid Bluescript SK+được cắt bởi hai enzym giới hạn Kpn I v à Sac I. Cassette này sẽ được chèn vào vị tríLac Z alpha (trong vùng T-DNA, cũng được cắt bởi Kpn I và Sac I) ở plasmidpCAMBIA 3301.

Tiếp theo chạy điện di trên gel agarose 0,8% kết quả điện di sau khi cắt bởi 2enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+ -GNA được cắt làm hai đoạn, đoạn khoảnggần 4 kb là nguyên cassette chứa gen gna còn plasmid pCAMBIA ch ỉ có 1 đoạn khoảng12 kb. Tách và làm sạch đoạn cassette và plasmid backbone trước khi đưa vào nối kết(ligation).

Phản ứng nối kết giữa gen gna và vector pCAMBIA bằng enzym ligase T4 ở 14 oCtrong 3 giờ. Sau đó các sản phẩm trên được biến nạp vào E. coli DH5 khả biến trongmôi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37 oC qua đêm. Kết quả cho thấytrên các đĩa đối chứng (biếp nạp không có plasmid), các tế b ào E. coli DH5 do khôngđược bổ sung plasmid khi thực hiện biến nạp n ên không có khả năng kháng Kanamycin,do vậy chúng không sinh trưởng được trên môi trường LB có bổ sung kanamycin.Ngược lại, các thể được biến nạp mang plasmid mới phát triển đ ược trên môi trườngchọn lọc này chứng tỏ chúng chính là các thể mong muốn. Bên cạnh đó, môi trườngchọn lọc có bổ sung X-gal, dựa trên nguyên tắc sàng lọc, các khuẩn lạc trắng trên đĩabiến nạp sẽ được sơ chọn để nhân bản plasmid mới. Để xác định kết quả, chúng tôi lấy


một số khuẩn lạc màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng có 50mg/l kháng sinhkanamycin, nuôi lắc qua đêm ở 370C. Sau khi tách DNA plasmid, ti ến hành xử lý 2enzym SacI và KpnI cho plasmid m ới và pCAMBIA. Kết quả xử lý enzym, chạy điện ditrên gel 0,8% cho thấy plasmid mới chứa 2 đoạn DNA: một đoạn 12 kb (t ương ứngpCAMBIA 3301 backbone) và m ột đoạn kích thước khoảng gần 4 kb (tương ứngcassette chứa gen gna); cho thấy plasmid đ ã được hình thành có kích thước khoảng gần16 kb. Như vậy có thể khẳng định gen mục ti êu đã được lắp ghép thành công và plasmidmới đã được nhân bản trong E. coli, plasmid này được ký hiệu là p3301-GNA. Sau đóchúng tôi đã tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang plasmid n ày.

2. Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng

Trên môi trường có PPT nồng độ 10mg/l, các mảnh lá đối chứng bị mất màu màuxanh sau 2-3 tuần. Ngược lại, một số mảnh lá đã xử lý vi khuẩn chuyển gen vẫn c ònmàu xanh và hình thành dần các cụm mô sẹo và chồi nhỏ. Sau 6 tuần chọn lọc, các chồinày được chuyển sang môi trường ra rễ có 20mg/l PPT. Chồi thuốc lá qua xử lý chuyểngen vẫn tiếp tục phát triển và ra rễ. Trong khi đó ở thí nghiệm đối chứng, chồi từ mô lákhông xử lý chuyển gen trên môi trường ra rễ chứa 20mg/l PPT dần dần vàng và chếttrong 2-3 tuần. Do đó chúng tôi cho rằng những chồi v à cây phát triển trên môi trường20 mg/l PPT là những cá thể giả định chuyển gen. Qua thí nghiệm chuyển gen, cây sinhtrưởng tốt trên môi trường có 20mg/l PPT có sự biểu hiện của gen gusA, lá của các câynày có màu xanh đặc trưng.

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi của cá c mảnh lá trên môi trường có 20mg/l PPT sau khinhiễm với Agrobacterium và mẫu lá đối chứng

Thí nghiệm Số mẫu lá thửnghiệm

Số lượng mẫu lá tái sinhchồi

Tần số chuyển gen( %)

Chuyển gen 120 11 9,16Đối chứng 20 0 0

Kiểm tra sự hiện diện của gen mục ti êu gna trong cây thuốc lá chuyển gen: Phảnứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen gna. Đối chứng dương làplasmid pUbi-GNA và đối chứng âm là DNA bộ gen tách chiết từ nhiễm sắc thể của câykhông được chuyển gen. Kết quả cho thấy ở các dòng cây giả định chuyển gen có sựhiện diện của vạch DNA mong đợi có kích th ước bằng với kích thước của vạch đốichứng dương tính là 0,47 kb (so với thang chuẩn). Không thấy vạch này ở trường hợpcây thuốc lá đối chứng. Kết quả n ày chứng minh gen mục tiêu gna từ plasmid của vikhuẩn Agrobacterium đã được chuyển và sáp nhập vào bộ gen của cây.

Sự hiện diện của gen bar và khả năng kháng thuốc trừ cỏ Basta: Kết quả phân tíchPCR cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen xuất hiện băng DNA với kích thướckhoảng 0,50 kb là kết quả của việc khuếch đại gen bar. Do đó, chúng tôi có thể khẳngđịnh bước đầu gen bar đã được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây. Sau khi trồng tại


vườn ươm khoảng 30 ngày, các cây thuốc lá đối chứng đã được kiểm tra khả năngchống chịu với thuốc trừ cỏ Basta bằng cách phun thuốc với các n ồng độ 4 g/l PPT. Sau14 ngày, tất cả cây thuốc lá đối chứng đều bị chết ở nồng độ nói tr ên nên chúng tôi đãchọn nồng độ 4g/l PPT để xử lý số cây thuốc lá chuyển gen. Sau 14 ng ày, cây thuốc láchuyển gen vẫn tiếp tục sinh trưởng bình thường.

KẾT LUẬN

Như vậy bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đ ã tạo được chủngAgrobacterium tumefaciens mang gen bar, gen gna và gen gusA. Sau đó đã sử dụng vikhuẩn này để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gnakháng côn trùng chích hút.

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh vàTrung tâm phát triển KHCN Trẻ - Thành Đoàn Tp Hồ Chí Minh đã tài trợ cho nghiêncứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Gleave A. P., 1992. A versatile binary vector syste m with a T-DNA organisationalstructure conductive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome.Plant Molecular Biology 20: 1203 -1207.

2. Hilder V. A., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A., Van Damme E., Boulter D., 1995.Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic tobacco plants results in addedprotection against aphids. Transgenic Research 4: 18 -25.

3. Kumar K. K., Sudhakar D., Raija J. A., Balasubramanian P., 1999. Engineeringresistance in elite indica rices to major diseases through Agr obacterium -mediatedtransformation.General Meeting of The International Program on RiceBiotechnology, September, 1999, Phuket, Thailand.

4. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.Ư

5. Rao K. V., Christou P., Gatehouse M. R., Gatehouse J. A, 1998. Expression ofsnowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brownplanthopper. Plant Journal 15(4): 469 -477.

6. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989. Molecular Cloning - A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.


SUMMARYProduction of transgenic tobacco plants ( Nicotiana tabacum

L.) resistant to insect and Basta R herbicide via Agrobacteriumtumefaciens

Pham Thi Hanh, Phan Tuong Loc, Le Ta n Duc, Nguyen Huu Ho

Institute of Tropical Biology

Intact gna gene cassette was collected from the plasmid pBluescript SK + byrestriction enzymes KpnI và SacI and inserted in Lac Z alpha region on T-DNA of theplasmid pCAMBIA 3301. Consequently, newly for med plasmid was introduced intocompetent E. coli and Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (for transformation). Afterco-cultivation, tobacco leaf disks were cultured on selection medium containing 10 mg/lPPT (Phosphinothricin). Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna,herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacteriumtumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA. PCR analyses andindigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presence and the expression ofgna, bar and gusA genes.


.

Hình 1. Ảnh điện di củaplasmid pCAMBIA 3301-

GNA (1) và pCAMBIA3301 (2)

Hình 2, 3: Kết quả phân tích PCR gen bar (h. 2) v à gna(h. 3) ở cây thuốc lá chuyển gen. L: thang DNA 1 kb,PC: đối chứng dương tính, NC: đối chứng âm tính,

1,2,3,4: cây chuyển gen

Hình 4: Cây thuốc lá chuyểngen và đối chứng trên môitrường chứa 20 mg/l PPT

Hình 5: Chồi cây thuốc láchuyển gen biểu hiệngen gusA qua ngâm

trong dung dịch X-gluc

Hình 6: Cây thuốc lá chuyểngen và đối chứng sau khi

phun dung dịch Basta


NGHIÊN CỨU TÁI SINH in vitro VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂNTÍCH CÂY CÚC Dendranthema grandiflorum L. MANG

GEN ipt tạo cytokinin

Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí,Nguyễn Thị Thanh

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Trong ngành trồng hoa thương mại, một trong các vấn đề được quan tâm nhiều nhấtlà nghiên cứu giữ cho cây hoa nói chung v à hoa cắt cành nói riêng sao cho lâu tàn. Cácnhà sản xuất và kinh doanh hoa cảnh đã sử dụng một số tác nhân làm cho hoa được tươilâu như dung dịch chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) cytokinin (dihydrozeatin hoặcbenzyladenin), dung d ịch đường, dung dịch sát khuẩn,,, để xử lý hoa cắt cành hoặc xử lýđối với cả cây hoa.

Cây hoa cúc là đối tượng cây hoa có nhu cầu tiêu thụ rất cao vì có hoa đẹp, đa dạng,nhiều màu sắc nhưng thời gian bền tươi của hoa cắt cành không dài nhất là khi đưa vàotiêu thụ giống cúc ôn đới hoặc trưng bày, bảo quản hoa trong điều kiện không thích hợpnên nghiên cứu làm tăng độ bền tươi của cây hoa này là vấn đề cần được quan tâm.

Như chúng ta đã biết, các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, gibberellin, ethylen,acid abscisic, cytokinin có ý nghĩa rất lớn trong việc điều ho à sự lão hoá. Trong cácnhóm chất nêu trên, cytokinin chiếm vai trò quan trọng [5,9,10,11]. Trong công nghệnuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rất rõ rệt trong việc giữ cho mô lá táchrời chậm thoái hoá d iệp lục tố - được xanh tươi lâu. Trong thực tiễn công tác giống câytrồng, việc xử lý cytokinin, liên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch vàkéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa thương mại rất cao.

Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển gen nạp ipt (mã hoá enzymisopentenyl transferase có liên quan đ ến sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin,zeatin và dihydrozeatin) vào cây tr ồng mục đích làm mô tế bào của chúng tự sản xuấtcytokinin. Thực tế nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng, ở một số trường hợpnhư cây thuốc lá [25], Petunia [5,10] cây bông cải [11], cây cải xà lách [13,14] kể cảcây cúc [8,9,10]…, tác dụng của cytokinin nội sinh (sản phẩm của gen đ ược chuyểnnạp) đối với tuổi thọ của lá và hoa của cây chuyển nạp gen là rất có ý nghĩa. Để tránh sựtạo dư thừa (overproduction) cytokinin gây thay đồi h ình dạng cây, các nhà khoa học đãsử dụng một số loại promoter khác nhau tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc


thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi môđi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.

Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à côngnghệ gen, chúng tôi nghiên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây hoa cúcDendranthema morifolium L. Với hy vọng sự hiện diện và biểu hiện của gen ipt nói trênsẽ có tác dụng góp phần làm cho cây hoa lâu héo tàn.


Giống lan: Sử dụng giống cúc đại đoá Đà Lạt có hoa màu vàng.

Phương pháp

Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin

1. Môi trường nuôi cây: MS (Murashige -Skoog, 1962) [15 ] không chất điều hoà sinhtrưởng (ĐHST).

2. Môi trường tái sinh chồi: MS có các chất ĐHST NAA , BA với các nồng độ khácnhau.

3. Môi trường vươn chồi tạo cây và ra rễ: như môi trường số 1.

4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.

Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 25-28 oC.

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmidpVDH396 (kích thước 15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (cónguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl t ransferase[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gengusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoterCaMV35S).

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhângiống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắc qua đêm trong môitrường khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệtđộ nuôi cấy: 25 - 280C.

Quy trình chuyển gen

Các mảnh lá với kích thước 0,6 x 0,6cm, từ cây in vitro trên môi trường MS khôngchất điều hoà sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.

Tóm tắt quy trình chuyển gen1. Nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có 0,5mg/l NAA và 1mg/l BA trong thời gian 2

ngày.


2. Gây nhiễm các mảnh lá với vi khuẩn trong thời gia n 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớtdịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.

3. Nuôi chung mảnh lá với vi khuẩn trong 2 ng ày. Sử dụng môi trường như trênnhưng có acetosyringone 100 M.

4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kếthợp lắc nhẹ).

5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường chọn lọc: như môitrường ở bước 1 của quy trình nhưng có bổ sung 10 mg/l hygromycin, 500mg/lcefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày / chu kỳ chọn lọc và thực hiện 2 chu kỳ.

6. Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc thêm 3 chu kỳ (15 ngày/chu kỳ) trên môi trườngchọn lọc như trên nhưng có 5mg/l hygromycin đến khi có chồi tái sinh.

7. Cấy truyền các chồi / cụm chồi tái sinh (cao khoảng 1 cm) sang môi trường MSkhông chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời giannuôi khoảng 1 tháng.

Kiểm tra cây chuyển gen

1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền cũng sang môi trường MSkhông chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi sự vươn chồi và ra rễ trongthời gian khoảng 20 ngày.

2. Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở370C (tủ ấm).

3. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặpmồi đặc hiệu.

Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:TACTTCTACACAGCCATC; chương trình nhiệt: 940C: 5 phút; 35 chu kỳ (940C: 1phút, 620C: 1 phút, 720C: 1 phút); 720C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.

Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 940C: 3 phút; 30 chu kỳ (940C:30 giây, 560C: 45 giây, 720C: 1 phút); 720C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .

Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương tr ình nhiệt: 900C:10 phút; 40 chu kỳ (940C: 15giây, 450C: 45 giây, 720C: 50 giây); 720C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNa. Tính chống chịu tự nhiên của mô lá đối với hygromycinTheo một số tài liệu công bố về chuyển nạp gen qua sử dụng tác nhân chọn lọc l à

hygromycin thì cây cúc là đối tượng rất mẫn cảm đối với tác nhân chọn lọc n ày. Quatriển khai thử nghiệm tính chống chịu đối với hygromycin d ùng vật liệu là mảnh lá vàcây con in vitro, kết quả cho thấy các mảnh lá (kích thước 0,6 x 0,6cm) và cây con (cao


khoảng 1,5 - 2cm) đều bị chết nâu trên môi trường MS không chất sinh trưởng có10mg/l hygromycin. Trên môi trường có nồng độ 5mg/l hygromycin, ở mảnh lá có sựhình thành mô sẹo nhưng mô sẹo đen dần và không có khả năng tái sinh chồi, và nếu cósự tái sinh chồi xảy ra th ì chồi rất yếu ớt, xanh nhạt; đối với thử nghiệm tr ên cây con thìcây tuy cũng có sự phát triển nhất định nh ưng chậm, rễ ra ngắn và có màu nâu đen, cáclá gần gốc ở trạng thái héo nâu, rũ.

Kết hợp thử nghiệm riêng trên giống cúc thí nghiệm và theo tài liệu đã công bố,chúng tôi chọn nồng độ hygromycin 10mg/l để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giai đoạnđầu (1 - 2 chu kỳ) qua sử dụng phiến lá (không mang phần cuống) l àm vật liệu xử lýchuyển gen. Tuy vậy, chúng tôi cũng quan tâm cân đối việc gia giảm nồng độ tác nhânchọn lọc này để đảm bảo vừa có sự tái sinh ở mức t ương đối chấp nhận được vừa khôngbị lúng túng do việc tái sinh nhiều cây không phải l à cây chuyển gen. Cũng qua thực tếtriển khai thử nghiệm này trên giống cúc đại đoá vàng Đồng Tháp (giống chịu nhiệt) th ìgiống này lại tỏ ra ít mẫn cảm hơn giống cúc nói trên (số liệu cá nhân).

b. Nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh cây phục vụ nghi ên cứu chuyển genNói chung, trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen thì việc quan tâm trạng

thái sinh lý của lá là yêu cầu quan trọng. Tuy giống cúc n ày phát triển rất tốt trong bìnhnuôi cấy, lá xanh đậm và to tạo thuận lợi cho việc lấy mẫu nh ưng theo kinh nghiệmnghiên cứu thì việc lấy các lá không ở vị trí ngọn cũng nh ư gần gốc là điều cần thiếtnhất là đối với nghiên cứu chuyển gen. Điều này rất rõ đối với nghiên cứu nuôi cấy môvà chuyển gen đối với cây hoa cát tường (tài liệu cá nhân).

Chúng tôi đã bố trí một số môi trường thí nghiệm tái sinh trên cơ sở khoáng MS vớicác nồng độ NAA 0,1; 0,5 và 1mg/l kết hợp với BA 1 và 2mg/l. Kết quả cho thấy, nóichung, khi NAA cao (0,5; 1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l thì sự tái sinh chồi xảyra theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) [22] thông qua giai đo ạn trung gian làmô sẹo. Ngược lại, khi nồng độ NAA thấp h ơn (0,1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2mg/l,nhất là khi dùng 2mg/l, thì sự tái sinh chồi xảy ra ít qua giai đoạn mô sẹo, một số chồicó vẻ hình thành trực tiếp từ mảnh lá [20,22,23]. Đặc biệt, sự hình thành trực tiếp này làthường theo kiểu sinh phôi sô-ma [19], xảy ra nhiều khi chỉ dùng BA từ 1 - 2mg/l màkhông bổ sung NAA (số liệu cá nhân).

Theo một số tác giả nước ngoài nghiên cứu chuyển gen trên cây cúc, sự tái sinhtheo dạng trực tiếp này không có lợi cho nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôiphù hợp ý kiến nêu trên. Về vấn đề này, thực tế nghiên cứu cho thấy khả năng nhậnđược cây chuyển gen sẽ cao hơn khi điều chỉnh sự tái sinh thông qua mô sẹo v ì theochúng tôi tế bào chuyển gen, trước hết, cần được nhân lên và như vậy sẽ tạo cơ hội caocho sự tái sinh cây mang gen chuyển. Nói chung, hiện nay tr ên thế giới, nghiên cứu nuôicấy mô phục vụ nhân giống [2], sự phát sinh h ình thái [4,8, 20,22,26] và phục vụchuyển nạp gen [17,18] đã và đang được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều ở đốitượng cây trồng này.

c. Quy trình chuyển gen

Như đã nói ở trên do tính rất mẫn cảm với hygromycin nên chúng tôi, như đã trìnhbày trong phần quy trình chuyển gen, sự chọn lọc được thực hiện ở giai đoạn đầu với


10mg/l hygromycin, sau đó giảm xuống còn 5mg/l nhằm tạo cơ hội cho sự tái sinh.Cách làm này của chúng tôi phù hợp với cách thực hiện của một số tác giả nước ngoàivì theo các tác giả ấy, trên giống cúc cụ thể ở công bố, th ì sự tái sinh không thể xảy radù đã có sự chuyển nạp gen (gen hph).

Cũng do quá mẫn cảm đối với hygromycin n ên quá trình chọn lọc tế bào chuyểngen từ sau xử lý vi khuẩn đến khi nhận được cây thì khá dài. Điều này là do trên môitrường có hygromycin tế bào tăng sinh chậm và cây khi đã có đầy đủ thân lá phát triểncũng rất chậm. Và thực tế cũng cho thấy khi đã là cây chuyển gen nhưng chúng cũngphát triển khá chậm trên môi trường có nồng độ hygromycin dù không phải ở mức quácao (5mg/l). Theo chúng tôi, đây là đi ểm đáp ứng đặc thù của các giống cúc khi sử dụngtác nhân chọn lọc là hygromycin. Qua quá trình chuyển gen, chúng tôi đã nhận được 3dòng chồi có khả năng vươn cao thành cây. Chúng được kiểm tra về khả năng sinhtrưởng, ra rễ trên môi trường có hygromycin sẽ được trình bày dưới dây.

Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học dùng nhiều phương pháp khác nhau [3, 6,12, 16, 17, 21, 23, 24, 27] để chuyển một số gen khác nhau nhằm tạo ra các đặc tínhmới cho cây cúc như cây chậm lão hoá [5, 9, 10, 13], tạo hoa có màu sắc mới lạ, khángvirus [27].

d. Kiểm tra khả năng ra rễ trên môi trường có hygromycin

Các cây vươn cao từ 2cm trở lên được cấy sang môi trường MS không chất sinhtrưởng có 5mg/l hygromycin để theo dõi sự sinh trưởng tiếp theo. So sánh với câyđối chứng, sự sinh trưởng tiếp tục với biểu hiện k èm theo là có sự hình thành rễ làhai hiện tượng xảy ra đồng thời đối với cây thực sự l à cây chuyển gen; ngược lại,cây đối chứng mất hoàn toàn khả năng sinh trưởng dẫn đến sự chết sau đó tr ên cùngloại môi trường.

e. Thử GUS

Điểm gây sự chú ý ở đây là các dòng chuyển gen đều cho kết quả âm tính đối với thửnghiệm GUS. Điểm đặc biệt nữa là không chỉ riêng giống cúc này trên các dòng chuyểngen khác nhau mà đối với giống cúc khác (đại đoá vàng Đồng Tháp) tạo ra cũng bằngphương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương pháp chuyển gen khác (là bắngen) thì tất cả các dòng chuyển gen cũng đều cho kết quả âm tính (tài liệu của phòng). Theomột tài liệu nước ngoài, hiện tượng âm tính đối với thử GUS này vẫn chưa giải thích đượckhi dùng dòng vi khuẩn LBA 4404 để chuyển nạp và khi dùng promoter CAMV35S chogen gusA. Tuy nhiên, theo chúng tôi, đây ch ỉ là gen chỉ thị nên dù có biểu hiện hay không làđiều không quan trọng, chỉ có điều nó gây cho ng ười nghiên cứu ít nhiều khó khăn khimuốn kiểm tra nhanh cây chuyển gen khi ch ưa cần làm PCR.

f. Phân tich PCR các gen hph, gusA và ipt

Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đã qua giai đoạn tạo rễ và cósinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCRcác gen hph, gusA, ipt với các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băngDNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 355 bp.


KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu nuôi cấy tái sinh cây và chuyển nạp gen trên cây cúc đại đoá vàngĐà Lạt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi có một số kết luận sau:

Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp đồng thời cho việc tái sinhcây và cho nghiên cứu chuyển nạp gen (ở khía cạnh cần sự tái sinh cây thông quamô sẹo) là môi trường MS có 0,5mg/l NAA và 1mg/l BA.

Giống cúc nói trên rất mẫn cảm đối với hygromycin n ên việc chọn lọc áp lực cao(10mg/l hygromycin) ch ỉ nên được thực hiện trong 1 - 2 chu kỳ đầu, sau đó cầngiảm xuống (5 - 6mg/l hygromycin) ở giai đoạn tái sinh để có thể nhận đ ược chồitái sinh.

Đã nhận được 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA. Sự hiện diện củachúng đã được kiểm tra bằng phân tích PCR.

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ ChíMinh đã tài trợ cho nghiên cứu này.


1. Aida, R., S. Nagaya, K. Yoshida, S. Kishimoto, M. Shibata , A. Ohmiya, 2005.Efficient transgene expression in chrysanthemum, Chrysanthemum morifoliumRamat., with the promoter of a gene for tobacco elongation factor 1 protein.JARQ 39(4): 269-274.

2. Bhattacharya, P., S. Dey, N. Das, B. C. Bhattacharya, 1990. Rap id masspropagation of Chrysanthemum morifolium by callus derived from stem and leafexplants. Plant Cell Rep. 9: 439-442.

Hình hàng trên (từ trái sang phải): Phôi sô -ma, chồi hình thành trực tiếp và giántiếp từ mảnh lá

Hình hàng dưới (từ trái sang phải): Cụm chồi kháng hygromycin; phân tích PCRgen hph (800 bp), gen gusA (365 bp) và gen ipt (355 bp)

hph gusA ipt


3. Boase, M. R., J. M. Bradley, N. K. Borst, 1998. Genetic transformation mediatedby Agrobacterium tumefaciens of Florists’ chrysanthemum (Dendranthemagrandiflorum) cultivar ‘Peach Margaret’. In vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 34: 46-51.

4. Bush, R., E. D. Earle, R. W. Langhans, 1976. Plantlets from petal segments, petalepidermis and shoot tips of the periclinal chimera, Chrysanthemum morifolium‘Indianapolis”. Am. J. Bot. 63: 729-737.

5. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction ofcytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG12-IPT delays corollasenescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183.

6. De Jong, J., W. Rademaker, M. F. Van Wordragen, 1993. Restoring adventitiousshoot formation on chrysanthemum leaf explants following co -cultivation withAgrobacterium tumefaciens . Plant Cell Tiss. Org. Cult . 32: 263-270.

7. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO 6: 3901-3907.

8. Kaul, V., R. M. Miller, J. F. Hutchinson, D. Richards, 1990. Shoot regenerationfrom stem and leaf explants of Dendranthema grandiflora ‘Tzvelev’ (syn.Chrysanthemum morifolium Ramat.). Plant Cell Tiss. Org. Cult . 21: 21-30.

9. Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulatedexpression of the ipt gene increases flower number in trans genic Dendranthemagrandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.

10. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvoy, 2005.Effects of cor15a-IPT gene expression on leaf senescence in transgenic Petuniahybrida and Dendranthema grandiflorum. Plant Growth Regulation 00: [email protected] .

11. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence incauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21 st Century, IXInternational Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers,Dordrecht, The Netherlands, p. 164.

12. Ledger, S. E., S. C. Deroles, N. K. Given, 1991. Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum. Plant Cell Rep. 10: 195-199.

13. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of PSAG12-ipt gene expression on developmentand senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol., 127: 505-516.

14. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Sch epers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey,1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J.Exp. Bot. Suppl. 49: 49.

15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.

[email protected]


16. Renou, J. P., P. Brochard, R. Jalouzot, 1993. Recovery of transgenicchrysanthemum (Dendranthema grandiflorum Tzvelev) after hygromycin resistanceselection. Plant Science 89: 185-197.i1

17. Sherman, J. M., J. W. Moyer, M. E. Dau b, 1998. A regeneration andAgrobacterium-mediated transformation system for genetically diversechrysanthemum cultivars. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123: 189-194.

18. Shinoyama, H., T. Kazuma, M. Komano, Y. Nomura, T. Tsuchiya, 2002. Anefficient transformation system in Chrysanthemum [Dendranthema x grandiflorum(Ramat.) Kitamura] for stable and non -chimeric expression of foreign genes. PlantBiotechnology 19(5): 335-343.

19. Tanaka, K., Y. Kanno, S. Kudo, M. Suzuki, 2000. Somatic embryogenesis andplant regeneration in chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.)Kitamura). Plant Cell Rep. 19:945-953.

20. Teixeira da Silva, J. A., 2003. Thin cell layer technology for induced response andcontrol of rhizogenesis in chrysanthemum. Plant Growth Regulation 39: 67-76.

21. Teixeira Da Silva, J. A., S. Fukai, 2002. Increasing transient and subsequent stabletransgene expression in chrysanthemum following optimization of particlebombardment and Agroinfection parameters. Plant Biotechnology 19(4): 229 -240.

22. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Chrysanthemum organogenesis throughthin cell layer technology and plant growth regulator control. Asian Journal of PlantSciences 2(6): 505-514.

23. Teixeira da Silva, J. A., S. Fukai, 2003. Four gene introduction methods affect theshoot regeneration and localization of transgene expression in greenhouse stemexplants and in vitro-grown chrysanthemum stem thin cell layers. African Journalof Biotechnology 2(5): 114-123.

24. Urban, L. A., J. M. Sherman, J. W. Moyer, M. E. Daub, 1994. High frequencyshoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum(Dendranthema grandiflora). Plant Sci. 98: 69-79.

25. Wang, J., D. S. Letham, E. Cornish, K. R. Stevenson, 1997. Studies on cytokininsaction and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus genecontrolled by a chalcone synthase promoter: 1. Developmental features of thetransgenic plants. Aus. J. Plant Physiol. 24: 661-672.

26. Xiaohan, Y., J. Bo, Z. Yan, M. Ding, T. Xuemei, 2002. Enhancement of directshoot regeneration from internode segments of chrysanthemum by silver nitrate.Propagation of Ornamental Plants 2(1): 28-37.

27. Yepes, L. C., V. Mittak, S-Z. Pang, C. Gonsalves, J. L. Slightom, D. Gonsalves,1995. Biolistic transformation of chrysanthemum wit h the nucleocapsid gene oftomato spotted wilt virus. Plant Cell Rep. 14: 694-698.


SUMMARYIn vitro plant regeneration and transformation of

Dendranthema grandiflorum L. with the ipt gene for cytokininproduction

Nguyen Huu Ho, Le Tan Duc, Phan Tuong L oc, Pham Duc Tri, Nguyen Thi ThanhInstitute of Tropical Biology

The leaf disks of Dendranthema grandiflorum L. (0.6 x 0.6 cm) were co-cultivatedwith Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404. This Agro-strain contains theplasmid pVDH396 harbouring the ipt gene (with SAG12 promoter) for the isopentenyltransferase enzyme, the nptII gene (for kanamycin resistance) and the reporter genegusA. After 2 day co-cultivation, The leaf disks were transferred to the mediumcontaining hygromycin of 10 mg/l for sel ection. Through 4 - 5 rounds of selection, 3independent transformed plants were obtained. The presence of the hph, gusA and iptgenes was checked by the PCR analyses and / or the GUS assay [In the case of gusAgene: positive in the PCR analysis; negative for the expression of gene in the differentorgans of three in vitro transformed plant lines, in the GUS assay]. These transgenicsare being grown in the greenhouse for further studies.


MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠOvắc-xin VIÊN GAN B TỪ CÂY TRỒNG

Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Lê Tấn Đức,Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm


MỞ ĐẦU

Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bướctiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, Hàn Quốc, TrungQuốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc -xin tái tổ hợp từ cây trồng[9,10,11,15,16,17,19,20]. Hướng nghiên cứu sản xuất vắc-xin này được xem là hướngcó tiềm năng vô cùng lớn vì theo tính toán giá thành sản phẩm sẽ thấp hơn rất nhiều sovới giá thành các sản phẩm hiện dùng do có thể sản xuất ở quy mô lớn, lại khá đ ơn giảntrong khâu tổ chức sản xuất, vận chuyển v à bảo quản nguồn vắc-xin, sản phẩm khôngchứa các virus gây bệnh cho người… - tạo điều kiện thuận lợi phục vụ tiêm chủng vắc-xin mở rộng cho người dân ở các nước nghèo và các nước đang phát triển. Nêu đề tàinghiên cứu này, chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của mình, cùng với kết quảnghiên cứu theo hướng này của các nhà khoa học khác trong nước, sẽ góp phần nhấtđịnh vào sự phát triển của lĩnh vực nghi ên cứu, sản xuất vắc-xin từ các nguồn vật liệutruyền thống nói chung và vắc-xin được sản xuất từ cây trồng nói ri êng.

Như chúng ta đã biết, nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B(HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 % dân số (trên dưới 10 triệungười). Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng. Bệnh này lây lantheo hướng đa dạng và phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan vàung thư gan, thời gian chữa trị kéo dài hơn nữa chi phí điều trị còn rất cao so với thunhập. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp phòng ngừa quan trọng làchủng ngừa. Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủphác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian).

Protein HBsAg của HBV là thành phần rất quan trọng giúp cho HBV bám dính v àomàng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh và huyết tương có chứaHBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyếttương (ngoài huyết tương, vắc-xin này còn được sản xuất từ nấm men, tế b ào động vậthữu nhũ…). Đã có một số công bố khoa học liên quan đến nghiên cứu chuyển nạp genHBsAg (mã hoá protein vỏ - HBsAg), dùng công nghệ chuyển gen vào nhân và lục lạptế bào, vào một số cây trồng, sản xuất sinh khối mô tế b ào cây chuyển gen, chiết táchprotein tinh khiết và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở c ơ thể động vật qua tiêm


chích protein tinh khiết hoặc/và ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gen. Qua các nghi êncứu nêu trên, nhận thấy protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hoá cókhả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt - mở ra triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gen nàyvào các cây trồng có bộ phận ăn tươi được như quả, lá, thân, củ… Cũng qua một sốcông bố nêu trên, kết quả nghiên cứu còn có mặt hạn chế là lượng protein (sản phẩmcủa gen chuyển) trong cây chuyển gen c òn chưa cao nên trong nghiên cứu này, chúngtôi đặt vấn đề đưa hệ thống sao chép T7 của thực khuẩ n thể vào nghiên cứu ở đối tượngthực vật (vấn đề đã gây được sự quan tâm đặc biệt chỉ trong v ài năm gần đây) kết hợpvới promoter PDS tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả nhằm hướng làm tăng hàm lượngprotein kháng nguyên trong loại mô này. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen HBsAg vớipromoter PDS được nghiên cứu sự tích hợp và biểu hiện trước hết ở cây thuốc lá tuyrằng protein biểu hiện chuyên biệt ở quả cây thuốc lá không có ý nghĩa sử dụng nh ư“vắc-xin ăn được” và kết quả nghiên cứu chuyển gen này trên cây cà chua quả bi là kếtquả khoa học mang tính mới mẻ.


Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng K.326 và cà chua bi quảdài (mua ngoài chợ). Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửasạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh trưởng. Các mảnh lácây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của câymầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.

Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS(Murashige và Skoog, 1962) [13].

Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đoạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng.1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốc

lá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua).

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.

Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS. Nguyễn Hữu Tâmthiết kế) mang gen HBsAg (promot er T7, terminator T7; 0,7 kb), gen gusA (promoterT7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S). Gen HBsAgmã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS(phytoene desaturase, 2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ởquả. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gâynhiễm mô.

Quy trình chuyển gen:

Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) v à lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;nuôi 2 ngày ngoài sáng.


Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút v à nuôi chung mô và vi khuẩn trong 2ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổsung acetosyringone 100 M).

Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất + 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹ mô.

Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhânchọn lọc kanamycin 100mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20 -50mg/l (đối vớicà chua); để ngoài sáng.

Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi trường chọn lọcnhư trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con.

Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển :

Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.

Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh.

PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng cáccặp mồi đặc hiệu.Gen nptII: K1: ACACGCTGAAATCACCAGTCTC, K2:

CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khuếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút;35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút.

Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .

Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khu ếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trìnhnhiệt: 94C:10 phút; 40 chu kỳ (94C: 50 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khu ếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt:như trên. Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) c òn được kiểm tra bằng máy phân tích tựđộng Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty AgilentTechnologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ).

Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói tr ên.

Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thửđặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNChuyển gen vào cây thuốc lá:

Sau khoảng 15 ngày nuôi cấy chọn lọc trên môi trường có hygromycin, nhìn chung cácphiến lá bị mất dần màu diệp lục, đồng thời có sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ ở mép lá và


sau đó là các chồi nhỏ được tái sinh. Trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọckanamycin đúng ngưỡng (100mg/l), màu sắc tương phản của chồi tái sinh (màu xanh lụcđậm) và phiến lá (mất màu xanh) là hiện tượng rất dễ nhận biết; điều này cho thấy các chồimới hình thành rất có thể là những chồi đã mang gen chọn lọc. Khá nhiều trường hợp cónhiều hơn một chồi / cây hình thành trên 4 đường cắt (chu vi) của một mảnh lá. Sau đó, cáccây con được cấy truyền sang môi trường nuôi (môi trường 1) cũng có nồng độ kanamycinnhư trên. Ở báo cáo này, cây giả định chuyển gen (GĐCG) được định nghĩa là những cây táisinh trên môi trường tái sinh có nồng độ chọn lọc ngưỡng, có khả năng phát triển tốt rễ thân látrên môi trường nuôi cây (MS không chất sinh trưởng) với cùng nồng độ chọn lọc ngưỡng.Thực ra, các dòng cây tái sinh trên môi trường chọn lọc thường cũng có khả năng phát tiển tốtrễ thân lá trên môi trường nuôi cây chọn lọc. Tất cả các dòng cây tái sinh qua xử lý chuyểngen đều đã được kiểm tra theo cách này trước khi được đem phân tích tiếp theo.

Do thuốc lá là một đối tượng có đáp ứng khá cao đối với chuyển gen nên sau một số chukỳ chọn lọc chúng tôi đã nhận được khá nhiều dòng cây GĐCG. Theo dự kiến của chúng tôithì gen gusA (cùng với gen HBsAg) sẽ không biểu hiện ở mô sinh d ưỡng như lá, thân, rễ dochúng được điều khiển bởi promoter PDS chỉ tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả. Kết quả thửnghiệm GUS đối với các loại mô nói trên đều cho kết quả âm tính với thuốc thử X -gluc, hoàntoàn phù hợp với dự kiến. Ngược lại, phân tích PCR gen gusA cho kết quả d ương tính vớibăng DNA 365 bp.

PCR gen chọn lọc nptII và gen mục tiêu HBsAg cũng đã được thực hiện với các trình tựDNA được khuếch đại theo thứ tự là 600 bp và 680 bp (đối với cặp mồi HBV1 và HBV2)hoặc 480 bp (đối với cặp mồi HBsAg1 và HBsAg2). Sự hiện diện cũng như kích thước đoạnkhuếch đại gen HBsAg (680 bp) qua kiểm tra bằng hệ thống phân tích tự động cho kết quảkhớp với kết quả chạy điện di trên gel agarose.

Cũng bằng hệ thống phân tích tự động nêu trên, một peak protein có trọng lượng phân tửkhoảng 23 kDa được ghi nhận [trọng lượng phân tử của protein thuộc loại nhỏ (S) trong số baloại protein cấu thành protein kháng nguyên bề mặt của virus (S, preS1, preS2)]; ngược lại, ởtrường hợp đối chứng thì không có. Như chúng ta đã biết, protein kháng nguyên bề mặt S làprotein quan trọng trong tạo đáp ứng miễn dịch ở cơ thể người và động vật.

Trong nghiên cứu này, do muốn kiểm tra sự chính xác của cấu trúc plasmid, gen v à vaitrò của promoter PDS nên chúng tôi, trước hết, nghiên cứu chuyển gen này vào cây thuốc lá.Hiện chúng tôi đang cấu trúc gen HBsAg với promoter cấu trúc (constitutive) CaMV35Strong hệ thống T7 nhằm tạo biểu hiện cao ở tất cả các bộ phận của cây với hy vọng trongtương lai có thể nghiên cứu chiết tách protein kháng nguyên tinh khiết từ lá cây thuốc lá - mộtđối tượng cây trồng cho sinh khối lá rất cao tương tự như một số nghiên cứu trên thế giới[9,11,15,20]. Việc sử dụng promoter tạo biểu hiện chuyên biệt ở một bộ phận của cây tronglĩnh vực nghiên cứu tạo vắc-xin từ cây trồng cũng đã được công bố [4]. Ngoài nghiên cứu sảnxuất vắc-xin viêm gan siêu vi B, hiện nay các nhà khoa học còn đang nghiên cứu tạo vắc-xinphòng bệnh viêm gan C từ cây trồng [14].

Các cây chuyển gen đang được trồng và theo dõi ở vườn ươm đến khi ra hoa, kếtquả. Chúng tôi sẽ thực hiện một số nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của genHBsAg và gen gusA ở giai đoạn quả.


Kết quả thử nhanh bằng que thử ELISA cho thấy có sự h ình thành vạch dương tính (testline) ngoài vạch đối chứng (control line) ở cây chuyển gen. Theo công ty ClinotechDiagnostics, que thử có độ chính xác rất cao (99,8%), tính đặc hiệu tuyệt đối (100%) đối vớitất cả các subtype virus có các quyết định kháng nguy ên (determinants) phổ biến hiện nay.

Chuyển gen vào cây cà chua bi:

Sau khi được cắt ra từ cây mầm, các lá mầm đ ược nuôi 2 ngày trên môi trường số 2nhằm làm tăng độ khoẻ (pre-conditioning) trước khi lây nhiễm với vi khuẩn. Các khâuxử lý, nuôi chung với vi khuẩn, chọn lọc đ ược thực hiện tương tự trường hợp cây thuốclá và đã được trình bày ở phần nguyên liệu và phương pháp.

Nói chung, cây cà chua bi có đáp ứng không cao đối với sự chuyển nạp gen mặc d ùkhả năng tái sinh in vitro khá cao (số liệu chưa công bố). Tại thời gian đầu nghiên cứu,sau khi nuôi chung, mô được cấy chọn lọc ngay trên môi trường (MS + 1mg/l NAA + 2mg/l BA) có nồng độ kanamycin cao - 50 mg/l. Kết quả cho thấy, tất cả các lá mầm đềuchết. Sau đó, chúng tôi áp dụng chế độ chọn lọc với nồng độ kanamycin t ăng dần từthấp đến cao - từ 20mg/l đến 50mg/l qua 4 chu kỳ chọn lọc và bước đầu nhận được 2dòng cây tái sinh.

Mảnh lá của hai dòng cây này, có kích thước khoảng 0,6 x 0,6cm, được cấy trênmôi trường chứa các chất điều hoà sinh trưởng NAA và BA và có 50mg/l kanamycin đểtheo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh cây. Kết quả cho thấy, khoảng 7 - 10ngày sau nuôi cấy có sự hình thành mô sẹo và có sự tái sinh chồi sau khoảng 20 -30 ngàynuôi cấy; ngược lại, ở lá cây đối chứng, ho àn toàn không có sự hình thành mô sẹo. Phântích PCR các gen đang được thực hiện để khẳng định chúng l à cây chuyển gen.

Như chúng ta đã biết, việc tạo một số “vắc -xin ăn được” nhằm phòng bệnh viêmgan B và một số bệnh khác [11,16,18,19, 21] đ ã được thực hiện trên một số đối tượngcây trồng có sản phẩm ăn được trực tiếp (đối với động vật) nh ư khoai tây [1,2,3,8] th ìcây cà chua [6,12] là đối tượng cây trồng được quan tâm vì có thể ăn trực tiếp quả đốivới nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho ng ười. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tiếpcận xu hướng này.

KẾT LUẬN

Qua sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ,chúng tôi đã nhận được một số dòng cây thuốc lá và cây cà chua bi mang gen mã hoáprotein kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B. Các dòng nói trên cơ bản đã qua kiểm

Hình 1: PCR gen nptII với băng. Hình 2: PCR gen HBsAg v ới băngDNA 600 bp DNA 450 bp


tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển bằng một số phương pháp định tính và sinhhọc phân tử. Nghiên cứu này nhằm hướng đến việc tạo “vắc-xin ăn được”.


1. Arakawa, T., 1997. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenicpotato plants. Transgenic Research 6: 403-413a3

2. Bose, B., N. Khanna, S. K. Acharya, S. Sinha, 2006. Generation andcharacterization of a single-gene mouse-human chimeric antibody against hepatitisB surface antigen. J. Gastroenterology and Hepatology 21: 1439-1447.

3. Diminsky, D., R. Schirmbech, J. Reiman n, Y. Barenholz, 1997. Comparisonbetween hepatitis B surface antigen (HBsAg) particles derived from mammaliancells (CHO) and yeast cells (Hansenula polymorpha): composition, structure andimmunogenecity. Vaccine 15(6-7): 637-647.

4. Domansky, N., P. Ehsani, A. H. Salmanian, T. Medvedeva, 1995. Organ -specificexpession of the hepatitis B surface antigen in potato. Biotechnol. Lett. 17: 863-866.

5. Ehsani, P., A. Khabiri, N. Domansky, 1997. Polypeptide of hepatitis B surfaceantigen in transgenic potato. Gene 190: 107-111.

6. Gao, Y., Y. Ma, M. Li, T. Cheng, S -W. Li, J. Zhang, N-S. Xia, 2003. Oralimmunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg.World journal of Gastroenterology 9(5): 996-1002.

7. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.

8. Joung, Y. H., et al., 2004. Expression of the hepatitis B surface S and preS2antigens in tubers of Solanum tuberosum. Plant Cell Rep. 22: 925-930.

9. Kapusta, J. et al., 1999. Biotechnological approaches to making vaccine in plants.Plant Biotechnology and In vitro Biology in the 21 st Century, A. Altman et al.(eds.), Kluwer Academic Publishers, 571 -574.

10. Kong, Q., L. J. Richter, Y. F. Yang, C . J. Arntzen, H. S. Mason, Y. Thanavala,2001. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenicplants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(20): 11539-11544.

11. Mason, H. S., C. J. Arntzen, 1995. Transgenic plants as vaccine productionsystems. Trends in Biotechnology 13: 388-392.

12. McGarvey, P. B., J. Hammond, M. M. Dienelt, D. C. Hooper, Z. F. Fu, B.Dietzschold, H. Koprowski, F. H. Michaels, 1995. Expression of the rabies virusglycoprotein in transgenic tomatoes. Bio/Technology 13: 1484-1487.

13. Murashige T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.

14. Nemchinov, L. G., T. J. Liang, M. M. Rifaat, H. M. Mazyad, A. Hadidi, J. M.Keith, 2000. Development of a plant -derived subunit vaccine candidate againsthepatitis C virus. Arch. Virol. 145: 2557-2573.


15. Ramírez, N., et al., 2003. Expression and characterization of an anti -(hepatitis Bsurface antigen) glycosylated mouse antibody in transgenic tobacco ( Nicotianatabacum) plants and its use in the immunopurification of its target antigen.Biotechnol. Appl. Biochem. 38: 223-230.

16. Richter, L. J., Y. Thanavala, C. J. Arntzen, H. S. Mason, 2000. Production ofhepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuniza tion. NatureBiotechnology 18: 1167-1171.

17. Sakakibara, K. Y., K. Saito, 2006. Genetically modified plants for the promotion ofhuman health. Biotechnol. Lett. 28: 1983-1991.

18. Smith, M. L., L. Richter, C. J. Arntzen, M. L. Shuler, H. S. Mason, 2003. Structura lcharacterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oralimmunization studies. Vaccine 21: 4011-4021.

19. Tripurani, S. K., N. S. Reddy, K. R. S. Sambasiva Rao, 2003. Green revolutionvaccines, edible vaccines. African Journal of Biotechnology 2(12): 679-683.

20. Valdés, R., et al., 2003. Hepatiris B surface antigen immunopurification using aplant-derived specific antibody produced in large scale. Biochemical andBiophysical Research Communication 310: 742-747.

21. Webster, D. E. et al., 2002. Successful boosting of a DNA measles immunizationwith an oral plant-derived measles virus vaccine. Virology 76: 7910-7912.

SUMMARYTowards evolving production of Hepatitis B vaccine

from plant

Nguyen Huu Ho, Truong Thien Tri, Le Tan Duc,Pham Thi Hanh, Nguyen Huu Tam


Towards production of vaccine from the plant cultivars, the leaf disks of tobaccoNicotiana tabacum L. and the cotyledons of tomato Lycopersicon esculentum were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing the HBsAggene (with T7 system and PDS promoter) along with the nptII gene (kanamycinresistance gene) and the reporter gene gusA. After 2 - 3 day co-cultivation, tissues weretransferred to the medium containing kanamyc in (100 mg/l for tobacco, 20-50mg/l fortomato) for selection. Through 3 -4 cycles of selection, several transgenic plants wereobtained. The presence of the HBsAg, nptII and gusA genes was checked by PCRanalyses and / or GUS assay [GUS assay: positive for the expre ssion in the fruit butnegative in the leaf, stem and root]. The presence of HBsAg protein was carried out bythe Agilent 2100 Bioanalyzer Automated Analysis System and by the quick ELISA testusing the dip stick of the Clinotech Diagnostics Inc. The trans genics are being grown inthe greenhouse for further studies.


CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG gfp VÀO CÂY HOA PHONGLAN Dendrobium cv. Burana White NHỜ VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh,Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển


MỞ ĐẦU

Phong lan là loại hoa đẹp do đa dạng về màu sắc, kiểu dáng; hoa được tiêu thụ phổbiến trên thế giới và trong nước, kinh doanh hoa lan trong n ước có khả năng đạt doanhthu rất cao (1 tỷ đồng/ha/năm). Ri êng tại Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chỉ đạo về pháttriển hoa lan đã được thành lập nhằm xây dựng chương trình giống và xác định vùngtrồng hoa lan với quy mô hàng hoá để đưa cây hoa lan trở thành cây nông nghiệp đô thịchủ lực của thành phố. Trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, Thành phố Hồ ChíMinh sẽ phấn đấu mở rộng diện tích trồng lan l ên 200 ha vào năm 2010. Trên th ế giớicũng như ở nước ta, ngoài việc nhân giống phong lan phục vụ sản xuất bằng ph ươngpháp nuôi cấy mô, việc tạo giống (dòng) mới như giống kháng bệnh (nấm, vi khuẩn,virus), giống có dạng cây nhỏ (mini) và đáp ứng các tiêu chuẩn đòi hỏi ngày càng caocủa người tiêu dùng như hoa có màu sắc và đặc tính mới lạ là những vấn đề đang và sẽđược quan tâm nghiên cứu.

Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,gây đột biến..., phương pháp công nghệ sinh học (chuyển nạp gen) đã và đang chứng tỏlà công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghi ên cứu tạo giống và song hành với các phươngpháp tạo giống truyền thống. Đến nay đ ã có khá nhiều giống cây trồng biến đổi gen (gennhân) được trồng trên diện rộng nhằm mục đích thương mại. Nghiên cứu tạo giống bằngcông nghệ gen đã và đang được thực hiện đối với cây lan một phần v ì việc tạo giống lanbằng phương pháp lai hữu tính tiêu tốn nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốndùng lai tạo không phong phú [12].

Trên thế giới, đã có khá nhiều thông báo đề cập chuyển một số gen v ào cây hoa lan(vào nhân) như gen bar, gen gusA, gen nptII, gen hpt...[11, 14, 16, 17, 18, 24, 25], genmã hoá protein vỏ virus (papaya ringspot virus ) [12], trình tự ACC antisense [1]; cũngđã ghi nhận được công trình nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp [16], luc [5,6]. Câyphong lan Dendrobium lai (hybrid) mang gen luc phát sáng sinh học (bioluminescentorchid) đã được rao bán đấu giá trên thị trường thế giới với giá khởi điểm 200.000 đô -laSingapore [4] [ở lĩnh vực chuyển gen vào động vật, cá cảnh Zebra - Zebra fish


Brachydanio rerio mang gen gfp [1] phát sáng có điều kiện (chiếu tia UV) cũng đã đượcthương mại hoá với giá 5 đô-la/con tại Singapore, Mỹ].

Như chúng ta đã biết, gen gfp (green fluorescent protein gene) t ạo protein GFP cókhả năng phát sáng - được phân lập (từ sứa biển Aequorea victoria), được xác định trìnhtự và dòng hoá vào đầu những năm 90 [2, 13]. Từ đó, gen n ày được biến nạp và biểuhiện ở nhiều loại cơ thể sinh học khác nhau như vi khuẩn, nấm, động vật có / không cóxương sống và thực vật [3, 8, 13]. Ngoài gen gfp, gen luc (mã hoá luciferase, phân lậptừ đom đóm) [4, 5, 6, 20] cũng tạo sự phát sáng - theo cơ chế khác nhưng ít được nghiêncứu hơn do kỹ thuật tạo phát sáng mô tế b ào cây chuyển gen phức tạp hơn. Ở lĩnh vựcchuyển nạp gen vào cây trồng, gen gfp được xem là gen chỉ thị sống (vital) [21, 22, 23],mới [22] và có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghi ên cứu [7, 8, 13, 19]. Đã có khá nhiềucông trình nghiên cứu chuyển gen này bằng phương pháp bắn gen [23], bằng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens [10, 13] vào một số cây trồng và có thể nghiên cứu sự biểuhiện của gen này ở mức ty thể tế bào. Do vậy, theo chúng tôi, gfp là đối tượng gen cầnđược xem xét sử dụng trong các nghi ên cứu về biến nạp di truyền.

Đến nay, ở nước ta, chưa ghi nhận được công trình công bố chuyển các gen nóichung, gen gfp nói riêng vào cây hoa lan. Vì v ậy, theo chúng tôi, nghiên cứu chuyểngen gfp cây phong lan (Dendrobium Burana White) là vấn đề cần được quan tâm thựchiện theo xu hướng chuyển gen này vào một số đối tượng cây hoa trên thế giới hiện nay.


Giống lan: Sử dụng giống lan Dendrobium Burana White có hoa màu trắng.Phương pháp:

Môi trường nuôi cấy mô

1. Môi trường nuôi, nhân protocorm -like body (PLB): 1/2 x MS (Murashige -Skoog,1962) [15] có1 mg/l BA.

2. Môi trường tạo sự vươn chồi: 1/2 x MS có 2mg/l BA.

3. Môi trường nuôi cây: 1/2 x MS không có chất sinh tr ưởng.

Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng / ngày, nhiệt độ 25-28oC.

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấySử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid

pCAMBIA 1303 (kích thước 12,36 kb) (CAMBIA) mang gen gfp5 tạo protein phát sángGFP (green fluorescent protein) , gen gusA và gen kháng hygromycin hph.

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 100mg/l kanamycin. Để nhângiống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắc qua đêm trong môitrường khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin như trên.

Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 28oC.


Quy trình chuyển genCác cụm nhỏ PLB (được cắt từ cụm to, nhằm tạo vết th ương) với kích thước 0,3 x

0,3cm được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.

Tóm tắt quy trình chuyển gen1. Nuôi các cụm PLB trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ngày.

2. Gây nhiễm các cụm PLB với vi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấmbớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.

3. Nuôi chung các cụm PLB với vi khuẩn trong 7 ng ày. Sử dụng môi trường số 1 cóbổ sung acetosyringone 100 M.


5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các cụm PLB trên môi trường chọn lọc: môitrường số 1 có bổ sung 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Thực hiện 2 chukỳ chọn lọc, thời gian chọn lọc 20 ngày / chu kỳ.

6. Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc th êm 3 chu kỳ (20 ngày / chu kỳ) trên môi trườngchọn lọc như trên nhưng có 30mg/l hygromycin.

7. Cấy truyền các cụm PLB kháng hygromycin sa ng môi trường số 2 cũng chứa30mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi khoảng 2 tháng.

Kiểm tra cây chuyển gen1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 1-1,5cm) và cấy truyền sang môi trường số 3 có

30mg/l hygromycin: theo dõi sự vươn chồi và ra rễ.

2. Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [ 9]: ủ mô PLB, chồi trong thuốc thử GUS ở37°C (tủ ấm) trong 24 giờ.

3. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gfp được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu.4. Sự phát sáng của PLB, chồi chuyển gen (đ ược ghi nhận trong điều kiện tối) bằng

cách chiếu tia cực tím sóng dài (365nm) từ đèn cực tím Blak-Ray (công ty UVP,San Gabriel, CA, Mỹ) hoặc sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Nikon. Chụp ảnhqua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số Nikon 8700 8 Mpixels (khi d ùng đèn cựctím cầm tay) hoặc dùng camera (khi dùng hệ thống kính hiển vi huỳnh qua ng).

Gen hpt: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.

Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp .


Gen gfp: GFP1: TGGAGAGGGTGAAGGTGATG, GFP2:TGTGTGGACAGGTAATGGTTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 30 chu kỳ (94C: 1phút, 55C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 500 bp.


Thực tiễn nghiên cứu trên thế giới về sự biểu hiện (phát sáng có điều kiện) củaprotein GFP ở cơ thể cây trồng cho thấy sự phát sáng xanh lục của protein GFP bị chekhuất bởi sự phát sáng đỏ của diệp lục tố khi cây đ ược chiếu ánh sáng cực tím sóng d àihoặc ánh sáng lam. Vì vậy, đối với cây trồng lấy hoa trang trí (hồng, cát t ường…), cácnhà khoa học thường chọn đối tượng có hoa màu trắng (không có diệp lục tố). Trongnghiên cứu này, chúng tôi cũng đã sử dụng giống phong lan Dendrobium Burana Whitecó hoa màu trắng.

Bước đầu nghiên cứu cho thấy, giống phong lan n ày tuy nuôi cấy mô không là vấnđề ở khía cạnh nhân giống và tạo chồi / cây từ PLB nhưng tương đối khó thực hiện sựdung nạp gen gfp hơn so với một số giống khác như Dendrobium Candy Stripe xMadam Cherry (số liệu chưa công bố) trong cùng điều kiện plasmid sử dụng, cùng điềukiện chuyển nạp và phương pháp chuyển nạp.

a. Tính chống chịu tự nhiên của mô PLB đối với kháng sinh hygromycinTuy đã có thông tin về nồng độ kháng sinh hygromycin d ùng chọn lọc mô PLB đối

với một số giống lan là 30mg/l nhưng yếu tố nhạy cảm đối với kháng sinh n ày, theochúng tôi, có khác nhau tuỳ giống. Thực tế nghiên cứu của chúng tôi cho thấy giốngBurana White có tính nhạy cảm cao hơn so với giống khác là Candy Stripe x MadameCherry. Điều này tạo thuận lợi và định hướng cho quá trình chọn lọc là cần sử dụng nồngđộ hygromycin từ thấp đến cao (tăng dần từ 15mg/l đến 30mg/l) - khác với các nghiêncứu trên thế giới là sử dụng nồng độ cao 30mg/l hygromycin ngay ở chu kỳ chọn lọc đầutiên; và thực tế cũng cho thấy rằng nếu dùng ngay nồng độ 30mg/l hygromycin thì thínghiệm không đạt kết quả. Thậm chí ở có một số lô thí nghiệ m, toàn bộ PLB chết hết khinồng độ hygromycin chỉ 15mg/l được sử dụng sau khi xử lý chuyển gen bằng vi khuẩn.

b. Giai đoạn nuôi chungTheo nhiều công bố về chuyển nạp gen ở cây trồng, giai đoạn nuôi chung mô với vi

khuẩn thường chỉ kéo dài từ 2 - 3 ngày. Nhưng ở đối tượng phong lan chúng tôi nghiêncứu, trên môi trường nuôi chung mô là môi trường 1/2 MS có 1mg/l BA và 100 Macetosyringone thì sau 2 ngày chúng tôi nh ận thấy vi khuẩn mọc rất yếu, th ường khôngnhận biết được bằng mắt thường. Vì vậy, chúng tôi kéo dài thời gian nuôi chung lên 7ngày và đôi khi để lâu hơn. Thời gian nuôi chung kéo dài ở nghiên cứu của chúng tôiphù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới (có lô thí nghiệm kéo d ài cả tháng); theochúng tôi có thể là do mô PLB khá cứng, tương đối trơn láng tạo độ bám ít, có thể trongcây lan có hợp chất không thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn; h ơn nữa môi trườngnuôi chung lại khá đơn giản (khoáng 1/2 MS). Sự xử lý kéo d ài thời gian nuôi chungthường ít được sử dụng trừ ở một vài đối tượng cây trồng và tuỳ loại mô như trường hợp


nuôi chung vi khuẩn với lá cây hoa cát tường - có thể lên đến 5 ngày. Nói tóm lại, nồngđộ 30mg/l hygromycin có thể được dùng để chọn lọc giống lan này.

c. Quy trình chuyển genNhư đã nói ở trên do tính mẫn cảm với hygromycin, tương tự như trường hợp chọn

lọc tế bào lúa bằng hygromycin dùng nồng độ tuần tự từ thấp đến cao, tr ước hết, chúngtôi dùng nồng độ tương đối thấp 15mg/l để chọn lọc. Trên môi trường này, sau khoảng 1tháng nuôi chọn, có sự hình thành một số cụm PLB mới tăng sinh nhưng đa số PLB cònsống nhiều. Sự chọn lọc dùng 15mg/l hygromycin được thực hiện 2 lần; tiếp theo l à 3lần chọn lọc trên môi trường có hygromycin 30mg/l. Sau thời gian chọn lọc ( 3 tháng),một số cụm PLB kháng hygromycin tăng sinh. The o chúng tôi, cần áp dụng chế độ chọnlọc theo kiểu tăng dần nồng độ hygromycin v ì bản chất tế bào cấu thành PLB khôngphải là tế bào mô sẹo nên theo chúng tôi tính độc lập của chúng trong hệ thống khôngcao so với tế bào mô sẹo nên chúng cần có điều kiện và thời gian để tăng sinh. Nhậnthấy các mô có khả năng tăng sinh mạnh trên môi trường 30mg/l hygromycin (do đượcchuyển gen) thì chúng vẫn có khả năng tăng sinh tr ên môi trường có nồng độhygromycin cao đến 50mg/l.

d. Kiểm tra khả năng ra rễ trên môi trường có hygromycin

Các cây nhận được trên môi trường chọn lọc đúng ngưỡng (30mg/l) được cấytruyền sang môi trường số 3. Kết quả cho thấy các cây chuyển gen ra rễ v à có sinhtrưởng bình thường trên môi trường có 30 mg/l hygromycin; ngược lại cây đối chứng bịchết sau khoảng 15-20 ngày nuôi.

e. Thử GUSHầu hết các mô PLB / mô chồi kháng hygromycin đều có kết quả d ương tính với

thuốc thử GUS (hình 1, 2). Cũng ghi nhận có một số trường hợp âm tính với thuốc thửnhưng có kết quả dương tính với PCR gen gusA, tuy nhiên do gen này không là genmục tiêu nên chúng tôi không quan tâm l ấy số liệu thống kê là bao nhiêu phần trăm.Đây là trường hợp thường nhận thấy ở các nghiên cứu chuyển nạp gen đặc biệt đối vớigen gusA.

f. Phân tích PCR các gen hph, gusA và gfp

Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đ ã qua giai đoạn tạo rễ và cósinh trưởng bình thường trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Kết quả phân tích PCRcác gen hph, gusA, gfp với các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băngDNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 500 bp (hình 5).

g. Sự phát sáng của mô chuyển genCác cụm PLB và chồi nhỏ được để trong tối trong khoảng thời gian 1 tháng (để

giảm hoặc hạn chế sự h ình thành diệp lục tố) được chiếu tia cực tím sóng d ài 365nm.Kết quả cho thấy có thể ghi nhận được sự phát sáng xanh lục bằng mắt th ường và sựphát sáng này được chụp qua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số hoặc máy ảnh thuộc hệthống kính hiển vi huỳnh quang Nikon (hình 3, 4).


KẾT LUẬN

Qua sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmidpCAMBIA 1303 mang gen gfp5, gen gusA và gen hph để chuyển gen vào PLB cây hoaphong lan Dendrobium Burana White, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây chuyểngen. Các dòng cây này có sinh trưởng in vitro bình thường trên môi trường cóhygromycin 30mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS v à có sự phát sáng màu xanh lụckhi được xử lý bằng tia UV sóng d ài (của đèn cực tím) hoặc sóng lam của hệ thống kínhhiển vi huỳnh quang.

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tàitrợ cho nghiên cứu này.


1. ‘BioThailand 2005’: Biotechnology - Challenges in the 21 st Century (The 3rd

International Biotechnology Trade Exhibition and Conference, Bangkok, T hailand,Nov. 2-5/2005; Conference on Biosafety of Genetically Modified Organisms -Plant Genetic Engineering Unit at Kasetsart University, Kamphaengsoen Campus).

2. Baulcombe D. C., Chapman S., Santa Cruz S. 1995. Jellyfish green fluorescentprotein as a reporter for virus infection. The Plant Journal. 7: 1045-1053.

3. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W., Prasher D. 1994. Green fluorescentprotein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.

4. Chia T. F. 2000. Bioluminescent orchid, Natural Science Academic Group, NTU,Singapore. E-mail: [email protected]; http://www.interauct.com.

5. Chia T. F., Chan Y. S., Chua N. H. 1990. In: Bonham D. G., Kemohan J. (eds).Proceedings of the 13 th World Orchid Conference. 13 WOC Proceedings Trust,Auckland, p. 284.

Hình 1, 2: Thử GUS dương tính ở PLB và chồi. 3, 4: PLB và chồi phát sáng xanh lụcqua xử lý tia UV sóng dài 365 nm. 5: Kết quả PCR dương tính gen gfp với băng DNA

được khuếch đại 500 bp

1 2 3 4

5

[email protected]

http://www.interauct.com


6. Chia T. F., Chan Y. S., Chua N. H. 1994. The firefly luciferase gene as a non -invasive reporter for Dendrobium transformation. The Plant Journal 6(3): 441-446.

7. Davis S. J., Vierstra R. D. 1998. Sol uble, highly fluorescent variants of greenfluorescent protein (GFP) for use in higher plants. Plant Molecular Biology 36:521-528.

8. Hu W., Cheng C. 1995. Expression of Aequorea fluorescent protein in plant cells.FEBS Lett. 369: 331-334.

9. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase asa sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.

10. Kim C. K., Chung J. D., Park S. H., Burrell A. M., Kamo K. K., Byrne D. H. 2004.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the greenfluorescent protein gene. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78(2): 107-111.

11. Knapp J. E., Kausch A. P., Chandlee J. M. 2000. Transformation of three genera oforchid using the bar gene as a selective marker. Plant Cell Rep. 19: 893-898.

12. Kuehnle A. R., Sugii N. 1992. Transformation of Dendrobium orchid using particleof protocorms. Plant Cell Rep. 11: 484-488.

13. Leffel S. M., Stephen A. M., Stewart Jr. C. N. 1997. Application of greenfluorescent protein in plants. BioTechniques 23(5): 912-918.

14. Men S., Ming X., Liu R., Wei C., Li Y. 2003. Agrobacterium-mediated genetictransformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 63-71.

15. Murashige, T., F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture. Physiol. Plant .15: 473-497.

16. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Factors affecting gene delivery by particlebombardment of Dendrobium orchids. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 31: 131-136.

17. Nan G. L., Kuehnle A. R. 1995. Genetic transformation of Dendrobium (orchid).In: Bajaj Y. P. S. (ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry . Vol. 34, Berlin:Spinger Verlag, pp. 149-160.

18. Nan G. L., Kuehnle A. R., Kado C. I. 1997. Dendrobium orchids contain an inducerof Agrobaterium virulence genes. Physiol. Mol. Plant Pathol . 51: 391-399.

19. Niedz R. P., Sussman M. R., Satterlee J. S. 1995. Green fluorescent protein: an invitro reporter of plant gene expression. Plant Cell Reports 14: 403-406.

20. Ow D. W., Wood K. V., DeLuca M., de Wet J. R., Helinski D. R., Howell S. H.1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cellsand transgenic plants. Science 234: 856-859.

21. Pang S., DeBoer D. L., Wan Y., Ye G., Layton J. G., Neher M. K., Armstrong C .L., Hinchee M. A. W., Fromm M. E. 1996. An improved green fluorescent proteingene as a vital marker in plant. Plant Physiol. 112: 893-900.


22. Sheen J., Hwang S., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D. W. 1995. Green -fluorescentprotein as a new vital marker in plant cells. The Plant Journal 8: 777-784.

23. Vain, P., Worland B., Kohli A., Snape J. W., Christou P. 1998. The greenfluorescent protein (GFP) as a vital screenable marker in rice transformation.Theor. Appl. Genet. 96, 164-169.

24. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2000. DOH1, a class 1 knox gene, is required formaintenance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant Cell12: 2143-2159.

25. Yu H., Yang S. H., Goh C. J. 2001. Agrobacterium-mediated transformation of aDendrobium orchid with the class 1 knox gene DOH1. Plant Cell Rep. 20: 301-305.

SUMMARYGenetic transformation of Dendrobium Burana Whitewith the gfp gene through Agrobacterium tumefaciens

Vo Phan Mi Sa, Le Tan Duc, Nguyen Thi Thanh,Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen


Protocorm - like bodies (PLBs), about 3mm in size, of the Dendrobium BuranaWhite (White flower) were cut and co -cultivated with the Agrobacterium tumefaciensstrain LBA 4404 containing the gfp5 gene (green fluorescent protein gen e), gusA geneand hph gene (hygromycin resistance gene) (from CAMBIA). Following co -cultivation(for one week), PLBs were cultured on the 1/2 MS (plus 1 mg/l BA) se lection mediumcontaining 20-30mg/l of hygromycin. After 5 rounds of selection, several tran sfomedPLBs were obtained. The transformed PLBs / in vitro small plants were checked forgreen fluorescence using the long - wave UV lamp (365nm) and/or the Nikonfluorescence microscope. They also showed the positive results on the GUS assay andthe PCR analyses of the hph and gfp genes.


BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN ipt TẠOcytokinin NHẰM KHẢ NĂNG LÀM CHẬM SỰ LÃO HOÁ

Ở CÂY BẮP CẢI (Brassica oleracea var. capitata)

Bùi Đình Thạch, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh,Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Nguyễn Đức Minh Hùng


MỞ ĐẦU

Như chúng ta đã biết, gen ipt (phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium) l à gen tạo raenzyme isopentenyl transferase và c ũng là enzyme quan trọng của con đường sinhtổng hợp cytokinin trong thực vật [4,5,7,20,22]. Đối với sự l ão hoá ở thực vật,cytokinin có vai trò điều hoà theo hướng tích cực là làm chậm quá trình này[6,7,9,10,13,16,20].

Nghiên cứu chuyển gen ipt vào thực vật đã được thực hiện thành công trên mộtsố đối tượng cây trồng như Arabidopsis, thuốc lá, Petunia, bông cải, cải x à lách,cúc,...[6,7,9,10,12,13,15] và k ết quả cho thấy cây chuyển gen có lá xanh t ươi hơn, ởcác lá già do diệp lục tố chậm bị phân huỷ n ên lá chậm chuyển sang màu vàng. Điềunày mở ra triển vọng khai thác tiềm năng của gen này trong nghiên cứu chuyển gentạo giống cây trồng chậm l ão hoá, tăng sinh trưởng và năng suất [10,17]. Ngoài ra,gen ipt còn có khả năng làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp ở cây d ược liệuchuyển gen [19] và có thể được sử dụng như gen có khả năng thay thế cho gen chọnlọc [8].

Trước đây, gen chuyển ipt tạo tình trạng dư thừa cytokinin (overproduction) dẫnđến sự thay đổi kiểu h ình của cây [9] nhưng gần đây tình trạng này đã được khắc phụcdo sử dụng các promoter như cor15a, SAG12... chỉ tạo biểu hiện trong những điều kiệnnhất định [12,13,15].

Ở cây bắp cải, trên đồng ruộng, các lá già gần gốc thường chuyển vàng sớm (mấtdiệp lục tố do lão hoá) tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập; ngo ài ra, việc giữ sảnphẩm sao cho được xanh tươi lâu trong quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản làyêu cầu rất quan trọng đối với các nh à trồng trọt và kinh doanh cây trồng này.

Nội dung bài này, chúng tôi trình bày kết quả bước đầu việc nghiên cứu chuyển genipt vào cây bắp cải nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm khả năng làm giảmcác ảnh hưởng không tốt do hiện tượng lão hoá gây ra như đã nói ở trên và đây là côngtrình đầu tiên về nghiên cứu chuyển gen này vào cây bắp cải.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPGiống bắp cải:Sử dụng giống F1 TN5 (của Công ty hạt giống Trang Nông).Phương pháp:

Khử trùng hạt

Trước hết, hạt được rửa với nước cất vô trùng 2 lần, khử trùng bằng nước Javelnồng độ 50% (v/v) trong 7 phút. Sau đó, hạt đ ược rửa sạch bằng nước vô trùng 3 lần vàđược gieo trên môi trường.

Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin

1. Môi trường gieo hạt và nuôi cây: khoáng MS (Murashige - Skoog, 1962), vitaminMorel (Morel, 1948), không có ch ất điều hoà sinh trưởng.

2. Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm: khoáng MS, vitam in B 5 (Gamborg và cs.,1968) có 0,1mg/l IBA , 3mg/l BA.

3. Môi trường vươn chồi và tạo rễ: như môi trường số 1.

4. Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1nhưng có hygromycin từ 5 - 10mg/l.

5. Các loại môi trường trên có đường 30g/l, thạch 9g/l, pH 5,8.

6. Điều kiện nuôi cấy: 12 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 23 - 25oC.

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmidpVDH396 (kích thước 15,9 kb) (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (cónguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) tạo enzyme isopentenyl transferase[có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gengusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoterCaMV35S).

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin. Để nhângiống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắc qua đêm trong môitrường khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên. Nhiệtđộ nuôi cấy: 25 - 28oC.

Quy trình chuyển gen

Các lá mầm, từ cây mầm 7 - 10 ngày tuổi trên môi trường MS không chất điều hoàsinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.

Tóm tắt quy trình chuyển gen

1. Nuôi cấy lá mầm trên môi trường số 2 (0,1mg/l IBA, 3mg/l BA) trong thời gian2 ngày.


2. Gây nhiễm các lá mầm với dịch vi khuẩn (OD= 0,6 -1) trong thời gian 15 phút. Vớtmẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.

3. Nuôi chung lá mầm với vi khuẩn trong 2 ngày. Sử dụng môi trường như trên nhưngcó acetosyringone 50 M.

4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kếthợp lắc nhẹ, 15 phút).

5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường số 2 bổ sung 5-10 mg/lhygromycin, 250mg/l cefotaxime. Thời gian nuôi 15 ngày/ chu kỳ chọn lọc và thựchiện 3 chu kỳ chọn lọc dùng tuần tự 5-10-5mg/l hygromycin.

6. Cấy truyền các chồi/ cụm chồi tái sinh (cao từ 1 -1,5cm) sang môi trường MS khôngchất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôikhoảng 1 tháng.

Kiểm tra cây chuyển gen

1. Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền sang môi trường MS khôngchất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi sự vươn chồi và ra rễ trong thờigian khoảng 20 ngày.

2. Mảnh lá cây giả định chuyển gen đ ược nuôi cấy trên môi trường số 2 có 5mg/lhygromycin và theo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh sau khoảng 20-30ngày (so với đối chứng).

3. Nhuộm GUS (Jefferson và cs., 1987) [11]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở37°C (tủ ấm).

4. PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gusA và gen ipt được kiểm tra dùng các cặpmồi đặc hiệu.

Gen hph: HPH1: CGTCGTTCGAGAAGTTTC, HPH2:TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.

Gen gusA: GUS1: CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG, GUS2:CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp.

Gen ipt: IPT1: TCAACCGGAAGCGGACGACC, IPT2:GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương trình nhiệt: 90C: 10 phút; 40 chu kỳ (94C:15 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp.


Do không có giống bắp cải thuần được bán trên thị trường nên chúng tôi sử dụnggiống lai F1 TN5 để nghiên cứu. Do vậy, việc nhân giống cây chuyển gen d ùng cho cácnghiên cứu tiếp theo sẽ được thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro /


ex vitro. Sau 7-10 ngày nuôi cấy hạt trên môi trường gieo hạt, các lá mầm được sử dụnglàm vật liệu chuyển gen.

Qua tham khảo một số tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây bắp cả i trong và ngoàinước, chúng tôi đã bố trí một số công thức môi tr ường với nồng độ chất điều ho à sinhtrưởng (ĐHST) IBA, BA khác nhau. Kết quả cho thấy, đối với giống F 1 TN5, tổ hợpĐHST IBA (0,1mg/l + BA 3mg/l) được xem là tổ hợp cho tỷ lệ tái sinh chồi rất cao ( 60%).Theo một số nghiên cứu trong và ngoài nước [1,3,18,21], nồng độ BA cao (2-4mg/l) đượcxem là thích hợp, tạo sự tái sinh với tần số cao; nồng độ 3mg/l BA trong nghiên cứu củachúng tôi phù hợp với khoảng dao động nồng độ BA sử dụng của các tác giả n êu trên.

Qua thử nghiệm tính chống chịu tự nhi ên của mô đối với kháng sinh hygromycin,kết quả cho thấy mô sẹo cũng nh ư chồi/ cây con rất mẫn cảm đối với kháng sinh n ày(nồng độ dùng chọn lọc chỉ từ 5-10mg/l) tương tự như trường hợp cây bông cải [2];ngược lại, đối với giống bắp cải B. oleracea cv. Alboglabra [3] và đối giống cảiBrassica rapa [13] thì nồng độ hygromycin sử dụng cao hơn, theo thứ tự là 30mg/l và25mg/l.

Lá mầm, sau khi xử lý và nuôi chung với vi khuẩn, được cấy trên môi trường táisinh có bổ sung 5mg/l hygromycin. Nhận thấy sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy, một số lámầm có phần gốc cuống ph ình to và khoảng một tháng sau có sự tái sinh chồi (h ình 1);ngược lại, toàn bộ lá mầm đối chứng đều chết.

Các chồi/ cụm chồi tái sinh trên môi trường có 5mg/l hygromycin được cấy truyềntiếp sang môi trường có nồng độ hygromycin cao h ơn (10mg/l) để sự chọn lọc được triệtđể hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy có một số chồi chết ở giai đoạn chọn lọc tiếp theonày. Các chồi/ cụm chồi tuy tái sinh tr ên môi trường có hygromycin nhưng khả năngphát triển của chúng không nhanh tr ên môi trường có 10mg/l hygromycin. Do vậy, ởchu kỳ chọn lọc thứ ba, chúng tô i chỉ dùng nồng độ hygromycin 5mg/l (như đối với chukỳ 1) để tiếp tục kiểm tra tính kháng của chồi/cây. Đến nay, chúng tôi đ ã nhận được mộtsố dòng chồi/ cây có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/lhygromycin (dòng cây giả định chuyển gen).

Như đã nói ở trên, do tính mẫn cảm cao đối với hygromycin n ên sau khi qua 3 chukỳ chọn lọc, chúng tôi cấy truyền chồi/cây sang môi tr ường nuôi cây không cóhygromycin để chồi/cây phát triển nhanh.

Các dòng giả định chuyển gen được kiểm tra một lần nữa qua sử dụng các mảnh láđể cấy trên môi trường tái sinh có 5mg/l hygromycin nhằm theo dõi khả năng tạo môsẹo và tái sinh. Kết quả cho thấy, các mảnh lá cây giả định chuyển gen có khả năng h ìnhthành mô sẹo và tái sinh chồi; ngược lại, mảnh lá cây đối chứng ho àn toàn không có khảnăng tạo mô mới và chết sau đó.

Mô lá của các chồi có khả năng phát triển li ên tục trên môi trường có hygromycinđược nhuộm với thuốc thử X -Gluc để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA. Kết quả chothấy chúng có màu xanh đặc trưng với thuốc thử (hình 2); ngược lại, các mẫu lá cây đốichứng đều âm tính ở kết quả thử GUS n ày. Cũng ghi nhận một số mô lá âm tính vớithuốc thử dù chồi có sự phát triển b ình thường trên môi trường chọn lọc và theo chúng


tôi có thể đây là do hiện tượng im lặng của gen gusA thường gặp trong nghiên cứuchuyển nạp gen này.

Chúng tôi đang tiến hành phân tích PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các genhph, gusA, ipt với các mồi đặc hiệu như đã ghi trong phần nguyên liệu và phương pháp.

LỜI CÁM ƠNCác tác giả xin chân thành cám ơn Trung tâm Phát tri ển Khoa học - Công nghệ Trẻ

Thành Đoàn Thành phố Hồ Chí Minh (Chương trình Vườn ươm sáng tạo) đã tài trợ chonghiên cứu này.


1. Nguyễn Thị Liên Chi, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Than h, Lao Thị Nga, NguyễnQuốc Bình, Nguyễn Văn Uyển, 1994. Chọn lọc các môi tr ường nuôi cấy để nângcao hiệu suất tái sinh cây bắp cải Brassica oleracea var. capitata dùng cho hệ thốngchuyển gen của Bacillus thuringiensis kháng sâu tơ. Tạp chí Khoa học và Côngnghệ 22(1): 1-7.

2. Kim Hong, N. T., E. J. Kane, P. J. Dix, 1998. Hormonal regulation of senescence incauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) (Abstract). In: Altman A., Ziv M.,Izhar S. (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21 st Century, IXInternational Congress on Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers,Dordrecht, The Netherlands, p. 164.

3. Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển, Maria Dolores Sacristan, 1997. Tạo haidòng cải Brassica oleracea L. cv. Alboglabra mang gen kháng hygromycin bởiAgrobacterium tumefaciens. Tạp chí Sinh học 19(4): 13-16.

Hình 1: Chồi chuyển gen tái sinh trênmôi trường chọn lọc có 5 mg/l

hygromycin

Hình 2: Mẫu lá/ chồi cây chuyển gendương tính với thuốc thử GUS


4. Akiyoshi, D. E., H. Klee, R. M. Amasino, E. W. Nester, M. P. Gordon, 1984. T -DNAof Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81: 5994-5998.

5. Barry, G. F., S. G. Rogers, R. T. Fraley RT, L. Brand, 1984. Identification of acloned cytokinin biosynthetic gene . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4776-4780.

6. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. Overproduction ofcytokinins in Petunia flowers transformed with P SAG12-IPT delays corollasenescence and decreases sensitivity to ethylene. Plant Physiology 132: 2174-2183.

7. Chang, H., M. L. Jones, G. M. Banowetz, D. G. Clark, 2003. The ArabidopsisAtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novocytokinin biosynthesis. Plant Physiol. 131(1): 167-176.

8. Ebinuma H., K. Sugita, E. Matsunaga, M. Yamakado, 1997. Selection of marker -free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94: 2117-2121.

9. Eklof, S., C. Astot, F. Sitbon, T. Moritz, O. Olsson, G. Sandberg, 2000. Transgenictobacco plants co-expressing Agrobacterium iaa and ipt genes have wild-typehormone levels but display both auxin -and cytokinin-overproducing phenotypes.The Plant Journal 23(2): 279-284.

10. He, S. S., A. Hoelscher, J. Liu, D. O’Neill, J. Layton, R. McCarroll, S. Dotson,2005. Cell cycle specific isopentenyl transferase expression led to coordinatedenhancement of cell division, cell growth and development in transgenicArabidopsis. Plant Biotechnology 22: 261-270.

11. Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, B. W. Bevan, 1987. GUS fusion: -glucuronidase asa sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO 6: 3901-3907.

12. Khodakovskaya, M. V., R. McAvoy, H. Liu, Y. Li, 1998. Ethylene -regulatedexpression of the ipt gene increases flower number in transgenic Dendranthemagrandiflorum. Abstracts, Society for In Vitro Biology.

13. Khodakovskaya, M. V., Y. Li, J. Li, R. Vankova, J. Malbeck, R. McAvo y, 2005.Effects of cor15a-ipt gene expression on leaf senescence in transgenic Petuniahybrida and Dendranthema grandiflorum. J. of Experimental Botany 56(414):1165-1175.

14. Kuvshinov, V., K. Koivu, K. E. Pehu, 1999. Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransfrmation of greenhouse-grown Brassica rapa ssp. Olifera. Plant Cell Reports18(9): 773-777.

15. McCabe, M. S. et al., 2001. Effects of PSAG12-ipt gene expression on developmentand senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol. 127: 505-516.

16. McCabe, M. S., U. Mohapatra, F. Schepers, K. Van Dun, J. B. Power, M. Davey,1998. Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene. J.Exp. Bot. Suppl. 49: 49.


17. Medford, J. I., R. Horgan, Z. El -Sa-wi, H. J. Klee, 1989. Alterations of endogenouscytokinins in transgenic plants using a chimeric isopentenyl transferase gene. ThePlant Cell 1: 403-413.

18. Metz, T. D., R. Dixit, E. D. Earle, 1995. Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleraceavar. capitata). Plant Cell Reports 15: 287-292.

19. Sa, G., M. Mi, Y. He-chun, L. Guo-feng, C. Kang, 2001. Effects of ipt geneexpression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L..Plant Science 160: 691-698.

20. Smart, C. M., Scofield S. R., M. W. Bevan, T. A. Dyer, 1991. Delayed leafsenescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene for cytokinin productionin Agrobacterium. Plant Cell 3: 647-656.

21. Tsukazaki, H., Y. Kuginuki, R. Aida, T. Suzuki, 2002 . Agrobacterium -mediatedtransformation of a double haploid line of cabbage. Plant Cell Reports 21: 257-262.

22. Werner, T., V. Motyka, M. Strnad, T. Schmulling, 2001. Regulation of plantgrowth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10487-10492.

SUMMARYPreliminary study on transfer of ipt gene into cabbage

(Brassica oleracea var. capitata) for retardation of senescence

Bui Dinh Thach, Nguyen Huu Ho, Nguyen Thi ThanhLe Tan Duc, Phan Tuong Loc, Nguyen Duc Minh Hung


Some transgenic cabbage plants were obtained via the Agrobacterium tumefaciensLBA 4404 carrying the ipt gene (for cytokinin production), gusA gene (as reporter genefor -glucuronidase) and hph gene (for hygromycin resistance). The cotyledons of theseedlings (7-10 days after seed germination) were cut at the basal and co -cultivated withAgrobacterium tumefaciens . After three cycles of selection on the MS (with IBA, BA)medium containing hygromycin (5 -10mg/l), several hygromycin resistant calli / shootswere induced. They expressed the GUS activity and the presence of transgenes in theplant genome was performed by PCR analysis .


XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH in vitro CÂY NGÔ Zeamays L. VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN

NẠP GEN TẠO protein GIẦU SẮT NHỜ VI KHUẨNAgrobacterium tumefaciens

Nguyễn Thị Phương Nam, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu TâmNguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển


MỞ ĐẦU

Ngô (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới cũng như ở nước ta.Ngoài việc dùng làm lương thực cho con người, ngô còn được dùng làm thức ăn trongchăn nuôi gia súc, gia cầm, làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất r ượu, cồn, tinhbột… Ngô là nguồn xuất khẩu thu ngoại tệ lớn đối với một số n ước như Mỹ, Pháp,Argentina, Trung Quốc…

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và chuyển gen, các nhà khoa học thường dùng vậtliệu phôi non (10-20 ngày sau thụ tinh) [3,4,5,6,16,18,22] để nghi ên cứu do có khả năngđáp ứng cao với nuôi cấy (tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi v à tái sinh cao). Tuy nhiên, thườngkhó chủ động trong việc thu phôi non v à cần nhiều thời gian, công sức cho công việctách lấy phôi. Để chủ động hơn trong nghiên cứu, chúng tôi dùng đốt thân (nodalsection) và chồi đỉnh cây in vitro (có nguồn gốc từ hạt tươi trưởng thành) như nguyênliệu dùng cho nghiên cứu nuôi cấy mô và để tạo mô tế bào thích hợp dùng chuyển nạp.

Trước đây, chọn tạo giống ngô được thực hiện thông qua phương pháp lai tạo, gâyđột biến. Hiện nay, công nghệ sinh học đ ã có nhiều đóng góp quan trọng trong tạo giốngcụ thể là nhờ công nghệ gen nhiều giống ngô chuyển gen với đặc tính quý đ ã được tạora và được thương mại hoá như giống ngô kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… . Theo cácnhà nghiên cứu, công nghệ chuyển nạp gen ng ày càng có vị trí quan trọng trong côngtác giống ngô đặc biệt trong tình trạng vốn gen tự nhiên cây ngô còn nhiều hạn chế.

Sự thiếu hụt dinh dưỡng sắt là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khoảng30 % dân số thế giới. Sự thiếu máu do thiếu hụt sắt có ảnh hưởng xấu hoặc rất xấu đếntrẻ em, thai phụ và phụ nữ sau khi sinh. Ở nước ta, theo điều tra tại các vùng nghèo tỷ lệtrẻ thiếu máu, thiếu sắt lên tới hơn 70%, chủ yếu do bữa ăn thiếu chất dinh d ưỡng vànghèo thành phần; sự thiếu sắt có tác động xấu đến sự phát triển về thể chất v à trí tuệcủa trẻ. Mặc dù việc bổ sung sắt vào thực phẩm hoặc khuyến cáo sử dụng thuốc đ ã tỏ racó hiệu quả nhằm kiểm soát nạn thiếu hụt sắt nh ưng các biện pháp nói trên khó có thểáp dụng nhanh chóng tại các nước còn nghèo nàn lạc hậu vì chi phí phát sinh cao và sốlượng các chương trình chăm sóc sức khoẻ ban đầu còn hạn chế. Một số cây họ Đậu,cây cải spinach… được biết chứa hàm lượng sắt cao nhưng cũng chứa nhiều acid oxalicvà các hợp chất có nhiều acid phytic (phytate -like substances) gây hạn chế hấp thu sắt.


Ferritin - protein dự trữ sắt được phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vikhuẩn. Ferritin của thực vật gồm 24 tiểu phần (subunit) có thể chứa từ 4.000 - 4.500nguyên tử sắt ở khoang trung tâm phân tử (central cavity) [10,11]. Các đoạn cDNAferritin thực vật đã được dòng hóa để nghiên cứu từ nhiều nguồn khác nhau nh ư trụ dướilá mầm đậu nành Glycine max [10], hạt non đậu Pisum sativum (pea), lá non đậu Vignaunguiculata, hạt đậu Phaseolus vulgaris (French bean)… Ferritin có hai nhi ệm vụ chínhtrong tế bào sống; một là, cung cấp sắt để tổng hợp các protein chứa sắt nh ư ferredoxinvà các cytochrome, hai là, chống các tác hại gây ra bởi các gốc tự do tạo ra bởi sự t ươngtác sắt / dioxygen. Các nghiên cứu gần đây cho thấy ferritin có thể đ ược sử dụng để xửlý các trường hợp bệnh thiếu máu ở chuột. Các phát hiện tr ên cho phép các nhà khoahọc đưa ra các nghiên cứu, bằng con đường công nghệ di truyền, tạo ra các cây ngũ cốcchuyển gen giàu sắt nhằm góp phần nhất định v ào việc giải quyết nạn thiếu hụt sắt ởcon người và cho đến nay, người ta đã tạo ra được một số dòng lúa indica và japonicavới hàm lượng sắt cao hơn gấp nhiều lần [11].

Nhằm tiếp cận hướng tạo giống dùng phương pháp công nghệ sinh học, ở nghiêncứu này, chúng tôi nêu nội dung nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây từ mô đốtthân và chồi đỉnh và bước đầu ứng dụng trong chuyển nạp gen tạo ferritin nhờ vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens với hy vọng cải thiện hàm lượng sắt ở cây ngô.


Giống ngô:Sử dụng giống ngô Nếp địa phương ở tỉnh Tiền Giang.

Phương pháp:Khử trùng hạt tươi

Bóc bỏ lá bao bên ngoài quả ngô tươi để lộ hạt ngô bên trong. Tách lấy hạt bằng tayvà khử trùng hạt bằng hypochlorite Na 50% (v/v) trong 20 phút. Rửa sạch bằng n ước cấtnhiều lần và cấy hạt trên môi trường MS không chất sinh trưởng.

Kỹ thuật tách nuôI chồi đỉnhDùng dao mổ cắt bỏ phần trên và dưới đốt thân cây ngô in vitro phát triển từ hạt

(sau khoảng 1/2 tháng nuôi cấy). Tách bỏ phần mô bao phía tr ên đốt thân để lộ đỉnhsinh trưởng. Cũng bằng dao mổ cắ t lấy chồi đỉnh 0,4 x 0,4mm v à đặt vào môi trườngnuôi cấy.

Môi trường nuôi cấy môMôi trường cấy hạt sau khử trùng: MS (Murashige-Skoog, 1962) không chất sinhtrưởng.

Môi trường nuôi cấy đốt thân cây in vitro:

1. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA

2. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 2,2g/l picloram + 1,38g/l L - proline + 3,4mg/l nitrate bạc


Môi trường nuôi cấy chồi đỉnh (kích th ước 0,4 mm) thân cây in vitro:

3. MS + 0 - 0,05mg/l BA

4. MS + 0,05mg/l NAA + 1-2mg/l BA

5. MS + 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA

Môi trường tạo vườn cây từ cụm chồi (môi trường số 6): MS + 0,1mg/l NAA + 1mg/l BA

Môi trường nuôi cây: MS không chất sinh tr ưởng.

Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy:Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pITB-

FERRITIN (do TS. Nguyễn Hữu Tâm thiết kế) mang gen tạo protein gi àu chất sắt(ferritin) và gen kháng hygromycin hph.

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin v à 25mg/lstreptomycin. Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắcqua đêm trong môi trường khoáng AB (Chilton và cs., 1974) cũng chứa các kháng sinhnhư trên. Nhiệt độ nuôi cấy: 25- 28oC.

Quy trình chuyển gen:Các cụm mô đang trong quá tr ình tái sinh (kích thước 0,5 x 0,5mm) hình thành từ

đốt thân hoặc/và chồi đỉnh trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (môi trườngsố 1) được dùng làm vật liệu chuyển gen.

Tóm tắt quy trình chuyển gen:1. Nuôi các cụm mô trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ngày.

2. Tạo vết thương bằng cách châm đầu lưỡi dao mổ nhọn vào mô, lây nhiễm mô vớivi khuẩn trong thời gian 10 phút. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằnggiấy lọc.

3. Nuôi chung mô với vi khuẩn trong 2 ngày (sử dụng môi trường số 1 có bổ sungacetosyringone 100 M).


5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy mô trên môi trường chọn lọc: môi trường số 1 cónồng độ hygromycin 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Thời gian chọn lọc15 ngày.

6. Tiếp tục chọn lọc tế bào thêm 3 chu kỳ (15 ngày / chu kỳ) trên môi trường chọn lọcnhư trên nhưng có 30mg/l hygromycin.

7. Cấy truyền các mô sang môi trường số 6 cũng bổ sung 30mg/l hygromycin, thờigian nuôi 20-30 ngày.


Kiểm tra cây chuyển gen:1. Tách cây và cấy cây sang môi trường MS không chất sinh trưởng có 30mg/l

hygromycin, thời gian theo dõi sự sinh trưởng khoảng 15 ngày.

2. PCR: Sự hiện diện của gen hph đang được kiểm tra dùng cặp mồi đặc hiệu: H1:CGTCGTTCGAGAAGTTTC, H2: TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ìnhnhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.


Về nuôi cấy mô:- Nuôi cấy đốt thân:

Trong nghiên cứu này, nói chung có sự hình thành hai loại hệ thống mô khác nhau:một là, mô sẹo có khả năng sinh phôi, h ình thành trên cả hai môi trường số 1 và 2, vớitỷ lệ cao hơn trên môi trường số 2 (60%); hai là, mô sẹo mang phác thể chồi (đang trongquá trình tái sinh) chỉ hình thành trên môi trường số 1 với tỷ lệ khoảng 52 %; và nhưvậy trên môi trường số 1 có sự hình thành cả hai loại mô nói trên. Theo chúng tôi, có sựhình thành hai loại mô nói trên trên môi trường số 1 là do môi trường nuôi cấy có mộtlượng auxin 2,4-D nhất định thúc đẩy sự tạo mô sẹo v à có cytokinin BA tạo sự phân hoáchồi. Thành phần môi trường số 2 có acid amin L - proline và tác nhân ức chế hìnhthành ethylen là nitrate bạc, theo một số tác giả, cần thiết cho sự h ình thành mô sẹo cókhả năng sinh phôi đối với cây ngô với tần số cao.

- Nuôi cấy chồi đỉnh:

Trên môi trường có 0,05mg/l NAA và 0,1mg/l BA, tất cả các chồi đỉnh đều phát triểnthành cây đơn. Khi giữ nguyên lượng NAA và có lượng BA tăng cao hơn (1mg/l), có sựhình thành cụm chồi với tỷ lệ khoảng 35% tương tự như hệ thống cụm chồi ở kết quảnghiên cứu trước đây [3]. Trên môi trường có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA, khoảng trên 50%số chồi đỉnh nuôi cấy hình thành cả hai loại mô như trong trường hợp nuôi cấy đốt thân.

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô cây ngô, trên thế giới cũng như trong nước, có mộtsố vật liệu phổ biến dùng để tạo mô sẹo là phôi non [4,6,18], mô thuẫn (scutellum) hoặcđốt thân phôi trưởng thành [14,20]… Phôi non được sử dụng nhiều do khả năng đápứng cao đối với sự hình thành mô sẹo phôi hoá cũng như tái sinh. Tuy nhiên, việc thuphôi non phụ thuộc vào thời vụ, gây trở ngại cho nghiên cứu. Do vậy, trong nghiên cứunày, theo hướng của các tác giả Sidorov v à cs., 2006 [20], chúng tôi sử dụng đốt thâncây in vitro làm nguyên liệu tạo mô cần thiết. Việc dùng nguyên liệu này mang tính chủđộng cao và nhận thấy mô cũng có đáp ứng khá tốt với nuôi cấy.

Về chuyển gen:Qua sử dụng mô sẹo đang trong quá tr ình tái sinh để chuyển nạp gen bằng phương

pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi bước đầu nhận được 2 dòngmô có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin. Thực tế nghiên


cứu của chúng tôi cho thấy có vấn đề khó khăn trong việc sử dụng mô sẹo phôi hoá đểnghiên cứu chuyển gen dùng vi khuẩn là mô sẹo sau khi xử lý vi khuẩn, nuôi chung, rửavà cấy chọn lọc thường trở nên nhão và chết với tỷ lệ rất lớn. Chúng tôi đang tiếp cậnhướng sử dụng phương pháp bắn gen nhằm loại bỏ một số yếu tố có thể gây ảnh h ưởngxấu trên mô như thao tác cơ học xử lý vi khuẩn, rửa, thấm khô mô… v à cũng có thể sựkhó khăn trên đây là do yếu tố giống. Khả năng tạo mô sẹo phôi hoá với tần số thấpcũng như duy trì nó trong thời gian dài mà không giảm khả năng tái sinh đã khiến mộtsố tác giả trên thế giới tiếp cận phương pháp dùng chồi đỉnh (intact tisue) để nghiên cứuchuyển gen [12,13]. Điểm thuận lợi của chúng tôi khi sử dụng hệ thống mô sẹo đangtrong quá trình tái sinh là loại mô này không giảm khả năng tái sinh trong thời gian dàicấy truyền. Được biết đến nay, đã có nhiều phương pháp chuyển gen được áp dụng trênđối tượng cây ngô như bắn gen [16,18,21,22], dùng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens [12,13,15, 20], dùng xung đi ện [5,7,9,17,19] nhưng hiện nay chỉ haiphương pháp bắn gen và dùng vi khuẩn là còn được áp dụng nhiều.

KẾT LUẬNQua nghiên cứu nuôi cấy đốt thân, chồi đỉnh v à chuyển nạp gen trên giống ngô Nếp

Tiền Giang, chúng tôi có một số kết luận sau:

Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp tạo loại mô vừa mang khảnăng tái sinh cao vừa có thể được dùng cho nghiên cứu chuyển nạp gen là môitrường MS có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA. Khả năng tái sinh cây đối với loại mônày có thể được duy trì trong thời gian dài.

Chồi đỉnh qua nuôi cấy có thể phát triển theo hướng tạo dạng mô sẹo mang phácthể chồi hoặc theo hướng tạo cụm chồi tuỳ theo loại chất điều ho à sinh trưởng vànồng độ được sử dụng.

Qua chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen hph và gen tạoprotein giàu sắt (ferritin), bước đầu chúng tôi đã chọn được 2 dòng mô ngô có khảnăng sinh trưởng tốt trên môi trường có 30mg/l hygromycin.

LỜI CÁM ƠNCác tác giả xin chân thành cám ơn Chương tr ình Nghiên cứu cơ bản đã tài trợ cho

nghiên cứu này.

Hình 1: Mô sẹo có khả năng sinh phôi d ùng chuyển gen. 2: Cụm mô kháng hygromycin.3: Thử GUS dương tính đối với mô chồi. 4: Kết quả PCR d ương tính gen hph với băng

DNA 800 bp. 5: Kết quả PCR dương tính gen tạo ferritin với băng DNA 700 bp

1 2 3

4 5



1. Trần Thị Dung, Trần Trung Hiếu, 2000. Bước đầu chuyển gen vào cây bắp (Zeamays L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens . Tập san KHKT Nông Lâmnghiệp 2: 59-61, Trường ĐH. Nông Lâm T/p HCM.

2. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Văn Uyển, 2003. Một sốnghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây ngô (Zeamays L.). Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, HàNội, 16-17/12/2003, tr. 1096-1101. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z. Y. Tkaschuc, L. V. Tkaschuc, 1995. T ạocụm chồi cây ngô (Zea mays L.) từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt nuôi cấy in vitro.Tạp chí Khoa học và Công nghệ 4: 6-9.

4. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Phạm Minh Thợi, Đỗ Năng Vịnh, 2003. Nghiêncứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen cây ngô. Tuyển tập Báocáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, tr.820-825. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

5. D’Halluin, K., E. Bonne, M. Bossut, M. De Beuckeleer, J. Leemans, 1992.Transgenic maize plants by tissue electroporation. The Plant Cell 4: 1495-1505.

6. Danson, J. W., M. Lagat, M. Mbogori, 2006. Screening tropical maize lines for theproduction and regeneration of friable and embryogenic type II callus. AfricanJournal of Biotechnology 5(230): 2367-2370.

7. Fennell, A., R. Hauptmann, 1992. Electroporation and PEG delivery of DNA intomaize microspores. Plant Cell Reports 11: 567-570.

8. Frame, B. R. et al., 2002. Agrobacterum tumefaciens-mediated transformation ofmaize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129: 13-22.

9. Fromm, M. E., L. P. Taylor, V. Walbot, 1986. Stable transformation of maize aftergene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793.

10. Goto, F., T. Yoshihara, H. Saiki, 1998. Iron accumulation in tobacco plantsexpressing soybean ferritin gene. Transgenic Research 7: 173-180.

11. Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa, 1999. Iron fortificationof rice seed by the soybean ferritin gene. Nature Biotechnology 17: 282-286.

12. Gould, J., M. Devey, O. Hasegawa, E. C. Ulian, G. Peterson, R. H. Smith, 1991.Transformation of Zea mays L. using Agrobacterum tumefaciens and the shootapex. Plant Physiol. 95: 426-434.

13. Grave, A. C. F., S. L. Goldman, 1986. The transformation of Zea mays seedlingswith Agrobacterium tumefaciens . Plant Molecular Biology 7: 43-50.

14. Huang, X. Q., Z. M. Wei, 2004. High-frequency plant regeneration through callusinitiation from mature embryos of maize (Zea mays L.). Plant Cell Reports 22: 793-800.


15. Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro, 1996. Highefficiency transformation of maize ( Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology 14: 745-750.

16. Klein, T.M., T. Gradziel, M. E. Fromm, J. C. Sanford, 1988. Factor influencinggene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles.Bio/Technology 6: 559-563.

17. Laursen, C. M., R. A. Krzyzek, C. E. Flick, P. C. Anderson, T. M. Spencer, 1994.Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culturecells. Plant Molecular Biology 24: 51-61.

18. O’Kennedy, M. M., J. T. Burger, D. K. Berger, 2001. Transformation of elite whitemaize using the particle inflow gun and detailed analysis of a low -copy integrationevent. Plant Cell Reports 20: 721-730.

19. Planckaert, F., V. Walbot, 1989. Transient expression after electroporation ofprotoplasts derived from embryogenic maize callus. Plant Cell Reports 8: 144-147.

20. Sidorov, V., L. Gilbertson, P. Addae, D. Duncan, 2006. Agrobacterium-mediatedtransformation of seedling-derived maize callus. Plant Cell Reports 25: 320-328.

21. Southgate, E. M., M. R. Davey, J. B. Power, R. J. Westcott, 1998. A comparison ofmethods for direct gene transfer into maize ( Zea mays L.). In Vitro Cell Dev. Biol. -Plant 34: 218-224.

22. Vain, P., M. D. McMullen, J. J. Finer, 1993. Osmotic treatment enhances particlebombardment-mediated transient and stable transformation of maize. Plant CellReports 12: 84-88.

SUMMARYPlant regeneration system and genetic transformation of

maize (Zea mays L.) with the ferritin gene via Agrobacteriumtumefaciens

Nguyen Phuong Nam, Le Tan Duc, Pham Duc Tri,Nguyen Huu Tam, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen


Nodal sections of 10 - 15 day old seedlings (Nep, Tien Giang province) were cut andcultured on the media: MS + 0.5mg/l 2,4-D + 1mg/l BA or MS + 0.5mg/l 2,4-D + 2.2g/l picloram + 1.38g/l L - proline + 3.4mg/l silver nitrate for the formation ofregenerating callus and/or embryogenic callus. Shoot apex culture (0.4mm in size) werealso carried out. There was the formation of multishoot from shoot apex cultured on theMS medium containing NAA (0.05mg/l) and BA (1-2mg/l). The regenerating calli wereused for genetic transformation via the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404with the aim to enhance the ferritin in the transformed plants.


NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI VÔ TÍNH CÂY KHOAI M Ì(Manihot esculenta Crantz)

Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu HổPhòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦUTrong 10 năm trở lại đây, việc trồng khoa i mì ở Việt Nam phát triển mạnh. Năm

1995, trên cả nước, diện tích trồng khoai m ì là 277,4 nghìn ha, sản lượng đạt 2211,5nghìn tấn; đến năm 2004, diện tích trồng tăng đến 383,6 ngh ìn ha, sản lượng đạt 5572,8nghìn tấn (Theo tài liệu Tổng cục Thống kê).

Ngoài vai trò là cây lương thực quan trọng, khoai m ì ngày nay còn là nguyên liệutrong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tinh bột khoai m ì được sử dụng để sản xuấtcác sản phẩm công nghệ sinh học đang đ ược quan tâm. Do đó, đầu tư và quản lý cácgiống khoai mì có chất lượng tốt và ổn định cho từng mục tiêu đặt ra là rất cần thiết.Khoai mì ra hoa không đều, sinh sản tự nhiên thấp, mức dị hợp tử cao, giao phối c ùnggiống cao nên việc ứng dụng các phương pháp cổ điển trong công tác giống khó khăn.Công nghệ sinh học đã đưa ra những công cụ tiên tiến, bổ sung cho các phương phápchọn giống cổ điển, nhằm bảo tồn, phục tráng giống tốt trong tự nhi ên, tạo ra các tínhtrạng ưu việt mới như tính kháng bệnh, sâu, tăng hàm lượng protein trong củ, giảm hàmlượng cyanogenic glucoside, tăng thời gian tồn trữ. Xây dựng được hệ thống nuôi cấymô hiệu quả sẽ là nền tảng cho nhiều nghiên cứu ứng dụng thực tiễn quan trọng, tronglĩnh vực công nghệ sinh học ở cây khoai m ì.

Nghiên cứu sự tạo phôi vô tính, phát triển th ành cây in vitro, và kiện toàn các bướcđưa cây ra trồng trong vườn ươm đã được thực hiện tại phòng Công nghệ gen Viện Sinhhọc Nhiệt đới. Giống khoai m ì KM 140, do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp MiềnNam cung cấp, đã được sử dụng trong nghiên cứu này.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu

- Đối tượng thực vật:Giống khoai mì KM 140. Đây là giống nhập nội đã thích nghi với điều kiện môi

trường Việt Nam, có hàm lượng tinh bột ở củ cao 27 -28%, thời gian canh tác ngắn,khoảng 6 tháng.

- Môi trường nuôi cấy:+ Môi trường cơ bản (KM): Khoáng đa lượng, vi lượng MS; vitamin B5, có bổ sung

thành phần CuSO4 0,5mg/l, casein thủy phân 50mg/l: đường 30g/l, agar 9g/l, pH 5,8.

+ Môi trường tạo phôi và phát triển cây: bổ sung thành phần chất điều hòa sinh


trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), p - fluorophenoxyacetic acid (4 -FA),Gibberellic acid (GA3).

Phương pháp

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của láCắt các thùy lá chân vịt non có chiều dài từ 2 - 6mm của cây mới vô mẫu hoặc từ

cây in vitro sau khi cấy truyền khoảng 10 ngày (hình 1a) và nuôi cấy tạo mô sẹo. Môitrường sử dụng là môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 12 mg/lhoặc 4-FA ở các nồng độ 2, 4, 6, 8.

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi của mô sẹoCác mẫu tạo mô sẹo được nuôi cấy tiếp trên cùng môi trường và tiếp tục theo dõi

thời gian hình thành phôi, số lượng phôi so với mẫu ban đầu, các giai đoạn phát triểnđiển hình của phôi.

Giải phẫu và nhuộm mẫu Nhằm quan sát các giai đoạn phát tr iển của mẫu từ mô sẹothành phôi theo phương pháp c ủa Nguyễn Tiến Bân và cs. (1979).

Khảo sát ảnh huởng của GA 3 đến sự phát triển từ phôi thành cây

Phôi phát triển đến giai đoạn cuối cùng sẽ được tách ra và cấy trên môi trường cơ bản cóbổ sung thành phần GA3 ở các nồng độ khác nhau 0,1; 0,2; 0,3mg/l và đối chứng để theodõi ảnh hưởng của GA3 đối với thời gian phôi phát triển th ành cây hoàn chỉnh. Chuyển cây in vitro ra trồng trong nhà lưới

Cây in vitro phát triển hoàn chỉnh từ phôi có chiều cao từ 5 - 7cm được đưa ra trồngtrong nhà lưới. Trong tuần đầu cây được đặt trong khung có ny lông bao kín và đượctưới phun sương 3 lần/ ngày để tránh sự thoát hơi nước của cây. Đến tuần thứ hai, câyđược mang ra khỏi khung ny lông, t ưới phun sương 3 lần/ ngày.

KẾT QUẢ

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA lên sự tạo mô sẹo của mẫu láCác thùy lá được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có 2,4-D đến ngày thứ 5, 6

thì mô sẹo bắt đầu hình thành ở vùng cuống và mép thùy lá. Khoảng 28 ngày mô sẹophát triển đầy mặt lá, các khối mô sẹo mềm, dạng thùy, trơn láng và có màu nâu nh ạt.

Bảng 1: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 2 v à thứ 5

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)Nghiệm thức Ký hiệumôi trường (MT)

Nồng độ2,4-D (mg/l) Tuần thứ 2 Tuần thứ 5

1 ĐC 0 0 G 0 G2 D2 2 11,11 ± 1,92 F 55,56 ± 1,93 F3 D4 4 38,89 ± 1,92 D 70,00 ± 3,33 D4 D6 6 76,67 ± 3,34 A 95,56 ± 1,93 A5 D8 8 58,89 ± 1,92 B 84,44 ± 1,93 B6 D10 10 48,89 ± 1,92 C 78,89 ± 1,92 C7 D12 12 27,78 ± 1,92 E 64,44 ± 1,93 E

**CV (%) = 5,49 **CV (%) = 3,21


Ở nghiệm thức 4, bảng 1, trên môi trường có 2,4-D nồng độ 6mg/l, mẫu hình thànhmô sẹo đạt tỷ lệ cao nhất 95,56%. Ở môi trường đối chứng (2,4-D nồng độ 0mg/l), mẫulá gia tăng kích thước nhưng không có dấu hiệu tạo mô sẹo. Ở tuần thứ 2, có sự hìnhthành rễ từ cuống và bìa một số mẫu lá.

Trên môi trường bổ sung 4-FA, sự hình thành mô sẹo chậm hơn. Hình thái mô sẹophát triển cũng tương tự như trên môi trường 2,4-D, tuy nhiên có sự hình thành các cụmmô nhỏ xốp trắng đục.

Bảng 2: Ảnh hưởng của 4-FA lên sự tạo mô sẹo sau tuần nuôi cấy thứ 3 v à thứ 6

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)Nghiệm thức Ký hiệuMT

Nồng độ4FA (mg/l)

Tuần thứ 3 Tuần thứ 6

1 ĐC 0 0 E 0 E

2 F2 2 21,11 ± 1,92 C 56,67 ± 3,34 C

3 F4 4 56,67 ± 3,34 A 85,56 ± 1,93 A

4 F6 6 42,22 ± 1,92 B 70,00 ± 3,33 B

5 F8 8 15,56 ± 1,93 D 47,78 ± 1,92 D

**CV (%) = 7,78 **CV (%) = 4,68

Nghiệm thức 3, bảng 2, môi trường có 4-FA nồng độ 4mg/l cho kết quả tốt nhất với56,67% mẫu tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 v à 85,56% ở tuần nuôi cấy thứ 6 (tỷ lệthấp hơn so với nghiệm thức tạo mô sẹo cao nhất tr ên môi trường có 2,4-D).

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và 4-FA đến khả năng sinh phôi của mẫu mô sẹoBảng 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng sinh phôi

Nghiệm thức Ký hiệuMT

Nồng độ2,4D (mg/l)

Tỷ lệ mẫusinh phôi (%) Tổng số phôi

1 ĐC 0 0 0 G

2 D2 2 16,67 25,00 ± 1,00 E

3 D4 4 26,67 39,33 ± 1,53 D

4 D6 6 58,89 76,00 ± 2,00 A

5 D8 8 36,67 60,33 ± 1,53 B

6 D10 10 20,00 47,00 ± 1,00 C

7 D12 12 7,78 11,67 ± 1,53 F

**CV = 3,68%

Trên môi trường có 2,4-D, sau 40 ngày nuôi cấy, phôi bắt đầu hình thành trên khốimô sẹo. Phôi tạo thành từng cụm gồm trung b ình 4,5 phôi nằm cạnh nhau. Theo dõi đếnngày 70 thì số lượng phôi hình thành không tăng.

Kết quả ở bảng 3 cho thấy nghiệ m thức 4, môi trường cơ bản có bổ sung 2,4-D ởnồng độ 6 mg/l, cho có ảnh hưởng tốt nhất đến sự phát sinh phôi, đạt 58,89% mẫu cấysinh phôi và tổng số phôi thu nhận được là 76 phôi.

Trên môi trường có 4-FA, sau 45 - 50 ngày phôi mới bắt đầu hình thành trên các


khối mô sẹo, chậm hơn so với trên môi trường có 2,4-D. Đến ngày thứ 75, số phôi tạothành không tăng thêm. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.

Bảng 4: Ảnh hưởng của 4-FA đến khả năng sinh phôi

Nghiệm thức Ký hiệuMT

Nồng độ4FA (mg/l)

Tỷ lệ mẫu sinhphôi (%) Tổng số phôi

1 ĐC 0 0 0 E

2 F2 2 34,44 46,00 ± 2,00 B

3 F4 4 57,78 101,67 ± 3,51 A

4 F6 6 20,00 29,67 ± 1,53 C

5 F8 8 8,89 16,67 ± 0,58 D

**CV = 5,02%

Kết quả ở bảng 4 cho thấy nghiệm thức 3 (môi tr ường có bổ sung 4 -FA ở nồngđộ 4 mg/l) đạt được giá trị cao nhất ở các chỉ ti êu theo dõi là 57,78% mẫu cấy sinh phôivà có tổng số phôi thu nhận được là 101,67 phôi.

Số phôi cao nhất nhận được từ môi trường có bổ sung 2,4-D (6mg/l) thấp hơn ở môitrường có bổ sung 4-FA (4mg/l), nhưng thời gian hình thành phôi nhanh hơn. Quá trìnhhình thành phôi trên môi trường có 2,4-D và 4-FA được ghi nhận qua các giai đoạn là thuầnthục và điển hình từ dạng cầu, tim thủy lôi và dạng có cực chồi và rễ (hình 1b-f).

Giải phẫu và nhuộm mẫuPhẫu thức các giai đoạn phát triển của phôi được nhuộm và quan sát rõ ràng dưới

kính hiển vi vật kính (x10) (H ình 2).

Khảo sát ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôiPhôi trưởng thành, thu nhận từ môi trường có bổ sung 2,4-D và 4-FA được cấy

truyền sang môi trường có bổ sung GA3. Sau 15 ngày, thân mầm vươn cao và rễ hìnhthành. Từ 22 - 25 ngày, hai lá mầm của cây tách ra, chồi ngọn xuất hiện với các lá ho ànchỉnh và phát triển thành cây bình thường. Một số phôi dị dạng không phát triển th ànhcây hoàn chỉnh, hoặc chết đi trong quá trình nuôi cấy.

Bảng 5: Ảnh hưởng của GA3 đến sự phát triển của phôi thu nhận từ môi tr ường có bổ sung2,4-D và 4-FA

Tỷ lệ phôi cólá và rễ mầm

(%)

Tỷ lệ phôi pháttriển thành câyhoàn chỉnh (%)

Tỷ lệ phôi cólá và rễ mầm

(%)

Tỷ lệ phôi pháttriển thành câyhoàn chỉnh (%)

Nghiệmthức

KýhiệuMT

Nồng độGA3

(mg/l)từ MT có bổ sung 2,4-D từ MT có bổ sung 4-FA

NT1 ĐC 0 54,44 3,33 ± 3,33 D 51,11 2,22 ± 1,92 D

NT2 G1 0,1 71,11 15,56 ± 1,93 C 70,00 17,78 ± 1,92 C

NT3 G2 0,2 85,56 36,67 ± 3,34 B 83,33 35,55 ± 3,85 B

NT4 G3 0,3 92,22 63,33 ± 3,34 A 91,11 62,22 ± 3,85 A

**CV = 10,24% **CV = 10,34%

Trên môi trường có bổ sung GA3 0,3mg/l, tỷ lệ phôi phát triển thành cây hoàn


chỉnh cao nhất ở cả hai trường hợp phôi thu nhận từ môi tr ường bổ sung 2,4-D và môitrường bổ sung 4-FA. Ở nghiệm thức 1, đối chứng, tỷ lệ phôi phát triển th ành cây hoànchỉnh rất thấp.

Chuyển cây in vitro ra trồng trong nhà lướiCây con in vitro cao khoảng 5-7cm được chuyển ra trồng trong bầu đất ngo ài vườn

ươm. Sau một tuần cây bén rễ và ra lá non mới, tỉ lệ cây sống và phát triển bình thườnglà 94 %. Chuyển cây sang chậu đất sau một tháng cây cao khoảng 50 - 60cm. (Các giátrị trung bình trong các bảng không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rấ tcó ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm LSD)

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Trên môi trường có bổ sung 2,4-D mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy. Môi tr ườngcó nồng độ 2,4-D 6mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo cao nhất là 95,56% sau 5tuần. Phôi bắt đầu hình thành ở tuần thứ 6. Cũng trên môi trường này tỉ lệ phôi hìnhthành cao nhất 58,89% với 76 phôi.

Đối với môi trường có bổ sung 4-FA, thời gian các mẫu cảm ứng tạo mô sẹo lâuhơn và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp hơn so với 2,4-D. Mẫu bắt đầu hình thành mô sẹosau 3 tuần và đạt tỷ lệ tối đa sau 6 tuần nuôi cấy. Ở nồng độ 4mg/l 4-FA mẫu tạomô sẹo cao nhất là 85,56%. Môi trường này cũng cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất l à57,78%, với 101,67 phôi.

GA3 có ảnh hưởng rõ rệt đến việc phát triển phôi thành cây hoàn chỉnh. Ở các nồngđộ thí nghiệm, môi trường bổ sung GA3 0,3mg/l là môi trường thích hợp nhất đểkích thích phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Tỷ lệ đạt được khoảng 63%.

Tỷ lệ sống của cây con khi chuyển từ trong b ình ra vườn ươm cây là 94%.

Có thể ứng dụng quy trình tạo phôi khoai mì cho các nghiên cứu chuyển gen để tạogiống mới.

Hình 1: Tạo phôi vô tính.a: cây khoai mì in vitrob, c, d: phôi phát triển qua các dạnghình cầu, hình tim, hình thủy lôie, f: phôi trưởng thành dạng có cực

Hình 2: Phẫu thức môa: phôi hình cầu; b: phôi hình timc, d: phôi dạng thủy lôi cắt dọcd: phôi trưởng thành có hai sơkhởi lá



1. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại c ương, phần II: Phát triển. NXB Đạihọc Quốc gia TP HCM, 187 - 223.

2. Brenda J. B., Micheal K. S., Kenneth J. S. (1986). The use of embryo culture forthe recovery of plants from cassava (Manihot esculenta Crantz) seeds. Plant CellTiss. Org. Cul. 6: 229-234.

3. Gonzalez A. E., Schopke C., Taylor N. J. (1998). Regeneration of transgenic cassavaplants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium-mediated transformation ofembryogenic suspension cultures. Plant Cell Reports 17: 827 – 831.

4. Hoàng Kim, Phạm Văn Biên (1995). Cây sắn (Khoai mì). Nhà xuất bản Nôngnghiệp, TP HCM. 66 tr.

5. Hoàng Thị Sản (chủ biên), Hoàng Thị Bé. Phân loại học thực vật. Nh à xuất bảnGiáo dục, 77 - 126.

6. Kartha K. K., Gamborrg O. L. (1975). Elimination of cassava mosaic disease bymeristem culture. Phytopathology 65: 862 - 868.

7. Li H. Q., Gui J. I., Huang Y. W. (1998). Regeneration of cassav a plants via shootorganogenesis. Plant Cell Rep. 17: 410-414.

8. Nguyễn My Uyên (2003). Phát sinh hình thái từ mô sẹo cây Paulownia fortunei v àthăm dò khả năng biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Luận vănthạc sĩ sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM.

9. Sofiary E., Reamakers C. J. J. M., Kanju E. (1997). Comparison of NAA and 2.4 -Dinduced somatic embryogenesis in cassava. Plant Cell Tissue and Organ Culture50: 45 - 46.

10. Stamp J. A., Henshaw G. G. (1987). Somatic embryogenesis from clonal leaftissues of cassava.

11. Annuals of Botany 59: 445 - 450.12. Trung tâm Tư liệu - Tổng Cục Thống kê Việt Nam http://www.gso.gov.vn

SUMMARYSomatic Embryogenesis in Cassava

Phan Tuong Loc, Nguyen Huu HoInstitute of Tropical Biology

Somatic embryos were obtained from immature leaf lobe explants of cassavacultured in vitro on the KM medium containing 6mg/l 2,4-D or 4mg/l 4-FA. Maturesomatic embryos were transferred to the medium supplemented with 0.3mg/l GA3 forelongating and rooting. In vitro plants were transplanted into soil. They were apparentlynormal, similar to the stock plants.


XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH in vitro CÂY HỒTIÊU (Piper nigrum. L) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN

NẠP GEN TẠO protein lect in KHÁNG CÔN TRÙNG

Nguyễn Thị Thanh, Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu HổPhòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp quan trọng có giá trị kinh tế caovà là cây gia vị được sử dụng rộng rãi trên thế giới (8), do hạt tiêu có vị nóng cay vàmùi thơm hấp dẫn, nên rất thích hợp cho việc chế biến thức ăn (3). Ngo ài ra, hạt tiêucòn được dùng trong ngành công nghiệp chế biến hương liệu, nước hoa và trong y dược.Trong những năm gần đây, sản xuất và xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam đã có bước pháttriển mạnh mẽ. Từ sản lượng 10.000 tấn và xuất khẩu 7.000 tấn năm 1996 đến năm2006 ước tính sản lượng và xuất khẩu đạt hơn 100.000 tấn và Việt Nam hiện nay, chiếmvị trí số một thế giới cả về số l ượng lẫn giá trị xuất khẩu hạt ti êu. Tuy nhiên để giữ vữngvị trí số một như hiện nay, sản lượng hồ tiêu khó tăng nhanh trong những năm tới, donăng suất còn thấp, chi phí cho hóa chất phòng trừ bệnh hại hồ tiêu cao, làm hạn chếkhả năng tăng năng suất và diện tích gieo trồng. Muốn tăng năng suất của hồ ti êu cả vềsố lượng và chất lượng, vấn đề đặt ra là làm sao tạo được những giống hồ tiêu sạch bệnhcó khả năng kháng virus, nấm… (2,7,10,11).

Để tạo ra giống (dòng) mới, sạch bệnh, một số phương pháp tiếp cận khác như táisinh cây bằng nuôi cấy phôi soma (4,8,9), đỉnh sinh tr ưởng, mô sẹo từ rễ, cuống lá, đốtvà mẫu mô lá (1,5,12) và bước đầu chuyển nạp gen vào cây hồ tiêu thông qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens (14) đã và đang được nghiên cứu.

Do đó, mục đích của nghiên cứu này nhằm tìm ra giống hồ tiêu cao sản có khả năngtái sinh cao, hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro cây hồ tiêu phục vụ cho các nghiên cứuvề chuyển nạp gen vào cây hồ tiêu trong tương lai.


Giống

Các giống hồ tiêu được dùng nghiên cứu là : Phú Quốc, Vĩnh Linh: Hạt hồ tiêuđược khử trùng và dùng làm nguyên liệu in vitro để tạo mô sẹo, chồi, lấy mẫu lá, thân,cuống lá cho nghiên cứu.


Môi trường nuôi cấy

1. Môi trường nuôi cấy in vitro MS (6)

2. Môi trường tạo mô sẹo từ hạt, rễ SH: (0,1-2 mg/l) 2,4-D + 0,1mg/l Kinetin.

3. Môi trường tái sinh chồi từ mẫu mô lá: MS + 1,5mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin +0,1mg/l IBA + 10% nước dừa

4. Môi trường tái sinh chồi từ đốt thân, cuống lá: MS + 2mg/l BAP + 0,1mg/lKinetin + 0,5mg/l IBA + 10% nước dừa

5. Môi trường giữ giống in vitro cây hồ tiêu: ½ MS + 0,1mg/l IBA + 10% nướcdừa + 0,1 % than hoạt tính.

Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ từ 25-26oC. Giai đoạn cho nẩy mầm từ hạt, giai đoạn tạo mô sẹo, nuôi cấytrong tối ở nhiệt độ 25oC. Cây tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá và thân thời gian chiếusáng 10 giờ/ngày.

Phương pháp

Hạt hồ tiêu được thu hoạch tại các vườn trồng hồ tiêu tại Phú Quốc, Đắk Lắk. Rửasạch và khử trùng bằng cồn 70o cho 1 phút, sau đó ngâm trong dung d ịch HgCl2 (0,1%),rửa với nước vô trùng ít nhất 6 lần, tiếp theo ngâm hạt v ào dung dịch cefotaxime 0,1%hoặc nước javels 40%, thời gian khử tr ùng khác nhau từ 30-60 phút. Hạt vô trùng đượcđặt trong môi trường MS cho hạt nẩy mầm, hoặc môi tr ường SH có bổ sung 2,4-D vớicác nồng độ khác nhau để tạo mô sẹo,

Hạt nẩy mầm chuyển sang môi tr ường ½ MS mới để tạo cây. Mô sẹo h ình thành,chuyển sang môi trường mới để nhân sinh khối mô sẹo.

Lá của cây sinh trưởng tốt như hình 2, cắt ra rừng mảnh khoảng 5cm và đặt trênmôi trường tái sinh (môi trường số 3), để tạo chồi.

Cắt đốt cây vô trùng, sau đó chẻ dọc làm đôi, và cuống lá, đặt lên môi trường 4, đểtạo mô sẹo và chồi. Các chồi sau đó được cấy trên môi trường số 5 để tạo rễ và giữgiống in vitro.

Ảnh hưởng của hygromycin lên sự tái sinh chồi hồ tiêu từ mô lá.

KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

1. Tạo giống vô trùng in vitro

Hồ tiêu là loại cây mang nhiều mầm bệnh nội sinh (7,11), bởi vậy điều quantrọng là làm sao loại bỏ được các mầm bệnh nội sinh trong hồ ti êu như nấm, virus, vikhuẩn nằm bên trong mô cây, hạt. Các phương pháp thông thư ờng khử trùng nhưdùng cồn và nước javel, không loại trừ được các mầm bệnh. Các mẫu qua xử lý tr ên


cho thấy: mặc dù khi sử dụng các chất có khả năng diệt khuẩn cao nh ư HgCl2 0,1 %trong 10 phút, mẫu khử trùng hạt vẫn nhiễm rất cao từ 80-90% sau 1 tháng trên môitrường nuôi cấy. Do đó phương pháp khử trùng hạt nêu trên thu được mẫu vô trùngrất thấp và hạt không nẩy mầm, sau một thời gian d ài (30 ngày) gieo trên môi trư ờngMS không chất kích thích sinh trưởng.

Để nhận được mẫu vô trùng, chúng tôi sử dụng phương pháp: Lột vỏ hạt tiêu, rửasạch, ngâm vào dung dịch HgCl2 0,1 % từ 5 -10 phút, sau đó ngâm hạt trong dung dịchcefotaxin 1% trong 1 giờ. Bằng cách này chúng tôi thu nhận được mẫu vô trùng từ 80-90%. Tỉ lệ nẩy mầm cao khoảng 57% so với hạt tiêu không lột vỏ.

2. Xây dựng hệ thống tái sinh qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt

Tạo mô sẹo từ hạt: Các hạt ti êu vô trùng được đặt trên các môi trường SH, có bổsung thêm các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D có các nồng độ từ 0,1 đến 2mg/l vàkinetin 0,1mg/l. Sau một thời gian nuôi cấy, quan sát thấy mô sẹo h ình thành ở vị trí mônoãn (seed-bud), sau khoảng 3 tuần khoảng 49% tạo mô sẹo, theo chúng tôi l à do tácđộng của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo (4).

Qua nuôi cấy mô sẹo từ hạt, chúng tôi còn nhận được mô sẹo từ rễ. Rễ hồ tiêu cắtvà đặt trên môi trường SH có bổ sung 0,5mg/l 2,4-D tạo mô sẹo đạt 95%.

Mô sẹo này được cấy truyền nhân lên cùng sang môi trường như trên. Do hiệu suấthình thành mô sẹo sinh phôi cũng như tốc độ nhân mô phôi trên môi trường agar khôngcao. Chúng tôi quan tâm đến vấn đề sử dụng loại mô n ày để nghiên cứu chuyển gen,nên chúng tôi tiếp tục nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô phôi bằng cách nuôi tr ênmôi trường lỏng, lắc nhẹ khoảng 80 vòng/phút để tăng hiệu quả sinh phôi mô nuôi cấy.

3. Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ đốt, lóng cây hồ ti êu

Chồi in vitro của cây hồ tiêu cao khoảng 6-7cm được cắt thành các đốt và lóngkhoảng 1,5cm. Mỗi đốt mang một chồi ngủ, được cất trên môi trường MS có bổ sung2mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA + 10 % nước dừa. Trên môi trường này,sau 3-5 tuần nuôi cấy, quan sát thấy xuất hiện chồi mới, số chồi h ình thành từ 4- 6 chồicho đốt già và 3-4 chồi được tạo ra từ lóng (hình 4).

Nghiên cứu sự tạo chồi từ các đốt cây, cho th ấy sự khác biệt về số lượng chồi đượctạo ra. Đốt gốc và đốt giữa có khả năng tạo chồi nhiều h ơn ở đốt ngọn. Nhằm làm tăngkhả năng tạo chồi từ đốt, chúng tôi chẻ dọc đốt ra l àm đôi, hy vọng tạo thêm một sốchồi từ vết cắt.

4. Xây dựng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô láCác mảnh lá (từ các lá phát triển đầy đủ), của cây sinh tr ưởng tốt trên môi

trường ½ MS, có bổ sung thêm 0,1mg/l IBA và 10% nước dừa. Mẫu lá được đặt trênmôi trường MS có BAP 1,5mg/l + 0,1mg/l IBA + 0,1 mg/l Kinetin và 10% nước dừa.Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo h ình thành từ những vết cắt, cấy truyền mô sẹo n ày sangmôi trường mới có cùng thành phần như trên. Chồi thu nhận được sau 2 tháng nuôi cấy.


Ở nước ta và trên thế giới, nghiên cứu tái sinh trực tiếp từ mẫu mô lá đ ã được thựchiện, nhưng chưa nhiều. qua nghiên cứu tạo chồi trực tiếp từ mẫu mô lá để d ùng chophương pháp bắn gen gna cùng với gen chọn lọc hygromycin, b ước đầu chúng tôi đãnhận được một số dòng mô chống chịu được hygromycin ở nồng độ 10mg/l. Nghi êncứu chuyển gen gna vào lá hồ tiêu bằng phương pháp bắn gen đang được thực hiện.

Hình 1. Tạo cây cây hồ tiêu in vitro: A: Hạt nẩy mầm; B: Cây con in vitro;

C: Mô sẹo tạo ra từ hạt; D: Chồi tái sinh từ cuống lá.

Hình 2. Ảnh hưởng của hygromycin lên sinh trưởng của hồ tiêu: A: Đối chứng,

B: hygromycin 15mg/l

A B

C D



1. Bhat SH, Chandel KPS, and Malik SK, 1995. Pl ant regeneration from variousexplants of cultivated species. Plant Cell Reports. 14: 398 -402.

2. De Silva DPP, Jones P, and Shaw MW, 2002. Identification and transmission ofPiper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper ( Pipernigrum) in Sri Lanka. Plant Pathology. 51: 537 -545.

3. Jagella T, and Grosch W, 1999. Flavour and off -f;avour compounds of black andwhite pepper (Piper nigrum L.) II. Odour activity values of desirable andundesirable odorants of black pepper. Eur Food Res Tec hnol. 209:22-26.

4. Joseph B, Joseph D, and Philip VJ, 1996. Plant regeneration from somatic embryosin black pepper. Plant Cell, Tissue and Orgen Culture. 47: 87 -90.

5. Kelkar SM, Krishnamurthy KV, 1998. Adventitious shoot regeneration from root,internode, petiole and leaf explants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Reports.17: 721-725.

6. Murashige T, Skoog F, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: 473 -497.

7. Lockhart BEL, Kiratiya - Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, etal., 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug -transmittedbadnavirus infecting Piper ssp. In Southeast Asia. European Juornal of PlantPathology. 103:303-311.

8. Nair RR, Gupta SD, 2006. High -frequency plant regeneration through cyclicsecondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.). Plant CellReports. 24: 699-707.

9. Nair RR, Dutta Gupta S, 2003. Somatic embryogenesis and plant regeneration in blackpepper (Piper nigrum L.): I. direct somatic embryogenesis from tissue of germinatingseeds and ontogeny of somatic embryos. J Hort Sci Biotechnol.: 416-421.

10. Nguyễn Tiến Thắng, Boico AL, 2001. Virus và bệnh virus trên cây hồ tiêu ở ViệtNam. Hội nghị Quốc tế lần 3, Kiev, Ucraina.

11. Qaher A, Mandeel, 2005. Fungal contamination of some imported spices.Mycopathologia. 159:291-298.

12. Sarma YR, Kalloo G, 2004. Status of current research towards increased productionand productivity in black pepper in India. Focus on Pepper. 1:69 -86.

13. Schenk RU, Hildebrandt AC, 1972. Medium and techniques for induction andgrowth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot. 50:199-204.

14. Sim SL, Jafar R, Power JB, Davey MR, 2004. Development of an Agrobacterium -mediated transformation system for black pepper (Piper nigrum L.). ISHS Acta


Horticulturae. 461. International Symposium on Biotechnology of Tropical andsubtropical Species part 2.

SUMMARYEstablishment of in vitro plant regeneration system of black

pepper (Piper nigrum L.) for gene transfer

Nguyen Thi Thanh, Vo Phan Mi Sa, Le Tan Duc, Nguyen Huu HoInstitute of Tropical Biology

The economic importance of black pepper ( Piper nigrum L.) has lead to itsselection and breeding over thousands of year in the world. For successful gene t ransferin black pepper, efficient shoot regeneration systems are required. Regenerationfrequencies in black pepper are often low and genotype dependent. Black pepper leaf isideal explant source for biolistic transformation, but is not optimal for plantregeneration. For this reason, A high -frequency shoot regeneration protocol wasdeveloped for two commercial cultivars of black pepper (Phu Quoc and Vinh Linh) anda range of culture media were tested for development of a highly -efficient regenerationsystem from leaf, petiole, root explants and callus which was derived from micropylartissues of germinating seeds on SH media in the absence of light at 25 oC. Both cultivarsPhu Quoc and Vinh Linh were response for shoot regeneration using either one -step (forpetiole, internode and leaf explants) or two -step regeneration protocols (for callus).These genotypes were chosen for further studies.


CHUYỂN NẠP GEN Ở CÂY DÂU TÂY ( Fragaria vesca L.)NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens KẾT HỢP XỬ

LÝ SÓNG SIÊU ÂM

Mai Trường, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu HổPhòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Cây dâu tây do người Pháp du nhập vào Việt Nam đầu những năm 1930, c ó tênkhoa học là Fragaria vesca L., là kết quả của sự lai giống giữa ( Fragaria chiloensisDuch và Fragaria virginiana Duch) thuộc nhóm hai lá mầm, họ Rosacea. Trong phầnthịt quả dâu tây có chứa nhiều sinh tố thiết yếu cho con ng ười như A, B1, B2 và đặc biệtlà sinh tố C. Do đó, những dòng dâu tây mang tính thương mại cao đã được chọn vàtriển khai canh tác đại trà ở Lâm Đồng như dòng Mỹ Đá, Mỹ Hương (nhập khẩu bởi cácCông ty nghiên cứu giống), dòng HO của Nhật Bản (Phân Viện Sinh học Đà Lạt)…[1]

Hiện nay, với sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ gen thực vật, đã cho phép đưamột số gen mã hóa cho những tính trạng có ích theo nhóm sau: kháng bệnh hại (sâu, rầy, côntrùng chích hút), chống chịu ngoại cảnh bất lợi (hạn, mặn, kháng thuốc trừ cỏ), trong y d ược(tăng cường vitamin A, vắc-xin ăn được)… thông qua một số kỹ thuật biến nạp gen như bắngen (biolistic), vi khuẩn Agrobacterium, xung điện (electroporation). Riêng đối với đối tượngcây ăn quả, nhiều công trình công bố quốc tế cho thấy cây dâu tây tỏ ra có ưu thế trong việcứng dụng công nghệ gen để tạo ra những giống mang đặc tính di truyền mới. Đồng thời câydâu tây có khả năng nhân giống nhanh và trồng đại trà tạo điều kiện cho việc thử nghiệmđánh giá một số tính trạng mới [4][5][6][9][10][11][12][13].

Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả trong việc xây dựngphương pháp chuyển nạp gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lýsóng siêu âm, thông qua hệ thống nuôi cấy tái sinh từ đĩa lá dâu tây [2][3][7][8].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Nguyên liệu

Giống dâu Mỹ Đá do Phân viện Sinh học Đ à Lạt cung cấp. Mảnh lá dâu tây từ nhângiống in vitro được cắt theo dạng đĩa với kích th ước (1x1) cm, dùng làm nguyênliệu để chuyển nạp gen.

Môi trường nuôi cấy: khoáng đa lượng, vi lượng (Murashige và Skoog, 1962),vitamin B5 (Gamborg, 1968), đường 30g/l, pH 5,8.

Chất điều hòa sinh trưởng: TDZ (Thidiazuron), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid).


Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301, manggen nptII mã hóa enzyme neomycine phosphotransferase, gen ch ỉ thị gusA. Nuôilắc vi khuẩn qua đêm trên môi trường AB (Chilton, 1974), chứa kh áng sinh chọnlọc kanamycin nồng độ 50mg/l.

2. Phương pháp nghiên cứua. Phương pháp chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp

xử lý sóng siêu âm

Thí nghiệm 1: đĩa lá (1x1) cm được ngâm chung với v i khuẩn trong 20 phút. Thí nghiệm 2: đĩa lá (1x1) cm được xử lý bằng sóng siêu âm trong 3 giây bằng thiết bị

siêu âm Transsonic 660 từ hãng Elma, sau đó ngâm chung với vi khuẩn trong 20 phút. Mẫu từ thí nghiệm 1 và 2 được nuôi cấy chung với vi khuẩn 2 ngày trên môi trường

tái sinh chồi có bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng TDZ 1,5mg/l, 2,4-D 0,2mg/l (viết tắt MSDT). Đĩa lá được rửa sạch nhiều lần bằng n ước cất vô trùng, vàchuyển sang môi trường tái sinh chồi như trên, có bổ sung kháng sinh diệt khuẩnCefotaxime 500mg/l và kháng sinh chọn lọc mô chuyển gen kanamycin 20mg/l.

Cấy truyền sang môi trường mới 2 tuần/lần. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 oC + 2.

Thời gian chiếu sáng 12g/ngày.

Cường độ chiếu sáng 3.000 lux. Mỗi công thức thí nghiệm gồm 50 mẫu lá, lặp lại thí nghiệm 3 lần.

b. Phương pháp phân tích sự hiện diện của gen chuyển nạp

Hóa mô: kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng cách ngâm chồi con trong dung dịch X -Gluc. Ủ qua đêm ở 370C.

PCR (Polymerase Chain Reaction): t ách chiết DNA nhiễm sắc thể từ mô lá theophương pháp của Dellaporta (1983) và sử dụng cặp mồi (primer) đặc hiệu cho genkháng kháng sinh kanamycin (nptII):

* Primer (f): 5’ ACA CGC TGA AAT CAC CAG TCT C 3 ’

* Primer (r): 3’ CTC GTC CTG CAG TTC ATT C 5 ’

* Chương trình nhiệt độ cho PCR:* Khởi đầu:

940C / 5 phút

- Tách sợi DNA : 940C / 1 phút

- Gắn mồi: 550C / 1 phút

- Tổng hợp DNA: 720C / 2 phút

* Kết thúc: 720C / 7 phút

35 chu kỳ



Các đĩa lá đối chứng (không xử lý với sóng si êu âm và vi khuẩn) trên môi trườngdo bị ức chế mạnh bởi kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l, nên sự phát sinhhình thái chồi không diễn ra. Đa phần mô sẹo h ình thành ngay vết cắt, hóa nâu vàchết sau 45 ngày nuôi cấy.

Tác động của kháng sinh kanamycin ở nồng độ 20mg/l lên khả năng tái sinh chồicủa mẫu lá đã xử lý chuyển gen và mẫu xử lý sóng siêu âm trước khi chuyển gentrên môi trường bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ, 2,4-D sau 45 ngày:

Mẫu xử lý chuyển gen trên môi trường MSDT cho thấy sự tăng sinh mô sẹo r õ rệt trêncuống lá, rìa lá xung quanh vết cắt đĩa lá, dần hóa nâu và chết. Chỉ thu nhận duy nhất 1mẫu lá tái sinh chồi và phát triển được trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc.

Mẫu xử lý sóng siêu âm trước và chuyển gen sau đó trên môi trường MSDT, sựphát sinh hình thái chồi xuất hiện ở vị trí cuống lá, rìa lá. Sơ khởi thu nhận 2 mẫu látái sinh chồi trên môi trường chọn lọc sau 45 ngày.

Bảng 1: Tần số tái sinh chồi của thí nghiệm 1 v à 2 trên môi trường chọn lọc chứakanamycin nồng độ 20 mg/l sau 45 ngày

Môi trường nuôi cấy MSDT(có kanamycin 20 mg/l)

Số mẫu láthí nghiệm

Số mẫu látái sinh chồi

Tỉ lệ tái sinh chồi (%)

Thí nghiệm 1 150 1 0,66Thí nghiệm 2 150 2 1,33

Hình 1: Mẫu nuôi cấy trên môi trường MSDT+ kanamycin 20 mg/l sau 45 ng àyA. Mẫu đối chứngB. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống láC. Mẫu xử lý sóng siêu âm+chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí r ìa láD. Mẫu xử lý chuyển gen tái sinh chồi ở vị trí cuống lá


- Kết quả phân tích mẫu chuyển gen có xử lý trước sóng siêu âm:

KẾT LUẬN

Đã thu nhận một số chồi in vitro kháng được kanamycin ở độ 20mg/l trên môitrường tái sinh bổ sung TDZ 1 ,5mg/l, 2-4D 0,2mg/l, thông qua phương phápchuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium kết hợp xử lý sóng siêu âm.

Kết quả hóa mô cho thấy sự hiện diện của gen gusA.

Gen npt II mã hóa cho enzyme neomycine phosphotransferase, tạo tính khángkanamycin đã được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.


1. Thông tin Khoa học Công nghệ Lâm Đồng, số 4 (2002).

2. Nguyễn Văn Uyển (1995). Những ph ương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập 1& 2. NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.

3. Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue cultures. Plant Physiol 15: 473-497.

4. Jame, D. J. et al. (1990). Agrobacterium-mediated transformation of the cultivatedstrawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using disarmed binary vector. PlantScience 69: 79-94.

5. Nehra, M. S. et al. (1990a). Agrobacterium-mediated transformation of strawberrycalli and recovery of transgenic plants. Plant Cell Reports 9:10-13.

6. Nehra, M. S. et al. (1990b). Genetic transformation of strawberry by Agrobacteriumtumefaciens using leaf disk regeneration system. Plant Cell Reports 9: 293-298.

Hình 2. Sự biểu hiện tạm thời củagen gusA thông qua phương pháp

hóa mô

Hình 3. Kết quả PCR đối với gen khángkanamycin (nptII). TC: Thang chuẩn DNA(1kb). 0: Plasmid pCAMBIA 2301. 1: M ẫukhông chuyển gen. 2,3: Mẫu chuyển gen


7. Graham, J. et al. (1995). Agrobacterium-mediated transformation of soft fruit Rubus,Ribes and Fragaria. Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, N. J.44: 129-133.

8. Trick, H. N. and Finer, J. J. (1997). SAAT: Sonication Assisted Agrobacterium-mediated Transformation. Transgenic Research 6:329-336.

9. Liu, Z. R. and Sanford, J. C. (1998). Plant regeneration by organogenesis fromstrawberry leaf and runner tissue. HortScience 23:1057-1059.

10. Haymes, K. M. and Davis, T. M. (1998). Agrobacterium-mediated transformationFragaria vesca, and transmission of transgenes to R 1 progeny. Plant

Cell Reports 17: 279-283.

11. Barcelo, M. et al. (1998). Regeneration and transformation via Agrobacteriumtumefaciens of the strawberry cultivar Chandler. Plant Cell, Tissue and OrganCulture 54: 29-36, 1998.

12. Yan Zhao, Qingzhong and Davis, R. E. (2004). Transgene expression instrawberries driven by a heterologous phloem -specific promoter. Plant Cell Reports23:224-230.

13. Nhut, D. T. et al. (2005). Callus formation, shoot proliferati on and rooting byliquid culture: A novel efficient method for rapid propagation of strawberry(Fragaria vesca L.). Proceedings of Vietnam -Korea International symposium2005 on Biotechnology and Biosystem Engineering , 96-100, HCMC Uni. ofAgriculture and Forestry.

SUMMARYLeaf disk transformation system of strawberry ( Fragaria

vesca L.) using the sonication assisted Agrobacterium method

Mai Truong, Le Tan Duc, Nguyen Huu HoInstitute of Tropical Biology

Leaf disk regeneration system of strawberry ( Fragaria vesca L.) was carried outusing modified Murashige and Skoog medium ( 1962) with TDZ 1,5 mg.l-1 and 2,4-D0,2 mg.l-1. Transformation works were performed via Agrobacterium tumefacienscontaining the plasmid pCAMBIA 2301 with gusA and npt II genes. Leaf explants werepretreated with sonication in 3 seconds by Transsonic 660 unit and a 2 days ofAgrobacterium co-cultivation. After a 45-day culture under the pressure of kanamycin20 mg.l-1 as a selective agent, shoot regeneration was recovered on the med ium withTDZ 1,5 mg.l-1, 2,4-D 0,2 mg.l-1. The transformation frequency is low with percentageof 1.33. Histochemical GUS assay and PCR analysis showed the presense of gusA andnpt II genes in putative transformants.

Documents

cay khang con trung