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学校编码：10384 分类号 密级：内部

学号：20620091151253 UDC

硕 士 学 位 论 文

微生物油脂中花生四烯酸的富集工艺研究

The Enrichment of Arachidonic Acid from Microbial Oil

董 宏 祯

指导教师姓名： 汤 培 平 教 授

许 晨 研究员

专 业 名 称： 化 学 工 程

论文提交日期： 2 0 1 2 年 05 月

论文答辩时间： 2 0 1 2 年 05 月

学位授予日期： 2 0 1 2 年 月

答辩委员会主席：

评 阅 人：

2012年 月

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厦门大学学位论文原创性声明

本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成

果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，

均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究

生学术活动规范（试行）》。

声明人（签名）：

年 月 日

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厦门大学学位论文著作权使用声明

本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办

法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送

交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学

图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加

入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文

的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学

位论文。

本学位论文属于：

（√）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于

2014年 7月 1日解密，解密后适用上述授权。

（ ）2.不保密，适用上述授权。

声明人（签名）：

导师（签名）：

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摘 要

-I-

摘 要

花生四烯酸(AA)是一种重要的 ω-6 系列多不饱和脂肪酸，对人体生理功

能具有重要的调节作用，如预防心血管疾病、促进脑组织发育、改善视网膜

功能和抗炎抗癌等，已在保健食品、医药和饲料等领域得到广泛应用。市售

AA 主要从深海鱼油、动物内脏中获取，但其资源有限，远远不能满足市场需

求，微生物培养生产 AA有效解决了这一问题。本文综述了 AA分离提纯的主

要方法及其优缺点，提出用低温溶剂结晶结合分子蒸馏技术，富集微生物油

脂中的 AA。

首先，对微生物油脂中 AA的检测方法进行了研究，确定气相色谱检测条

件为：毛细管柱 HP-INNOWAX ，柱流速 1.0 mL/min；进样口温度 250 C，

检测器温度 250 C，柱温 240 C 保持 30 min，FID，分流比为 10:1。经红外

吸收光谱(IR)、气相色谱质谱(GC-MS)对衍生化后的样品做定性分析，确定各

组成成分。

接下来，选用酸催化法，考察了酯化温度、时间、催化剂体积分数和搅

拌转速的影响，确定适宜的甲酯化工艺： NaOH-CH3OH 溶液与油脂皂化 1 h，

再甲酯化 3 h，酯化温度 80 °C，催化剂体积分数 2.0%，转速 400 r/min，产品

中花生四烯酸甲酯(AA-ME) 含量为 37.75%，产率 88.35%。再与乙醇以体积比

1:10 在-5 °C 下结晶 2h，样品中 AA-ME质量分数提高到 50%，产率为 90%。

然后，以 AA-ME 样品为原料，考察了分子蒸馏富集的影响因素，得到最

佳富集工艺：操作压力 1.0 Pa，蒸发温度 80 °C，转速 150 r/min，冷凝温度

10 °C，进料流率 1.5 mL/min，AA-ME 质量分数提高到 67.48%，总产率

85.86%。以一级轻相产物继续进行分子蒸馏，经过三级分子蒸馏后，AA-ME

含量提高到 70.14%，产品呈淡黄色，几乎没有任何气味。

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摘 要

-II-

最后，对分子蒸馏富集过程进行数值计算。分子平均自由程的计算说明

分子蒸馏器中蒸发面和冷凝面之间的距离远大于分子平均自由程，分子蒸馏

器可以适当进行放大，对产品的分离效果没有很大影响。利用混合池模型描

述液膜的蒸发过程，模拟计算值与实验值具有一定的吻合度。

关键词： 花生四烯酸；甲酯化；低温结晶；分子蒸馏；数值计算

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Abstract

-III-

Abstract

Arachidonic acid(AA) is one of the -6-polyunsaturated fatty acids, which has

important effects on human physiology, including the cardiovascular disease

prevention, the development of brain tissue promotion, the retina function

improvement and anti- inflammatory cancer etc. It has been widely applied to health

food, medicine, feed and other areas. The sold AA is mainly gained from the deep sea

fish oil and animal innards, but far to satisfy the market need for its limited resources.

AA from microorganism culture production has effectively resolved the problem. This

paper summarized the main methods of separation and purification on AA, plus their

advantages and disadvantages, and proposes the use of low temperature solvent

crystallization combined with molecular distillation to enrich AA from microbial oil.

Firstly, a gas chromatography method for the determination of AA from

microbial oil was developed. Capillary column HP-INNOWAX with FID, column

flow of 1.0 mL/min, injector and detector temperature of 250 °C, column temperature

of 240 °C lasting for 30 min and diversion ratio of 10:1 were used for detection.

Qualitative analysis of the derivative samples was carried out through the infrared

absorption spectrum(IR) and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),

confirming the composition of the products.

Secondly, the methyl esterification of microbial oil was optimized with respect to

temperature, reaction time, catalyst(concentrated sulfuric acid)dosage and agitation

speed using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method,

using acid catalyst method. The appropriate methyl ester process was achieved after 1

h of saponification with NaOH-CH3OH, followed by 3 h of reaction at 80 °C and an

agitation speed of 400 r/min under the catalysis of 2.0% concentrated sulfuric

acid.The obtained product contained 37.75% AA with the yield of 88.35%. Proceed

with 2 h of crystallization at -5 °C using ethanol with the volume ratio of 1:10, the

mass fraction and yield of AA reached 50% and 90%, respectively.

Afterwards, the influence factors of molecular distillation enrichment were

investigated with AA-ME as raw materials. It showed that the mass fraction and the

yield of arachidonic acid could reach 67.48% and 85.86%, respectively, under the

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Abstract

-IV-

operation pressure of 1.0Pa, distillation pressure of 80 °C, agitated speed of 150 r/min,

cool temperature of 10 °C and feed rate of 1.5 mL/min. Proceed with first molecular

distillation distillate for three times of distillation, the mass content of AA increased

to 70.14%. The product appeared pale yellow and released almost no smell.

Finally, the numerical calculation of the molecular distillation enrichment

process was carried out.The calculation results of molecular mean free path showed

that the distance between evaporating plane and condensing side was far greater than

the molecular mean free path. As to no obvious influence on the separation efficiency

of product, molecular distillation device could amplify appropriately. Using mixing

pool model to describe the liquid film evaporation process, the simulation calculation

and experimental value had certain alignment.

Key Words: AA; methyl esterification; low temperature crystallization; molecular

distillation; numerical calculation

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- i -

目 录

第一章 文献综述 ............................................................................... 1

1.1 花生四烯酸理化性质 .......................................................................................... 1

1.2 花生四烯酸来源及应用 ...................................................................................... 1

1.2.1 来源 ............................................................................................................... 1

1.2.2 应用................................................................................................................ 3

1.3 花生四烯酸的分离纯化方法 .............................................................................. 5

1.3.1 低温溶剂结晶法 ........................................................................................... 5

1.3.2 尿素包合法 ................................................................................................... 5

1.3.3 吸附分离法 ................................................................................................... 6

1.3.4 脂肪酶浓缩法 ............................................................................................... 7

1.3.5 超临界流体萃取法 ....................................................................................... 7

1.3.6 超临界流体色谱法 ....................................................................................... 8

1.3.7 分子蒸馏法 ................................................................................................... 8

1.3.8 多种分离方法相结合 ................................................................................... 9

1.4 分子蒸馏技术 ...................................................................................................... 9

1.4.1 分子蒸馏的原理 ......................................................................................... 10

1.4.2 分子蒸馏的特点 ......................................................................................... 12

1.4.3 分子蒸馏设备 ............................................................................................. 13

1.4.4 分子蒸馏的工业化应用 ............................................................................. 14

1.5 研究内容 ............................................................................................................ 17

第二章 微生物油脂中花生四烯酸检测方法研究 ............................. 19

2.1 微生物油脂理化性质测定 ................................................................................ 19

2.1.1 酸值 ............................................................................................................. 19

2.1.2 皂化值 ......................................................................................................... 19

2.1.3 不皂化物 ..................................................................................................... 19

2.2 气相色谱法测定实验 ........................................................................................ 20

2.2.1 实验材料 ..................................................................................................... 20

2.2.2 检测条件 .................................................................................................... 20

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- ii -

2.2.3 样品衍生化 ................................................................................................ 21

2.2.4 方法学考察 ................................................................................................. 21

2.3 结构鉴定 ............................................................................................................ 24

2.3.1 检测条件 .................................................................................................... 24

2.3.2 定性分析 .................................................................................................... 24

2.4 本章小结 ............................................................................................................ 26

第三章 微生物油脂中花生四烯酸甲酯化工艺研究 ......................... 27

3.1 甲酯化原理 ........................................................................................................ 27

3.2 甲酯化材料与装置 ............................................................................................ 28

3.3 实验步骤 ............................................................................................................ 28

3.4 结果与讨论 ........................................................................................................ 29

3.4.1 酯化温度 ..................................................................................................... 29

3.4.2 酯化时间 ..................................................................................................... 30

3.4.3 转速 ............................................................................................................. 30

3.4.4 催化剂浓度 ................................................................................................. 31

3.4.5 正交实验 ..................................................................................................... 32

3.4.6 皂化甲酯化实验 ......................................................................................... 33

3.5 甲酯化产品预处理 ........................................................................................... 34

3.5.1 低温溶剂结晶原理 .................................................................................... 34

3.5.2 实验材料与步骤 ........................................................................................ 34

3.5.3 结果与讨论 ................................................................................................ 35

3.6 本章小结 ............................................................................................................ 38

第四章 分子蒸馏富集微生物油脂中花生四烯酸 ........................... 39

4.1 分子蒸馏实验 ................................................................................................... 39

4.1.1 分子蒸馏装置 ............................................................................................ 39

4.1.2 实验步骤 .................................................................................................... 40

4.1.3 结果与讨论 ................................................................................................ 41

4.1.4 正交实验 .................................................................................................... 46

4.2 二级分子蒸馏实验 ........................................................................................... 48

4.2.1 实验原料 .................................................................................................... 48

4.2.2 实验步骤 .................................................................................................... 48

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目 录

- iii -

4.2.3 结果与讨论 ................................................................................................ 48

4.3 多重分子蒸馏实验 ........................................................................................... 52

4.4 本章小结 ........................................................................................................... 52

第五章 分子蒸馏富集过程数值计算 ............................................... 54

5.1 分子平均自由程的计算 ................................................................................... 54

5.1.1 公式的提出 ................................................................................................. 54

5.1.2 结果与讨论 ................................................................................................. 55

5.2 混合池模型的计算 ........................................................................................... 56

5.2.1 混合池模型 ................................................................................................. 57

5.2.2 模型的求解.................................................................................................. 58

5.2.3 结果与讨论 ................................................................................................. 60

5.3 本章小结 ........................................................................................................... 61

第六章 结论 ..................................................................................... 62

附 录 ................................................................................................ 63

参考文献........................................................................................... 68

致谢 .................................................................................................. 74

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Contents

- iv -

Contents

CHAPTER ONE INTRODUCTION..................................................1

1.1 Physicochemical Property of AA ..................................................................... 1

1.2 Resources and Utilization of AA ...................................................................... 1

1.2.1 Resources of AA ............................................................................................ 1

1.2.2 Utilization of AA ........................................................................................... 3

1.3 Seperation and Purification of AA .................................................................. 5

1.3.1 Low temperature crystallization .................................................................... 5

1.3.2 Urea complexion............................................................................................ 5

1.3.3 Adsorption ..................................................................................................... 6

1.3.4 Lipase concentration ...................................................................................... 7

1.3.5 Supercritical fluid extration ........................................................................... 7

1.3.6 Supercritical fluid chromatography ............................................................... 8

1.3.7 Molecular distillation ..................................................................................... 8

1.3.8 Multiple separation methods combined ......................................................... 9

1.4 Molecular Distillation ....................................................................................... 9

1.4.1 Mechanism of molecular distillation ........................................................... 10

1.4.2 Characteristic of molecular distillation........................................................ 12

1.4.3 Apparatus of molecular distillation ............................................................. 13

1.4.4 Practical utilization of molecular distillation............................................... 14

1.5 The Content of This Thesis.............................................................................. 17

CHAPTER TWO DETERMINATION METHODS OF AA FROM MICROBIAL OIL ............................................................................19

2.1 Detection of Physicochemical Property of Microbial Oil ............................. 19

2.1.1 Acid value .................................................................................................... 19

2.1.2 Saponification value .................................................................................... 19

2.1.1 Unsaponifiable matter.................................................................................. 19

2.2 Gas Chromatography Detection of Microbial Oil......................................... 20

2.2.1 Materials and equipments ............................................................................ 20

2.2.2 Detection conditions .................................................................................... 20

2.2.3 Derivatization of microbial oil..................................................................... 21

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Contents

- v -

2.2.4 Methodology test ......................................................................................... 21

2.3 Identification of Structure ............................................................................... 24

2.3.1 Detection conditions .................................................................................... 24

2.3.2 Qualitative analysis...................................................................................... 24

2.4 Conclusion......................................................................................................... 26

CHAPTER THREE METHYL ESTERIFICATION OF AA FROM MICROBIAL OIL ............................................................................27

3.1 Mechanism of Methyl Esterification .............................................................. 27

3.2 Materials and Equipments .............................................................................. 28

3.3 Experimental Procedure .................................................................................. 28

3.4 Results and Discussion ..................................................................................... 29

3.4.1 Methyl esterification temperature ................................................................ 29

3.4.2 Methyl esterification time ............................................................................ 30

3.4.3 Rotation rate................................................................................................. 30

3.4.4 Catalyst concentration ................................................................................. 31

3.4.5 Orthogonal experiments............................................................................... 32

3.4.6 Saponification and methyl esterification ..................................................... 33

3.5 Pretreament of Methyl Esterification Product .............................................. 34

3.5.1 Mechanism of low temperature crystallization............................................ 34

3.5.2 Experimental materials and procedure ........................................................ 34

3.5.3 Results and discussion ................................................................................. 35

3.6 Conclusion......................................................................................................... 38

CHAPTER FOUR ENRICHMENT OF AA BY MOLECULAR DISTILLATION ...............................................................................39

4.1 Molecular Distillation Experiments................................................................ 39

4.1.1 Molecular distillation equipments ............................................................... 39

4.1.2 Experimental procedure ............................................................................... 40

4.1.3 Results and discussion ................................................................................. 41

4.1.4 Orthogonal experiments............................................................................... 46

4.2 Second Step Molecular Distillation................................................................. 48

4.2.1 Materials ...................................................................................................... 48

4.2.2 Experimental procedure ............................................................................... 48

4.2.3 Results and discussion ................................................................................. 48

4.3 Multiple Molecular Distillation....................................................................... 52

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Contents

- vi -

4.4 Conclusion......................................................................................................... 52

CHAPTER FIVE NUMERICAL CALCULATION OF

MOLECULAR DISTILLATION PROCESS ...................................54

5.1 Calulation of Molecular Average Free Path ................................................. 54

5.1.1 Formula of the proposed .............................................................................. 54

5.1.2 Results and discussion ................................................................................. 55

5.2 Calulation of Mixing Pool Model .................................................................... 56

5.2.1 Mixing pool model ...................................................................................... 57

5.2.2 Solution of mixing pool model .................................................................... 58

5.2.3 Results and discussion ................................................................................. 60

5.3 Conclusion......................................................................................................... 61

CHAPTER SIX CONCLUSIONS .....................................................62

APPENDIX .......................................................................................63

REFERENCES .................................................................................68

ACKNOWLEDGE ............................................................................74

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第一章 文献综述

-1-

第一章 文献综述

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，简称 PUFAs)是指在脂肪链上

含有 1 个以上双键且碳原子数为 18-22 的直链脂肪酸。通常分为 ω-3 和 ω-6 系

列，在多不饱合脂肪酸分子中，距羧基最远端双键在倒数第 3 个碳原子上的属

于 ω-3，包括亚麻酸(linolenic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)

和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等；在第六个碳原子上的，属于

ω-6 系列，包括亚油酸(linoleic acid)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)等 [1]。

PUFAs因其独特的生物活性，引起了人们的极大兴趣。

1.1 花生四烯酸理化性质

花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA或 AA)，系统名为全顺式 Δ-5, 8, 11, 14-

二十碳四烯酸，其中第一个双键起始于甲基端起第 6 个碳原子，属于 ω-6 系列

的多不饱和脂肪酸，简记为 20:4(n-6)。其分子式为 C20H3202，相对分子量为

304.47，化学式为 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4CH2CH2COOH，结构式如图 1.1

图 1.1 AA分子结构式

Fig. 1.1 The structure of AA

AA 常温下是淡黄色油状液体，溶于乙醇、丙酮、苯等有机溶剂，沸点为

245 ºC，熔点为-49.5 ºC，碘值为 333.50 gI/100g，中和值 184.20，折射率 1.4824，

紫外吸收峰为 257、268、315 nm。AA 化学性质因双键较多而不稳定，在空气

中易氧化，高温或者光照条件下容易发生聚合、异构化等反应。一般采用避光、

避热、低温、真空、充氮贮存，使用除氧剂、添加抗氧化剂等方法进行保存。

1.2 花生四烯酸来源及应用

1.2.1 来源

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第一章 文献综述

-2-

哺乳动物内质网上缺乏 Δ-9 以上脱氢酶，不能合成 AA 等多不饱和脂肪酸，

需从食物中获取，因而称为必需脂肪酸[2]。植物油绝大多数都不含 AA，这可能

与植物不需要 AA的代谢产物(前列腺素等)有关。少数植物油如十字花科植物：

荒野独行菜油、北美独行菜油等中含有 AA，但其含量均很低。

AA 是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广的一种多不饱和脂肪酸，主要

存在于哺乳动物的器官、肌肉和血液中。动物的内脏中 AA 含量一般较高，如

猪肝的脂肪成分中，AA 含量约为 11.2%；猪心的脂肪成分中，AA 含量可达

15.9%；而在人的胎盘组织中，AA 的含量更是高达 20%~25%；鱼油中也含有

少量的 AA，一般在 0.2%左右[3-5]。在母乳中，天然存在着丰富的 AA，γ-亚麻

酸和 DH-γ-亚麻酸。一般母乳脂质中 AA 含量为 0.6%~3%，DHA 含量为

0.3%~1%。目前，国际上销售的 AA 主要从深海鱼油中提取，但存在以下缺点：

(1) 资源有限，产量不稳定。不同来源的鱼油脂肪酸组成，即多不饱和脂肪酸

的含量，因鱼的种类、捕捞季节、气候和地点的不同而存在着差异，鱼油

产量波动很大。

(2) 纯化工艺复杂，产品得率低。由于鱼油成分复杂，含有难以去除的胆固醇

成分、脂溶性纤维素，同时，还含有高达 80%的饱和脂肪酸和大量 ω-3 系

列脂肪酸，要获得纯度较高的 AA，分离纯化工艺非常复杂，成本也比较高，

导致 AA的价格一直居高不下。

(3) 不利于环境资源的保护。由于人们对多不饱和脂肪酸的生理作用认识的不

断提高，对 AA、DHA 等多不饱和脂肪酸的市场需求也在不断增加，这会

导致某些为了商业利益而不计后果的过量捕捞行为出现，给环境资源保护

带来负面影响。

世界各国特别是日本、美国，一直都致力于运用现代生物工程进行AA工业

化生产的研究。AA广泛存在于低等生物中，在原生动物，变形虫，藻类，一些

海洋细菌及低等真菌中都存在AA，特别是被孢霉属真菌含有大量AA，并且发

酵得到含AA的油脂无毒性，无致突变性，因此微生物发酵及藻类培养生产成为

新兴的两种生产AA的方式[6-8]。与传统制备方法相比具有如下几个优势：

(1) 生产周期短，繁殖力强；

(2) 不受气候、场地、季节、资源的影响，可全年进行生产；

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第一章 文献综述

-3-

(3) 微生物发酵的菌种种类多，发酵条件比较容易控制，可利用基因工程手段

来选育高产菌株，并结合微生物产多不饱和脂肪酸的代谢途径，利用代谢

调控的方法来控制PUFAs的产量和组成；

(4) 微生物发酵生产的油脂含有大量必需脂肪酸，脂肪酸组成比较简单，

PUFAs的含量比较高，成分更接近母乳。

1996年美国马泰克生物技术有限公司(Martek)研究出真菌产甘油三酯类油脂

技术，开始工业化生产AA油脂，其单细胞油脂产品随即推向市场。国内对微生

物发酵生产AA的研究也很多，如中国科学院等离子物理研究所用离子束生物技

术对AA生产菌进行诱变选育，选育出AA高产菌，已经产业化[9,10]，其中包括嘉

吉烯王生物工程有限公司、湖北福星生物科技有限公司、金达威集团等几家微

生物油脂生产厂商。

1.2.2 应用

AA 主要以磷脂形式存在于机体的各个组织细胞膜上，决定细胞膜的一些

重要生物活性，是许多二十碳烯酸衍生物如前列腺素 E2 (PGE2)、前列环素

(PGI2)、血栓烷素 A2(TXA2)、白三烯 Lekuotrinee B4(LTB4)和 C4(LTC4)等的直接

前体。这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功

能和血小板激活等具有重要的调节作用。同时，还具有降血脂、促进脑组织发

育、改善视网膜功能和抗炎抗癌等生理活性功能 [11-16 ]。目前已广泛应用于保健

食品、医药、化妆品和饲料等领域。

1.2.2.1 AA在营养保健食品中的应用

AA、DHA 等 PUFAs 作为营养强化剂被誉为“21 世纪功能性食品的主角”，

可改善人类的膳食结构，增强机体的免疫力。一些动物实验显示，在脑发育期，

膳食中缺乏 AA会引起认知功能和视觉功能的损伤[3]。鉴于 AA对婴儿的神经及

其生理的发育、青少年的生长发育的重要作用，世界卫生组织(WHO)和国际粮

农组织委员会(FAO)针对人类摄入 AA 量不足，于 1995 年在“关于脂肪、油脂

与人类营养的报告”中推荐，婴儿配方奶粉应该含有每公斤婴儿体重 40mg 的

DHA和 60mgAA[17,18]。

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